轉基因植物中的棉鈴蟲昆蟲抗性管理的制作方法

專利名稱：轉基因植物中的棉鈴蟲昆蟲抗性管理的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物病蟲害防治領域，特別是昆蟲的防治。本發明涉及在昆蟲抗性 管理計劃中使用轉基因植物細胞和植物，其中所述細胞和植物的基因組(或更典型地，前 驅(predecessor)植物細胞或植物)已被提供了至少兩個基因，每個基因編碼對谷實夜蛾 (Helicoverpa zea)或棉鈴實夜蛾(Helicoverpa armigera)具有殺蟲性的不同蛋白質，其 中這些蛋白質可飽和地結合此類昆蟲物種的刷狀緣膜，所述蛋白質為a)Cry2A蛋白和b) CrylA, CrylF 或 VIP3A 蛋白，例如 VIP3A、CrylAc, CrylAb 或 CrylA. 105 蛋白。在一個實施 方案中，此類植物用于延緩或防止棉鈴蟲(cotton bo 11 worm)群體出現對農作物的抗性。另外，本發明提供了同時或相繼使用Cry2A蛋白和VIP3A、CrylA或CrylF蛋白或 表達此類Cry2A蛋白和VIP3A、CrylA或CrylF蛋白的植物，以延緩或防止棉鈴蟲，特別是谷 實夜蛾或棉鈴實夜蛾，的抗性出現。此類轉化的植物比用單個殺蟲蛋白基因轉化的植物或用CrylF-和CrylA-編碼基 因轉化的植物具有優勢，尤其是在延緩或防止棉鈴蟲群體出現針對此類植物所表達的殺昆 蟲蛋白的抗性方面。本發明還涉及用于生產轉基因植物、特別是玉米、棉花、稻、大豆、高粱、番茄、向日 葵和甘蔗的方法，所述轉基因植物包括至少兩個不同的殺昆蟲Cry蛋白，這些蛋白顯示對 谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾幼蟲中腸刷狀緣中的結合位點無競爭結合。在植物中同時表達編碼 Cry2A蛋白和VIP3A、CrylF或CrylA蛋白、特別是VIP3Aa、CrylAb或CrylAc蛋白的嵌合基 因，在防止或延緩棉鈴蟲群體對此類植物中表達的殺昆蟲蛋白出現抗性方面特別有用。本發明進一步涉及用于防止或延緩谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體對表達VIP3或 CrylA和/或CrylF蛋白的轉基因植物出現抗性的方法，其包括提供還具有表達Cry2A蛋白 的基因的此類植物。由于Cry2A蛋白和CrylA或VIP3或CrylF蛋白對谷實夜蛾或棉鈴實 夜蛾幼蟲的中腸刷狀緣中的特異性結合位點無競爭，所以這些組合可以用于獲得對抗所述 幼蟲的長期保護作用。本發明還涉及在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲物種群體已對含有VIP3、CrylF和/ 或CrylA蛋白的植物產生抗性的地區中控制谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲的方法，所述方法 包括步驟在所述地區中播種、種植或生長含有至少一個編碼Cry2A蛋白的基因的種子或 植物。在本發明的一個實施方案中，所述植物還可包含(除編碼Cry2A蛋白的基因之外) 編碼另一種在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾中與Cry2A、VIP3、CrylF或CrylA蛋白不共享結合位 點的殺昆蟲蛋白的基因。
背景技術：
昆蟲害蟲使全世界農作物生產遭受著巨大的經濟損失，并且農民每年都會面臨由 于蟲害造成產量損失的威脅。農作物中的昆蟲抗性基因工程已經成為降低與農作物管理和 化學防治實踐相關的成本的一個具有吸引力的方法。基于在植物中表達源自革蘭氏陽性土 壤細菌蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(在本文中縮寫成“Bt”)的殺昆蟲蛋 白，自1996年以來，第一代昆蟲抗性農作物已投放市場。
與昆蟲對某些合成殺昆蟲劑快速出現抗性相比，盡管已應用了很多年，但是迄今 仍未報導昆蟲對摻入殺昆蟲蛋白例如蘇云金芽孢桿菌蛋白的植物出現抗性。這可能歸因于 正在用于此類轉基因植物的昆蟲抗性管理程序，例如表達高劑量水平的針對主要目標昆蟲 的蛋白質、和使用含有無此類殺昆蟲蛋白的植物的避難所(refuge area)(天然避難所或結 構避難所)。為了賦予植物抗昆蟲抗性而在植物中表達蘇云金芽孢桿菌或其它殺昆蟲蛋白基 因的方法是本領域眾所周知的，并且提供了農業昆蟲防治的新方法，該方法同時也是安全 的、在環境方面具有吸引力且有成本效益的。該方法持續成功的一個重要決定因素是是否 (或什么時候)昆蟲能夠出現對轉基因植物中表達的殺昆蟲蛋白的抗性。與葉敷(foliar application)(之后殺昆蟲蛋白通常快速降解)相比，轉基因植物將對昆蟲施加持續的選 擇壓力。從實驗室選擇試驗中可清楚看出，持續的選擇壓力可在昆蟲中產生對殺昆蟲蛋白 例如蘇云金芽孢桿菌Cry蛋白的適應性。谷實夜蛾和棉鈴實夜蛾分別是新舊世界中最重要的多寄主性鱗翅目昆蟲害蟲物 種。這些昆蟲有相當快速地對殺昆蟲劑發展出抗性的歷史，并且它們通常對很多Bt衍生的 殺昆蟲蛋白的敏感性不如重要的其它鱗翅目昆蟲害蟲。因此，這些昆蟲物種是對Bt植物例 如Bt棉花或Bt玉米植物出現抗性的最有可能的候選物。使用最廣泛的為控制鱗翅目昆蟲而導入植物中的蛋白質包括CrylA、CrylF和 VIP3A蛋白。基于競爭結合試驗，已提出，在谷實夜蛾和棉鈴實夜蛾中CrylF蛋白與CrylAc 競爭相同的中腸結合位點。而且，未發現證據表明這些昆蟲物種中CrylF有任何未被共享 的位點(Hernandez和狗！·!^，2005)。因此，這兩種蛋白在同一植物中的組合不是適用于 谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲的抗性管理的方法。已經發現Cryli^a對CrylAc結合位點具 有僅低親和力，這種低親和力有可能反映所觀察到的這些昆蟲物種中CrylF蛋白的低毒性 (Liao 等人，2002)。有這樣一個普遍認可的見解Cry2毒素的作用方式是獨特的，且不同于其它3個 結構域的Cry毒素，這是因為它們非特異性地和/或不可飽和地與不受限數目的結合位點 結合(English等人，1994 ;Lee等人，2006)。自English等人(1994)的出版物以來，該出 版物中所描述的Cry2A蛋白的該結合特征已被明顯地重申，且幾位作者還提及該文獻中描 述的用于制備Cry2A蛋白進行結合試驗的方法(例如，Luo等人，2007)。此外，EPA生物性 殺蟲劑資料單006487 ^)0 陳述了 Cry2Ab蛋白，以及一般地Cry2蛋白，產生高度有效 的離子通道以補償與自身或與大量非特異性結合位點的結合。(www, epa. rov/oppOOOOI/ biopesticides/ingredients/factsheets/factsheet 006487. htm)。此夕卜，English 等人 (1994)和Karim等人(2000b)報導了在谷實夜蛾中CrylA和Cry2A蛋白至少部分地競爭或 共享共同的結合位點。此外，USDA-APHIS非管制狀態申請06-298-0 Ip Q006)中陳述Cry IA 和 Cry2A 蛋白共享很多共有結合位點(www, aphis, usda. Rov/brs/aphisdocs/06 29801p. pdf)。尚無根據直接可飽和性試驗證實Cry2A蛋白的可飽和結合的報告，在該測定試驗 中使用固定濃度的結合位點(即BBMV)，向所述結合位點加入濃度漸增的標記蛋白。與本領 域的報告和發現不同，本發明人最終在本文證明Cry2A毒素可以以特異的且可飽和的方式 結合敏感昆蟲中的受體，并且Cry2A毒素在棉鈴蟲(谷實夜蛾和棉鈴實夜蛾)中與CrylA毒素不共享(或競爭)結合位點。本文件包含了顯示在直接可飽和性試驗中Cry2A蛋白可 飽和地結合敏感昆蟲的中腸刷狀緣膜的首次報道，并且還包含分析不同Cry2A蛋白之間的 結合競爭性的首次報告。發明概述本文提供在轉基因植物中控制谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾侵擾同時獲得谷實夜蛾或 棉鈴實夜蛾昆蟲對所述植物的抗性發展的較慢積累的方法，其包括在所述植物中表達a) 對所述昆蟲物種有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白和b)對所述昆蟲物種具有殺昆蟲性的Cry 1A、 CrylF或VIP3A蛋白的組合。本文還提供用于在昆蟲物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體中防止或延緩針對表達 殺昆蟲蛋白的轉基因植物的昆蟲抗性發展以控制所述蟲害的方法，其包括在所述植物中表 達對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白以及對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具 有殺昆蟲性的Cry 1A、CrylF或VIP3A蛋白的組合。在本發明的一個實施方案中，提供了在昆蟲物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體已對 表達VIP3A、CryIA或CrylF蛋白的植物產生抗性的地區中控制谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的方 法，其包括在所述地區中播種或種植表達至少一種對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性 的Cry2Ae蛋白的植物的步驟。本文還提供，在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體已對表達Cry2Ae蛋白的植物產生抗 性的地區中控制谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的方法，其包括在所述地區中播種或種植表達對谷 實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylF、VIP3或CrylA蛋白的植物的步驟。依照本發明還提供，用于獲得包含編碼至少兩種不同的殺昆蟲蛋白的嵌合基因的 植物的方法，其中如在使用谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲幼蟲的刷狀緣膜小泡的競爭結合實 驗中測定的，所述蛋白質在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾物種的幼蟲中不具有共享的結合位點， 所述方法包括以下步驟獲得包含編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae 蛋白的可植物表達嵌合基因和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylA、VIP3 或CrylF蛋白的可植物表達嵌合基因的植物。本文進一步提供了這樣的方法，其中所述植 物通過如下方式獲得用所述編碼Cry2Ae和CrylA、VIP3或CrylF蛋白的可植物表達的嵌 合基因轉化植物，并獲得包含所述嵌合基因的所述植物的種子和后代植物；或將包含所述 編碼Cry2Ae的嵌合基因的親本植物與包含所述編碼CrylA、VIP3或CrylF的嵌合基因的親 本植物雜交，并獲得包含所述嵌合基因的后代植物和種子；或在包含編碼對谷實夜蛾或棉 鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的可植物表達的嵌合基因的植物中轉化編碼對谷實 夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylA、VIP3或CrylF蛋白的第二可植物表達的嵌合基 因，并獲得包含該至少兩個嵌合基因的后代植物和種子。在本發明的另一個實施方案中，提供了用于獲得表達至少兩種不同的殺昆蟲蛋白 的植物的方法，其中如可以在使用谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾幼蟲的刷狀緣膜小泡的競爭結合 實驗中測定的，所述蛋白質在物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的幼蟲中不具有共享的中腸結合 位點，且其中所述蛋白質為a)對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白和b) 對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylA、VIP3或CrylF蛋白、特別是對谷實夜蛾或 棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的VIP3或CrylA蛋白。本文還提供播種、種植或生長植物的方法，其中所述植物被保護而可以對抗棉鈴蟲，所述植物包含表達至少兩種不同的殺昆蟲蛋白的嵌合基因，其中如在使用谷實夜蛾或 棉鈴實夜蛾幼蟲的刷狀緣膜小泡的競爭結合實驗中測定的，所述蛋白質在物種谷實夜蛾或 棉鈴實夜蛾的幼蟲中不具有共享的結合位點，所述方法包括以下步驟播種、種植或生長包 含編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和編碼對谷實夜 蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylA、VIP3或CrylF蛋白、優選對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾 具有殺昆蟲性的VIP3或CrylA蛋白的嵌合基因的植物。本文還提供至少兩種不同的殺昆蟲蛋白在轉基因植物中的用途，用于防止或延 緩谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體中的昆蟲抗性發展，其中如可通過競爭結合實驗測定的，所 述蛋白質在所述昆蟲物種的昆蟲中腸中不具有共享的結合位點，所述應用包括在所述轉基 因植物中表達對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白和對谷實夜蛾或棉 鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylF、VIP3或CrylA蛋白；和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具 有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的 CrylF、VIP3或CrylA蛋白的嵌合基因，特別是編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性 的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的VIP3或CrylA 蛋白的嵌合基因，的用途，用于防止或延緩昆蟲物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體中對表達 殺昆蟲蛋白的轉基因植物的昆蟲抗性發展，以控制所述蟲害。在本文的一個實施方案中，提供了對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的 Cry2Ae蛋白與對所述物種昆蟲具有殺昆蟲性的Cry 1A、VIP3或CrylF蛋白的組合的用途， 用于防止或延緩所述物種昆蟲對表達異源性殺昆蟲毒素的轉基因植物的抗性發展，特別是 當所述用途通過在植物中表達所述蛋白組合而實現時。本文還提供包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的植物 在如下地區中的應用，在所述地區所述昆蟲物種的群體已對包含CrylF、VIP3和/或CrylA 蛋白的植物產生了抗性，其中所述應用可以包括在所述地區中播種、種植或生長包含對谷 實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的植物；和包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜 蛾具有殺昆蟲性的CrylF、VIP3和/或CrylA蛋白的植物在如下地區中的應用，在所述地 區所述昆蟲物種的群體已對包含Cry2Ae蛋白的植物產生了抗性，其中所述應用可以包括 在所述地區中播種、種植或生長包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylF、VIP3 和/或Cry IA蛋白的植物。本文還提供編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的嵌合 基因和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylA、VIP3或CrylF蛋白的嵌合基 因、特別是編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和編碼 對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylA或VIP3蛋白的嵌合基因在用于獲得能夠 表達至少兩種不同的殺昆蟲蛋白的植物的方法中的應用，其中如可在競爭結合實驗(例如 通過使用所述昆蟲幼蟲的刷狀緣膜小泡)中測定的，所述殺昆蟲蛋白在物種谷實夜蛾或棉 鈴實夜蛾的幼蟲中不具有共享的結合位點。在本發明的一個實施方案中，提供了編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性 的Cry2Ae蛋白的嵌合基因的用途，用于獲得包含至少兩種不同的殺昆蟲蛋白的植物，其中 如可在例如通過使用所述昆蟲幼蟲的刷狀緣膜小泡的競爭結合實驗中測定的，所述殺昆蟲 蛋白在物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的幼蟲中不具有共享的中腸結合位點，其中所述Cry2Ae
