專利名稱：基于補體因子h對腦膜炎奈瑟球菌血清殺菌活性的鑒定的制作方法
技術領域：
本發明涉及對腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)抗體殺菌活性的鑒定。
背景技術：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是常見于健康青少年咽喉的一種共生生物(Maiden, Μ. C.等(2008) J Infect Dis. ；Mueller，J. Ε.等(2007)Emerg Infect Dis 13 :847-854 ；Trotter,C. L. ^ (2006)Epidemiol Infectl34 :556-566 ；Bogaert,D.等 (2005)Clin Infect Dis 40 :899-902 ；Verdu, Μ. E.等(2001)Epidemiol Infect 127 245-259 ；Ala' Aldeen, D. Α.等(2000) J ClinMicrobiol 38 :2311-2316)。在很少的情況下，該生物體侵入血流，并引起腦膜炎或迅速致死的膿毒癥。
據目前已知，確定該生物體為人病原體。腦膜炎球菌疾病的可靠動物模型難以開發(Lewis, Τ.等(1943) J Clin Invest 22 :375-385 ；Ashton, F. Ε.等(1989)Microb Pathog 6 :455-458 ；Zarantonelli, M. L.等(2007) Infect Immun75 :5609-5614)。在人體中具有高致病性的很多腦膜炎奈瑟球菌包囊菌株易于從常用的實驗動物如兔(Lewis， Τ.等(1943) J Clin Invest 22 :375-385)、小鼠(Zarantonelli, Μ. L.等(2007) Infect Immun 75 :5609-5614 ；Oftung, F.等(1999)FEMS Immunol Med Microbiol 26:75-82; Holbein, B. Ε.等(1979nnfect Immun 24 =545-551)或大鼠(易變不定，參見下文)的血流中清除。此外，據報道，腦膜炎球菌菌株在年幼大鼠中引起菌血癥的能力不同(參見例如，Welsch，J. A.等(2004) J Immunol 172 :5606-5615, Hou, V. C.等(2005) J Infect Dis 192 :580-590 ；Toropainen, M.等(2005)Vaccine23 :4821-4833 ；Toropainen, M.等(2005) Infect Immun 73:4694-4703 ；Toropainen, Μ.等(2001)Microb Pathog 30 :139-148 ； Toropainen, Μ.等(2006)Infect Immun 74:2803—2808)。
腦膜炎奈瑟球菌與人的補體因子H(fH)結合(khne ider，Μ. C.等Q006) J Immunol 176 :7566-7575 ；Madico, G. ^ (2006) JImmunol 177 :501-510)，補體因子 H 是下調補體激活作用的分子。與fH的結合增強該生物體對補體介導的殺菌作用的抗性，可能是使腦膜炎奈瑟球菌避開先天宿主防御的重要機制。淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)與fH 的結合限于人fH，這可部分解釋天然淋球菌感染的種特異性限制(Ngampasutadol，J.等 (2008) JImmunol 180 =3426-3435)。血清fH對人的腦膜炎球菌疾病易感性的重要性得到了強調，近來的流行病學觀察到，在CfH基因的啟動子區中推定的NF-K B-應答元件內的單核苷酸多態性(C-496T)與較高的血清fH水平OVC純合基因型)和增大的患腦膜炎球菌疾病風險(Haralambous, E.等(2006) Scand J Infect Dis 38 :764-771)相關。
相當多的數據顯示，血清補體介導的殺菌抗體具有針對腦膜炎球菌疾病的保護作用(Goldschneider,I.等(1969) J Exp Med 129 :1307-1326 ；，I.等(1969) J Exp Med 129 1327-1348 ；Borrow，R.等(2005)Vaccine 23 :2222-2227 ；Balmer,P.等(2004)Expert Rev Vaccines 3 :77-87 ；Andrews, N^ (2003)ClinDiagn Lab Immunol 10 :780-786 ；Borrow, R. ^ (2001) Infect Immun69 :1568-1573)。在用人補體測定時，估計最小保護血清效價在 1 4到1 8之間。評價殺菌抗體效價已成為評價人對象是否具有針對奈瑟球菌的保護性免疫應答的黃金標準。
然而，人補體難以獲得(很大程度上由于大多數人血清具有對腦膜炎奈瑟球菌的自然獲得抗體，使它們不適合作為人補體的來源)。必須對大量健康捐贈者進行篩選，其中顯示缺乏抗體的血清可提供合適的補體用于鑒定。因此，用于血清群A和C殺菌鑒定的若干標準化方案采用幼兔血清代替人血清作為補體來源(MaslankhS.E.等(1997)Clin Diagn LabImmunol 4 156-167 Jodar，L.等(2000)Biologicals 28:193-197)。采用兔血清作為補體來源的鑒定已廣泛用于推斷疫苗有效性并作為新腦膜炎球菌疫苗頒發許可的根據。雖然由于較易進行標準化而選擇兔補體用于這些方案，但多年來已知與用人補體測定的效價相比，兔補體會增大血清殺菌效價(Zollinger, W. D.等(1983) Infect Immun 40 :257-264 ； Santos, G. F.等(2001)Clin Diagn Lab Immunol 8:616-623)。雖然用兔補體測定的血清殺菌效價與引入大量人群的腦膜炎球菌疫苗接種的有效性相關聯(Borrow，R.等Q005) Vaccine 23 :2222-2227 ；Balmer,P.等(2004)Expert Rev Vaccines 3 :77-87 ；N等(2003) Clin Diagn Lab Immunol 10 :780-786)，但如果用人補體進行測試，很多這些血清均缺乏殺菌活性。
因此，用兔補體觀察到的相關性可能無法精確或完全反映疫苗誘導抗體賦予的保護作用的實際機制。例如，在存在人補體且抗體濃度或質量不足以引發殺菌活性但足以支持調理吞噬作用時，用兔補體測定的陽性效價可以是清除腦膜炎奈瑟球菌替代機制的代替物(ffelsch,J. Α.等(2007)ClinVaccine Immunol 14 :1596-1602 ；Plested,J. S.等(2008) Clin Vaccine Immunol15 :799-804)。
發明概述 本發明提供了采用介導與奈瑟球菌H因子結合蛋白(fhBp)結合的具有人氨基酸序列的H因子多肽來檢測殺菌性抗奈瑟球菌抗體的鑒定方法，還提供了奈瑟球菌感染的非人動物模型。
因此，本發明提供檢測樣品中殺菌性抗奈瑟球菌抗體的方法，所述方法包括將疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品、包含人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的 fH多肽、非人補體來源和奈瑟球菌在反應混合物中混合，通過評價奈瑟球菌的生存力來檢測樣品中存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體，其中所述樣品存在下的奈瑟球菌生存力減小表示所述樣品包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體。在相關實施方式中，所述fH多肽是人fH多肽。 在其它實施方式中，所述fH多肽是包含非人動物內源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽， 所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人補體可以是例如兔補體、大鼠補體或小鼠補體。在其它相關實施方式中，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌，其可來自任何莢膜群，例如群A、B、C、X、Y或W-135。在感興趣的實施方式中，所述樣品是人血清。
本發明還提供反應混合物，其包含疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品、包含人保守序列重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子(fH)多肽(即不是可天然存在于待測樣品中的fH)、非人補體和奈瑟球菌。在相關實施方式中，所述fH多肽是人fH多肽。在其它實施方式中，所述fH多肽是包含非人動物內源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人補體可以是例如兔補體、 大鼠補體或小鼠補體。在其它相關實施方式中，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌，其可來自任何莢膜群，例如群A、B、C、X、Y或W-135。在感興趣的實施方式中，所述樣品是人血清。
本發明還提供包含一個或多個小瓶的試劑盒，所述小瓶包含包含人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子(fH)多肽和非人補體。所述試劑盒還包含奈瑟球菌的培養物作為檢測殺菌抗體的靶。在相關實施方式中，所述fH多肽是人fH多肽，且 /或可以是包含非人動物內源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述試劑盒的非人補體可以是例如兔補體、大鼠補體或小鼠補體。
本發明還提供非人動物，其編碼含人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的H 因子(fH)多肽的基因組整合核酸，其中所述轉基因操作性連接于啟動子以提供所述核酸在非人動物中的表達，所述核酸在非人動物中的表達提供結合奈瑟球菌的fH多肽的產生。 在相關實施方式中，所述fH多肽是人fH多肽，且/或可以是包含非人動物內源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人動物可以是例如大鼠或小鼠。在一些實施方式中，用奈瑟球菌例如腦膜炎奈瑟球菌感染所述非人動物。這樣的非人動物模型可用于篩選對奈瑟球菌具有活性的候選試劑的方法，其中這樣的方法通常包括在用奈瑟球菌進行感染之前、期間或之后將候選試劑給予所述非人動物，檢測存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體的產生。