8嵌合基因存在于還包含編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylA、VIP3或 CrylF蛋白的嵌合基因的植物中。在一個實施方案中，上述應用包括步驟通過用編碼所述Cry2Ae和CrylA、VIP3或 CrylF蛋白的嵌合基因轉化植物而獲得包含此類不同殺昆蟲蛋白的植物，和通過將包含編 碼所述Cry2Ae蛋白的嵌合基因的植物與包含編碼所述CrylA、VIP3或CrylF蛋白的嵌合基 因的植物雜交而獲得包含此類不同殺昆蟲蛋白的植物，和獲得包含所述嵌合基因的所述植 物的種子和后代植物。本發明還提供了這樣的應用用不含有對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的 Cry2,Cryl或VIP3蛋白的植物播種、種植或生長避難所(refuge area)，例如通過在包含本 文所述的Cry2Ae、VIP3和Cryl蛋白的植物的相同種植區或附近播種、種植或生長此類植 物。本文還提供上述應用或方法，其中植物以對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾而言的高劑量 表達 Cry2Ae、VIP3、CrylF 或 CrylA 蛋白。本文還提供生長、播種或種植表達Cry蛋白或VIP3蛋白的植物以控制棉鈴實夜 蛾或谷實夜蛾昆蟲的方法，其包括步驟在該種植區中或在該種植區附近種植、播種或生長 小于20%、小于15%或小于10%種植區的噴灑過殺蟲劑的結構避難所、或小于5%種植區 的未噴灑過殺蟲劑的結構避難所，或在種植區中不種植、播種或生長避難所，其中所述避難 所位于相同的種植區內，或者位于種植區的2英里內、1英里內或0. 5英里內，且含有不包含 該Cry或VIP3蛋白的植物，其中所述表達Cry蛋白或VIP3蛋白的植物表達對所述昆蟲物 種具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白和對所述昆蟲物種具有殺昆蟲性的CrylA、CrylF或VIP3A 蛋白、特別是Cry2Ae和CrylAb或CrylAc或VIP3A蛋白、優選Cry2Ae和CrylAb和VIP3蛋 白的組合。本文還提供植物、特別是玉米或棉花植物的種植區(field)，其包含小于20%、 小于15%、小于10%或小于5%的結構避難所或不包含結構避難所，其中所述種植區種植 有表達對棉鈴實夜蛾或谷實夜蛾昆蟲具有殺昆蟲性的Cry2Ae或Cry2Ab蛋白和對所述昆蟲 物種之一具有殺昆蟲性的07認、07明或￥1 34蛋白、特別是072々6和CrylAb、CrylAc或 VIP3A蛋白、優選Cry2Ae和CrylAb和VIP3蛋白的組合的植物。在本發明的一個實施方案中，還提供了特異地且可飽和地結合谷實夜蛾幼蟲中腸 中的結合位點的至少2種殺昆蟲蛋白的用途，用于延緩或防止該昆蟲物種對表達殺昆蟲蛋 白的植物的抗性發展，其中在所述植物中所述蛋白質之一是對該昆蟲物種具有殺昆蟲性 的Cry2A蛋白，例如Cry2Ab蛋白，而另一種蛋白質是對該昆蟲物種具有殺昆蟲性的CrylA、 CrylF或VIP3蛋白，其中在可飽和性試驗中確定所述的可飽和結合，所述試驗使用固定濃 度的結合位點(即BBMV)，并向所述結合位點加入濃度漸增的標記蛋白。特別地，在此用途 中，Cry IA蛋白選自下組Cry IAc、Cry IAb、Cry 1A. 105或Cry IAc或Cry IAb雜合蛋白，例如由 任何一種本文提及的cryIA編碼區編碼的蛋白質。在谷實夜蛾昆蟲幼蟲的中腸中該Cry2Ab 和CrylA蛋白對它們的(可飽和且特異的)結合位點不存在競爭，如可在BBMV競爭結合試 驗中測量的。本文使用的Cry2Ae蛋白是指殺昆蟲Cry2Ae蛋白，例如TO2002/057664的SEQ ID No. 2 的全長 Cry2Ae 蛋白(Cry2Ael，SEQ ID No. 1) ；Cry2Ae 毒性片段或包含 Cry2Ae 毒 性片段的蛋白質(如W02002/057664中所述)，例如Cry2Ae蛋白片段與葉綠體轉運肽或對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的另一肽序列的融合蛋白；或是包含如下氨基酸序列 的對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質，所述氨基酸序列與本文SEQ ID No. 1 的氨基酸序列或與WO 2002/057664的SEQ IDNo. 2具有至少95、97或99%序列同一性，特 別是在對應于最小毒性片段的部分中；或是由包含在棉花事件EE-GH6 (在要求歐洲專利申 請號0707M60或0707M85(未公開)的優先權的PCT專利申請中描述)中的Cry2Ae嵌合 基因的Cry2Ae編碼區部分編碼的蛋白質，特別是包含所述Cry2Ae蛋白之任一的最小毒性 片段的任何蛋白質，或對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的具有1-5個氨基酸不同的所述 Cry2Ae蛋白之任一的變體。本文使用的Cry2Ab 蛋白是指Crickmore 等人(1998)或 www, lifesci. susx. ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/中對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的任何一 種Cry2Ab蛋白，例如全長Cry2Ab蛋白、Cry2Ab毒性片段、Cry2Ab2蛋白(本文為SEQ ID No. 2)、或包含Cry2Ab毒性片段的蛋白，例如Cry2Al32蛋白片段與葉綠體轉運肽或對谷實夜 蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的另一肽序列的融合蛋白；或是包含如下氨基酸序列的對谷實夜 蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質，所述氨基酸序列與本文SEQID No. 2或與NCBI登 錄CAA39075的氨基酸序列(Dankocsik等人，1990)具有至少95、97或99%序列同一性，特 別是在對應于最小毒性片段的部分中；或是由包含在棉花事件15985(在USDA-APHIS非管 制狀態申請OO-342-Olp中描述)中的Cry2Ab嵌合基因的Cry2Ab2編碼區部分編碼的蛋白 質、由包含在玉米事件M0N89034(在USDA-APHIS非管制狀態申請06-298-01p中描述)中 的Cry2Ab嵌合基因的Cry2Al32編碼區部分編碼的蛋白質、特別是包含所述Cry2Ab蛋白之 任一的最小毒性片段的任何蛋白、或者對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性且具有1-5個氨 基酸不同的所述Cry2Ab蛋白之任一的變體。本文使用的CrylF蛋白包括包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的CrylF蛋 白氨基酸序列的最小毒性片段的任何蛋白質，例如NCBI登錄號AAA22347(US 2005049410 的SEQ ID No. 10)的蛋白或CrylFal蛋白(SEQ ID No. 3)。此定義還包括SEQ ID No. 3 或NCBI登錄號AAA22347的氨基酸序列的變體，例如與SEQ ID No. 3或與NCBI登錄號 AAA22347的CrylF蛋白具有至少90 %序列同一性的氨基酸序列(如利用GCGWisconsin 軟件包的GAP程序(Madison，Wisconsin, USA, 10. 2版)，使用成對比對確定)，特別是在 對應于最小毒性片段的部分中具有此同一性。本文使用的CrylF蛋白包括由CrylF棉花 事件 281-24-236 (W02005/103266,參見 USDA APHIS 非管制狀態申請 03-036_01p)中或玉 米事件 TC1507 或 Td675(US 7，288, 643、WO 2004/099447、USDAAPHIS 非管制狀態申請 OO-136-Olp和03-181-01p)中的CrylF基因編碼的蛋白質，特別是包含所述CrylF蛋白之 任一的最小毒性片段的任何蛋白質，或對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有毒性的具有1-5個氨 基酸不同的所述CrylF蛋白之任一的變體。在本發明的一個實施方案中，VIP3蛋白是對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾幼蟲具有殺 昆蟲性的蛋白質，其是Crickmore等人Q008)中列出的任何一種VIP3蛋白，或包含這些 蛋白質之任一的最小毒性片段的任何蛋白質。所用的VIP3蛋白可以是對谷實夜蛾或棉鈴 實夜蛾具有殺昆蟲性的VIP3A蛋白，例如SEQ ID No. 4的VIP3Aal蛋白、SEQ ID No. 5的 VIP3Afl蛋白、本文所述的VIP3Aal9 (NCBI登錄號ABG20^8，EPA實驗應用許可手冊(EPA experimental use permit factsheet) 006499 (2007), ^JC SEQ ID No. 6) VIP3Aa20 ^白(本文SEQ ID No. 7)，以及包含其殺昆蟲片段或功能結構域的任何蛋白；以及與NCBI登 錄號AAC37036 (Estruch等人，1996)或SEQ ID No. 4的VIP3Aal蛋白(特別是與其最小毒 性片段)、或與 NCBI 登錄號 CAI43275 的 VIP3Afl 蛋白(本文 SEQ ID No. 5, W003/080656 中的SEQ ID No. 4)(特別是與其最小毒性片段)具有至少70%序列同一性(如使利用GCG Wisconsin軟件包的GAP程序、使用成對比對測定)的、對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆 蟲性的任何蛋白；以及選自如下的對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的VIP3A蛋白 VIP3Ab、VIP3Ac、VIP3Ad、VIP3Ae、VIP3Af、VIP3Ag 或 VIP3Ah，特別是 VIP3AH、VIP3Adl 或 VIP3Ael 蛋白(分別為 NCBI 登錄號 CAI43275(ISP3a，WO 03/080656 中的 SEQ ID No. 4), CAI43276(ISP3b, WO 03/080656 中的 SEQ ID No. 6)、和 CAI43277 (ISP3C，WO 03/080656 中 的SEQ ID No. 2))，及其殺昆蟲片段、雜種或變體。在一個實施方案中，VIP3蛋白是導入棉 花植物中(例如包含事件C0T102的植物，在WO 2004/039986或USDA APHIS非管制狀態申 請 03-155-01p 中描述)的 VIP3Aal9 蛋白(NCBI 登錄號 ABG20428，SEQ IDNo. 6)，或導入玉 米植物中(例如事件MIR162，USDA APHIS非管制狀態申請07-253_01p)的VIP3Aa20蛋白 (NCBI 登錄號 ABG20429，W02007/142840 中的 SEQ ID NO :2，本文為 SEQ ID No. 7)、或在棉 花事件 C0T202 或 C0T203(分別見 WO 2005/0M479 和 WO 2005/054480)中產生的 VIP3A 蛋 白，或具有1-5個氨基酸不同且對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的任何一種上述VIP3蛋 白的變體。本文使用的CrylA 蛋白是指 CrylAcl (SEQ ID No. 8)、CrylA. 105(SEQID No. 9)或 CrylAbKSEQ ID No. 10)蛋白，且包括包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的CrylAc、 CrylA. 105或CrylAb蛋白氨基酸序列的最小毒性片段的任何蛋白，例如包含SEQ ID No. 8 或 NCBI 登錄號 AAA22331 (CrylAc ;Adang 等人，1985)中的蛋白質、SEQ ID No. 10 或 NCBI 登錄號AAA22330 (Wabiko等人，1986 (CrylAb))中的蛋白質、或由玉米事件M0N890;34(USDA APHIS 非管制狀態申請 06-298-01p、W02007/140256，WO 2007/027777 中的 SEQ ID NO: 2或4)中的CrylA轉基因編碼的本文SEQ ID No. 9的CrylA. 105蛋白、或由棉花事件 C0T67B (USDA APHIS 不解除管制狀態申請 07-108_01p、WO 2006/128573)中的 cryIAb 編碼區編碼的CrylAb蛋白的最小毒性片段的任何蛋白。此定義還包括NCBI登錄號 AAA22331 (CrylAcl)、NCBI 登錄號 AAA22330 (CrylAb，Wabiko 等人，1986)中的氨基酸序列、 或USDA APHIS非管制狀態申請06-298-01p中所述的CrylA. 105蛋白的氨基酸序列的變 體，例如與該Cry lAc、CrylA. 105或CrylAb蛋白，特別是SEQ ID Nos. 8、9或10的蛋白， 更特別是在對應于最小毒性片段的部分中，具有至少90%氨基酸序列同一性(如利用GCG Wisconsin軟件包的GAP程序(Madison, Wisconsin, USA, 10. 2版)、使用配對比對確定)、 具有CrylA蛋白的最小毒性片段的蛋白質。CrylA蛋白在本文中包括由US 6，114，608的SEQ ID NO 3編碼的CrylAb蛋白、 特別是由玉米事件M0N810(US 6，713，259，USDA APHIS不解除管制狀態(non-deregulated status)申請96-017-01p及其補充)中的crylAb編碼區編碼的CrylAb蛋白、由玉米事 件 Btll(USDA APHIS 不解除管制狀態申請 95-195-Olp，US 專利 6，114，608)中的 crylAb 編碼區編碼的 CrylAb 蛋白、由棉花事件 3006-210-23 (US 7，179，965、WO 2005/103266, USDA APHIS不解除管制狀態申請03-036-02p)中的轉基因編碼的CrylAc蛋白、由棉花事 件 C0T67B(USDA APHIS 不解除管制狀態申請 07-108_01p、WO 2006/128573)中的 crylAb
11編碼區、包含在PCT專利申請PCT/EP2008/002667(未公開)所述的棉花事件EE-GH5中 的CrylAb編碼區、美國專利7，049, 491的SEQ ID No. 2的CrylAb編碼區編碼的CrylAb 蛋白、由玉米事件 M0N890;34(USDA APHIS 非管制狀態申請 06-298-01p、WO 2007/140256、 WO 2007/027777中的SEQ ID NO :2或4)中的CrylA轉基因編碼的CrylA. 105蛋白、由 棉花事件15985或棉花事件531，757或1076 (USDA APHIS非管制狀態申請94-308_01p， WO 2002/100163的cryIA棉花事件編碼的嵌合CrylAc蛋白)中的雜種cryIAc編碼區編 碼的 CrylAc 樣蛋白、由分別述于 WO 2006/128568, WO 2006/128569, WO 2006/128570, WO 2006/128571 或 WO 2006/128572 的棉花事件 T342-142、1143-14A、1143-51B、CE44-69D 或 CE46-02A 中的 crylAb 編碼區編碼的 crylAb 蛋白(即由 WO 2006/128568,WO 2006/128569、 WO 2006/U8571 或W02006/U8572 中的 SEQ ID No. 7 的 DNA 或由 WO 2006/U8570 中的 SEQ IDNo. 5的DNA編碼的蛋白)、或包含上述CrylA蛋白之任一的最小毒性片段的蛋白質、或具 有1-5個氨基酸不同但保留對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的毒性的上述CrylA蛋白之任一的變 體。本文還提供包含至少2個轉基因的植物或種子，其中每個轉基因各編碼不同的對 谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質，所述蛋白質可飽和地且特異性地結合此類 昆蟲中腸中的結合位點，其中所述蛋白在此類昆蟲中不競爭相同結合位點，且其中所述蛋 白質為i)Cry2A蛋白和ii)CrylA、CrylF或VIP3蛋白。在一個實施方案中，所述植物包 含編碼下述蛋白的轉基因i)Cry2Aa、Cry2Ab 或 Cry2Ae、和 ii)CrylAb、CryIAc, CryIFa 或 VIP3A、特別是Cry2Ae蛋白和CrylAb和/或VIP3A蛋白。在另一個實施方案中，所述植物 或種子是包含編碼CrylA、CrylF或VIP3蛋白的嵌合基因和編碼Cry2A蛋白、特別是Cry2Ae 蛋白的嵌合基因的玉米或棉花植物或種子，其中所述植物或種子包含選自下組的轉化事 件玉米事件M0N89034、玉米事件MIR162、包含編碼Cry2Ae蛋白的轉基因的玉米事件、玉米 事件TC1507、玉米事件Btll、玉米事件M0N810、棉花事件EE-GH6、棉花事件C0T102、棉花事 件C0T202、棉花事件C0T203、棉花事件T342-142、棉花事件1143-14A、棉花事件1143-51B、 棉花事件CE44-69D、棉花事件CE46-02A、棉花事件C0T67B、棉花事件15985、棉花事件 3006-210-23、棉花事件531、棉花事件EE-GH5、棉花事件觀1-對_236，所有事件如本文進一 步的定義。本文還提供包含至少3個轉基因的植物，其中每個轉基因編碼不同的對谷實夜蛾 或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質，所述蛋白質可飽和且特異性地結合此類昆蟲中腸中 的結合位點，其中所述蛋白在此類昆蟲中不競爭相同結合位點，且其中所述植物包含編碼 CrylA或CrylF蛋白的嵌合基因、編碼Cry2A蛋白的嵌合基因和編碼VIP3A蛋白的嵌合基 因，且其中這些事件選自如上文段落所述的組。在本發明的一個實施方案中，在本發明的用途、方法或植物中，Cry2Ae、Cry2Ab、 VIP3、CrylF或CrylA嵌合基因是包含在上述玉米或棉花事件之任一中的嵌合基因。依照 本發明，還包括其中的術語Cry2Ae被術語Cry2Aa或Cry2Ab替代的本文所述的任何用途、 方法、植物或種子；以及涉及Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab蛋白的任何上述用途、方法、植物或 種子，其中該Cry2A蛋白與谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的中腸BBMV的結合是特異性的且可飽 和的，特別是當在直接可飽和性結合試驗中確定可飽和結合時；優選這樣的用途、方法、植 物或種子，其中在本文所述的標準競爭結合試驗中，在棉鈴實夜蛾或谷實夜蛾中任何所述