本發明還提供奈瑟球菌感染的非人動物模型，其包含包含人短同源重復序列 6 (SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的非人動物宿主，其中所述fH多肽存在于非人動物宿主的血流中；用奈瑟球菌進行細菌感染，其中所述fH多肽存在于非人動物的血清中。所述fH多肽可由整合到非人動物基因組中的核酸編碼(因此表達到血流中)，且/或可通過對非人動物宿主的血流從外源給藥而提供。所述fH多肽可以是人fH多肽或包含非人動物內源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人動物宿主可以是例如大鼠或小鼠。所述奈瑟球菌可以是感興趣的腦膜炎奈瑟球菌菌株。
本發明還提供使用本文所述奈瑟球菌感染的非人動物模型的方法，以篩選候選試劑用于促進抗奈瑟球菌活性，所述方法包括將候選試劑給予用奈瑟球菌感染的非人動物， 檢測候選試劑對所述非人動物中奈瑟球菌的生存力存在或缺乏作用。
通過閱讀本發明，普通技術人員不難理解其它的方面和實施方式。
附圖簡要說明
圖1的A-C顯示fH與腦膜炎奈瑟球菌結合的種特異性。(
圖1A)通過Western印跡測定的靈長動物fH與腦膜炎奈瑟球菌菌株H44/76的結合。抗人fH抗體識別來自黑猩猩、狒狒和獼猴血清的fH的能力顯示于標記為“僅血清”的泳道中，其包含來自所述各種靈長動物的以1 100稀釋的熱失活血清。標記為“血清+細菌”的泳道包含用所述各種靈長動物血清培育的H44/76，具有H44/76而無血清(“無”)的泳道僅包含細菌。(
圖1B)和 (
圖1C)通過流式細胞術測定的加入大鼠(
圖1B)或兔(
圖1C)血清對生物素化人fH與腦膜炎奈瑟球菌細胞結合的作用。虛線表示不加生物素化人fH時的細菌細胞。實黑線表示不加血清時生物素化人fH的結合情況。實灰線表示存在40%熱失活人血清時生物素化人 fH的結合情況。填充的淺灰色區域表示存在40%熱失活大鼠或兔血清時生物素化人fH的結合情況。在三個獨立的實驗中均觀察到大鼠和兔血清而非人血清存在時生物素化人fH 的結合的類似抑制作用。
圖2顯示在年幼大鼠血清中加入人fH對腦膜炎奈瑟球菌存活率的作用。將細菌 (約10，000CFU/ml)懸浮在不同濃度的年幼大鼠血清中。將各血清分為兩等份，向其中加入50 μ g/ml或0 μ g/ml人fH。將血清和細菌在37°C培育1小時。虛線表示不加fH時血清中細菌存活率百分數；實線表示包含人fH時血清中的存活率百分數。數據是來自每個菌株9-20個血清樣品的結果的平均值士95%置信區間。
圖3A和;3B顯示大鼠C3與腦膜炎奈瑟球菌的結合情況和人fH對大鼠C3結合的調控作用。(圖3A)大鼠C3與用年幼大鼠補體培育而不加人fH(Hu fH，實線)或包含25 μ g/ mi人fH(灰色陰影直方圖)的菌株H44/76和NZ98/2M的結合情況。(圖3B)人fH對大鼠 C3結合的濃度依賴性抑制作用。僅用10%年幼大鼠血清或用加入濃度范圍為50-6. 25 μ g/ ml的人fH的10%大鼠血清培育細菌。通過流式細胞術采用抗大鼠C3-FITC測定C3在細菌上的沉積。在類似條件下測定大鼠C3與作為替代途徑激活物的酵母聚糖的結合作為對照。X軸表示Iogltl度量的熒光，Y軸是事件數量。(圖3C)人fH與細菌的結合調控兔替代途徑激活作用。人fH(hfH)對兔C3結合腦膜炎球菌的劑量應答性抑制作用。用包含劑量范圍為0-64 μ g/ml的hfH的經Mg/EGTA處理的幼兔補體培育菌株A2594 (左圖)，通過流式細胞術測定與細菌結合的兔C3。將作為替代途徑激活物的酵母聚糖用作對照(右圖)， 以確保對兔C3結合的抑制作用不是非特異性補體抑制作用的結果。對照直方圖(不加血清)用虛線表示。
圖4顯示在用群B菌株H44/76對年幼大鼠進行IP刺激之后人fH聯合給藥對菌血癥的作用。除給予動物Oyg fH的動物數量是10以外，各組均每組由15只大鼠組成。在細菌刺激后8小時獲得的血液培養物中測定菌血癥。用50 μ g人fH處理的大鼠的幾何平均CFU/ml高于用50 μ g人Cl酯酶抑制劑處理的對照(P < 0. 005)。給予每只大鼠50、10、 2或0 μ g人fH的四組的各自的幾何平均值具有顯著性(AN0VA測定P < 0. 02)。
圖5顯示加入人fH(25 μ g/ml)對用幼兔補體測定的血清群C血清殺菌效價的作用。在對用群C腦膜炎球菌偶聯疫苗免疫的11名成人或用四價腦膜炎球菌多糖疫苗免疫的19名4歲兒童進行免疫之后獲得所述血清。
圖6顯示fH結合對腦膜炎奈瑟球菌的對補體介導殺死作用的抗性的作用。
圖7顯示人、黑猩猩、獼猴、大鼠和小鼠的fH的短同源重復序列6 (SCR6)的氨基酸序列。虛線表示的殘基與人fH氨基酸序列中的相應殘基相同。
圖8顯示維斯達(Wistar)大鼠幼崽(F0代)中人fH表達的Western印跡。用抗人fH抗體探測所述印跡，加樣的人血清作為陽性對照。
在描述本發明和本發明的具體示例性實施方式之前，應理解，本發明不限于所述的具體實施方式
，因為它們當然可能發生變化。還應理解，本文所用術語的目的僅是描述具體實施方式
，不用來構成限制，因為本發明的范圍僅受所附權利要求書的限制。
應理解，提供數值范圍時，除非上下文中另有明確說明，該范圍上下限之間、以下限單位的十分之一為間隔的各間插數值，以及所述范圍的任何其它所述或間插數值均包括在本發明內。這些較小范圍的上下限可獨立地包括在所述較小范圍中，也包括在本發明內， 除非所述范圍中存在任何明確排除的限值。所述范圍包括一個或兩個限值時，排除這一個或兩個所包括限值的范圍也包括在本發明中。
除非另有說明，本文所用的所有科技術語與本發明所屬領域普通技術人員所理解的通常含義相同。雖然也可采用與本文所述的任何類似或等同的方法和材料實施或測試本發明，但以下描述的是優選的方法和材料。本文提及的所有出版物均通過引用納入本文，以公開和描述與所引用出版物相關的方法和/或材料。這樣的出版物可列出與本發明明確或隱含的定義沖突的術語定義，該情況下以本發明的定義為準。
必須注意到，本文和所附權利要求書所用的單數形式“一個”、“一種”和“所述”、 “該”包括復數對象，除非上下文另有明確說明。因此，例如，提及“一個多肽”包括多個這樣的多肽，提及“所述細菌”包括一個或多個細菌，等等。
提供本文討論的出版物僅因為其公開早于本申請的申請日。本文中所有內容均不應解釋為承認本發明由于在先發明而不早于這樣的出版物。此外，所提供的出版日期可能與實際
公開日期不同，可能需要單獨確認。
示例性實施方式的詳述 本發明提供了采用介導與奈瑟球菌H因子結合蛋白(fhBp)結合的具有人氨基酸序列的H因子多肽來檢測殺菌性抗奈瑟球菌抗體的鑒定方法，還提供了奈瑟球菌感染的非人動物模型。
定義 “補體”指提供功能性補體級聯系統的血清蛋白質的集合，所述補體級聯系統是促進細菌死亡的生化級聯系統。同樣地，本文所用的“補體”指可介導與經典途徑、替代途徑或二者相關的功能性補體級聯系統的血清蛋白質的集合，還可包括可介導甘露糖結合凝集素途徑的血清蛋白質。
“非人補體”指來自非人來源通常為哺乳動物來源的補體，其包括但不一定限于嚙齒動物補體(例如，大鼠補體、小鼠補體、兔補體)和非人靈長動物補體(例如，黑猩猩補體、猴補體)等。
本文所用的“殺菌性抗體”指促進補體介導細菌殺死作用的抗體。
“H因子結合蛋白”(fHBP)在文獻中也稱為GNA1870、GNA 1870、0RF2086、 LP2086(脂蛋白2086)，“741”指呈現在細菌表面的奈瑟球菌例如腦膜炎奈瑟球菌的多肽。 根據氨基酸序列可變性和免疫交叉反應性(Masignani等J Exp Med 2003 ； 197 =789-99), 腦膜炎奈瑟球菌菌株已被細分為三個fHBP變體群(在一些報道(Masignani等2003，見上)中稱為變體1 (v. 1)、變體2 (v. 2)和變體3 (v. 3)，在其它報道(參見例如，Fletcher等 2004 Infect Immun 2088-2100)中稱為家族A和B)。為清楚起見，本發明采用術語v. 1、 v. 2和v. 3。因為變體2 (v. 2) fHBP蛋白(來自菌株8047)和變體3 (v. 3) fHBP蛋白(來自菌株M1239)的長度與MC58的長度分別具有_1和+7氨基酸殘基的差異，用來指代v. 2和 v. 3fHBP蛋白質殘基的編號與基于這些蛋白質實際氨基酸序列的編號不同。
“分離的”指感興趣的化合物(例如fH多肽)如果天然存在，其所在的環境與其可天然產生的環境不同。“分離的”用來包括充分富集感興趣的化合物和/或其中感興趣的化合物部分或充分純化的樣品內的化合物。所述化合物不是天然存在時，“分離的”表示所述化合物已與由合成或重組手段對其進行制備的環境隔離。
“富集”表示對樣品進行非自然操作(例如通過實驗者或臨床醫生)，使感興趣的化合物以大于(例如，至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍或更大)起始樣品如生物樣品(例如所述化合物天然產生或在給藥后存在于其中的樣品)或制備所述化合物的樣品(例如在細菌多肽、抗體、嵌合多肽等中的情況)中所述化合物的濃度存在。
“基本純”表示實體(例如多肽)的量大于組合物的總含量(例如組合物的總蛋白質)的約50%，通常大于總蛋白質含量的約60%。更通常地說，“基本純”指組合物總量 (例如總蛋白質)的至少75%、至少75%、至少85%、至少90%或更多是感興趣的實體的組合物。優選所述蛋白質的量大于組合物中總蛋白質的約90%，更優選大于組合物中總蛋白質的約95%。
術語“異源”指由來自不同來源的結構定義的兩種組分。例如，在上下文中存在嵌合多肽而使用“異源”時，所述嵌合多肽包含可來自不同多肽的操作性連接的氨基酸序列 (例如，來自第一來源(例如人)fH多肽的第一組分和來自第二來源(例如兔)fH多肽的第二組分)。類似地，上下文中存在編碼嵌合多肽的多核苷酸時的“異源”包括可來自不同基因的操作性連接的核酸序列。其它示例性“異源”核酸包括表達構建體，其中包含編碼序列的核酸操作性連接于來自不同于編碼序列來源的遺傳來源的調節元件(例如啟動子)(例如，以提供在感興趣的宿主細胞中表達，所述宿主細胞可來自相對于啟動子、編碼序列或二者不同的遺傳來源)。例如，據稱，操作性連接于編碼fH多肽或其結構域的多核苷酸的T7 啟動子是異源核酸。上下文中存在重組細胞時的“異源”可指存在與其存在的宿主細胞遺傳來源不同的核酸(或基因產物，如多肽)。
本文在上下文中存在嵌合fH多肽時所用的“異源”表示所述嵌合fH多肽包含操作性連接的至少兩個不同來源的不同fH多肽的結構元件的鄰接氨基酸序列。例如，“異源 fH多肽”包括具有兔fH多肽氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列側接具有人CSR6序列的 CSR6結構域。
上下文存在氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，“衍生自”人fH多肽的氨基酸序列)時的“衍生自”用來表示所述多肽或核酸的序列基于參考多肽或核酸(例如，天然產生的人fH多肽或編碼核酸)的序列，而不用來對所述蛋白質或核酸制備的來源或方法構成限制。上下文中存在細菌菌株時的“衍生自”用來表示通過體內或體外培養親本菌株獲得的菌株和/或通過修飾親本菌株獲得的重組細胞。
術語“保護性免疫”指給予哺乳動物的疫苗或免疫方案誘導防止、延遲由腦膜炎奈瑟球菌引起的疾病的發展、降低所述疾病的嚴重程度或減少或一并消除所述疾病癥狀的免疫應答。保護性免疫可伴隨殺菌性抗體的產生。應注意，針對腦膜炎奈瑟球菌的殺菌性抗體的產生在所述領域中被接受為預示疫苗在人中具有保護作用(Goldschneider等，1969， J. Exp. Med. 129 1307 ；Borrow φ 2001 Infect Immun. 69 156 。
術語“轉基因”在本文中用來描述已被或即將被人工插入到非人動物基因組特別是活的非人哺乳動物(例如嚙齒動物，如大鼠、小鼠)細胞中的遺傳材料。
術語“轉基因動物”指具有整合到所述動物一個或多個細胞基因組中的轉基因元件的非人動物。因此，本文所用的“轉基因動物”包括所有或幾乎所有細胞包含遺傳修飾的動物(例如，完全轉基因動物、具有可遺傳轉基因的特定轉基因動物)，以及動物中細胞亞組經修飾包含基因組整合轉基因的嵌合轉基因動物。
靶基因“敲除”指導致靶基因功能降低的基因序列的改變。特別感興趣的“敲除” 是指靶基因的表達不可檢測或不顯著的敲除。例如，受體基因的敲除指所述受體功能顯著降低，使結合其正常配體的受體活性不可檢測或處于不顯著水平。功能降低可由遺傳改變引起的全長基因產物的產生減少或相對于天然基因產物具有功能缺陷的改變的基因產物產生而造成。本發明的“敲除”轉基因學可以是雜合或純合敲除靶基因的轉基因動物。“敲除”還包括條件性敲除，其中靶基因的改變可由例如使動物接觸促進靶基因改變的物質而發生。
基因“敲入”指向基因組加入編碼感興趣的基因產物的核酸，其可伴隨相應內源基因的敲除。可將這樣的“敲入”基因重組到基因組中，使其受調控的方式與內源基因的方式相當。所述轉基因可以是內源基因的修飾形式(例如在嵌合fH多肽中的情況)。“敲入”轉基因學可具有雜合或純合的遺傳改變。“敲入”還包括條件性敲入。
概述 本發明提供方法和組合物，其利用了關于人H因子(fH)可介導腦膜炎奈瑟球菌對非人補體(例如，兔補體、大鼠補體)的補體介導殺死作用的抗性的觀察。該觀察可用來提供可評價采用人fH和非人補體來源的抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的補體介導殺死作用的鑒定，以降低假陽性結果(即鑒定顯示樣品包含殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌抗體而其實際并不包含，或顯示其包含的殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌水平高于其實際水平的結果)的發生率和 /或程度。向這樣的鑒定中加入人fH可更精確地模擬人體內的情況，即fH與腦膜炎奈瑟球菌結合并抑制補體介導的細菌殺死作用，由此可能破壞人血清中可能存在的抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的殺菌活性。本發明的鑒定提供的額外優點在于，采用非人補體(例如大鼠或兔補體)進行這樣的鑒定，由此避免了采用人補體的需求。人補體來源價格昂貴，至少部分是由于這樣的鑒定需要人補體不含抗腦膜炎奈瑟球菌抗體，其可能增大假陽性結果的發生率。因此，利用關于分離的人fH可與非人補體因子協同發揮作用的發現，以提供對人免疫更為相關的反映和相比采用非人補體的常規鑒定方法價格更為低廉的鑒定。
本發明還利用了關于人fH可在非人補體存在時發揮作用的發現，以提供腦膜炎奈瑟球菌感染的非人動物模型。由于非人fH不與腦膜炎奈瑟球菌結合，因此非人fH不提供對補體介導殺死作用的抗性，消除了腦膜炎奈瑟球菌對非人動物的感染，由此破壞對提供感染的非人動物模型的嘗試。本發明的非人動物模型提供具有結合腦膜炎奈瑟球菌的 fH的非人動物。所述“結合腦膜炎奈瑟球菌的fH”指包含介導與腦膜炎奈瑟球菌結合的人 fH的氨基酸序列即人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列，對其更詳細的描述見下文。 因此，所述結合腦膜炎奈瑟球菌的fH可以是人fH，可通過以下方式提供在例如被動保護的體內小鼠或年幼大鼠模型中給予奈瑟球菌(例如腦膜炎奈瑟球菌)接種物(例如，采用胃腸外(如靜脈內、腹膜內)或鼻內刺激)之前、同時或之后給予人fH(例如胃腸外給藥，如靜脈內、腹膜內、皮下)；表達非人動物中存在的人fH編碼轉基因；“人源化”非人動物fH 編碼基因的SCR 6氨基酸序列；和/或表達來自非人動物中存在的轉基因的這樣的“人源化” fH。
對示例性實施方式更詳細的描述見下文。
H 因子(FHBP)多肽 “ H因子多肽”、“ H因子”、“補體因子H”、“ H因子蛋白”、“ fH”、“ fH蛋白”和“ fH多肽”在本文中可互換使用以指代調節補體途徑的多肽，其在包含人fH多肽的短同源重復結構域6(SCR6)時通過奈瑟球菌蛋白H因子結合蛋白(fHbp)與奈瑟球菌結合。在人中，H因子是補體激活作用調節子(RCA)基因簇的成員，編碼具有20個短同源重復序列(SCR)結構域的蛋白質。在體內，fH分泌到血流中，在調節補體激活中發揮作用，在清除細菌感染中具有特定作用。
“包含人短同源重復序列6 (SCR6)氨基酸序列的H因子(fH)多肽”指包含fH多肽氨基酸序列的多肽，其包含或經修飾包含具有人fH多肽的人SCR6氨基酸序列的短同源重復結構域6 (SCR6)。因此，“包含人SCR6氨基酸序列的fH多肽”包括完整的人fH多肽及其片段，以及包含操作性連接于非人fH氨基酸序列的人SCR6氨基酸序列的嵌合多肽，條件為所述多肽具有與奈瑟球菌(例如腦膜炎奈瑟球菌)H因子結合蛋白結合的活性。
術語“短同源重復結構域6”在本文中也稱為“短同源重復序列6”和“SCR6”，三者可互換使用，指在人H因子中將H因子的結合能力賦予奈瑟球菌fHbp的H因子多肽結構域。“人SCR6”指具有SEQ ID NO :1氨基酸序列的多肽(以及編碼這樣的多肽的核酸，從使用時的上下文不難理解)。圖7顯示黑猩猩(SEQ ID NO 2)、獼猴(SEQ ID NO 3)、大鼠 (SEQ IDNO 4)和小鼠(SEQ ID NO :5)SCR6的氨基酸序列。
可從任何合適的來源獲得適合用于本文所述方法的fH多肽。例如，所述fH多肽是人fH多肽時，可通過從天然產生所述多肽或經遺傳修飾產生所述多肽的來源(例如重組來源)分離獲得所述人fH多肽。
已知各種哺乳動物來源的編碼fH多肽的核酸，以及編碼的fH多肽的核酸序列和氨基酸序列。對人fH多肽及其編碼核酸的描述見例如GenBank登錄號NM_000186，對可變剪接多肽變體的描述見GenBank登錄號NM_001014975。其它示例性哺乳動物fH多肽(核酸和多肽序列)為本領域已知，包括但不限于小鼠(GenBank登錄號NM_009888)、大鼠、靈長動物(例如，黑猩猩、猴(例如獼猴))和綿羊(GenBank登錄號EU888587)。
可通過本領域可利用和已知的任何合適的方法改造包含人CSR6氨基酸序列的嵌合fH多肽。例如，可采用本領域眾所周知的重組方法用編碼人SCR6的核酸片段代替編碼非人哺乳動物fH多肽的核酸編碼序列。或者或此外，可通過定點突變修飾編碼序列來產生這樣的嵌合fH多肽，以編碼人SCR6的氨基酸殘基。其它可利用的技術包括對fH編碼DNA 進行核酸擴增，將擴增的序列或消化的片段克隆到含啟動子和PolyA尾的載體中以形成fH 編碼構建體。在適合的情況下可通過合成技術產生包括嵌合fH多肽在內的fH多肽。
可采用本領域眾所周知的標準蛋白質表達方法在體外或體內將核酸構建體表達為蛋白質，以產生包含人SCR6的嵌合多肽。也可將這樣的改造核酸構建體引入到非人動物的基因組中，以便表達為轉基因基因產物。
fH多肽的生產方法可包括任何合適的構建體和任何合適的宿主細胞，其可以是原核或真核細胞，通常為哺乳動物、細菌或酵母宿主細胞。將遺傳材料引入到宿主細胞中的方法包括例如，轉化、電穿孔、接合、磷酸鈣法等。可選擇轉移的方法以使引入的fH多肽編碼核酸穩定表達。可以可遺傳的游離元件(例如質粒)的形式提供這樣的核酸，或可對其進行基因組整合。
轉移感興趣核酸的合適載體的組成可不同。整合載體可以是條件性復制或自殺質粒、噬菌體等。所述構建體可包括各種元件，包括例如，啟動子、選擇性遺傳標記(例如，具有抗生素抗性的基因(例如，卡那霉素、紅霉素、氯霉素或慶大霉素))、復制起點(以促進在宿主細胞例如細菌宿主細胞中的復制)等。對載體的選擇取決于各種因素，如需要增殖的細胞類型和增殖的目的。某些載體可用于擴增和制備大量所需DNA序列。其它載體適合用于在培養物的細胞中進行表達。還有其它載體適合用于在整個動物的細胞中進行轉移和表達。對合適載體的選擇是本領域眾所周知的技術。很多這樣的載體可市售購得。
在一個實施方式中，所述載體是表達載體，其基于包含選擇性藥物抗性標記和提供在不同宿主細胞(例如在大腸桿菌(E.coli)和腦膜炎奈瑟球菌二者)中自主復制的元件的游離質粒。這樣的“穿梭載體”的一個例子是質粒PFPlO (Pagotto等Gene 2000244 13-19)。
可通過例如將感興趣的多核苷酸插入到構建體主鏈中，通過采用DNA連接酶連接到載體中切割的限制性酶位點來制備構建體。或者，可通過同源重組或位點特異性重組插入所需核苷酸序列。通常通過將同源區域與載體在所需核苷酸序列的側翼連接來完成同源重組，而通過采用促進位點特異性重組的序列(例如，Cre-l0X、att位點等)來完成位點特異性重組。可通過例如連接寡核苷酸或采用同時包含同源區域和所需核苷酸序列一部分的引物進行聚合酶鏈反應來加入包含這樣序列的核酸。
載體可在宿主細胞中保持處于染色體外，或可整合到宿主細胞基因組中。本領域技術人員眾所周知的大量出版物詳細描述了載體，所述出版物包括例如，《分子生物學簡明實驗方案》(Short Protocols in MolecularBiology)，(1999) F. Ausubel 等編，韋利&森斯出版公司(Wiley&Sons)。載體可表達編碼嵌合fHBP的核酸，可擴增所述對象核酸，或二者兼有。
可采用的示例性載體包括但不限于衍生自重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA的載體。例如，可采用質粒載體如pBR322、pUC 19/18、pUC118、119和M13mp系列載體。pET21 也是可采用的表達載體。噬菌體載體可包括AgtlO、AgtlU Agtl8-23、λ ZAP/R和EMBL 系列噬菌體載體。可利用的其它載體包括但不限于，pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、 pMCS、pNNL、pHSG274、C0S202、C0S203、pWE15、pffE16 和卡隆粒 9 系列載體。
就表達感興趣的fH多肽而言，可采用表達盒。因此，本發明提供包含對象核酸的重組表達載體。所述表達載體提供轉錄和翻譯調節序列，并可提供誘導型或組成型表達，其中在轉錄起始區以及轉錄和翻譯終止區的轉錄控制下操作性連接編碼區。這些控制區可以是天然產生的fH多肽先天具有的，或可衍生自外源。通常，所述轉錄和翻譯調節序列可包括但不限于，啟動子序列、核糖體結合序列、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或激活物序列。啟動子可以是組成型或誘導型，并可以是強組成型啟動子(例如 T7 等)。