12Cry2A蛋白和Cry 1A、CrylF或VIP3蛋白的特異性結合之間均沒有生物學顯著的競爭。在本發明的上述植物、種子、用途或方法中，優選的植物，例如對于將不同的嵌合 基因通過雜交而堆疊或組合在同一植物中而言，是包含任何一個上述玉米事件或任何一個 上述棉花事件的植物，以及其包含編碼所述Cry2A、和所述VIP3和/或Cryl蛋白的嵌合基 因的后代或子代。本文使用的植物或種子包括會顯著受到棉鈴蟲破壞的任何植物物種的植物或種 子，但特別包括玉米、棉花、稻、大豆、高粱、番茄、向日葵和甘蔗。本文還提供用于使表達對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質的植物 的種植或商品化獲得解除管制或獲得監管部門批準的方法；或用于減少含有不產生對谷實 夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的任何蛋白質的植物的結構避難所的方法；或用于種植不 具有結構避難所的種植區的方法，所述方法包括以下步驟引用、提交或依賴昆蟲試驗結合 數據，其中所述數據顯示Cry2A蛋白特異性且可飽和地結合所述昆蟲的昆蟲中腸膜、并且 所述Cry2A蛋白在所述昆蟲中不競爭Cry 1A、CrylF或VIP3蛋白的結合位點，例如本文所 公開的數據或在其它文件中報導的類似數據。在一個實施方案中，Cry2A蛋白是Cry2Aa、 Cry2Ab 或 Cry2Ae 蛋白，且 CrylA 蛋白是 CrylAc、CrylAb 或 CrylA-105 蛋白，且 VIP3 蛋白 是VIP3Aa蛋白。本文還提供種植有含有殺昆蟲蛋白的植物的種植區(field)，其中所述蛋白保 護所述植物免受棉鈴實夜蛾或谷實夜蛾昆蟲的損害，其中所述種植區具有小于20%的結構 避難所、或小于5%的結構避難所、或在所述種植區中沒有結構避難所，且其中所述植物表 達a)對所述昆蟲物種具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白和b)對所述昆蟲物種具有殺昆蟲性的 CrylA, CrylF或VIP3A蛋白的組合。所述植物優選為玉米或棉花植物。本發明還包括上述方法或植物，其中除Cry或VIP3蛋白之外，Bt毒素增強蛋白也 在所述植物中表達，其中所述Bt毒素增強蛋白是蛋白質或其片段，即，昆蟲中Bt毒素受體 的一部分，優選包含或對應于結合結構域的部分，例如鈣粘著蛋白樣蛋白的片段。這些Bt 毒素增強蛋白與一種或多種Bt殺昆蟲毒素例如Cry蛋白一起被飼喂給目標昆蟲。這些Bt 毒素增強蛋白可以增強Bt殺昆蟲蛋白對該受體的來源昆蟲物種以及對其它昆蟲物種的毒 素活性。在一個實施方案中，所述Bt毒素增強蛋白是谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲的中腸細 胞Bt毒素受體的一部分。發明詳述由于包含導入的殺昆蟲蛋白例如Bt Cry或VIP3蛋白的植物的成功和此類植物數 目的增加，現在抗性管理比過去甚至更為重要。盡管源自Bt或其它細菌的不同殺昆蟲蛋白例如Cry或VIP蛋白的殺蟲譜可能不 同，但是其發揮毒性作用的主要途徑是共同的。所有用于轉基因植物的Bt源殺昆蟲蛋白 (已經在至少一種目標昆蟲中研究過其作用機理)(例如Cryl和VIP3毒素)，在昆蟲腸中 被蛋白水解激活，并與敏感物種的中腸上皮相互作用，引起上皮細胞的裂解。在Cry蛋白和 VIP蛋白的毒性作用途徑中，毒素與這些細胞的刷狀緣膜上的受體位點的特異性結合是關 鍵性質(Hofmarm等人，1988 ；Lee等人，2003)。結合位點通常被稱為受體，因為這種結合是 可飽和的且具有高親和力。當兩種不同的殺昆蟲蛋白在昆蟲中共享受體結合位點時，它們不能夠提供用于昆蟲抗性管理目的的良好組合。實際上，對殺昆蟲蛋白例如Bt Cry蛋白產生抗性的最有可能 的機制——以及迄今在田間出現的抗Bt噴霧劑的昆蟲抗性中發現的唯一主要機制——是 受體結合的修飾。氨基酸序列高度類似的蛋白通常共享受體位點(例如CrylAb和CrylAc 蛋白)。但是，甚至具有十分不同的氨基酸序列的兩個不同蛋白也可能在昆蟲物種中以高 親和力結合共同的結合位點(例如，CrylAb和CrylF蛋白在菜蛾(Plutella xylostella) 中)。而且，已發現在一個昆蟲物種中不具有共享的結合位點的兩種蛋白可以在另一個昆蟲 物種中享有共同的結合位點(例如，Fiuza等人(1996)發現CrylAc和CrylBa蛋白在二化 螟(Chilo suppressalis)中共享結合位點，而Ballester等人(1999)發現它們在菜蛾中 結合不同的結合位點)。本發明涉及在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾中對CrylF、VIP3或CrylA受體不顯示競爭 的Cry2A蛋白，這使得最為有意義的是在相同植物中組合至少Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab蛋 白和 VIP3、CrylF 或 CrylA 蛋白(優選至少 Cry2Ae 蛋白和 CrylAb, CrylAc, CrylA. 105 或 VIP3A蛋白)，以防止或延緩谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的昆蟲抗性發展。此方法有利地應該是 用于昆蟲抗性管理的全局策略的一個部分，所述策略，如有需要或必要，包括結構避難所和 以針對目標昆蟲的高劑量表達蛋白質。本文所提及的結合位點僅指對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白(例 如Cry2Ae、Cry2Ab、VIP3A、CrylAc或CrylAb蛋白)的特異性結合位點。這些是特異性結 合蛋白質的結合位點，即，對于這些結合位點而言，標記配體(例如Cry2Ae或VIP3A蛋白) 與其結合位點的結合可以被過量的未標記的同源配體(分別為Cry2Ae或VIP3A蛋白)置 換(或競爭)。術語結合位點或受體在本文可互換使用，且是等同的。在一個實施方案中， 如在直接可飽和性試驗中測量的，與此類特異性結合位點的結合是可飽和的。本文使用的 “直接可飽和性試驗”是指這樣的試驗，其中用漸增量的標記配體孵育固定量的受體(在本 案中為BBMV)。在可飽和結合的情況下，當將結合數據作圖時(Y軸為結合％，X軸為標記配 體的濃度)，平臺(plateau)——或至少自線性的偏離——將是明顯的，而在不可飽和結合 的情況下，將明顯無平臺——或自線性的偏離，而是隨著標記配體濃度增加，結合％保持線 性地增加。平臺是在實驗條件下可以獲得的最大結合，因為所有可用的特異性結合位點均 已被標記配體占據。當為了延緩或減少目標昆蟲物種的昆蟲抗性發展而在植物中組合不同殺昆蟲蛋 白時，重要的是在目標昆蟲物種中實驗性(即通過實施結合試驗)檢查所提議組合的不同 殺昆蟲蛋白是否在目標昆蟲的中腸中共享結合位點。在本發明中，當兩種不同的殺昆蟲蛋 白之間對單個結合位點存在競爭時(意味著，當對來自競爭結合實驗的結合數據作圖時， 兩種蛋白在競爭曲線的底部達到相同平臺)，從昆蟲抗性管理角度來看，這些蛋白質在植物 中不是有用的組合。如本文使用，當兩種不同的殺昆蟲蛋白結合兩個不同的結合位點時，從 昆蟲抗性管理角度來看，這些蛋白質是有用的。如本文使用，對于與不同結合位點結合的蛋 白，一種蛋白對另一種蛋白的結合位點的競爭不被認為是生物學顯著的(或者，換句話說， 被認為是生物學非顯著的競爭)，如果該競爭僅在該異源性競爭劑的非常高濃度下發生時 (例如，如果，通過對結合數據作圖(結合％對未標記配體濃度)來測定，IOOnM(或更多) 未標記的該異源性競爭劑僅置換很少量結合的標記配體(例如約25%或更少的標記配體 的特異性結合))。如果蛋白X僅以低親和力(例如，如果，通過對結合數據作圖(結合％對未標記配體濃度)來測定，IOOnM(或更多)未標記的該異源性競爭劑僅置換很少量結合的 標記配體(例如約25%或更少的標記配體的特異性結合))結合標記蛋白Y的結合位點，但 是在使用標記蛋白X的對等(reciprocal)結合試驗中不存在任何不同結合位點的證據，則 兩種蛋白有效地結合相同的結合位點，因此不適于組合用于抗性管理目的。在本發明中，因為變性蛋白的(結合)特征可不同于非變性蛋白，故使用變性BBMV 蛋白通過配體印跡測量Cry或VIP3蛋白的結合，不被認為是對存在于中腸中或BBMV制備 物中的實際特異性結合位點的可靠量度(其可以在使用放射性標記的或生物素化的蛋白 質的BBMV結合試驗中測量，因此在此測定試驗中結合是針對非變性BBMV蛋白的)。用于測試一對不同殺昆蟲蛋白對昆蟲幼蟲中的結合位點的共享的方法和技術，在 本領域是眾所周知的(參見例如，Van Rie等人，1989，Ferr6等人，1991)。首先，確定對目 標昆蟲(此處為谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾)均具有殺蟲活性的一對殺昆蟲蛋白。由谷實夜蛾 或棉鈴實夜蛾中腸，使用已知方法(參見例如，Wolfersberger等人1987)，制備刷狀緣膜 小泡(BBMV)，并分析經純化的標記蛋白(例如Cry2Ae、Cry2Ab、VIP3或Cryl蛋白)與此 BBMV的特異性結合。進行同源競爭測定試驗以確定是否結合是特異性的(在此，過量的未 標記的相同蛋白用作標記配體的競爭劑)，并進行異源競爭測定試驗以確定在這些BBMV中 另一種蛋白質是否競爭相同結合位點(在此，過量的未標記的不同蛋白用作標記配體的競 爭劑)。在此類異源競爭測定試驗中，當使用標記蛋白X和未標記蛋白Y作為競爭劑而未 發現競爭時，還使用標記蛋白Y和未標記蛋白X作為競爭劑進行對等實驗，以確認不存在競 爭。在同源競爭測定試驗中，如果標記蛋白的顯著一部分的結合被未標記蛋白(即同源競 爭劑)競爭(或置換)，那么該結合是特異性的一未被同源配體置換或競爭的結合部分被 認為是非特異性結合。可通過眾所周知的生物素標記、熒光標記技術、或通過放射性標記例 如通過使用Na125I (使用已知方法，例如氯胺-τ方法)，對用于本發明的蛋白(例如Cry2Ae、 Cry2Ab、VIP3或Cryl蛋白)進行標記。依照本發明，“核酸序列”是指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子、優選編碼任何用 于本發明的蛋白質的DNA或RNA、特別是DNA。本文使用的“分離的核酸序列”是指不再存 在于其所分離自的天然環境中的核酸序列，例如在其它細菌宿主或植物細胞核基因組中的 核酸序列。如本文使用，“異源”蛋白，例如當提及在植物中使用異源殺昆蟲蛋白時，是指天然 不存在于該生物體(例如植物)中的蛋白質，特別是由導入植物基因組中的轉基因編碼的 蛋白質，其中此蛋白質源自細菌蛋白。依照本發明，術語“蛋白質”或“多肽”可互換地用于指，由氨基酸鏈組成的分子， 而不涉及任何具體的作用模式、大小、三維結構或來源。因此，用于本發明的蛋白質的片段 或部分在本文仍稱為“蛋白質”。本文使用的“分離的蛋白質”是指，不再存在于其天然環境 中的蛋白質。蛋白質的天然環境是指當編碼其的核苷酸序列在其天然環境中(即在核苷酸 序列分離自的環境中)表達和翻譯時可以發現該蛋白質的環境。例如，分離的蛋白質可存 在于體外、或其它細菌宿主中或植物細胞中，或其可以自其它細菌宿主或自植物細胞分泌。本文使用的“殺昆蟲蛋白”應被理解為指，具有殺昆蟲活性、特別是對谷實夜蛾或 棉鈴實夜蛾幼蟲具有殺昆蟲活性的、完整蛋白質或其部分。這可以是天然存在的蛋白質或包含不同殺昆蟲蛋白的部分的嵌合蛋白或雜合蛋白(例如，通過利用基因改組，混合來自 不同蛋白的結構域，或混合不同蛋白的部分)，或可以是基本上具有細菌蛋白的氨基酸序列 但某些氨基酸被修飾的變體。在這點上，殺昆蟲蛋白可以是源自Bt或其它細菌菌株的VIP 或Cry蛋白，或由突變基因或重組基因(可通過基因改組、誘變等由編碼Bt殺昆蟲蛋白例 如Cry或VIP蛋白的基因獲得)編碼的蛋白質。本文使用的“原毒素”應理解為指，在中腸中發生任何斷裂之前編碼殺昆蟲蛋白的 全長基因的最初翻譯產物。通常，VIP3原毒素具有約88kD的分子量，CrylF或CrylA原毒 素具有約130-140kD的分子量，而Cry2A原毒素具有約60_70kD的分子量。本文使用的“毒素”或“最小毒性片段”應理解為殺昆蟲蛋白例如Cry2A、VIP3或 CrylF或CrylA蛋白的部分，其可以通過胰蛋白酶消化或通過在(目標昆蟲，例如谷實夜蛾 或棉鈴實夜蛾)中腸液中蛋白水解而獲得、且仍具有殺昆蟲活性。通常，在SDS-PAGE凝膠 上，VIP3或Cryl毒素具有約60_65kD的分子量，Cry2A毒素具有約50_58kD的分子量。本文使用的“VIP3蛋白”或“VIP3”是指對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾幼蟲具有殺昆蟲 性的蛋白質，其是在Crickmore等人Q008，見表3)中在VIP侖名網站www, lifesci. susx. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/VIP. html上列出的任何一種VIP3蛋白，或包含這些蛋白 質之任一的最小毒性片段的任何蛋白質。在一個實施方案中，這是對谷實夜蛾或棉鈴實夜 蛾具有殺昆蟲性的VIP3A蛋白，例如VIP3Aal (NCBI登錄號AAC37036)、VIP3Afl (NCBI登錄 號 CAI43275)、VIP3Aal9 (NCBI 登錄號 ABG20428)或 VIP3Aa20 蛋白(NCBI 登錄號 ABG20429)， 以及其任何殺昆蟲片段；或在氨基酸序列水平上與NCBI登錄號AAC37036的VIP3Aal蛋 白、或 NCBI 登錄號 CAI43275(ISP3A，WO 03/080656 的 SEQ ID No. 4)的 VIP3AH 蛋白、 特別是與它們的最小毒性片段，具有至少70%、特別是至少75^^80^^85^^90^^95%, 96%、97%、98%或99%序列同一性(如利用GCG Wisconsin軟件包的GAP程序(Madison, Wisconsin, USA，10. 2版)、使用成對比對來測定)的蛋白質。GAP程序使用下面參數用于 氨基酸序列比較‘bloSum62’評分矩陣，8的‘空位生成罰分’(或‘空位權重’)和2的 ‘空位延伸罰分’(或‘長度權重’)。在一個實施方案中，本文使用的VIP3蛋白是VIP3A蛋 白例如Estruch等人(1996，NCBI登錄號AAC37036)所述的VIP3Aal蛋白，和選自下組的 對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的VIP3A蛋白VIP3Ab、VIP3Ac、VIP3Ad、VIP3Ae、 VIP3Af、VIP3Ag 或 VIP3Ah、特別是 VIP3Afl、VIP3Adl 或 VIP3Ael 蛋白(分別為 NCBI 登錄號 CAI43275(ISP3a,W0 03/080656 的 SEQ ID No. 4)、CAI43276 (ISP3b，WO 03/080656 中的 SEQ ID No. 6)和 CAI43277(ISP3C，W0 03/080656 的 SEQ ID No. 2))及其殺昆蟲片段。當然，除 天然存在的VIP3蛋白和包含其殺昆蟲片段的蛋白之外，本文還包括由對谷實夜蛾或棉鈴 實夜蛾保留殺昆蟲活性的VIP3蛋白制成的雜合蛋白或嵌合蛋白，例如Fang等人Q007)所 述的嵌合VIP3AcAa蛋白，和某些氨基酸不同但保留親本分子的大多數或全部谷實夜蛾或 棉鈴實夜蛾毒性的VIP3蛋白突變體或等效物；例如，具有一些、優選5-10個、特別是小于5 個的添加、置換或缺失的氨基酸(優選在對應于最小毒性片段的部分中)且蛋白質的谷實 夜蛾或棉鈴實夜蛾殺昆蟲活性沒有明顯改變的VIP3蛋白變體，例如導入棉花植物(例如 W02004/039986或USDAAPHIS非管制狀態申請03-155_01p中所述的包含事件C0T102的植 物)中的VIP3Aal9蛋白(NCBI登錄號ABG20^8，EPA實驗應用許可手冊006499 Q007))、或 導入玉米植物(例如事件MIR162，USDAAPHIS非管制狀態申請07-253_01p)中的VIP3Aa20
16蛋白(NCBI登錄號ABG20429，WO 2007/1似840中的SEQ ID NO :2)、或在棉花事件C0T202 或C0T203(分別為WO 2005/0M479和WO 2005/054480)中產生的VIP3A蛋白、或包含這些 VIP3蛋白之任一的最小毒性片段的蛋白質、或具有1-5個氨基酸不同且對谷實夜蛾或棉鈴 實夜蛾保留毒性的這些VIP3蛋白之任一的變體。此外，在本發明的一個實施方案中，在本發明的VIP3蛋白中，任何推定的天然(細 菌)分泌信號肽都可以缺失或可以被Met氨基酸或Met-Ala 二肽或被合適的信號肽例如 葉綠體轉運肽置換。可以使用基于計算機的分析、利用程序例如信號肽搜索程序(SignalP VI. 1或2. 0)、使用用于原核生物革蘭氏陽性菌的矩陣和小于0. 5的閾值分數、尤其是0. 25 或更小的閾值分數，檢測推定的信號肽(Von Heijne, Gunnar, 1986和Nielsen等人，1996)。本文使用的“CrylF蛋白”或“CrylF”包括包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性 的CrylF蛋白的氨基酸序列的最小毒性片段的任何蛋白質，例如NCBI登錄號AAA22347的 蛋白質(US 2005049410的SEQ ID No. 10)、或Cryli^a蛋白。這也包括包含CrylF蛋白的最 小毒性片段、或至少一個結構域、優選3個結構域中的至少2個、的雜合蛋白或嵌合蛋白，例 如源自WO 1999/024581中的CrylF的雜合蛋白。此定義還包括NCBI登錄號AAA22347的氨 基酸序列的變體，例如與NCBI登錄號AAA22347(US2005049410的SEQ ID No. 10)的CrylF 蛋白具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，其中利用GCG Wisconsin軟件包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，10. 2版)、使用成對比對來測量序 列同一性，特別是此同一性針對對應于最小毒性片段的部分。GAP程序使用下面參數用于氨 基酸序列比較‘bloSum62’評分矩陣，8的‘空位生成罰分’(或‘空位權重’)和2的‘空位 延伸罰分’(或‘長度權重’)。優選地，此定義包括具有一些、優選5-10個、特別是小于5個 添加、置換或缺失的氨基酸而不明顯降低該蛋白質的谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾殺昆蟲活性的 蛋白質，例如為了克隆目的具有一個或多個保守性氨基酸置換的CrylF蛋白。本文使用的 CrylF蛋白包括由CrylF棉花事件281-24-236 (W02005/103266,參見USDA APHIS非管制狀 態申請 03-036-01p)中、或玉米事件 TC1507 或 Td675(US 7，288，643、WO 2004/099447、 USDA APHIS非管制狀態申請OO-136-Olp和03-181-01p)中的CrylF基因編碼的蛋白質，特 別是包含這些CrylF蛋白之任一的最小毒性片段的蛋白質、或具有1_5個氨基酸不同且對 谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的這些CrylF蛋白之任一的變體。本文使用的“Cry2Ae”蛋白是指殺昆蟲Cry2Ae蛋白，例如TO2002/057664的SEQ ID No. 2的全長Cry2Ae蛋白、Cry2Ae毒性片段或包含Cry2Ae毒性片段的蛋白質(如WO 2002/057664中所述)，例如Cry2Ae蛋白片段與葉綠體轉運肽或對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾 具有殺昆蟲性的另一肽序列的融合蛋白；或是包含如下氨基酸序列的對谷實夜蛾或棉鈴實 夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質，所述氨基酸序列與WO 2002/057664的SEQ ID No. 2的氨基酸 序列、特別是在對應于最小毒性片段的部分中，具有至少95、97或99%序列同一性；或是由 包含在棉花事件EE-GH6 (見要求歐洲專利申請號0707M60或0707M85 (未公開)的優先 權的PCT專利申請)中的Cry2Ae基因編碼的蛋白質、或包含這些Cry2Ae蛋白之任一的最 小毒性片段的蛋白質、或具有1-5個氨基酸不同且對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的這 些Cry2Ae蛋白之任一的變體。本文使用的“Cry2Ab” 蛋白是指 Crickmore 等人(1998,2008)或 www, lifesci. susx. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/中對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的任何一種Cry2Ab蛋白，例如全長Cry2Ab蛋白、Cry2Ab毒性片段、或包含Cry2Ab毒性片段的蛋 白質，例如Cry2Ab2蛋白片段與葉綠體轉運肽或對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的另一 肽序列的融合蛋白；或是包含如下氨基酸序列的對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的 蛋白質，所述氨基酸序列與NCBI登錄號CAA39075 (Dankocsik等人，1990)的編碼區、特別 是在對應于最小毒性片段的部分中，具有至少95、97或99%序列同一性；或是由包含在棉 花事件15985(見USDAAPHIS非管制狀態申請OO-342-Olp)中的Cry2Ab2基因編碼的蛋白 質、由包含在玉米事件M0N89034 (見USDAAPHIS非管制狀態申請06-298-0 Ip)中的Cry2Ab2 基因編碼的蛋白質，或包含所述Cry2Ab蛋白之任一的最小毒性片段的任何蛋白、或者具有 1-5個氨基酸不同且對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的所述Cry2Ab蛋白之任一的變體。本文使用的“CrylA”蛋白是指CrylAc、CrylΑ. 105或CrylAb蛋白，且包括包含對 谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的CrylAc、CrylA. 105或CrylAb蛋白氨基酸序列的最小毒 性片段的任何蛋白質，例如NCBI登錄號AAA22331的蛋白(CrylAc ；Adang等人，1985) ,NCBI 登錄號 AAA22330 的蛋白(Wabiko 等人，1986 (CrylAb)、或由玉米事件 M0N890;34 (USDAAPHIS 非管制狀態申請 06-298-Olp、WO 2007/140256、WO 2007/027777 中的 SEQ ID N0:2 或 4) 中的CrylA轉基因編碼的CrylA. 105蛋白、或由棉花事件C0T67B (USDA APHIS不解除管制 狀態申請07-108-01p、W02006/128573)中的cryIAb編碼區編碼的CrylAb蛋白的最小毒 性片段。這包括包含CrylA蛋白例如CrylAb或CrylAc的最小毒性片段、或至少一個結構 域、優選3個結構域中的至少2個、的雜合蛋白或嵌合蛋白，例如棉鈴蟲活性增加的嵌合或 雜合CrylA蛋白(如US 6，962，705或US 7，070，982中所述)。此定義還包括NCBI登錄 號 AAA22331 (CrylAcl)、NCBI 登錄號 AAA22330 (CrylAb、Wabiko 等人，1986)中的氨基酸序 列、或USDA APHIS非管制狀態申請06-298-01p中所述的CrylA. 105蛋白的氨基酸序列的 變體，例如在氨基酸序列水平上與所述CrylAc、CrylA. 105或CrylAb蛋白(特別是在對應 于最小毒性片段的部分中)具有至少90%、95 %、96%、97 %、98%或99 %氨基酸序列同一 性(如利用 GCG Wisconsin 軟件包的 GAP 程序(Madison, Wisconsin, USA, 10. 2 版)、使用 成對比對來測量)、具有CrylA蛋白的最小毒性片段的蛋白質。GAP程序使用下面參數用于 氨基酸序列比較‘bloSum62’評分矩陣，8的‘空位生成罰分’(或‘空位權重’)和2的‘空 位延伸罰分’(或‘長度權重’)。優選地，此定義包括具有一些、優選5-10個、特別是小于5 個添加、置換或缺失的氨基酸而不明顯改變該蛋白質的谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾殺昆蟲活性 的蛋白質，例如(為了例如克隆目的)具有一個或多個保守性氨基酸置換的CrylA蛋白。用于本發明的CrylA蛋白的實例包括由US 6，114，608的SEQ IDNO :3編碼的 CrylAb蛋白、特別是由玉米事件M0N810 (US 6，713，259，USDA APHIS不解除管制狀態申請 96-017-0 Ip及其補充)中的cry IAb編碼區編碼的Cry IAb蛋白、由玉米事件Bt 11 (USDA APHIS不解除管制狀態申請95-195-Olp、US專利6，114，608)中的cryIAb編碼區編碼的 CrylAb 蛋白、由棉花事件 3006-210-23 (US 7，179，965、WO 2005/103266, USDAAPHIS 不解 除管制狀態申請03-036-02p)中的轉基因編碼的CrylAc蛋白、由棉花事件C0T67B(USDA APHIS不解除管制狀態申請07-108-01p、W02006/128573)中的cryIAb編碼區、包含在棉 花事件EE-GH5(PCT專利申請PCT/EP2008/002667(未公布)中描述)中的CrylAb編碼 區、US專利7，049, 491的SEQ ID No. 2的CrylAb編碼區編碼的CrylAb蛋白、由玉米事件 M0N89034(USDA APHIS 非管制狀態申請 06-298_01p、W02007/140256、WO 2007/027777 中
18的SEQ ID N0:2或4)中的CrylA轉基因編碼的CrylA. 105蛋白、由棉花事件15985或棉花 事件 531,757 或 1076 (USDA APHIS 非管制狀態申請 94-308_01p、W0 2002/100163 的 cryIA 棉花事件編碼的嵌合CrylAc蛋白)中的雜合cryIAc編碼區編碼的CrylAc樣蛋白、由棉 花事件 T342-142、1143-14A、1143-51B、CE44-69D 或 CE46_02A(分別見 WO 2006/128568、 WO 2006/128569, WO 2006/128570, WO 2006/U8571 或 WO 2006/128572)中的 cryIAb 編 碼區編碼的 crylAb 蛋白(即由 WO 2006/128568, WO 2006/128569, WO 2006/U8571 或 W02006/128572 中的 SEQ ID No. 7 的 DNA 或由 WO 2006/128570 中的 SEQID No. 5 的 DNA 編 碼的蛋白質)。在本發明的一個實施方案中，使用來自上列的CrylAb或CrylA. 105蛋白或 包含其最小毒性片段的蛋白質、或包含這些CrylA蛋白之任一的最小毒性片段的蛋白質、 或具有1-5個氨基酸不同且對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾保留毒性的這些CrylA蛋白之任一的 變體。在本發明中，已發現在棉鈴實夜蛾中Cry2Ae和Cry2Aa蛋白與Cry2Ab蛋白競爭 相同的結合位點，且在谷實夜蛾和棉鈴實夜蛾中該結合位點不同于(即不共享)CrylAc的 結合位點。此外，在這些昆蟲物種中CrylAc對Cry2Ab的結合也不產生競爭。而且，早已報 導在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾中CrylF與CrylAc、以及CrylAc與CrylAb共享結合位點(例 如，Hernandez 和 Ferre，2005，Karim 等人，2000b ；Estela 等人，2004)。因此，在谷實夜蛾 或棉鈴實夜蛾中CrylAb、CrylF和CrylAc結合不同于Cry2Ae或Cry2Aa的結合位點的結 合位點。另外，已報導VIP3A蛋白與Cry2Ab結合不同的結合位點(Lee等人，2006)。由于 Cry2Aa和Cry2Ae與Cry2Ab共享共同的結合位點，所以在谷實夜蛾和棉鈴實夜蛾中Cry2Ae 或Cry2Aa蛋白與VIP3A蛋白結合不同的結合位點。盡管與所測試的Cry 1A、VIP3A或Cry2A 蛋白相比，通常CrylF蛋白對這些昆蟲物種具有較低的活性，但是它們屬于在植物中使用 最廣泛的Cryl蛋白，且由于它們與Cry2A蛋白不具有共享的結合位點，所以當然地如果植 物可以提供足夠高水平的CrylF蛋白表達，那么它們也可以用于昆蟲抗性管理。一些CrylF 源蛋白對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有較高的內在活性，且這些是本發明中更優選的CrylF 蛋白。當在CrylF與CrylA蛋白之間進行選擇以與Cry2A蛋白在給定植物物種中組合時， 考慮到CrylA蛋白例如CrylAb或CrylA. 105蛋白對于谷實夜蛾和棉鈴實夜蛾昆蟲物種具 有更高的內在毒性，對于延緩或防止谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的抗性發展而言，CrylA蛋白將 是更好的選擇。Bt &7蛋白例如07明、072六和07認蛋白在其天然宿主細胞(蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis))中以原毒素形式表達，它們在昆蟲腸中通過蛋白水解而轉化 成毒素形式。本文使用的CrylF、Cry2A或CrylA蛋白是指全長原毒素或毒素，或任何具有 殺昆蟲活性的中間體形式。在一個實施方案中，CrylF蛋白包括包含NCBI登錄號AAA22347 的氨基酸位置四至氨基酸位置604的氨基酸序列的蛋白質，CrylA蛋白包括包含NCBI登錄 號AAA2233l(CrylAcl ；Adang等人，1985)的氨基酸位置四至607的氨基酸序列、包含NCBI 登錄號AAA22330 (CrylAb、Wabiko等人，1986)的氨基酸位置四至氨基酸位置607的氨基酸 序列、或包含USDAAPHIS非管制狀態申請06-298-01p中圖IV-I的氨基酸位置四至氨基酸 位置607的氨基酸序列的蛋白質。本文使用的Cry2A蛋白包括包含US專利7，265, 269的 SEQ ID No. 2的氨基酸位置50至625的氨基酸序列的蛋白質、包含USDAAPHIS非管制狀態 申請06-298-01p中圖IV-2的氨基酸位置81至746的氨基酸序列的蛋白質、或包含NCBI登錄號CAA39075的氨基酸位置50至氨基酸位置626的氨基酸序列的蛋白質。本文使用的“Cryl”蛋白是指如上所定義的CrylF或CrylA蛋白。本文使用的 “Cry2A”蛋白不僅指如上所定義的Cry2Ae或Cry2Ab蛋白，而且也可以指Crickmore等人 (2008)中的任何對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2A蛋白，例如Cry2Aa蛋白。 本文使用的VIP3或cryl “基因”或“DNA”是指編碼本發明VIP3或Cryl蛋白的DNA。基因 可以全部或部分是天然存在的、人工的(修飾的)或合成的。本文使用的術語“事件”(event)是指在植物基因組中的特定位置特異性整合一 個或多個轉基因，其可被認為是包含所插入的序列和側翼植物序列的DNA的部分。事件可 通過雜交而進入相同物種的很多其它植物中或不同物種的植物中，從而允許通過育種技術 (包括技術例如胚胎拯救)與包含事件的植物雜交。本文使用的“包含”應被解釋為指存在提及的所述特征、整數、步驟或組分，但不排 除一個或多個其它特征、整數、步驟或組分或其組的存在或添加。因此，本文使用的術語“包 含序列或區域X的DNA/蛋白質”是指該DNA或蛋白質至少包括或含有序列或區域X，由此 在5’(或N末端)和/或3’(或C末端)末端可以包括其它核苷酸或氨基酸序列，例如轉 運肽(的核苷酸序列)、和/或5 ‘或3 ‘前導序列。本文使用的編碼VIP3或Cry蛋白的“嵌合基因“是指這樣的編碼VIP3或Cry的 DNA(或編碼區)，其5'和/或3'調控序列，至少5’調控序列或啟動子，不同于在該VIP3 或Cry蛋白的天然宿主細胞中驅動該VIP3或Cry蛋白表達的天然細菌5'和/或3'調控 序列，例如與可植物表達的啟動子可操作連接的VIP3或cry DNA,由此所述嵌合基因可在 含有其的植物中表達。嵌合基因無需在所有時間或在植物的每個細胞中都表達，例如，使用 創傷誘導型啟動子，表達可以被昆蟲的啃食或傷害所誘導，或者表達可局限于主要被昆蟲 例如谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾幼蟲攻擊的那些植物部分，特別是那些對種植者或農民最具價 值的部分，例如玉米植物的葉和穗，或棉花植物的葉和棉鈴、或大豆植物的葉和豆莢。因此， 表達本文使用的VIP3、Cry2A、CrylF或CrylA蛋白的植物是指，包含必要的編碼此類蛋白的 可植物表達嵌合基因的植物，由此該蛋白在相關組織中或在相關的時間期限表達，其無需 在所有植物組織中表達或無需在所有時間表達。為本發明的目的，表述為百分比的兩個相關核苷酸或氨基酸序列的“序列同一 性”是指，在最佳比對的這兩個序列內具有相同殘基的位置的數目除以所比較的位置數 (X100)。將空位(即，在比對中，在該位置處，在一個序列中存在殘基而在另一個序列中不 存在殘基)視作具有不同殘基的位置。為計算根據本發明的兩個序列之間的序列同一性， 可以利用使用 Needleman 和 Wunsch 算法(1970)且由 the Wisconsin Package, 10. 2 版， GeneticsComputer Group (GCG), 575Science Drive, Madison, Wisconsin 53711, USA 提供 的GAP程序。所用的GAP參數為空位生成罰分=50 (核苷酸)/8 (氨基酸)、空位延伸罰分 =3(核苷酸)/2(氨基酸)和評分矩陣“nwsgapdna”(核苷酸)或“bloSum62”(氨基酸)。GAP使用Needleman和^msch全局比對算法在序列全長上進行兩個序列的比對， 使匹配數目最大并使空位數目最小。默認參數為空位生成罰分=50 (核苷酸)/8 (蛋白)和 空位延伸罰分=3(核苷酸)/2(蛋白)。對于核苷酸，使用的默認評分矩陣是“nwsgapdna”， 對于蛋白質，默認評分矩陣為“blosum62” (Henikoff & Henikoff，1992)。在本文中VIP3或Cry DNA包括那些編碼VIP3或Cry蛋白的DNA、或其變體或雜