表達載體通常具有位于啟動子序列附近的方便的限制性位點，以便插入編碼感興趣蛋白質的核酸序列。可存在在表達宿主中可操作的選擇性標記以促進對包含所述載體的細胞進行選擇。此外，所述表達構建體可包含其它元件。例如，所述表達載體可具有一個或多個復制系統，由此使其能保持于用于表達的生物例如哺乳動物或昆蟲細胞中和用于克隆和擴增的原核宿主中。此外，所述表達構建體可包含選擇性標記基因以允許對轉化的宿主細胞進行選擇。選擇基因在本領域中眾所周知，隨采用的宿主細胞而變化。
應注意，重組fH多肽可包含其它元件，如可檢測標記，例如，放射性標記、熒光標記、生物素標記和免疫可檢測標記(例如，HA標簽、多組氨酸標簽)等。可提供這樣的其它元件以促進通過各種方法(例如親和捕獲等)進行分離(例如，生物素標簽、免疫可檢測標簽)。
可根據本領域已知的方法完成對感興趣多肽的分離和純化。例如，可通過免疫親和純化從經遺傳修飾表達fH多肽的細胞的裂解物分離fH多肽，其通常包括使所述樣品接觸抗fH多肽抗體，洗滌以去除非特異性結合的材料，洗脫特異性結合的fH多肽。可通過透析和其它通常用于蛋白質純化的方法來進一步純化分離的fH多肽。可提供純化的fH多肽， 使所述多肽存在于基本不含其它表達多肽的組合物中，例如，所述組合物少于90%、通常少于60 %、更通常少于50 %的部分由其它表達多肽組成。
殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的檢測鑒定 如上所述，本發明提供檢測樣品中殺菌性抗奈瑟球菌抗體的方法和組合物。采用包含人短同源重復序列6 (SCR6)氨基酸序列的分離的H因子多肽和非人補體來提供評價抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的補體介導殺死作用的鑒定。這樣的鑒定可降低假陽性結果(即鑒定顯示樣品包含殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌抗體而其實際并不包含，或顯示樣品包含的殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌水平高于其實際水平的結果)的發生率和/或程度。向這樣的鑒定中加入包含人SCR6的分離的H因子多肽相比傳統鑒定可更精確地模擬人體內的情況，因為人fH 的SCR6結構域與腦膜炎奈瑟球菌結合并抑制補體介導的細菌殺死作用，由此可能破壞可能存在于人血清中的抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的殺菌活性。本發明的鑒定提供的額外優點在于，采用非人補體(例如大鼠或兔補體)進行這樣的鑒定，由此避免了采用人補體的需求。 因此，利用關于人fH可與非人補體因子協同發揮作用的發現，以提供相比采用人補體的常規鑒定方法更精確、價格更低廉的鑒定。
所述方法通常包括將疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品、包含人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子多肽、非人補體和奈瑟球菌在反應混合物中混合，評價奈瑟球菌的生存力，其中所述樣品存在下的奈瑟球菌生存力減小表示所述樣品包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體。
人fH或包含人短同源重復序列(SCR 6)氨基酸序列的分離的H因子多肽也可用于采用非人補體評價抗奈瑟球菌抗體的調理吞噬(opsonophagocytic)活性。調理吞噬作用鑒定通常包括將疑似包含調理吞噬性抗奈瑟球菌抗體的樣品、作為吞噬作用效應細胞的外周血單核白細胞或在組織培養物中生長的單核細胞細胞系、包含人短同源重復序列 6(SCR6)的氨基酸序列的分離的H因子多肽、非免疫非人補體和奈瑟球菌在反應混合物中混合，評價奈瑟球菌的生存力，其中所述樣品存在下的奈瑟球菌生存力減小表示所述樣品包含調理吞噬性抗奈瑟球菌抗體。對測試樣品(即對調理吞噬性抗奈瑟球菌抗體的存在接受評價的樣品)進行熱失活以去除任何內部補體活性。對測定調理吞噬活性的鑒定及其在評價抗奈瑟球菌抗體中的應用的描述見Plested J. S.和Granoff D. M. , Clin Vaccine Immunol2008,15(5) :799-804 和 GranoffDM，Vaccine, 2009 ( “補體介導的殺菌和調理活性對腦膜炎疾病保護作用的相對重要性(Relative importance ofcomplement-mediated bactericidal and opsonic activity for protection againstmeningococcal disease) ” Doi :10. 1016/j. vaccine. 2009. 04. 066)。
樣品 可鑒定疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的任何樣品，例如從對象(例如，血液或血液成分(例如血清)、粘膜分泌物、組織等)、從細胞培養物(例如從抗體分泌細胞(例如雜交瘤)的上清液)獲得的生物樣品。所述血清樣品可用緩沖液例如杜貝克(Dulbecco) 緩沖液稀釋，并可作為系列稀釋物進行測試以促進對抗體效價的評價。通常，所述樣品可能包含補體(例如在血清樣品中的情況)時，例如通過加熱(例如在56°C進行約30分鐘)處理所述樣品以使內源補體失活。樣品在使用前可以是新鮮的或冷凍的。評價樣品以確定疫苗引發殺菌性抗奈瑟球菌抗體的有效性時，可在免疫對象之前和之后獲得所述樣品。
非人補體 用于所述鑒定的非人補體可來自任何合適的來源，通常為哺乳動物來源。補體的示例性來源包括兔類動物(例如兔)、嚙齒動物(大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠等)、有蹄類動物 (例如，牛、綿羊、山羊、豬)和非人靈長動物(猴、猿、黑猩猩)，可以是年幼動物(例如，幼兔、年幼大鼠等)。非人補體可市售購得，或可根據本領域已知方法很容易地從血清獲得。所述非人補體通常不包含或經處理而不包含可檢測的殺菌活性。這可通過例如采用來自年幼動物的血清或處理來自年老動物的非人血清以在用于鑒定之前消除抗體(例如采用抗IgG 親和柱)來完成。作為對照的樣品在鑒定中非人補體的量可不同，或可提供與各測試樣品 (例如作為標準)中幾乎相同的量。例如，所述反應混合物可在血清中包含約10%-25% (體積/體積)非人補體。
可向反應混合物中加入不同量的非人補體，以提供具有不同已知量的非人補體的反應樣品。可平行鑒定這樣的樣品以促進對殺菌性抗體效價的檢測。
奈瑟球菌 任何合適的奈瑟球菌，特別是表達表面fHbp的奈瑟球菌均可用作本文所述鑒定中檢測殺菌性抗體的靶細菌。這樣的奈瑟球菌包括腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌。可根據待鑒定的殺菌性抗體的特異性選擇所述靶細菌。例如，所述鑒定用來提供對殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的檢測時，所述靶細菌可以是任何合適的腦膜炎奈瑟球菌，例如，群A、B、 C、X、Y或W-135，或感興趣的任何其它莢膜群的腦膜炎奈瑟球菌、表達特定感興趣的抗原的腦膜炎奈瑟球菌菌株(例如，v. 1、v. 2或v. 3fHbp，包括fHbp亞變體，PorA型等)。所述鑒定可與經遺傳修飾而表達感興趣的抗原的奈瑟球菌聯用。例如，可選擇所述靶細菌以促進對用疫苗免疫之后殺菌性抗奈瑟球菌抗體的產生進行分析。
在用于鑒定之前，可通過本領域已知方法，例如在肉湯(例如穆勒-辛頓 (Mueller-Hinton)肉湯)中或在瓊脂平板(例如巧克力瓊脂平板)上培養所述靶細菌。如果在瓊脂平板上培養，從所述瓊脂平板上去除所述細菌并將其重懸浮。如果在液體肉湯中培養，可離心所述細菌并將其重懸浮。通常提供所需細胞數量的細菌，并可提供細胞數量不同的樣品作為對照。例如，可以約IO5-IO8集落生成單位(CFU)/ml，通常為約切IO7CFU/ml的細胞密度重懸浮細菌。可選擇重懸浮溶液以可與檢測鑒定相容使用，所述溶液例如緩沖液，通常為補充有MgCl2和CaCl2 WHBSS(漢克斯堿性鹽溶液(Hanks Basic Salt Solution))或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
在用于鑒定之前，可洗滌所述細菌一次或多次以去除配培養肉湯的組分。例如，可用緩沖液(例如包含牛血清白蛋白)和/或用熱失活血清(例如消除IgG，例如以使包含的 IgG不可檢測)洗滌所述細菌。洗滌通常包括將所述細菌重懸浮在溶液中，通過離心沉淀所述細菌細胞，例如用反應混合物緩沖液重懸浮所述細菌以便用于鑒定。
fH多月太 本文所述的具有人SCR6氨基酸序列的任何合適的fH多肽均可用于所述鑒定。特別感興趣的是采用完整的人fH多肽和其保持與fHbp結合和調節補體級聯系統的活性的片段。包括SCR6在內的H因子若干結構域的晶體結構已被破解，可為產生感興趣的片段提供指導。可向反應混合物中加入任何合適量例如約5-6μ g/ml、10y g/ml、12y g/ml、20y g/ ml,25 μ g/ml、50 μ g/ml或更多的fH多肽。采用的量根據反應混合物是否包含鈣螯合劑而變化(例如，以檢測獨立于補體活性經典途徑的替代途徑)。
反應混合物 通過將鑒定試劑(包含含人SCR6氨基酸序列的分離的H因子多肽和非人補體)、 奈瑟球菌和測試樣品以任何合適的順序混合來制備所述鑒定的反應混合物。可通過將這些組分在任何合適的容器，如試管、平板孔或毛細管中混合來產生所述反應混合物。通常用緩沖液，特別是生理相容性緩沖液例如PBS或本文示例的其它合適的緩沖液懸浮所述反應混合物。所述反應混合物的反應體積可不同，通常為數微升到數毫升(例如， οομ 1、500μ 1、 Iml等)。可提供在反應混合物中具有不同稀釋度例如1 2、1 4、1 6、1 8、1 10、 1 12、1 14、1 16、1 18、1 20、1 22、1 24或更大以及類似稀釋度的樣品，，其中感興趣的是14和更大的稀釋度。
在適合補體介導的殺菌性抗體活性的條件下培育所述反應混合物。例如，可將所述反應混合物在合適的溫度(例如環境溫度或生理學相關溫度(例如約37°C ))下培育一段時間，所述時間足以產生補體介導的殺菌性抗體活性(例如，約15分鐘-90分鐘、約30 分鐘-90分鐘等)。除測試樣品以外，可提供對照樣品。這樣的對照樣品可包括陰性對照樣品(例如與測試樣品條件平行但不加生物樣品、不加fH、不加非人補體或加入殺菌活性不可檢測的抗體的樣品)和/或陽性對照樣品(例如與測試樣品條件平行但加入對靶細菌具有已知殺菌活性的抗體的樣品)。