20合體，其中所述變體或雜合體對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性且在嚴格雜交條件下 與可編碼VIP3或Cry蛋白的DNA雜交。本文使用的“嚴格雜交條件”特別是指以下條件在 濾膜上固定相關DNA，并且在42°C、在50%甲酰胺、5% SSPE、2x Denhardt試劑和0. 1% SDS 中預雜交濾膜1至2小時，或者在68°C、在6x SSC、2x Denhardt試劑和0. 1% SDS中預雜 交濾膜1至2小時。然后將變性(地高辛配基-或放射_)標記探針直接加入預雜交液中， 在上述的適當溫度孵育16至M小時。孵育后，在室溫、在h SSC、0. 1% SDS中洗滌濾膜 30分鐘，接著在68°C、0. 5x SSC和0. 1 % SDS中進行各30分鐘的2次洗滌。通過在_70°C 用增感屏使濾膜曝光于X射線膠片(Kodak XAR-2或等效物) 至48小時，完成放射自顯 影成像。[20x SSC = 3M NaCl和0. 3M檸檬酸鈉；IOOx Denhart試劑=2% (w/v)牛血清白 蛋白，2% (w/v)FicolITM和2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮；SDS =十二烷基硫酸鈉；20x SSPE =3. 6M NaCl,0. 2M磷酸鈉和0. 02MEDTA pH7. 7]。當然，在該方法中可以使用等同的條件和 參數，同時仍保留期望的嚴格雜交條件。本文使用的蛋白質的“殺昆蟲活性”指，當喂食昆蟲此蛋白質時——優選通過在重 組宿主例如植物中表達此蛋白質來實現——該蛋白質能夠殺死昆蟲的能力。應理解，如果 蛋白質在昆蟲的至少一個發育階段、優選地幼蟲階段具有殺死昆蟲的能力，那么該蛋白質 具有殺昆蟲活性。如本文使用的，昆蟲物種群體對表達殺昆蟲蛋白的植物(該植物以前控制或殺死 所述昆蟲群體)“已經產生抗性”或“已成為抗性的”是指，與首次引入該植物時由相同昆 蟲物種造成的該植物的產量損失水平相比，在該植物中檢測到由該昆蟲群體造成的重復的 且顯著不可接受的產量損失。必須對此進行驗證，以檢查植物實際上正在產生殺昆蟲蛋白 (即它們不是非轉基因植物)，和此昆蟲群體的成員實際上需要更高量的殺昆蟲蛋白來控 制或殺死。換句話說，昆蟲群體已對其產生抗性的植物不再產生昆蟲控制量(如本文所定 義)或者不再對該昆蟲物種群體具有殺昆蟲性。因此，本文中，“昆蟲抗性發展”導致檢測到 增加的植物損害。在一個實施方案中，如果來自昆蟲物種群體的昆蟲可在植物上完成它們 的生命周期并繼續損害植物，而不是因為此植物中產生的殺昆蟲蛋白而造成它們的生長和 進食習性被抑制(在昆蟲抗性的一個極端形式中，在昆蟲攻擊下，該植物可受到像具有相 同遺傳背景的常規非轉基因植物一樣的損害)，則該昆蟲物種群體的昆蟲抗性是容易被觀 察到的。在一個實施方案中，可以在(標準)競爭結合試驗中使用谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾 BBMV分析Cry或VIP3蛋白與抗性昆蟲的結合，以確認該抗性歸因于結合位點修飾。本文還包括上述方法、用途、植物或植物細胞，其中除了 Cry或VIP3蛋白之外，Bt 毒素增強蛋白也在所述植物中表達，其中所述Bt毒素增強蛋白是蛋白質或其片段，S卩，昆 蟲中Bt毒素受體的一部分，優選包含或對應于結合結構域的部分，例如鈣粘著蛋白樣蛋白 的片段。此類蛋白質記載于公開的US專利申請20090018075中。可以將這些Bt毒素增強 蛋白與一種或多種Bt殺昆蟲毒素例如Cry蛋白一起飼喂給目標昆蟲。這些Bt毒素增強蛋 白可增強Bt殺昆蟲蛋白抵抗該受體的來源昆蟲物種以及抵抗其它昆蟲物種的毒素活性。 在一個實施方案中，所述Bt毒素增強蛋白是谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲的中腸細胞Bt毒 素受體的一部分。本文使用的“谷實夜蛾”(H. zea)是指谷實夜蛾(Helicoverpa zea，Boddie)，一種 重要的鱗翅目害蟲，也稱為(美洲)棉鈴蟲、玉米穗蟲(corn earworm)或番茄果蟲(tomatofruitworm)、高粱穗蟲(sorghum headworm)或巢菜蟲(vetchworm)。此昆蟲是玉米、棉花禾口 番茄中重要的害蟲，而且攻擊例如下述的植物朝鮮薊(artichoke)、蘆筍、卷心菜、網紋甜 瓜(cantaloupe)、羽衣甘藍、豇豆、黃瓜、茄子、萵苣、利馬豆(lima bean)、甜瓜、秋葵、豌豆、 胡椒、馬鈴薯、南瓜、食莢菜豆(snap bean)、菠菜、西葫蘆(squash)、甘薯(sweet potato)、 西瓜、紫花苜蓿、苜蓿(clover)、亞麻、燕麥、粟(millet)、稻、高粱、大豆、甘蔗、向日葵、煙 草、巢菜(vetch)和小麥。本文使用的“棉鈴實夜蛾”(H. armigera)是指棉鈴實夜蛾(Helicoberpa armigera，Hiibner)，一種重要的鱗翅目害蟲，其也稱為(非洲)棉鈴蟲、番茄蠐螬(tomato grubworm)、番爺蟲牙蟲(tobacco budworm)、玉米穗蟲(corn earworm)、舊世界棉鈴蟲或 scarce bordered straw，其是具有強遷移性的最為多寄主性的害蟲之一。此昆蟲是玉米和 棉花中重要的害蟲，但是它還攻擊植物，例如煙草、向日葵、亞麻子、大豆、苜蓿(Lucerne)、 豌豆例如木豆或鷹嘴豆、紅辣椒(chili)、秋葵、康乃馨、天竺葵和其它觀賞植物或花卉作 物、水果、蔬菜例如卷心菜、茄子(aubergine)、辣椒、番茄和黃瓜。本文中以一般意義使用的“棉鈴蟲”(cotton bo 11 worm/bo 11 worm)是指谷實夜蛾 和/或棉鈴實夜蛾。本文使用的蛋白質的“昆蟲控制量”是指足以將以植物為食的昆蟲(例如昆蟲幼 蟲)在該植物上造成的損害限制到商業可接受水平的蛋白量，例如通過殺死昆蟲或通過抑 制昆蟲發育、繁殖力或生長，使昆蟲對植物的損害變小并且使植物產量不受到顯著不利影 響。在本發明的一個實施方案中，本發明的VIP3和/或Cry蛋白以高劑量在用于本發 明的植物中表達。當提及用于本發明的植物時，本文使用的表述“高劑量”是指，殺昆蟲蛋 白在植物中的濃度(通過ELISA測定為總可溶性蛋白質的百分比，其中在標準提取緩沖液 中提取可溶性蛋白質后，使用Bradford分析(Bio-I ad，Richmond, CA ；Bradford, 1976)測 定該總可溶性蛋白質)，所述濃度可以殺死至少95%的出于目標昆蟲的如下發育階段中的 昆蟲，在該發育階段的昆蟲對殺昆蟲蛋白的敏感性與該昆蟲的1齡幼蟲期(first larval stage)相比顯著更低，優選低至少25倍(可在標準殺昆蟲蛋白生物測定試驗中分析)，并 因此預期該濃度可以確保對目標昆蟲物種的完全控制。本文使用的“結構避難所(structured refuge) ”是指，種植者或農民的種植Bt 植物的種植區或田地中的一部分，該部分未種植Bt植物，而是種植了不含Bt轉基因的植物 (相對地，圍繞農民的種植區的雜草或其它非Bt植物用作天然避難所)。用于評價和開發至少兩種殺昆蟲基因用于在目標昆蟲中防止針對表達這些基 因的轉基因植物的抗性發展的一般程序，可見于公開的歐洲專利申請EP408403。用于 受體結合分析領域的定義可以見于www, unmc. edu/PharmacoloRy/receptortutorial/ definitions/definitions, htm。依照本發明，已研究了 Cry蛋白與谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲幼蟲的中腸細胞 刷狀緣膜的結合。刷狀緣膜是VIP3或Cry蛋白的主要靶點，并且膜小泡，優選源自昆蟲 中腸刷狀緣膜(對于刷狀緣膜小泡，本文稱為BBMV)，可以根據本領域已知的方法例如 Wolfersberger 等人(1987)獲得。本發明涉及在轉基因植物中組合表達至少兩種殺昆蟲蛋白基因以延緩或防止目
22標昆蟲谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體中的抗性發展。所述基因插入到植物細胞基因組中，優 選插入到其細胞核基因組中，使得所插入的基因位于啟動子的下游并且與啟動子可操作地 連接，其中所述啟動子可指導基因在植物細胞中表達。在本發明的一個實施方案中，提供了對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有持久抗性的植 物，所述植物包含編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2A蛋白例如Cry2Ab或 Cry2Ae蛋白的嵌合基因、和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylA、VIP3和/ 或CrylF蛋白、優選如上定義的CrylAb、VIP3A或CrylA. 105蛋白的嵌合基因。本文還提供了 在轉基因植物中控制谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾侵擾同時獲得谷實 夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲對所述植物的抗性發展的較慢積累的方法，其包括在所述植物中表 達a)對所述昆蟲物種有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白和b)對所述昆蟲物種具有殺昆蟲性的 CrylA, CrylF或VIP3A蛋白的組合；和用于防止或延緩昆蟲物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群 體中針對表達殺昆蟲蛋白的轉基因植物的昆蟲抗性發展以控制所述昆蟲害的方法，其包括 在所述植物中表達對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白與對谷實夜蛾或 棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry 1A、CrylF或VIP3A蛋白的組合。在本發明的一個實施方案中，提供了在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲群體已對表達 VIP3A、CrylF和/或CrylA蛋白的植物產生抗性的地區中控制所述昆蟲物種的方法，其包 括在所述地區中播種或種植至少表達對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋 白的植物的步驟。本文還提供，在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體已對表達Cry2Ae蛋白的植物 產生抗性的地區中控制所述昆蟲的方法，其包括在所述地區中播種或種植表達對谷實夜蛾 或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylF、VIP3或CrylA蛋白的植物的步驟。依照本發明還提供，用于獲得包含編碼至少兩種不同的殺昆蟲蛋白的嵌合基因的 植物的方法，其中如在使用物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲幼蟲的刷狀緣膜小泡的競爭結 合試驗中測定的，所述蛋白質在所述昆蟲幼蟲中不具有共享的結合位點，所述方法包括以 下步驟獲得包含編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的可植物表 達嵌合基因和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylA、VIP3或CrylF蛋白的 可植物表達嵌合基因的植物。此處還提供播種、種植或生長植物的方法，所述植物被保護而免受棉鈴蟲損害， 其包含表達至少兩種不同的殺昆蟲蛋白的嵌合基因，其中如在使用谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾 幼蟲刷狀緣膜小泡的競爭結合實驗中測定的，所述蛋白在所述昆蟲物種的幼蟲中不具有共 享的結合位點，所述方法包括以下步驟播種、種植或生長包含編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜 蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性 的CrylA、VIP3或CrylF蛋白、優選對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的VIP3或CrylA 蛋白的嵌合基因的植物。本文還提供至少兩種不同的殺昆蟲蛋白在轉基因植物中用于防止或延緩谷實夜 蛾或棉鈴實夜蛾群體中的昆蟲抗性發展的用途，其中如可通過競爭結合實驗測定的，所述 蛋白在所述昆蟲物種的昆蟲中腸中不具有共享的結合位點，所述應用包括在所述轉基因 植物中表達對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白和對谷實夜蛾或棉鈴實 夜蛾具有殺昆蟲性的CrylF、VIP3或CrylA蛋白；和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺 昆蟲性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylF、VIP3或CrylA蛋白的嵌合基因、特別是編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的 Cry2Ae蛋白的嵌合基因和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的VIP3或CrylA蛋 白的嵌合基因的用途，用于防止或延緩昆蟲物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體中對表達殺昆 蟲蛋白的轉基因植物的昆蟲抗性發展以控制所述昆蟲害。在本文的一個實施方案中提供對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的 Cry2Ae蛋白和對所述物種昆蟲具有殺昆蟲性的Cry 1A、VIP3或CrylF蛋白的組合的用途， 用于防止或延緩所述物種昆蟲對表達異源性殺昆蟲毒素的轉基因植物的抗性發展，特別是 當所述應用通過在植物中表達所述蛋白組合而進行時。本文還提供包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的植物 在所述昆蟲物種的群體已對包含CrylF、VIP3和/或CrylA蛋白的植物產生抗性的地區中 的應用，其中所述應用可包括在所述地區中播種、種植或生長包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜 蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae蛋白的植物；和包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的 CrylF、VIP3和/或CrylA蛋白的植物在所述昆蟲物種的群體已對包含Cry2Ae蛋白的植物 產生抗性的地區中的應用，其中所述應用可包括在所述地區中播種、種植或生長包含對谷 實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的CrylF、VIP3和/或CrylA蛋白的植物。本發明還提供這樣的應用，其中播種、種植或生長具有不包含對谷實夜蛾或棉鈴 實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2、Cryl或VIP3蛋白的植物的避難所，例如通過將此植物播種、 種植或生長在包含本文所述的Cry2Ae、VIP3和Cryl蛋白的植物的相同種植區或附近。本文還提供上述用途或方法，其中植物以針對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的高劑量表 達Cry2Ae、VIP3、CrylF或CrylA蛋白，其中所述高劑量如本文中所定義。本文還提供生長、播種或種植表達Cry蛋白或VIP3蛋白的植物以控制棉鈴實夜 蛾或谷實夜蛾昆蟲的方法，其包括步驟在該種植區中或在該種植區附近種植、播種或生長 小于20%種植區的噴灑過殺蟲劑的結構避難所、或小于5%種植區的未噴灑過殺蟲劑的結 構避難所，或在種植區中不種植、播種或生長避難所，其中所述結構避難所位于相同的種植 區內，或者位于種植區的2英里內、1英里內或0. 5英里內，且含有不包含該Cry或VIP3蛋 白的植物，其中所述表達Cry蛋白或VIP3蛋白的植物表達對所述昆蟲物種具有殺昆蟲性的 Cry2Ae蛋白和對所述昆蟲物種具有殺昆蟲性的CrylA、CrylF或VIP3A蛋白、特別是Cry2Ae 和CrylAb或CrylAc或VIP3A蛋白、優選Cry2Ae和CrylAb和VIP3蛋白的組合。在本發明的一個實施方案中，還提供了特異地且可飽和地結合谷實夜蛾幼蟲中腸 中的結合位點的至少2種殺昆蟲蛋白的用途，用于延緩或防止該昆蟲物種對表達殺昆蟲蛋 白的植物的抗性發展，其中在所述植物中所述蛋白質之一是對該昆蟲物種具有殺昆蟲性 的Cry2A蛋白，例如Cry2Ab蛋白，而另一種蛋白質是對該昆蟲物種具有殺昆蟲性的Cry 1A、 CrylF或VIP3蛋白，其中在可飽和性試驗中確定所述的可飽和結合，所述試驗使用固定濃 度的結合位點(即BBMV)，并向所述結合位點加入濃度漸增的標記蛋白。特別地，在此用途 中，CrylA 蛋白選自下組=CrylAc, CrylAb, CrylA. 105、或 CrylAc 或 CrylAb 雜合蛋白，例 如由任何一種本文提及的crylA編碼區編碼的蛋白質。在谷實夜蛾昆蟲幼蟲的中腸中該 Cry2Ab和CrylA蛋白不存在對它們的(可飽和且特異的)結合位點的競爭，如可在BBMV競 爭結合試驗中測量的。本文還提供包含至少2個轉基因的植物或種子，其中每個轉基因各編碼不同的對
24谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質，所述蛋白質可飽和地且特異性地結合此類 昆蟲中腸中的結合位點，其中所述蛋白在此類昆蟲中不競爭相同結合位點，且其中所述蛋 白質為i)Cry2A蛋白和ii)CrylA、CrylF或VIP3蛋白。在一個實施方案中，所述植物包 含編碼下述蛋白的轉基因i)Cry2Aa、Cry2Ab 或 Cry2Ae、和 ii)CrylAb、CryIAc, CrylFa 或 VIP3A、特別是Cry2Ae蛋白和CrylAb和/或VIP3A蛋白。在另一個實施方案中，所述植物 或種子是包含編碼CrylA、CrylF或VIP3蛋白的嵌合基因和編碼Cry2A蛋白、特別是Cry2Ae 蛋白的嵌合基因的玉米或棉花植物或種子，其中所述植物或種子包含選自下組的轉化事 件玉米事件M0N89034、玉米事件MIR162、包含編碼Cry2Ae蛋白的轉基因的玉米事件、玉米 事件TC1507、玉米事件Btll、玉米事件M0N810、棉花事件EE-GH6、棉花事件C0T102、棉花事 件C0T202、棉花事件C0T203、棉花事件T342-142、棉花事件1143-14A、棉花事件1143-51B、 棉花事件CE44-69D、棉花事件CE46-02A、棉花事件C0T67B、棉花事件15985、棉花事件 3006-210-23、棉花事件531、棉花事件EE-GH5、棉花事件觀1-對_236，所有事件如本文進一 步的定義。本文還提供包含至少3個轉基因的植物，其中每個轉基因編碼不同的對谷實夜蛾 或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質，所述蛋白質可飽和且特異性地結合此類昆蟲中腸中 的結合位點，其中所述蛋白在此類昆蟲中不競爭相同結合位點，且其中所述植物包含編碼 CrylA或CrylF蛋白的嵌合基因、編碼Cry2A蛋白的嵌合基因和編碼VIP3A蛋白的嵌合基 因，且其中這些事件選自如上文段落所述的組。在本發明的一個實施方案中，在本發明的用途、方法或植物中，Cry2Ae、Cry2Ab、 VIP3、CrylF或CrylA嵌合基因是包含在上述特定玉米或棉花事件之任一中的嵌合基因。依 照本發明，還包括其中的術語Cry2Ae被術語Cry2Aa或Cry2Ab替代的本文所述的任何用 途、方法、植物或種子；以及涉及Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab蛋白的任何上述用途、方法、植物 或種子，其中該Cry2A蛋白與谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的中腸BBMV的結合是特異性的且可飽 和的，特別是當在直接可飽和性結合試驗中確定可飽和結合時；優選這樣的用途、方法、植 物或種子，其中在本文所述的標準競爭結合試驗中，在棉鈴實夜蛾或谷實夜蛾中任何所述 Cry2A蛋白和Cry 1A、CrylF或VIP3蛋白的特異性結合之間均沒有生物學顯著的競爭。在本發明的上述植物、種子、用途或方法中，優選的植物，例如對于將不同的嵌合 基因通過雜交而堆疊或組合在同一植物中而言，是包含任何一個上述玉米事件或任何一個 上述棉花事件的植物，以及其包含編碼所述Cry2A、和所述VIP3和/或Cryl蛋白的嵌合基 因的后代或子代。本文使用的植物或種子包括會顯著受到棉鈴蟲破壞的任何植物物種的植物或種 子，但特別包括玉米、棉花、稻、大豆、高粱、番茄、向日葵和甘蔗。本文還提供用于使表達對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質的植物 的種植或商品化獲得解除管制或獲得監管部門批準的方法；或用于減少含有不產生對谷實 夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的任何蛋白質的植物的結構避難所的方法；或用于種植不 具有結構避難所的種植區的方法，所述方法包括以下步驟引用、提交或依賴昆蟲試驗結合 數據，其中所述數據顯示Cry2A蛋白特異性且可飽和地結合所述昆蟲的昆蟲中腸膜、并且 所述Cry2A蛋白在所述昆蟲中不競爭Cry 1A、CrylF或VIP3蛋白的結合位點，例如本文所 公開的數據或在其它文件中報導的類似數據。在一個實施方案中，Cry2A蛋白是Cry2Aa、
25Cry2Ab 或 Cry2Ae 蛋白，且 CrylA 蛋白是 Cry lAc、CrylAb 或 Cry ΙΑ. 105 蛋白，且 VIP3 蛋白 是VIP3Aa蛋白。為了在大腸桿菌、其它Bt菌株和植物中表達編碼Cry2A、VIP3或Cryl蛋白的全長 DNA序列或其殺昆蟲有效部分，可以在該DNA序列的側翼導入適當的限制酶切位點。這可以 使用眾所周知的方法通過定點誘變來進行Gtanssens等人，1989 ；White等人，1989)。為 了在植物中獲得增強的表達，可以依照PCT公布WO 91/16432與WO 93/09218和公布EP 0 385 962、EP 0 359 472和US 5，689，052，對本發明的基因或殺昆蟲有效基因部分的密碼 子使用進行修飾以形成等效的、修飾的或人工的基因或基因部分，或可以將該基因或基因 部分插入質體、線粒體或葉綠體的基因組中，并使用合適的啟動子在該處進行表達(例如， Mc Bride 等人，1995 ；US 專利 5，693，507、WO 2004/053133)。由于遺傳密碼子的簡并性，可以將一些氨基酸密碼子置換為其他氨基酸密碼子而 不改變蛋白質的氨基酸序列，而且，一些氨基酸可以被其它等同氨基酸置換，而不顯著改 變，優選不改變，蛋白質的殺昆蟲活性，至少不以負向的方式改變蛋白質的殺昆蟲活性。例 如，只要不明顯降低蛋白質的殺昆蟲活性，在堿性(例如Arg、His、Lys)、酸性(例如Asp、 Glu)、非極性(例如 Ala、Val、Gly、Leu、lie、Met)或極性(例如 Ser、Thr、Cys, Asn、Gin) 類別內的保守性氨基酸置換落入本發明的范圍內。此外，只要不明顯降低蛋白質的殺昆蟲 活性，非保守性氨基酸置換也落入本發明的范圍內。本發明的DNA序列的變體或等同物包 括與用于本發明的Cry2A、VIP3、CrylF或CrylA蛋白的天然基因相比具有不同的密碼子使 用，但是編碼具有相同殺昆蟲活性和基本上相同(優選相同)的氨基酸序列的蛋白質的DNA 序列。利用可獲得的密碼子使用表，通過將密碼子使用適應性修改為植物基因中最優選的 密碼子使用，特別是原產于目的植物屬或物種的基因的密碼子使用(Bermetzen & Hall， 1982 ；Itakura等人，1977)，可以對DNA序列進行密碼子優化(例如使其更適應于在玉米、 棉花、稻、大豆、高粱、番茄、向日葵或甘蔗中表達)。用于各種植物物種的密碼子使用表由例 如 Ikemura(1993)和 Nakamura 等人(2000)公開。為了在單子葉植物例如玉米、甘蔗或稻中獲得增強的表達，也可以將內含子、優選 單子葉內含子加到嵌合基因中。例如，已顯示插入玉米Adhl基因的內含子到5'調控區， 可以增強在玉米中的表達(Callis等人，1987)。同樣地，可以使用US 5，859，347中描述的 HSP70內含子以增強表達。可以以翻譯中性方式，通過內含子定點插入和/或通過在密碼 子使用中導入改變(例如將密碼子使用調整至植物(優選具體的相關目標植物物種/屬) 的最優選密碼子使用(Murray等人，1989)而不明顯改變(優選不改變)所編碼的氨基酸序 列)，進一步改變殺昆蟲蛋白基因或其殺昆蟲部分的DNA序列，以修飾存在于該基因部分中 的可能的抑制性DNA序列。在本發明的一個實施方案中，使對VIP3、Cry2A、CrylF或CrylA蛋白敏感的棉鈴 蟲(谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾)與昆蟲控制量的、優選殺昆蟲量的這些蛋白質的組合接觸，例 如可以通過在這些粘蟲的靶植物中表達這些蛋白質或通過轉化植物以使這些植物及其后 代包含編碼這些蛋白的嵌合基因，來實現所述接觸。在一個實施方案中，這些粘蟲的靶植物 是玉米、棉花、稻、大豆、高粱、番茄、向日葵或甘蔗植物，特別是在北美、中美和南美州國家。 本文使用的術語植物包括全株植物和植物的部分，例如葉、莖、花或種子。在一個實施方案 中，在此類靶植物中組合本發明的至少3種在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾中結合不同結合位點
26的不同蛋白質，所述組合通過如下方式進行向靶植物提供編碼這些蛋白的必需嵌合基因、 所述蛋白為例如Cry或VIP3蛋白的任何一種下述組合Cry2Ab、CrylAb和VIP3A蛋白； Cry2Ab、CrylAc 和 VIP3A 蛋白；Cry2Ab、CrylF 和 VIP3A 蛋白；Cry2Ab、CrylΑ. 105 和 VIP3A 蛋白；Cry2Ae、CrylAb 和 VIP3A 蛋白；Cry2Ae、CrylA. 105 和 VIP3A 蛋白；Cry2Ae、CrylAc 和 VIP3A 蛋白；或 Cry2Ae、CrylF 和 VIP3A 蛋白。可以將編碼Cry2A、VIP3、CrylF或CrylA蛋白的殺昆蟲有效部分的殺昆蟲有效基 因、優選嵌合基因以常規方式穩定地插入到單個植物細胞的細胞核基因組中，并且可以以 常規方式使用由此轉化的植物細胞以產生具有昆蟲抗性的轉化植物。在這點上，可以使用 根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中的包含殺昆蟲有效基因的T-DNA載體轉化植 物細胞，此后可以使用例如在EP 0 116 718、EP 0 270 822、PCT公布WO 84/(^913和公開 的歐洲專利申請EPO 242 246和Gould等人(1991)中所述的方法，從轉化的植物細胞再生 轉化的植物。用于農桿菌介導的植物轉化的T-DNA載體的構建是本領域眾所周知的。T-DNA 載體可以是如EP 0 120 561和EP 0 120 515中所述的雙元載體，或者如EP 0 116 718中 所述的可通過同源重組整合到農桿菌Ti-質粒中的共整合載體。優選的T-DNA載體均包含 位于T-DNA邊界序列之間、或至少位于右邊界序列的左側的、與殺昆蟲有效基因可操作連 接的啟動子。邊界序列描述于Gielen等人(1984)中。當然，可以使用其它載體類型，利用 下述方法來轉化植物細胞例如直接基因轉移(例如在EP 0223247中描述)、花粉介導的 轉化(例如在EP 0270356和WO 85/01856中描述)、原生質體轉化(例如在US 4, 684,611 中描述)、植物RNA病毒介導的轉化(例如在EP 0 067 553和US 4，407，956中描述)、脂 質體介導的轉化(例如在US 4，536，475中描述)和其它方法，例如最近描述的用于轉化 某些玉米株系(例如，US 6，140, 553 ；Fromm等人，1990 ；Gordon-Kamm等人，1990)和稻株 系(Shimamoto等人，1989 ；Datta等人1990)的方法和一般性用于轉化單子葉植物的方法 (PCT出版物W092/09696)。對于棉花轉化，尤其優選PCT專利公開WO 00/71733中所述的 方法。對于稻轉化,參考WO 92/09696, WO 94/00977和WO 95/06722中所述的方法。Cry2A和VIP3、CrylF或CrylA蛋白的組合表達在被棉鈴蟲靶向(或損害)的植物 中是最有用的，所述植物包括玉米(飼料用玉米和甜玉米)、棉花、番茄、朝鮮薊、蘆筍、茄子 (aubergiens)、卷心菜、網紋甜瓜、羽衣甘藍、豇豆、黃瓜、茄子(eggplant)、萵苣、利馬豆、 甜瓜、秋葵、豌豆、胡椒、馬鈴薯、南瓜、食莢菜豆、菠菜、西葫蘆、甘薯、西瓜、紫花苜蓿、苜蓿、 亞麻、燕麥、粟、稻、高粱、大豆、甘蔗、向日葵、煙草、巢菜、小麥、煙草、亞麻子、豌豆例如木豆 或鷹嘴豆、紅辣椒、秋葵、以及康乃馨、天竺葵和其它觀賞植物或花卉作物、或水果作物；優 選玉米、棉花、稻、大豆、向日葵、番茄或甘蔗植物。因此，優選在這些植物之任何一種中，依 照本發明組合使用Cry2A蛋白和VIP3、CrylF或CrylA蛋白以延緩或防止棉鈴蟲的抗性 發展。本文所用的術語“玉米”是指玉蜀黍(Zeamays)。本文所用的“棉花”是指棉屬物種 (Gossypium spp.)、特別是陸地棉(G. hirsutum)和海島棉(G. barbadense)。術語“稻”是 指稻屬物種(Oryza spp.)、特別是稻(0. sativa)。“大豆”是指大豆屬物種(Glycine spp)、 特別是大豆(G.max)。甘蔗在本文用于指甘蔗屬(Saccharum)植物，一種高大的多年生禾 本科草，原產于溫帶至熱帶區，可用于提取糖。本文使用的向日葵是指向日葵(Helianthus annuus)0轉化的植物可用于常規的植物育種方案中，以產生具有相同特征的更多轉化植物或以將殺昆蟲有效基因部分引入到相同或親緣植物物種的其它品種中。獲自轉化植物的種 子包含作為穩定基因組插入物的殺昆蟲有效基因。可以以常規方式對轉化植物的細胞進行 培養以產生Cry2A、VIP3或Cryl毒素或蛋白質的殺昆蟲有效部分，然后可將其回收以用在 抗鱗翅目昆蟲的常規殺昆蟲組合物中。將殺昆蟲有效基因插入植物細胞基因組中，以使所插入基因位于可指導該基因部 分在植物細胞中表達的啟動子(可植物表達啟動子)的下游(即3')，并在該啟動子的控 制下。這優選通過在植物細胞基因組中、特別是在細胞核或質體(例如葉綠體)基因組中 插入嵌合基因而完成。可用于本發明的可植物表達啟動子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV)分 離物 CM 1841 (Gardner 等人，1981)、CabbB-S (Franck 等人，1980)禾Π CabbB-JI (Hull 和 Howell, 1987)的強組成型35S啟動子("35S啟動子”)；由Odell等人(1985)所述的35S 啟動子、來自泛素家族的啟動子(例如，Christensen等人1992，EP 0 342擬6的玉米泛素 啟動子，還參見Cornejo等人，1993)、gos2啟動子(de Pater等人，1992)、emu啟動子(Last 等人，1990)、擬南芥屬(Arabidopsis)肌動蛋白啟動子例如由An等人(1996)所述的啟動 子、稻肌動蛋白啟動子例如由^iang等人(1991)所述的啟動子和US 5，641，876中所述的 啟動子；木薯脈花葉病毒啟動子(W0 97/48819，Verdaguer等人(1998))、來自地下三葉草 矮化病毒(Subterranean Clover Stunt Virus)的 pPLEX 系列啟動子(W0 96/06932、特別 是S7啟動子)、醇脫氫酶啟動子例如pAdhIS (GenBank登錄號號X04049、X00581)、和分別驅 動T-DNAWl'和2'基因表達(Velten等人，1984)的TRl'啟動子與TR2'啟動子(分別 為‘‘TR1’啟動子”和‘‘TR2'啟動子”)。或者，可以利用非組成型的、但對植物的一種或多種 組織或器官(例如葉和/或根)具有特異性的啟動子，由此所插入基因部分僅在該特定組 織或器官的細胞中表達。例如，可以通過將殺昆蟲有效基因部分置于光誘導型啟動子的控 制下，在植物(例如玉米、棉花、稻、大豆)的葉中選擇性地表達殺昆蟲有效基因，所述光誘 導型啟動子可以是例如植物本身或另一種植物，例如豌豆的核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶小 亞基基因的啟動子，見US 5，2M，799中的公開。例如，可以選擇啟動子使得本發明的基因 僅在靶昆蟲害蟲啃食的那些組織或細胞中表達，以便與不表達該基因的植物相比，敏感性 靶昆蟲的進食對該宿主植物引起減少的昆蟲損害。另一種備選方案是使用可誘導表達的啟 動子，例如由Cordera等人(1994)所述的MPI啟動子，其通過創傷(例如由昆蟲的進食造 成的創傷)來誘導，或化學品誘導型啟動子，例如由Aoyama和Chua(1997)所述的地塞米松 誘導型啟動子，或溫度誘導型啟動子，例如US5，447，858中所述的熱休克啟動子，或可由其 它外界刺激誘導的啟動子。可以將殺昆蟲有效基因插入到植物基因組中，使得所插入基因位于合適的3'末 端轉錄調節信號(即轉錄物形成和聚腺苷酸化信號)的上游(即5')。這優選通過在植 物細胞基因組中插入嵌合基因而完成。聚腺苷酸化和轉錄物形成信號的類型不是關鍵的， 可包括CaMV 35S基因、胭脂堿合酶基因(D印icker等人，198 、章魚堿合酶基因(Gielen 等人，1984)或T-DNA基因7 (Velten和Schel 1，1985)的那些，其在轉化植物細胞中作為 3'-非翻譯DNA序列起作用。用于本發明嵌合基因的標記基因的選擇也不是關鍵的，且可以使用任何編碼如下 蛋白質或多肽的常規DNA序列，所述蛋白質或多肽使表達該DNA序列的植物細胞容易地與
28不表達該DNA序列的植物細胞區分開(EP0344(^9)。該標記基因可處于其自身啟動子的控 制下，且具有其自身的3'非翻譯DNA序列(如上公開)，條件是該標記基因處于在其鑒別 的基因的基因座附近的基因座中。標記基因可以例如是除草劑抗性基因例如sfr或sfrv 基因(EPA 87400141)；編碼經修飾的除草劑目標酶的基因，所述修飾的目標酶對該除草劑 的親和力比天然(非經修飾)目標酶低，例如作為草甘膦靶點的經修飾5-EPSP(美國專利 號4，535，060 ;EP 0218571)或作為谷氨酰胺合成酶抑制劑靶點的經修飾谷氨酰胺合成酶 (EP 0240972)；或抗生素抗性基因，例如neo基因(PCT公布WO 84/02913 ；EP 0193259)。可以遵照不同的常規方法以獲得至少兩個殺昆蟲蛋白基因在轉基因植物中的組 合表達，見EP 408403(并入本文作為參考)中的總結。這些方法包括在不同植物中轉化 單基因并雜交這些植物、使已分別導入了不同所需基因的植物雜交、在已轉化了一個基因 的植物中再轉化第二基因、使用不同質粒共轉化植物、用在一個轉化DNA上的至少兩個基 因轉化以使得這些基因插在相同的基因座上、使用翻譯融合基因用于轉化(參見例如，Ho 等人Q006))等。所得的轉基因植物可用于進一步的植物育種方案。可將所轉化的植物自交以獲得 對所插入基因而言的純合植物。如果該植物是近交系，那么該純合植物可用于直接產生種 子或作為親本系用于產生雜種品種。還可使用常規植物育種方法，將該基因雜交入自由授 粉群體或相同植物的其它近交系中。由于目前已經令人信服地證實，Cry2A蛋白特異地且可飽和地結合敏感目標昆蟲 害蟲的昆蟲中腸，所以可以通過本領域已知方法分離被Cry2A蛋白特異性結合的受體分 子。因此，本發明還包括用于分離Cry2A蛋白受體、特別是用作Cry2Ab受體的蛋白質的方 法，以及此類經分離的受體蛋白可以具有的多種用途。此類經分離的受體分子可用于篩選 試驗，以發現結合不同受體的蛋白質，以發現對受體具有提高的結合的蛋白質等。此外，此 類Cry2A受體的DNA序列可提供有用的篩選工具，用于篩選此類DNA中的變化(可以指示 導致抗性發展的該蛋白質的變化)。可以使用標準DNA檢測工具例如PCR，自田間收集的昆 蟲中，快速地進行這種篩選。