檢測 用測試樣品培育之后，通過評價反應混合物中奈瑟球菌的生存力來檢測存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體。這可通過例如以下步驟完成將所述反應混合物接種在合適的培養基(例如瓊脂平板)上，評價集落生成單位，在肉湯中培養所述反應混合物，通過細胞密度、FACS(參見例如，Mountzouros等“在群B腦膜炎奈瑟球菌的基于熒光的血清殺菌鑒定中檢測補體介導的抗體依賴性殺菌活性(Detection of Complement MediatedAntibody-Dependent Bactericidal Activity in a Fluorescence-Based SerumBactericidal Assay for Group B Neisseria meningitidis)” (2000)J. Clin. Microbiol. 38 :2878-2884)等評價細菌的生長情況(例如通過分光光度吸收)。將殺菌效價定義為觀察到活奈瑟球菌減少(例如每毫升CFU降低)時的血清稀釋度，通常為與在零時間(或60分鐘之后或在陰性對照血清中培育)的對照相比引起生存力下降50%或90% (例如每毫升CFU降低50%)的稀釋度。結果也可描述為與零時間的存活率相比的50%存活率。
本領域普通技術人員應理解，需要使對照反應混合物與實驗反應混合物的實驗平行進行。例如，可將包含已知殺菌性抗體效價(從低到高)的樣品作為陽性對照進行鑒定。 此外，應進行不加樣品的反應混合物以及不加非人補體的反應混合物的實驗。也可平行進行包含非人fH多肽代替包含人SCR6氨基酸序列的H因子多肽的反應混合物的實驗，以確認包含人SCR6氨基酸序列的H因子(fH)多肽會減弱補體介導的對奈瑟球菌的毒性。
試劑盒 本發明還提供用于本文所述鑒定的試劑盒。這樣的試劑盒可包含例如，具有人 CSR6氨基酸序列的fH多肽(例如人fH多肽)、非人補體并任選包含靶奈瑟球菌。可用獨立的小瓶提供所述試劑，或至少可用單個小瓶提供fH多肽和非人補體。所述試劑盒可任選包含用于上述對照鑒定的試劑。
除上述組分以外，所述試劑盒還可包括使用試劑盒組分實施本文所述鑒定的說明書。所述說明書通常記錄在合適的記錄媒介上。例如，所述說明書可印刷在基材如紙或塑料等上。同樣地，所述說明書在試劑盒中可作為包裝插入物存在、處于試劑盒或其組分的容器標簽(即與包裝或分裝相關)中等。可在存在于合適的計算機可讀存儲介質例如⑶-ROM、 磁盤等上的電子存儲數據文件上提供所述說明書。在一些實施方式中，試劑盒中不存在實際的說明書，但提供從遠程來源例如經互聯網獲得說明書的手段。該實施方式的一個例子是包括網絡地址的試劑盒，可從所述網絡地址瀏覽說明書且/或可從所述網絡地址下載說明書。就說明書而言，獲得說明書的手段記錄在合適的基材上。
除說明書以外，所述試劑盒還包含一個或多個對照試劑混合物，例如，具有已知的針對奈瑟球菌的補體介導殺菌活性的抗體(殺菌活性為陽性或殺菌活性不可檢測)等。
非人動物模型 如上所述，本發明還利用了關于人fH可在非人補體存在時發揮作用的發現，以提供腦膜炎奈瑟球菌感染的非人動物模型。由于非人fH不與腦膜炎奈瑟球菌發生可檢測或顯著的結合，因此非人fH不提供對補體介導殺死作用的抗性，消除了腦膜炎奈瑟球菌對非人動物的感染，由此破壞對提供感染的非人動物模型的嘗試。
本發明的非人動物模型提供具有結合腦膜炎奈瑟球菌的fH的非人動物。所述“結合腦膜炎奈瑟球菌的fH”指包含介導與腦膜炎奈瑟球菌結合的人fH的氨基酸序列即人短同源重復結構域6(SCR 6)的氨基酸序列，對其更為詳細的描述見下文。因此，所述結合腦膜炎奈瑟球菌的fH可以是人fH，可通過給予fH(例如靜脈內給藥)，從非人動物中存在的人fH編碼核酸序列進行表達，或表達經“人源化”包含代替內源SCR6結構域或除內源SCR6 結構域以外的編碼人SCR6結構域的序列的非人fH編碼核酸來提供。可采用以上討論的任何合適的技術獲得人fH編碼核酸以及嵌合fH多肽編碼核酸用于在非人動物中表達。
轉基因動物 產生經修飾表達fH多肽的轉基因動物的方法在本領域中眾所周知。示例性方法包括在以下出版物、專利和文獻中描述的方法《轉基因動物的產生和應用》(TransgenicAnimal Generation and Use) L. Μ· Houdebine,哈伍德學術出版社(Harwood Academic Press) 1997 ;《轉基因技術原理禾口方法》(Transgenesis Techniques =Principles and Protocols)D. Murphy 和 D. A. Carter 編(1993 年 6 月)胡馬納出版社(Humana Press)； 《轉基因動物技術實驗手冊》(Transgenic Animal Technology :A LaboratoryHandbook) C. A. Pinkert編(1994年1月)學術出版社(Academic Press)《轉基因動物》(Transgenic Animals) F. Grosveld 和 G Kollias 編(1992 年 7 月)學術出版社(Academic Press)和《胚胎干細胞將計劃的改變引入動物種系》(Embryonal Stem Cells =Introducing Planned Changes into theAnimal Germline)M. L. Hooper (1993 年 1 月)戈登和布里奇科學出版社 (Gordon&Breach Science Pub)；美國專利第 6，344，596 號、美國專利第 6，271，436 號、美國專利第 6，218，596 號和美國專利第 6，204, 431 號；Maga 和 Murray (1995)Bio/technol. 13 1452-1457 ；Ebert 等(1991)Bio/Technol. 9 :835-838 ；Velander 等(1992)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :12003-12007；Wright 等(1991)Bio/technol。
也可通過核轉移或克隆方法采用胚胎或成體細胞系產生轉基因動物，如例如 Campbell 等(1996) Nature 380 :64-66 和 Wilmut 等(1997) Nature385 :810-813 中所述。可采用胞質注射DNA，如美國專利第5，523，222號所述。可通過引入包含硬脂酰輔酶A去飽和酶編碼序列的構建體獲得對象轉基因動物。
轉基因動物還包括體細胞轉基因動物，例如體細胞(而非生殖系細胞)中包含轉基因的轉基因動物。例如，用硬脂酰輔酶A去飽和酶轉基因轉化動物的乳腺細胞，轉基因在所述動物的乳腺細胞中表達。本領域中描述了體細胞轉化的方法。參見例如Furth等 (1995)Mol. Biotechnol. 4 :121_127。
可采用本發明的方法和系統對基因組易于修飾的任何非人動物進行遺傳修飾以產生轉基因動物。所述非人動物可以是脊椎動物或無脊椎動物，可以是哺乳動物或非哺乳動物(例如鳥類(例如雞))。示例性非人哺乳動物對象包括但不一定限于非人靈長動物 (猴、猿、黑猩猩)、嚙齒動物(大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠等)、兔類動物(例如兔)和有蹄類動物(例如，牛、綿羊、山羊、豬)。術語“有蹄類動物”用來表示豬、牛、綿羊和山羊的任何種或亞種。
可采用本領域眾所周知的克隆方法對經“人源化”包含用于在非人動物中表達的編碼人SCR6結構域的序列的非人fH編碼核酸序列進行改造。例如，改造小鼠fH編碼核酸序列，使其包含編碼人SCR6結構域而非小鼠SCR6的序列，可采用限制性消化酶將編碼小鼠 SCR6多肽的核酸序列從小鼠fH的⑶S (注釋于Genbank登陸號NM_009888)中去除，并采用連接酶用編碼人SCR6多肽的核酸序列代替。
為在非人動物中表達而改造的核酸序列可設有操作性連接以調節其表達的序列如啟動予序列。本文所述實施方式的核酸序列可經改造而包含本領域已知各種啟動子中的任何一種以調節所述核酸序列的表達。例如，可改造所述核酸序列使核酸序列表達受fH啟動子、組織特異性或細胞特異性啟動子、由信號傳導途徑例如雌激素受體激活作用或藥物例如四環素調節的啟動子的調節。
可將人fH編碼核酸序列或經人源化包含編碼人SCR6結構域的序列的嵌合fH編碼核酸序列引入非人動物的基因組中，使其在非人動物宿主中從與編碼內源fH多肽的基因分離的基因組進行表達。這樣的一個例子是轉基因小鼠模型，其中向發育的囊胚提供編碼感興趣序列的改造DNA，并允許其隨機插入到囊胚細胞的DNA中。這樣的另一個例子是通過感染例如腺病毒或慢病毒感染提供DNA的動物，可在胚胎發育、出生后發育過程中或成體中進行。
或者，可將改造的核酸序列引入基因組中，使其由基因組從特定的基因座例如以所需方式調節的基因座編碼，目的是限制轉基因的表達或用轉基因代替內源基因，如“敲入”轉基因動物的情況。可通過將編碼感興趣序列的改造核酸序列引入胚胎干(EQ細胞來產生這樣的敲入轉基因動物，然后對其進行篩選以鑒定改造DNA已代替基因組內源序列的細胞。然后向所述ES細胞注射囊胚細胞或與囊胚細胞混合，以有利于發育的動物。通常， 對引入以產生這樣的動物的核酸進行改造，使所述核酸序列受其所代替基因的啟動子的調節。本領域眾所周知，在這樣的情況中，不需要改造的核酸序列包含完整的非人fH，其中換入引入編碼人SCR6的序列以代替非人SCR6 ；而可采用直接側接SCR6的非人fH結構域。
通過給予fH多肽產生的非人動物模型 本發明還提供用作奈瑟球菌感染模型的非人動物，其中將fH多肽(例如，人fH多肽或具有人SCR6氨基酸序列的其它fH多肽)從外源引入非人動物的血流中。例如，可通過輸注將所述fH多肽引入血流中以使血流中的fH多肽水平模擬人中發現的水平。
使用方法 非人動物模型可用于以下示例的各種背景中。通常，所述非人動物模型可用來測試候選疫苗引發殺菌性抗奈瑟球菌抗體(例如抗腦膜炎奈瑟球菌抗體)的功效。在給予候選試劑之前或之后感染非人動物模型時，所述模型可用于評價候選試劑(例如，候選抗生素、候選疫苗試劑)降低非人動物中細菌接種量的能力。
通常，用感興趣的奈瑟球菌(例如，腦膜炎奈瑟球菌菌株、淋病奈瑟球菌菌株)接種非人動物模型。從培養物(例如從肉湯培養物)中取出細菌時，通常在如上所述給藥之前洗滌所述細菌。接種物的密度可不同，例如，約102-109CFU/ml、約104_107CFU/ml、約 105-106CFU/ml 等。
篩選鑒定 可通過向本文所述的非人動物模型給藥來篩選各種候選試劑中的任何一種。例如，所述動物模型可用來鑒定例如抑制或防止奈瑟球菌(例如腦膜炎奈瑟球菌)感染、復制或其引起疾病癥狀的候選試劑。
“候選試劑”用來包括合成、天然產生或重組產生的分子(例如，小分子、藥物、多肽、抗體(包括抗原結合抗體片段，例如以提供被動免疫)或其它免疫治療試劑，真核或原核細胞中存在的內源因子(例如，多肽、植物提取物等)等)。
本文所述的非人動物模型可用來評價用奈瑟球菌抗原免疫的人或非人動物中產生的抗奈瑟球菌抗體提供的被動免疫。本文所述的非人動物模型也可用于測試針對表達低水平fHbp的奈瑟球菌菌株的被動保護作用。例如，某些奈瑟球菌菌株如群C菌株4343可侵入年幼大鼠的血液并在其中復制(ffelsch JA和GranoffDM，Infect Immun.，2004，72 (10) 5903-9)。這些菌株還可在非免疫人血清中存活，與其結合的fH不可檢測(Welsch JA等 J. Infect. Dis. ,2008,197(7) :1053-61)。這樣的菌株傾向于表達低水平的fHbp。然而， 低fHbp表達子菌株的fHbp對所述菌株在人血液和人血清中的存活率具有重要作用Geib KL, Infect. Immun. 2009,77(1) :292-299)。因此，所述非人動物模型可用于評價甚至針對fH低表達子的被動免疫。