0123]序列表0124]SEQIDNo.1:Cry2Ael 蛋白0125]SEQIDNo.2:Cry2Ab2 蛋白0126]SEQIDNo.3= CrylFal 蛋白0127]SEQIDNo.4:VIP3Aal 蛋白0128]SEQIDNo.5:VIP3Afl 蛋白0129]SEQIDNo.6:VIP3Aal9 蛋白0130]SEQIDNo.7:VIP3Aa20 蛋白0131]SEQIDNo.8= CrylAcl 蛋白0132]SEQIDNo.9Cry ΙΑ. 105 蛋白0133]SEQIDNo.IC= CrylAbl 蛋白下面的實施例示例了本發明，但是不旨在對本發明或其保護范圍構成限制。除了在實施例中另有說明之外，根據Sambrook和Russell (2001)《分子克隆實 驗室手冊》(Molecular Cloning :A Laboratory Manual),第三版，Cold Spring Harbor
29Laboratory Press, NY ；Ausubel等人(1994)《現代分子生物學技術，現代技術》(Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols), USA 的第 1 卷禾口第 2 卷； Brown (1998)《植物分子生物學 Labfax》(Molecular Biology LabFax)，第 2 版，Academic Press(UK)的卷I和卷II中描述的標準方法，進行所有重組DNA技術。用于植物分子生 物學工作的標準材料和方法描述于R. D. D. Croy所著的《植物分子生物學Labfax》(Plant Molecular Biology Labfax(1993))(由 BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和 Blackwell Scientific Publications，UK聯合出版)中。用于聚合酶鏈式反應的標準材 料和方法可見于Dieffenbach和Dveksler (199 ((PCR引物實驗室手冊》(PCR Primer =A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press 禾口 McPherson 入(2000) PCR-Basics :From Background to Bench,第一版，Springer Verlag, Germany 中。
實施例實施例11. 1.材料與方法毒素純化和毒素的活化于沘.5 °C在連續搖動和補充空氣下、將來自Bacillus Genetic Stock Collection (Columbus, OH)的表達CrylAc的蘇云金芽孢桿菌菌株HD73在CCY培養基 Gtewart等人，1981)中生長48小時。將沉淀的不溶部分用IM NaClUOmM EDTA洗滌兩次， 用IOmM KCl洗滌1次。將CrylAc晶體溶于新制備的碳酸鹽緩沖液(50mM Na2C03/NaHC03, IOmM DTT ；pH 10. 5)中，在以150rpm搖動下于室溫孵育2. 5小時。通過于4°C以25000X g 離心10分鐘，棄去不溶殘渣。通過于37°C用胰蛋白酶(SigmaT-8642)以1 10(w w)的 胰蛋白酶蛋白質比率孵育2小時，活化溶解的CrylAc原毒素。于4°C以25000Xg離心 10分鐘后，將上清液在緩沖液A (20mM Tris_HCl，pH 8.65)中透析，過濾，然后在MonoQ 5/5 柱中使用λΚΤΑ色譜法系統(GE Healthcare, UK)進行陰離子交換純化。使用至60%的 緩沖液B(20mM Tris-HC1,1M NaCl，pH 8.65)的連續梯度洗脫活化的CrylAc毒素。除了在NEE 緩沖液(50mM Na2CO3, 5mM EDTA, IOmM EGTA ；ρΗ12· 1)中進行溶解外，如 CrylAc —樣地，對來自 Bacillus Genetic Stock Collection (Columbus，OH)的表達Cry2Aa 的菌株ECEU6進行生長和活化。于在80rpm搖動下、將表達Cry2Ab2的重組蘇云金芽孢桿菌菌株BtIPS78/ll 在含有6 μ g/ml氯霉素的C2培養基(Donovan等人，1988)中生長47小時。在加入了 250mM NaCl 的磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ (8mMNa2HP04, 2mM KH2PO4,150mM NaCl ；pH 7. 4)中進行兩個洗 滌步驟后，將細胞沉淀溶解于NEE緩沖液。加入取自新制備的25mg胰蛋白酶/ml的胰蛋白 酶至0. 3mg/ml最終濃度，將混合物于37°C孵育75分鐘，離心。用硫酸銨沉淀Cry2Ab毒素 溶液，將所得沉淀溶解于TEE緩沖液(50mOTris-HCl，5mM EDTA, IOmM EGTA ；pH 8.6)中。于在80rpm搖動下、將含有表達Cry2Ae的質粒pGA32的重組蘇云金芽孢桿 菌berliner變種1715cry-菌株在含有20 μ g/ml紅霉素的C2培養基中生長144小時。在 PBS+250mM NaCl中進行兩個洗滌步驟后，將細胞沉淀溶解于堿性緩沖液(0. IM CAPS, IOmM EGTA, 5mM EDTA，pH 12. 0)，于37°C孵育1小時。從新制備的7. 5mg胰蛋白酶/ml中加入胰 蛋白酶(以3 1比率，w/w)。將混合物于37°C孵育過夜，離心。用PBS透析Cry2Ae毒素溶液。生物測定試驗測試了每種活化的Cry蛋白的各7個不同濃度，針對每個濃度使用16條新生棉鈴 實夜蛾幼蟲。將50 μ 1體積的樣品稀釋液施加到分配到多空板中的人工飼料的表面。每個 孔中放入一條幼蟲。在65士5%的相對濕度和16:8(光照黑暗)的光周期下、于25士2°C 孵育板。7天后評價死亡率。使用POLO-PC概率值分析程序(LeOra Software, Berkeley, CA)對毒性數據進行分析。中腸分離和BBMV制備將棉鈴實夜蛾(ANGR菌株，CSIRO Entomology, Australia)和谷實夜蛾 (USDA-ARSjMS)的末齡幼蟲進行解剖，將中腸保藏于_80°C直到需要時為止。通過差示鎂沉 淀法(Wolfersberger等人，1987)制備BBMV，冷凍于液氮中，在_80°C貯存。使用牛血清白 蛋白作為標準通過Bradford法(1976)測定BBMV制備物中的蛋白質濃度。Cry毒素的放射性標記使用氯胺T方法對CrylAc和Cry2Ab毒素進行標記。在存在l/3v的18mM氯胺 T (PBS 中)下將 Na125I (0. 5mCi) (PerkinElmer，Boston, ΜΑ)加至 25 微克 Cry 毒素中。孵 育45秒后，通過加入l/4v的23mM偏亞硫酸氫鉀(于H2O中)終止反應。最后，加入l/4v 的IM NaI，將混合物裝載到用緩沖液柱QOmM Tris-HCl, 150mM NaCl,0. 1 % BSA)平衡過的 PDlO脫鹽柱(GE Healthcare, UK)上。通過SDS-PAGE、進一步將干凝膠對X射線膠片曝光， 分析洗脫級分，以檢查標記蛋白的純度。根據投入的毒素、蛋白質峰中洗脫的放射性、和由 SDS-PAGE(


圖1)揭示的毒素條帶中的放射性相對于次要條帶中的放射性的百分比，計算標 記毒素的比活性。經估計，1251-CrylAc和125I_Cry2Ab毒素的比活性分別為3mCi/mg和 2. 4mCi/mg。125I-標記的CrylAc和Cry2Ab的結合試驗使用前，將BBMV以16000Xg離心10分鐘，再懸浮于結合緩沖液(8mMNa2HP04, 2mM KH2PO4,150mM NaCl ；pH 7. 4 ;0. 1 %牛血清白蛋白)。通過于25°C在結合緩沖液中用 漸增量的125I_Cry2Ab將20微克來自棉鈴實夜蛾的BBMV孵育1小時，進行飽和實驗。孵 育后，將樣品以Ieoooxg離心10分鐘，將沉淀用500微升冷結合緩沖液洗滌兩次。在 LKB 1282Compugamma CS γ計數器中測量保留在沉淀中的放射性。通過將過量的未標記 Cry2Ab(l微摩爾)加至反應中，測定非特異性結合。通過將非特異性結合從總結合中減去， 計算特異性結合。為了測定BBMV用于競爭實驗的最佳濃度，于25°C在終體積為0. Iml的結合緩沖液 中分別使0. 4nM和1. 2nM標記的CrylAc和Cry2Ab與漸增量的BBMV孵育1小時。使用過 量的未標記毒素來計算非特異性結合。于25°C在存在漸增量的未標記毒素下、將20微克BBMV和lnM125I-Cry2Ab或5微 克BBMV和0.6nM125I-CrylAC孵育1小時，進行競爭實驗。對于定量測定，在Y計數器中測 定結合BBMV的標記毒素的級分。使用LIGAND程序(Munson和Rodbard，1980)，計算結合位 點的濃度和解離常數。對于定性測定，將沉淀在加樣緩沖液(Laemmli，1970)中煮沸10分 鐘，然后在SDS-PAGE中跑膠。曝光1周后，通過放射自顯影術檢測保留在沉淀中的標記毒素。
1.2.結果活化的Cry蛋白對棉鈴實夜蛾的毒性測試了 CrylAc和Cry2Ab制備物的毒性。活化的CrylAc和Cry2Ab蛋白對棉鈴實 夜蛾幼蟲具有毒性，LC5tl值示于表2中。而且，活化的Cry2Ae蛋白顯示對棉鈴實夜蛾具有 明顯的殺昆蟲活性。125I-Cry2Ab與棉鈴實夜蛾BBMV的特異性結合作為第一方法，通過用放射性標記的Cry2Ab孵育來自棉鈴實夜蛾的BBMV，測試 Cry2Ab的特異性結合(
圖1)。盡管于125I_Cry2Ab制備物中存在其它標記的污染物，但是 僅僅相應于Cry2Ab的條帶結合BBMV。過量的未標記Cry2Ab急劇減少125I_Cry2Ab的結合， 表明大多數這種結合是特異性的。相比之下，過量的未標記CrylAc不降低標記Cry2Ab的 結合，表明CrylAc不識別Cry2Ab結合位點。125I-Cry2Ab與棉鈴實夜蛾BBMV的結合的飽和通過用漸增濃度的標記Cry2Ab孵育棉鈴實夜蛾BBMV，證實了 Cry2Ab的結合是可 飽和的。在使用的條件(0. 2mg BBMV蛋白/ml)下，曲線約在5nM125I-Cry2Ab處開始偏離線 性，在約20nM時達到最大值(圖2)。應用棉鈴實夜蛾BBMV的競爭實驗為發現BBMV用于競爭結合實驗的最佳濃度，用漸增濃度的棉鈴實夜蛾BBMV孵 育固定濃度的125I_Cry2Ab。如預料的一樣，減去非特異性結合后，觀察到特異性結合的增 加，相應于結合位點的增加(圖3A)。選擇O.aiig/ml濃度的BBMV進行競爭結合實驗。用 125I-CrylAc進行了類似實驗，表明用于競爭實驗的最佳BBMV濃度為0. 05mg/ml (數據未顯 示)°在同源競爭試驗中用未標記Cry2Ab蛋白觀察到的125I_Cry2Ab置換證實，Cry2Ab 在此昆蟲中的結合是特異性且可飽和的(圖3B)。在我們的實驗條件下，也觀察到一些非特 異性結合。使用Cry2Aa和Cry2Ae作為異源競爭劑的競爭結合試驗顯示，這些Cry蛋白很容 易地與125I-Cry2Ab競爭(圖。相比之下，在所測試的濃度范圍中未標記的CrylAc不能 競爭125I-Cry2Ab的結合(比示于圖中的濃度更高濃度的CrylAc弓丨起了 125I_Cry2Ab的 沉淀)。這些結果表明，Cry2Ab結合位點被其它兩種Cry2毒素共享，但不被CrylAc共享。使用CrylAc、Cry2Ab、Cry2Aa 和 Cry2Ae 作為競爭劑，也進行了 125I-CrylAc 的競爭 試驗(圖3C)。沒有一個Cry2A蛋白與125I-CrylAc競爭結合，證實CrylAc和這些Cry2A蛋 白存在不同的結合位點。根據同源競爭曲線，計算了 Cry2Ab和CrylAc的結合參數，解離常數(Kd)和結合 位點濃度(Rt)(表1)。在這兩種情況下，同源競爭數據擬合單位點模型方程。如示于表1， 在棉鈴實夜蛾中Cry2Ab具有比CrylAc略多的特異性結合位點，但是對于它們的各自結合 位點，Cry2Ab的親和力低于CrylAc的親和力。Cry2Ab和CrylAc的放射性標記獨立地進行了兩次，并用新制備的第二個放射性 標記的CrylAc和Cry2Ab制備物，重復上文所述的所有實驗。用該第二組放射性標記的毒 素獲得的結果類似于上述的那些結果。在使用125I-Cry2Ab的競爭試驗中，對于VIP3Aa和Cryli^a蛋白，也沒有在棉鈴實 夜蛾BBMV中看到對Cry2Ab結合位點的競爭。
32
Cry2Ab與谷實夜蛾BBMV的特異性結合為證實從棉鈴實夜蛾的實驗中獲得的結合位點模型，也在谷實夜蛾中進行了結合 試驗。在這種昆蟲中，當將漸增量的BBMV與125I-Cry2Ab孵育時，也觀察到了特異性結合。 當使用相同的BBMV濃度范圍時，谷實夜蛾中結合的毒素的百分比低于棉鈴實夜蛾中結合 的毒素的百分比(比較圖4A和3A)。使用125I-Cry2Ab在谷實夜蛾中進行同源和異源競爭試驗。如在棉鈴實夜蛾中一 樣，未標記Cry2Ab競爭125I-Cry2Ab的結合位點(圖4B)。同源競爭間接地表明在這種昆蟲 中Cry2Ab的可飽和結合，因為在未標記競爭劑的濃度范圍中曲線反映了有限數量的結合 位點。異源競爭試驗表明CrylAc不與125I_Cry2Ab競爭。125I-CrylAc的實驗表明Cry2Ab不競爭CrylAc的結合位點(圖4C)，由此證明了 Cry2Ab和CrylAc在谷實夜蛾中也存在不同的結合位點。可以在直接可飽和性試驗中在谷實夜蛾的BBMV上獲得與在棉鈴實夜蛾BBMV上所 觀察到的類似的Cry2Ab蛋白的可飽和結合。而且，在谷實夜蛾中，Cry2Aa、Cry2Ab和Cry2Ae 蛋白也結合共同受體。此外，在Cry2Ab與Cry IAb、Cry 1 Ac、Cry 11 或VIP3Aa蛋白之任何一 個蛋白之間也不存在對結合位點的競爭。1. 3.結果分析用Cry2Ab進行的飽和結合實驗已表明，在敏感昆蟲中腸細胞的膜中存在有限數 量的特異性受體。用標記CrylAc進行的類似飽和試驗揭示，在相同濃度的BBMV下，使用 比在Cry2Ab試驗中少四倍的毒素，實現了結合位點的飽和(數據未顯示)。我們的結果 與來自Cry2Aa飽和結合試驗的先前結果是不同的，先前結果的結論是Cry2Aa蛋白質的 結合是不可飽和的(English等人，1994，Jurat-Fuentes等人，2003 ；EPA生物農藥手冊 006487 (2002))。對于在那些Cry2Aa飽和實驗中觀察到的或多或少線性的曲線，有很多可 能的解釋。首先，這些作者使用了標記的Cry2Aa原毒素而不是活化的毒素。而且，在一項 研究中用變性Cry2Aa蛋白進行標記，而并未核實在所用的條件下Cry2Aa可以耐受變性和 復性的循環(English等人，1994)。其次，在Cry2A原毒素不可溶的pH值下使用緩沖液 (Maples等人，2001)。在飽和實驗中，低溶解度和Cry2A蛋白聚集的趨勢(Perlak等人， 2001)可能導致由沉淀引起的回收的放射性的線性增加。第三，用于飽和實驗的Cry2Aa蛋 白的濃度范圍可能不足以飽和結合位點。所用范圍與用于CrylAc毒素的范圍相同，但由于 Cry2A蛋白的較低親和力，可能需要較高濃度的Cry2Aa蛋白來顯示結合位點的飽和。第四， 所用的BBMV濃度可能不足以區別特異性結合。如果結合位點濃度不足夠高，那么Cry2A蛋 白(與小泡組分和/或小瓶或過濾器)的高水平非特異性結合可能掩蓋特異性結合。在用125I-Cry2A毒素進行的某些研究中，BBMV結合能力試驗(即固定濃度的標記 毒素和漸增量的BBMV)被表現為125I-Cry2A飽和試驗(即固定的BBMV濃度和漸增量的標 記毒素)(Karim和Dean，2000，Karim等人，2000b，Luo等人，2007)。當實驗中結合位點的 濃度一直在變化時，結合位點的可飽和性是不能被確定的。因此，在這些研究中，基于了錯 誤類型的實驗來將Cry2A結合分類為可飽和的(Luo等人，2007)或不可飽和的(Karim和 Dean, 2000, Karim等人，2000b)。本研究是基于正確的飽和實驗描述Cry2毒素的可飽和結 合的第一份報告。在本研究中，棉鈴實夜蛾和谷實夜蛾中Cry2Ab的同源競爭試驗證實，存在有限數量的結合位點。實際上，如果Cry2A結合是不可飽和的，那么將存在基本上無限數量的可用 于結合的結合位點，并且未標記毒素與標記毒素對于這些位點的競爭將幾乎是不可能的。 在本實驗中，一定百分比的Cry2Ab結合似乎是非特異性的。但非常有可能的是，歸類為非 特異性結合的放射性中的大多數實際上是來自于沉淀的標記Cry2Ab的放射性。對來自同源競爭試驗的結合參數進行的分析得出，在本文所分析的兩個 Helicoverpa物種中，Cry2Ab毒素的解離常數(Kd)的值比CrylAc的值高約35倍，這表明 Cry2Ab的結合親和力較低。然而，就結合位點的濃度而言，兩毒素之間的差異低得多(約3 倍)。由競爭試驗計算得出的Cry2Ab和CrylAc的kd值與由棉鈴實夜蛾中的飽和實驗計算 得出的值相似(數據未顯示)。Mandal等人Q007)提出，某些作者所報導的Cry2A毒素的 低受體結合親和力歸因于在該毒素中額外N末端區域的存在。就我們所知，這是關于Cry2A蛋白之間的結合競爭試驗的第一份報告。標記 Cry2Ab和未標記Cry2Aa和Cry2Ae毒素的異源競爭實驗顯示，這些蛋白共享共同的結合位