候選試劑包括多種類型的分子和大量化學類別，例如，多肽、核酸、有機分子(例如分子量大于50且小于約2500道爾頓的小有機化合物)。可從各種來源包括合成或天然化合物文庫獲得候選試劑。
篩選候選抗奈瑟球菌試劑 可鑒定候選試劑以評價例如所述候選試劑降低細菌接種量、促進抗奈瑟球菌抗體產生等方面的能力。通常，將所述候選試劑給予動物模型，評價候選試劑相對于對照(例如，相對于未感染動物、相對于用抗菌作用已知的試劑處理的感染動物等)的作用。例如， 可將所述候選試劑給予腦膜炎奈瑟球菌感染的動物模型，將受處理動物的細菌效價與處理之前和/或對照、未處理動物的細菌效價進行比較。通常，可檢測到用候選試劑處理之后感染動物細菌效價顯著降低，這指示所述試劑的抗菌活性。
可以任何所需的和/或適合遞送所述試劑的方式給予所述候選試劑，以實現所需結果。例如，可通過注射(例如，靜脈內、肌內、皮下或直接注射到需要達到所需效果的組織中)、口服或任何其它所需手段給予所述候選試劑。體內篩選通常包括接受不同量和濃度的候選試劑(從無試劑到用量達到可成功遞送到動物的上限量的試劑)的大量動物，并可包括以不同制劑和途徑遞送所述試劑。所述試劑可單獨給藥或與兩種或更多種試劑聯合給藥，特別是在試劑聯合給藥可產生協同作用時。
可通過各種方式評價所述候選試劑的活性。例如，用奈瑟球菌感染宿主動物時，可通過檢測血清樣品存在病原體(例如細菌效價)或與病原體存在相關的標記物(例如病原體特異性蛋白質或編碼核酸等)來評價所述試劑的作用。檢測和評價細菌感染的存在和/ 或嚴重程度的定性和定量方法在本領域中眾所周知。在一個實施方式中，可通過檢測血清樣品和/或組織切片存在細菌來評價針對奈瑟球菌感染的試劑活性。
如之前所述，所述候選試劑可以是來自用奈瑟球菌抗原免疫的人或非人動物的測試血清，可鑒定所述測試血清賦予針對奈瑟球菌被動免疫的能力。可將所述測試血清給予所述非人動物模型。可將陰性對照血清如來自非免疫動物的血清或從免疫前動物獲得的血清給予非人動物模型作為陰性對照。可通過如上所述的各種方式評價所述測試血清賦予的被動免疫。對評價針對奈瑟球菌的被動免疫的方法的描述見例如，Welsch JA等(J. Infect. Dis.，2003，188(11) :1730-40)，Vu DM 等(J. Infect.Dis.，2006，193(6) :821-8)。
疫苗開發 本文所述動物模型還可用來對候選疫苗防止或改善奈瑟球菌感染的能力進行篩選。通常，“疫苗”是在給予之后促進宿主獲得針對靶病原體的免疫應答的試劑。引發的體液、細胞或體液/細胞免疫應答可促進對疫苗針對的病原體感染的抑制作用。特別感興趣的是引發抑制奈瑟球菌，例如腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌感染和/或復制的保護性免疫應答的預防疫苗。同樣感興趣的還有提供針對例如殺菌性抗奈瑟球菌抗體產生引起的刺激的保護作用的治療疫苗。
可通過例如在用奈瑟球菌接種之前給予候選試劑來完成對候選疫苗的篩選。可通過快速灌注方式(例如，腹膜內或肌內注射)，并可在之后任選地進行一次或多次加強免疫來給予所述候選試劑。可通過檢測抗體應答例如采用常規鑒定或本文所述鑒定來評價對免疫應答的誘導作用。可用奈瑟球菌刺激免疫動物，然后觀察所述免疫動物和所需非免疫對照動物(如果有)的感染發展，評價感染的嚴重程度(例如通過評價存在的奈瑟球菌效價)。將使感染顯著降低和/或殺菌性抗奈瑟球菌抗體顯著增加的疫苗候選物鑒定為活疫苗。
實施例 提供以下實施例以進一步說明本發明的優點和特征，并不用來限制本發明的范圍。盡管它們是可能采用的典型實施例，但可代替采用本領域技術人員已知的其它方案、方法或技術。
材料和方法 細菌菌株 將腦膜炎奈瑟球菌群C菌株4243用于采用幼兔補體測定免疫人(接種疫苗者)血清的殺菌活性。之前已對該菌株的特征進行了鑒定(Harris，S. L.等OOOiBnnfect Immun 71:275-286 ；D. M.等(2005)Vaccine 23 :4307-4314 ；ffelsch,J. Α.等(2004)Infect Immun 72 :5903-5909 ；Granoff, D. Μ.等(2005) Pediatr Infect Dis J 24:132-136)。所述測試菌株包括三個腦膜炎奈瑟球菌群B菌株H44/76、Cu385和NZ98/2M，所述三個菌株已用于制備顯示對人有效的外膜囊泡(OMV)疫苗(Sierra, G. V.等(1991) NIPHAnn 14 :195-207和 208-110 ；Bjune,G.等(1991)Lancet 338 :1093-1096 ；Kelly,C.等(2007)Am J Epidemiol 166 :817-823)。各菌株還廣泛用于測定接種疫苗的人中的腦膜炎球菌血清殺菌性抗體應答(Tappero, J. W.等(1999)Jama281 :1520-1527 ；Perkins, B. Α.等(1998)J Infect Dis 177 :683-691 ；Μ.等(1999)Vaccine 17:2377-2383；Wong, S.等(2007)Pediatr Infect Dis J26 :345-350 ；ffedege,E.等(2007)Clin Vaccine Immunol 14 :830-838 ；Sandbu，S.等 (2007)Clin Vaccine Immunol 14 :1062-1069 ；0ster,P. ^ (2007)Vaccine25 :3075-3079 ； Thornton, V. ^ (2006) Vaccine 24:1395—1400)。測試年幼大鼠血清中所述三個群B菌株的存活率。此外，選擇三個菌株之一的H44/76來檢測給予人fH后年幼大鼠血流中的生物存活率。在之前的研究中，該菌株用于年幼大鼠菌血癥模型中以測定OMV疫苗引發抗體的被動保護活性(Toropainen, M.等(1999)Vaccine 17 :2677-2689 ；Toropainen, M.等 (2005)Vaccine 23 :4821-4833 ；Toropainen, Μ. φ (2005)Infect Immun 73 :4694-4703 ； Toropainen, Μ.等(2001)Microb Pathog 30:139—148)。
菌株4243的血清型(PorB)、血清亞型(PorA)和序列型(ST)分別是2a、Pl. 5，2 和ST-11。菌株H44/76的相應類別是15、Pl. 7，16和ST-32，菌株Cu385的相應類別是4， 7P1. 19，15 和 ST-33，菌株 NZ98/254 的相應類別是 4、P1. 4 和 ST-42。菌株 H44/76 和 Cu385 是變體1群中H因子結合蛋白(fHbp)的高表達子，具有與菌株MC58相同的fHbp氨基酸序列(Masignani, V.等(2003) J Exp Med 197:789-799)。菌株 4243 和 NZ98/254 表達較低量的變體1群中的亞變體fHbp (與菌株MC58的fHbp的氨基酸相同性具有< 12%的差異) (Welsch, J.A.等(2004)J Immunol172 :5606-5615；ffelsch, J. A.等(2008)J Infect Dis 197 :1053-1061)。
血清樣品 可從之前的研究獲得在對用四價腦膜炎球菌多糖免疫的4-5歲兒童接種疫苗之前和一個月之后立即獲得的冷凍血清，或來自用群C腦膜炎球菌寡糖-CRM197偶聯疫苗免疫的成人的血清(King, W. J.等(1996) J Pediatrl28 :196-202 ；Vu, D. Μ.等(2006) Clin Vaccine Immunol 13:605-610)。在本研究中，根據各體積血清的可用性選擇來自69名兒童和11名成人的方便血清樣品進行鑒定。
靈長動物fH與腦膜炎奈瑟球菌的結合 從市場供應商(紐約希克威爾的生物改造公司(Bioreclamation，Hicksville， NY))獲得黑猩猩、獼猴和狒狒的補體。從10名健康的成人志愿者獲得人血清(fH結合的陽性對照)并進行合并。將該鑒定所用的所有血清在56°C加熱30分鐘以防止補體激活和 C3b與細菌結合，從而可作為fH結合的另外配體。如之前采用也與靈長動物fH結合的多克隆抗人fH的淋病奈瑟球菌的情況所述，通過Western印跡測定黑猩猩、獼猴和狒狒的fH 與菌株H44/76的結合。在用各血清分別培育所述細菌之后，洗滌、溶解所述細菌，并通過 SDS-PAGE進行分析。通過Western印跡檢測fH。
大鼠和兔血清對人H因子與腦膜炎奈瑟球菌結合的抑制作用 因為僅有多克隆抗人fH可作為測定fH與細菌直接結合的手段，所述試劑不與來自非靈長動物如大鼠或兔的fH交叉反應，因此非靈長動物fH與腦膜炎奈瑟球菌的結合不可直接測定。而是通過流式細胞術測定大鼠或兔血清抑制人fH與腦膜炎奈瑟球菌結合的能力。簡單而言，將大鼠或兔血清和對照人血清在56°C加熱30分鐘以防止C3b與細菌結合。血清熱失活不影響補體抑制功能或fH的結合性質(JarVa，H.等000 J Immunol 168 1886-1894 ；Ram,S.等(1998)J Exp Med 188 :671-680)。
在生長6-8小時后從巧克力瓊脂平板收獲腦膜炎奈瑟球菌菌株H44/76，將其懸浮在包含ImM CaCljP ImM MgCl2 (HBSS2+)的漢克斯堿性鹽溶液(HBSQ中，達到約切IO7CFU/ ml。用40 μ 1熱失活的人、大鼠或兔血清將所述細菌懸浮液以100 μ 1反應體積在37°C培育10分鐘，之后加入5 μ g生物素化的人H因子(根據制造商的說明書，采用NHS-LC-生物素(皮爾斯公司(Pierce))以20 1的生物素fH摩爾比進行生物素化反應)。將所述反應混合物(最終體積ΙΙΟμΙ)再培育15分鐘，之后通過流式細胞術采用抗生物素蛋白 (Extravidin)-FITC(西格瑪公司(Sigma))在1 100稀釋度下檢測結合的生物素化人fH。
異源C3在腦膜炎奈瑟球菌上的沉積和人fH的抑制作用 測定大鼠C3在用年幼大鼠血清培育(終濃度10% (體積/體積(ν/ν)))的菌株Η44/76和ΝΖ98/2Μ上的沉積。通過流式細胞術Q4)采用偶聯FITC的抗大鼠C3測定結合細菌的大鼠C3。采用流式細胞術，通過增大加入年幼大鼠血清的人fH濃度(范圍為 0-50 μ g/ml)來評價人fH限制大鼠C3在菌株H44/76上沉積的能力，之后用5 X IO7細菌培育血清(終濃度20% )和fH的混合物。在一些實施方式中，向所述大鼠血清中加入EGTA 和MgCl2 (二者終濃度均達到IOmM)以阻斷補體的經典和凝集素途徑并選擇性地允許替代途徑激活。采用酵母聚糖作為補體替代途徑完整性的對照，其為補體替代途徑的有效激活物(Fearon，D. T.等(1977) Proc NatlAcadSci U SA74 :1683-1687)。將酵母聚糖(西格瑪公司)懸浮在PBS中，使濃度達到10mg/ml。將10 μ 1該懸浮液加入如上所述的包含人fH 的年幼大鼠血清中，最終反應體積為50μ 1。
年幼大鼠血清中腦膜炎奈瑟球菌的存活率 根據所述菌株，在9-20只年幼大鼠的血清中測試腦膜炎奈瑟球菌的存活率。通過對6窩幼崽進行心臟穿刺獲得所述血清，將其儲存在-70°C以維持內源補體。使用于鑒定的細菌在補充有0. 25%葡萄糖(重量/體積(wt/vol))和0.02mM胞苷-5，- 一磷-N-乙酰神經氨酸(密蘇里州圣路易斯的西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich Co. , St. Louis, MO))的穆勒-辛頓肉湯(新澤西州富蘭克林拉克斯的BD公司(BD, Franklin Lakes, NJ)) 中生長約2小時(A62tlnm達到約0.6)到對數期。如上所述在別處洗滌所述細菌(52)并將其重懸浮于包含0. 9mM Ca2+(CaCl2x2H20)和0. 5mM Mg2+(MgCl2x6H20)的杜貝克磷酸鹽緩沖鹽水 (DPBS，弗吉尼亞州赫恩頓的密迪亞泰克公司(Mediatech，Herndon，VA))和(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA科恩組分V(Cohn Fraction V)，德克薩斯州科爾威爾的艾奇泰克生物公司 (Equitech-Bio, Inc. ,Kerrville, TX)) (DPBS/Ca2+/Mg2+-1 % BSA)中。最終的 40 μ 1 反應混合物包含約400CFU細菌，20 %、40 %或60 %血清和0_50 μ g/ml純化的人fH (德克薩斯州泰勒的補體技術公司(ComplementTechnologies, Inc.，Tyler, TX))。通過將培育60分鐘之后存在的各CFU/ml與陰性對照反應中在零時間的CFU/ml分別進行比較來確定各反應混合物中細菌的存活率百分數。陰性對照包含細菌和來自非免疫成人的不具有針對任何測試菌株的內源殺菌活性的20%或40%血清，其通常在37°C培育60分鐘之后可產生大于150% 的存活率。
補體介導的血清殺菌活性 對對數期經洗滌的生物測定群C殺菌效價，所述生長的生物已經過洗滌，如上所述被重懸浮于DPBS/Ca27Mg2+-l% BSA中，以便進行年幼大鼠血清中腦膜炎奈瑟球菌的存活率實驗。補體來源是20%合并的幼兔血清代替非免疫人血清。所述兔血清合并物(阿肯色州羅杰斯的佩爾-弗里茲公司(Pel-Freeze，Rogers, Arkansas))未顯示出可檢測的殺菌活性(與零時間的CFU/ml相比，在1小時培育過程中，20%或40%血清中測試菌株CFU/ml 的增長大于150%). 年幼大鼠中的菌血癥 獲得懷孕的遠系繁殖維斯達大鼠(密歇根州波蒂奇的查爾斯河公司(Charles River, Portage, MI))，在出生后4_6天，將幼崽隨機重新分配給養母以防止實驗不同處理中的母性偏向。采用CHORI IA⑶C(兒童醫院奧克蘭研究中心，研究動物管理和使用委員會)批準的方案進行動物實驗。如上所述使細菌生長并進行洗滌用于血清殺菌鑒定，將其重懸浮于包含10%合并熱失活年幼大鼠血清的DPBS/Ca2+/Mg2+中，所述年幼大鼠血清已通過ImL Hi1Trap蛋白G HP柱(新澤西州皮斯卡塔韋的通用醫療公司(GEHealthcare， Piscataway,NJ))以去除IgG。通過ELISA檢測不到消耗的血清中的IgG (大于99%的IgG 被去除)，在熱失活之前的血清中不存在可檢測的殺菌活性。
將所述細菌懸浮液分為五等份，置于試管中。向其中三等份加入純化的人fH(補體技術公司)以達到20 μ g/ml、100 μ g/ml或500 μ g/ml的濃度(以在100 μ 1中遞送2 μ g、 IOyg或50yg/只大鼠用于刺激)。向第四等份中加入(500 μ g/ml)純化的人Cl酯酶抑制劑(補體技術公司)作為陰性對照。僅含細菌的第五等份作為另外的陰性對照(Oyg fH或C 1酯酶抑制劑)。在零時間，用100μ1含經洗滌的對數期腦膜炎奈瑟球菌(約7X 103CFU/只大鼠)連同劑量為0、2、10或50 μ g的人fH或50 μ g的C 1酯酶抑制劑對幼崽進行IP刺激。細菌刺激后8小時，通過心臟穿刺獲得血液標本，將1 μ L、10 μ L和100 μ L 的血液份涂布到巧克力瓊脂(堪薩斯州來尼克謝的瑞美爾公司(Remel，Lenexa, Kansas)) 平板上。在37°C的5% CO2中過夜培育平板之后確定血液的CFU/mL。
統計學分析 求冪計算60分鐘時CFU/ml的各幾何平均數。在進行Iogltl轉化時，對低于細菌檢測下限的樣品的賦值為下限的一半(即5CFU/ml)。通過單向ANOVA確定分別給予50 μ g、 10yg、2yg或Oyg fH/只大鼠的四組CFU/ml幾何平均數各差異的顯著性。通過T檢驗確定從用50 μ g人fH相對于50 μ g人Cl酯酶抑制劑處理的動物獲得的CFU/ml幾何平均數的差異顯著性。
fH轉基因盒的產生 采用含 cfH 的質粒(pBluescript-cfH ；Ngampasutadol J.等 J. Immunol. 180 3426-35,2008)作為模板擴增人H因子基因(cfH)。將擴增的PCR產物克隆到載體 pCAGGS(pCAGGS 包含雞的 β-肌動蛋白啟動子=Niwa, H.，K.等 Gene 108 :193-9,1991)的 EcoRI限制位點中。用Mil和I3StI消化所得的載體pCAGGS-cfH，對包含啟動子和cfH基因的約61Λ的轉基因盒進行凝膠純化。將純化的盒用于維斯達大鼠胚胎的微注射。
實施例1 靈長動物fH與腦膜炎奈瑟球菌結合的種特異性 多克隆抗人fH識別來自人以及非人靈長動物的熱失活血清中的fH (
圖1A，標記為 (“僅血清”)的泳道)，因此可用來測試靈長動物fH與細菌的結合。fH與靈長動物熱失活血清中的菌株H44/76的結合顯示于標記為“血清+細菌”的泳道。熱處理不影響fH的結合性質(Jarva, H.等(2002) JImmunol 168 :1886-1894 ；Ram, S.等(1998) J Exp Med 188 671-680)。用人血清培育的細菌(陽性對照)顯示最多的fH結合，而黑猩猩血清中fH的結合處于低水平，狒狒和獼猴血清中檢測不到結合。
實施例2 大鼠或兔fH不與人fH形成結合腦膜炎奈瑟球菌的競爭 采用間接流式細胞鑒定來確定熱失活大鼠或兔fH(在其各自的熱失活血清中)是否與生物素化的人fH形成結合活腦膜炎奈瑟球菌上相同配體的競爭。加入40%熱失活的大鼠或兔血清(最高測試濃度)不會抑制生物素化的人fH與腦膜炎奈瑟球菌結合，而加入作為陽性對照的40%熱失活的人血清會抑制生物素化的人fH的結合(圖IB和1C)。這些數據表示大鼠和兔fH在腦膜炎奈瑟球菌上結合的配體與人fH的不同。雖然不能排除大鼠和兔fH在腦膜炎球菌上的結合位點不同于人fH的結合位點的可能性，但人fH、獼猴fH和大鼠fH(來自NCBI數據庫)的氨基酸序列比對顯示，與人和大鼠fH之間約64%的氨基酸序列相同性相比，人和獼猴fH具有約88 %的氨基酸序列相同性。因為獼猴fH不與腦膜炎球菌結合(
圖1A)，大鼠或兔血清對人fH缺乏抑制作用與這些物種的fH也不與腦膜炎球菌結合相一致。
實施例3 加入年幼大鼠血清的人fH對腦膜炎奈瑟球菌存活率的作用 在37°C下對混合物中的腦膜炎奈瑟球菌三個菌株培育1小時時，測定向年幼大鼠血清加入人fH對其存活率的作用(圖幻。在濃度為20%、40%和60%的濃度下測試各血清。不加fH時，與各自的零時間存活率相比，NZ98/2M和Cu385兩個菌株(分別為圖2的上圖和中圖)的存活率在培育期間升高超過150%。相比之下，第三個菌株H44/76的存活率在所有三個血清濃度(圖2下圖)中均降低40% -60%。在向反應加入濃度為50μ g/ml 的人fH時，菌株H44/76相應的存活率升高> 150% (例如，相比不加人fH時的存活率，包含人fH的60%血清中的存活率為152%，P<0. 001)。兩個已對血清具有抗性的菌株中的一種(菌株NZ98/2M)的存活率不受加入人fH的影響，而第二個血清抗性菌株Cu385的存活率在40%和60%血清中進一步升高(fH，P < 0. 001)。
雖然菌株H44/76在不加人fH的年幼大鼠血清中顯示很差的存活率，但該菌株在于來自缺乏自然獲得殺菌性抗體的成人的人血清中培育時可存活(在20%、40%或60% 血清中在37°C培育1小時的存活率> 130%，數據未顯示)，這一觀察強調了生理學相關水平的人fH的存在對血清中菌株H44/76存活率的重要性。這些結果與我們之前的研究類似，之前的研究顯示用來自健康成人的缺乏腦膜炎球菌殺菌性或調理性抗體的抗凝人全血或血漿培育的菌株H44/76的存活和生長情況(Welsch, J. A.等(2008) J InfectDis 197 1053-1061)。
實施例4 大鼠C3與腦膜炎球菌的結合和人fH對其的調節作用 為研究各菌株中年幼大鼠血清殺死作用抗性差異的基礎，對大鼠C3與菌株 H44/76(對年幼大鼠血清的殺死作用敏感)和NZ98/2M(對殺死作用具有抗性)的結合進行測定。在年幼大鼠血清中培育時，菌株NZ98/2M和H44/76結合類似量的大鼠C3 (圖3A， 實線顯示的直方圖)。因此，C3沉積(如總C3結合量所確定)時或其之前的調節作用無法解釋NZ98/2M對年幼大鼠血清殺菌活性的抗性和H44/76對其的易感性。向大鼠補體中加入25 μ g/ml人fH導致大鼠C3與兩個菌株的結合均降低(圖3A，陰影灰色直方圖)。確定大鼠C3通過人fH對菌株H44/76的調節效率以評價敏感性降低與大鼠血清的殺死作用可能的相關性。加入人fH以劑量反應形式降低了大鼠C3與H44/76的結合(圖；在向大鼠血清加入25和50 μ g/ml的人fH時，可見幾乎完全的抑制作用，而大鼠血清中人fH濃度為6. 25 μ g/ml時可見部分抑制作用。排它性地采用補體替代途徑的實驗(向補充有人H 因子的大鼠血清加入Mg-EGTA以阻斷補體的經典途徑)顯示在缺乏經典途徑時C3調節效率增強(C3結合降低)。圖3C顯示人fH與細菌的結合也以劑量依賴方式調節兔的替代途徑激活作用。
為確保對大鼠C3與菌株H44/76結合的抑制作用并非由對補體激活的非特異性抑制作用產生，采用作為補體替代途徑有效激活物的酵母聚糖O^earon，D. Τ.等(1977)ft~OC NatlAcadSci USA 74 :1683-1687)進行平行實驗。替代途徑特異性補體激活作用和大鼠C3 與酵母聚糖的結合在補充有濃度增加的人fH(在較高濃度的fH下可見一些抑制作用，實驗為顯示)的大鼠血清中以不受抑制的方式發生。
實施例5 人fH對年幼大鼠中腦膜炎球菌菌血癥的作用 為確定人fH是否增強了體內腦膜炎奈瑟球菌球菌的存活率，將劑量為2、10或 50 μ g的人fH聯合給予每只大鼠用約7X IO3對數期CFU的菌株H44/76刺激的年幼大鼠 (N = 15/組)。作為陰性對照，給予一組大鼠不含人fH(Oyg)的細菌刺激，給予第二組含 50 μ g/只大鼠的人Cl酯酶抑制劑。刺激8小時后獲得血液培養物。從給予與感染接種物混合的、量減少(50、10、2或Oyg)的fH的動物血液中分離的細菌數量(CFU/ml)降低(圖 4，由ANOVA得到P < 0. 02)。從給予人fH最高測試劑量50 μ g的動物血液分離的幾何平均 CFU/ml顯著高于給予50 μ g人Cl酯酶抑制劑的對照分離的CFU/ml (1050vs. 43，P < 0. 005， T檢驗)。
實施例6 人fH對幼兔補體引發的免疫人血清殺菌效價的作用 采用兔補體測定來自用腦膜炎球菌多糖疫苗免疫的69名4-5歲兒童的免疫前和免疫一個月后的血清中群C殺菌效價。19名兒童的效價在免疫前血清中<1 16(測試最低稀釋度)，在免疫后血清中為1 64或更高。
用單獨的兔補體、用加入25 μ g/ml人fH的兔補體或作為對照的25 μ g/ml人補體 Cl酯酶抑制劑重新鑒定19例陽性免疫后血清的效價。對來自用群C腦膜炎球菌偶聯疫苗免疫的11名成人的免疫后血清進行類似的鑒定。結果總結在圖5中。在向反應加入人fH 時，成人的血清殺菌幾何平均效價(GMT)下降超過8倍(P<0. 001)，兒童的血清殺菌幾何平均效價下降60倍(P<0. 001)。在加入人Cl酯酶抑制劑時，各GMT與不含抑制劑測定的各效價不具有顯著差異(P > 0. 5)。
實施例7 表達人fH的FO轉基因大鼠的產生 向大鼠胚胎注射純化的人fH轉基因盒(參見“材料和方法”)。將經微注射的大鼠胚胎植入到假孕的雌性維斯達大鼠中。通過Western印跡采用親和分離的多克隆山羊抗人fH對FO代的一窩大鼠篩選人fH在血清中的表達(Granoff，D. M.，J.A. ^felsch和 S. Ram. 2009. Infect Immun 77 :764-9 ；Ngampasutadol J.等，J. Immunol. 180 :3426-35, 2008)。將0.5μ1來自16只FO大鼠幼崽的血清加樣到泳道中。將0. 06 μ 1人血清用作陽性對照。16只動物(F0代)中的兩只在其血清中表達人fH(圖8)。
實施例8 表達人fH的轉基因大鼠的產生 使表達fH的FO轉基因大鼠與野生型維斯達大鼠交配，并對來自該交配的幼崽(Fl 代)篩選如實施例7所述血清中的fH表達。通過PCR確定這些幼崽中存在CfH基因。將來自表達人fH的Fl代的大鼠鑒定為將人CfH整合到生殖系細胞中，用來進一步繁殖育種以產生表達人fH的純合轉基因大鼠。
討論 以上內容表明(a) fH與腦膜炎奈瑟球菌的結合對人fH而言是特異性的，(b)向年幼大鼠血清加入人fH增加了細菌對補體介導殺菌活性的抗性并降低了大鼠C3沉積，(c) 在用群B腦膜炎奈瑟球菌進行腹膜內刺激時將人fH給予年幼大鼠使生物的存活率升高超過llog1(1。此外，在向測試反應混合物加入人H因子時，采用幼兔補體在免疫兒童和成人血清中測定的群C殺菌效價下降了 8-60倍。
近30年前首次報道了補體在宿主對腦膜炎奈瑟球菌防御中的重要作用 (Nicholson, A.等(1979) Science 205 :298-299)。Zollinger 和 Mandrell 在 25 年前報道， 用兔補體測定的血清殺菌效價遠高于用人補體測定的各效價Zollinger，W. D.等(1983) InfectImmun 40 :257-264)，這一觀察被隨后的研究證實(Santos, G. F.等(2001)Clin Diagn Lab Immunol 8:616-623)。以上數據(圖5)顯示，加入人fH降低了采用兔補體在來自免疫兒童或成人的血清中測定的殺菌效價。因此，腦膜炎球菌選擇性與人fH結合的能力可能是用非人補體源測定的殺菌效價較高的一個原因。應注意，在我們的研究中，在測試人血清的高稀釋度Ol 64)下，預期人fH是有限的。然而，在人血清的較低稀釋度下， 預期人fH的濃度足以下調兔C3，其可有利于用兔補體偶然觀察到的前區(即在人測試血清的低稀釋度下缺乏殺菌活性，但在兔C3激活作用不再受人fH的下調時在高稀釋度下存在殺菌活性)。
權利要求
1.一種檢測樣品中殺菌性抗奈瑟球菌抗體的方法，所述方法包括 將以下組分在反應混合物中混合疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品；包含人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽， 非人補體來源，和奈瑟球菌；通過評價奈瑟球菌的生存力來檢測樣品中存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體， 其中所述樣品存在下的奈瑟球菌生存力減小表示所述樣品包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動物內源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人補體是兔補體。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人補體是大鼠補體或小鼠補體。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述腦膜炎奈瑟球菌是群A、B、C、X、Y或 W-135腦膜炎奈瑟球菌。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品包含人血清。
9.一種反應混合物，其包含疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品；包含人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子(fH)多肽， 非人補體，和奈瑟球菌。
10.如權利要求9所述的反應混合物，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
11.如權利要求9所述的反應混合物，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動物內源 fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
12.如權利要求9所述的反應混合物，其特征在于，所述非人補體是兔補體。
13.如權利要求9所述的反應混合物，其特征在于，所述非人補體是大鼠補體或小鼠補體。
14.如權利要求9所述的反應混合物，其特征在于，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌。
15.如權利要求13所述的反應混合物，其特征在于，所述腦膜炎奈瑟球菌是群A、B、C、 X、Y或W-135腦膜炎奈瑟球菌。
16.一種包括一個或多個小瓶的試劑盒，所述小瓶包含包含人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子(fH)多肽；和非人補體。
17.如權利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含奈瑟球菌的培養物作為檢測殺菌性抗體的靶。
18.如權利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
19.如權利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動物內源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
20.如權利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述非人補體是兔補體。
21.一種非人動物，其包含編碼含人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的基因組整合核酸，其中所述轉基因操作性連接于啟動子以提供所述核酸在非人動物中的表達； 其中所述核酸在非人動物中的表達提供結合奈瑟球菌的fH多肽的產生。
22.如權利要求21所述的非人動物，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
23.如權利要求21所述的非人動物，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動物內源fH 多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
24.如權利要求21所述的非人動物，其特征在于，所述非人動物是大鼠或小鼠。
25.如權利要求21所述的非人動物，其特征在于，用奈瑟球菌感染所述非人動物。
26.如權利要求25所述的非人動物，其特征在于，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌。
27.—種篩選候選奈瑟球菌疫苗的方法，所述方法包括 將候選試劑給予如權利要求21所述的非人動物； 檢測存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體的產生。
28.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將奈瑟球菌給予所述非人動物。
29.一種奈瑟球菌感染的非人動物模型，其包含包含人短同源重復序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的非人動物宿主， 其中所述fH多肽存在于所述非人動物宿主的血流中；和用奈瑟球菌進行細菌感染； 其中所述fH多肽存在于非人動物的血清中。
30.如權利要求四所述的非人動物模型，其特征在于，所述fH多肽由整合到非人動物基因組中的核酸編碼。
31.如權利要求四所述的非人動物模型，其特征在于，對非人動物宿主的血流從外源給予所述fH多肽。
32.如權利要求四所述的非人動物模型，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
33.如權利要求四所述的非人動物模型，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動物內源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
34.如權利要求四所述的非人動物宿主，其特征在于，所述非人動物是大鼠或小鼠。
35.如權利要求四所述的非人動物宿主，其特征在于，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌。
36.一種篩選促進抗奈瑟球菌活性的候選試劑的方法，所述方法包括將候選試劑給予如權利要求25所述的非人動物或如權利要求四所述的非人動物模型；檢測候選試劑對非人動物中奈瑟球菌的生存力存在或缺乏作用。
全文摘要
本發明提供了采用介導與奈瑟球菌H因子結合蛋白(fhBp)結合的具有人氨基酸序列的H因子多肽來檢測殺菌性抗奈瑟球菌抗體的鑒定方法，還提供了奈瑟球菌感染的非人動物模型。
文檔編號A01K67/027GK102203276SQ200980134145
公開日2011年9月28日 申請日期2009年8月26日 優先權日2008年8月27日
發明者D·M·格拉諾夫, J·A·韋爾施爾, S·拉姆 申請人:奧克蘭兒童醫院及研究中心, 馬薩諸塞州立大學, 諾華疫苗和診斷公司