點ο總的來說，我們的結果清楚地表明，Cry2A蛋白以高親和力可飽和地結合棉鈴實夜 蛾和谷實夜蛾BBMV中的特異性位點。此外，Cry2Aa, Cry2Ab與Cry2Ae共享該高親和力結 合位點，但不與CrylAc、VIP3或CrylF共享。此外，對于CrylAa、CrylAb和CrylAc，已報導 在所測試的所有昆蟲物種中至少一個共同的高親和力結合位點。證實Cry2A蛋白具有可飽 和的高親和力結合位點且該結合位點不同于CrylA蛋白的結合位點，對昆蟲抗性管理具有 重要的意義它對CrylA與Cry2A蛋白之間的抗性轉移(Cross-resistance)為什么那么罕 見給出了生物化學解釋，并且為在同一農作物中組合cryIA和cry2A基因以靶向棉鈴實夜 蛾或谷實夜蛾的抗性管理策略提供了可靠的支持。實施例2幾種方法可以預期用于在轉基因植物例如玉米或棉花植物中獲得至少兩個殺昆 蟲蛋白基因例如Cry2Ae和CrylAb基因的組合表達。第一種方法基于相繼的轉化步驟，其中對已轉化了第一嵌合基因的植物進行再轉 化，以引入第二基因。該相繼轉化優選使用兩個不同的選擇標記基因，例如卡那霉素抗性基 因和賦予對草銨膦除草劑的抗性的膦絲菌素乙酰轉移酶基因(例如，眾所周知的pat或bar 基因)。在De Block等人(1987)中已描述了這兩種選擇標記的應用。第二種方法基于在單個步驟中共轉化在不同質粒上編碼不同殺昆蟲蛋白的兩個 嵌合基因。可以通過利用與各自基因連接的選擇標記，選擇兩個基因的整合。此外，可以在獨立的轉化事件中，將兩個殺昆蟲蛋白基因各自單獨地轉移至不同 植物的細胞核基因組中，隨后可以通過雜交將其組合在單個植物中，并且可以使用DNA標 記技術來選擇包含這些不同基因的植物。將包含MIR162 事件(W0 2007/142840, USDA APHIS 非管制狀態申請 07_253_01p) 的玉米植物與包含含有WO 2002/057664的SEQ ID No. 9的編碼區的嵌合基因的玉米植物 雜交，產生表達VIP3A和Cry2Ae昆蟲控制蛋白的玉米植物。或者，將包含事件Btll (USDA APHIS非管制狀態申請95-195-Olp)的玉米植物或包含事件M0N810 (USDA APHIS請愿書 96-017-01p)的玉米植物與含有包含WO 2002/057664的SEQ ID No. 9的編碼區的嵌合基因 的玉米植物雜交，產生表達CrylAb和Cry2Ae昆蟲控制蛋白的玉米植物。
34
將包含如要求歐洲專利申請號0707M60或0707M85的優先權的PCT專利申請 (未公開)中所述的事件EE-GH6的棉花植物與包含PCT專利申請PCT/EP2008/0(^667中所 述的事件EE-GH5的棉花植物雜交，以獲得表達Cry2A和CrylA蛋白的棉花植物，該植物具 有對谷實夜蛾和棉鈴實夜蛾的內在昆蟲抗性管理。此外，將包含USDA APHIS 申請 03-155_01p (W0 2004/039986)的 C0T102 事件的棉 花植物與上述2基因棉花植物、或與含有包含W02002/057664的SEQ ID N. 7的編碼區的嵌 合基因和包含US專利7，049，491的SEQ ID No. 2的CrylAb編碼區的嵌合基因的棉花植物 雜交，以獲得表達VIP3A、CrylAb和Cry2Ae蛋白的棉花植物。可以通過昆蟲毒性測試和通過本領域已知的生物化學方法，評價至少兩個殺昆蟲 蛋白基因在單個轉化體中的共表達。特異性探針允許轉錄物水平的定量分析；與相應基因 產物交叉反應的單克隆抗體允許在ELISA試驗中定量分析相應基因產物；特異性DNA探針 允許表征轉化體中轉基因的基因組整合。當然，除了用于棉鈴蟲昆蟲抗性管理的Cry2A、VIP3和Cryl基因的上述組合之外， 這些植物還可包含其它轉基因，例如賦予對抗其它鱗翅目昆蟲物種或對抗來自其它昆蟲目 的昆蟲物種例如鞘翅目(Coleopteran)或同翅目(Homopteran)昆蟲物種的保護作用的基 因，或賦予除草劑耐受性的基因等。本文提及或引用的所有專利、專利申請和出版物或公眾公開(包括互聯網出版物 和非管制狀態申請)在與本說明書的明確教導相抵觸的程度上以其全文并入作為參考。本 文任何文件的引用都不意味著該文件形成本領域公知常識的部分。引用的參考文獻An 等人(1996) Plant J. 10，107Adang 等人(1985) Gene 36,289-300Aranda 等人(1996) J. Invertebr. Pathol. 68, 203-212Aoyama 禾口 Chua(1997)Plant Journal 11,605-612Ballester 等人(1999) Appl. Environm. Microbiol. 65，1413-1419Bennetzen & Hall(1982)J. Biol. Chem. 257，3026-3031Bradford(1976)Anal Biochem 72，248-254Callis 等人(1987)Genes Developm. 1，1183-1200Chalfant(1975)J. Georgia Entomo1. Soc. 10，32-33Christensen 等人(1992)Plant Mol. Biol. 18，675-689Cordera 等人(1994) The Plant Journal 6，141Cornejo 等人(1993) Plant Mol. Biol. 23，567-581Crickmore 等人(1998)Microbiol. Molecul. Biol. Revs. 62,807-813Crickmore 等人 Q008) “蘇云金芽孢桿菌毒素命名法(Bacillus thuringiensis toxin nomenclature)，，，www. lifesci. sussex. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/Dankocsik 等人(1990) Mol. Microbiol. 4, 2087-2094Datta 等人(1990) Bio/technology 8，736-740De Block 等人(1987) EMBO J. 6，2513-2518De Pater 等人(1992) Plant J. 2，834—844
35
D印icker 等人(I982)J. Molec. Appl. Genetics 1,561-573Donovan 等人(1988) J. Biol. Chem. 263 :561-567English 等人(1994) Insect Biochem. Molec. Biol. 24，1025-1035EPA生物農藥手冊006487 Q002)。蘇云金芽孢桿菌Cry2Ab2蛋白和在棉花中生產 ^Pfiwi^iMi^^J^ (006487), FactSheet (Environmental Protection Agency, USA (www. epa. gov)EPA實驗應用許可手冊006499 ^)07)蘇云金芽孢桿菌Vip3Aal9蛋白和在事 件C0T102棉花植物中產生其所需的遺傳物質(載體pCOTl) (006499)實驗應用許可手冊 (Environmental Protection Agency, USA, www. epa.gov)Estela 等人(2004) Appl. Environ. Microbiol. 70 :1378-1384Estruch 等人(1996)Proc Natl Acad Sci U S A. 93,5389-94Fang 等人(2007) Appl. Environm. Microbiol. 73,956-961Ferr6 等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,5119-5123Fiuza 等人(1996) Appl. Environm. Microbiol. 62，1544-1549Franck 等人(1980) Cell 21,285-294Fromm 等人(1990) Bio/Technology 8，833-839Gardner 等人(1981) Nucleic Acids Research 9，2871—2887Gielen 等人(1984) EMBO J 3，835-845Gordon-Kamm 等人(1990) The Plant Cell 2，603—618Gould 等人(1991) Plant Physiol. 95，426-434Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166，557-580Henikoff 禾口 Henikoff(1992)Proc. Natl. Academy Science 89，915—919Hernandez 禾口 Ferre(2005)Appl. Environm. Microbiol. 71,5627-5629Ho 等人(2006) Crop Sci 46，781-789Hofmann 等人(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85，7844-7848Hull and Howell(1987)Virology 86，482-493Ikemura, 1993,"Plant Molecular Biology Labfax”，Croy編輯，Bios Scientific Publishers Ltd.Itakura 等人(1977) kience 198，1056-1063Jurat-Fuentes 等人(2003) Appl Environ Microbiol. 69(10) :5898-906Karim 和 Dean(2000)Curr Microbiol. 41(4) :276-83Karim 等人(2000a) Curr Microbiol. 41(3) :214-9Karim 等人(2000b) Pesticide Biochem. Phisiol. 67 :198-216Laemmli 等人(1970)Nature 227,680-685Last 等人(1990) Theor. Appl. Genet. 81，581-588Lee 等人(2003) Appl. Environm. Microbiol. 69,4648-4657Lee 等人(2006) Biochem. Biophys. Res. Comm. 339，1043-1047Liao 等人(2002) J. Invertebr. Pathol. 80 :55Luo 等人(1999) Appl. Environm. Microbiol. 65,457-464
36
Luo 等人(2007) J Econ Entomol. 100(3) :909-15Mandal 等人(2007)蛋白 Eng Des Sel. 20(12) :599-606McBride 等人(1995) Bio/technology 13，362Munson & Rodbard(1980)Anal. Biochem. 107,220-239Murray 等人(1989)Nucleic Acids Research 17,477-498Nakamura 等人(2000) Nucl .Ac ids Res. 28,292Needleman 和 Wunsch(1970)J. Mol. Biol. 48，443-453Nielsen 等人(1996) Int. J. Neur· Sys.，8，581-599，1997Odeu 等人(1985)Nature 313,810-812Perlak 等人(2001) Plant J. 27(6) :489-501Rang 等人 O004) Curr. Microbiol. 49，22-27Robertson & Preisler (1992) CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, H 127 頁Sayyed 等人(2000) Appl. Environm. Microb. 66,1509-1516Shimamoto 等人(1989)Nature 338,274-276Stanssens 等人(1989)Nucleic Acids Research 12,4441-4454Staples 等人(2001) Curr Microbiol. 42(6) :388-92Stewart 等人(1981) Biochem. J. 198，101-106玉米事件MON 89034 的 USDA APHIS 非管制狀態申請 06-298_01p (2006)，參 見于2007年12月13日在US聯邦公報中公開的通告(72 FR70817-70819 ；檔案號 APHIS-2007-0030)Van Rie 等人(1989)Eur. J. Biochem. 186,239-247Velten 等人(1984) EMBO J 3，2723-2730Velten 和 Schell(1985) ,Nucleic Acids Research 13,6981-6998Verdaguer 等人(1998)，Plant Mol. Biol. 37，1055-1067Von Hei jne, Gunnar (1986) Nucl. Acids Res. 14 :11，4683—4690Wabiko 等人(1986)DNA 5,305-314Wolfersberger 等人(1987)，Comp. Biochem. Physiol. 86，301-308White 等人(1989) Trends in Genet. 5，185-189Zhang 等人(1991) The Plant Cell 3，1155-1165表1.棉鈴實夜蛾和谷實夜蛾中的結合參數
毒素棉鈴實_谷實_反/RtbKaRtCrylAcc Cry2Abd0.08士0.02e 3.1±0.50.96±0.10 2.5±0.30.17 士 0.04 5.9士1.5 ^10 士 2 !.7±0.5Kd值表示平衡解離常數，其根據同源競爭試驗計算，且以納摩爾濃度表示。bRt值表示結合位點濃度，且以皮摩爾/毫克BBMV蛋白表示。
37
e值是兩個重復的平均值。 d值是至少四個重復的平均值。 ee平均值士 SEM。^2^CrylAc和Cry2Ab活化蛋白對棉鈴實夜蛾新生幼蟲的毒性(7天后測量)
權利要求
1.用于防止或延緩昆蟲物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾群體中對表達殺昆蟲蛋白的轉基 因植物的昆蟲抗性發展以控制所述昆蟲害的方法，其包括在所述植物中組合表達對谷實夜 蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab蛋白與對谷實夜蛾或棉鈴實夜 蛾具有殺昆蟲性的VIP3、CrylF或CrylA蛋白。
2.在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲的群體已對包含VIP3、CrylF或CrylA蛋白的植物產 生抗性的地區中控制谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的方法，其包括步驟在所述地區中播種或種 植包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae蛋白的植物。
3.在谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲的群體已對包含Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae蛋白的植 物產生抗性的地區中控制谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的方法，其包括步驟在所述地區中播種 或種植包含對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的VIP3、CrylF或CrylA蛋白的植物。
4.用于獲得包含至少兩種不同的殺昆蟲蛋白的植物的方法，其中如在使用谷實夜蛾 或棉鈴實夜蛾昆蟲幼蟲的刷狀緣膜小泡的競爭結合試驗中測定的，所述蛋白質可飽和且 特異性地結合物種谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾幼蟲中的結合位點、并且所述蛋白質不共享結 合位點，所述方法包括以下步驟獲得包含編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的 Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae蛋白的可植物表達嵌合基因和編碼對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具 有殺昆蟲性的VIP3、CrylA或CrylF蛋白的可植物表達嵌合基因的植物。
5.權利要求4的方法，其中所述植物通過如下方式獲得用編碼所述Cry2Aa、Cry2Ab 或Cry2Ae蛋白和所述VIP3、CrylA或CrylF蛋白的嵌合基因轉化植物，和獲得包含所述嵌 合基因的所述植物的種子和后代植物；或將包含編碼Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab的嵌合基因 的親本植物與包含編碼VIP3、CrylA或CrylF的嵌合基因的親本植物雜交，和獲得包含所述 組合的嵌合基因的后代植物和種子。
6.播種、種植或生長植物的方法，所述植物通過表達至少兩種不同的殺昆蟲蛋白而被 保護免受谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的損害，其中如在使用刷狀緣膜小泡的競爭結合實驗中測 定的，所述蛋白質可飽和且特異性地結合所述昆蟲物種的幼蟲中腸中的結合位點、并且所 述蛋白質不共享結合位點，所述方法包括以下步驟播種、種植或生長包含編碼對谷實夜蛾 或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的Cry2Ab、Cry2Aa或Cry2Ae蛋白的嵌合基因和編碼對谷實夜 蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的VIP3、CrylA或CrylF蛋白的嵌合基因的植物。
7.權利要求2 6中任一項的方法，其中包含編碼殺昆蟲VIP3蛋白的嵌合基因 的所述植物選自下組包含編碼VIP3Aal、VIP3Aal9、VIP3Aa20或VIP3Af 1蛋白、或與 任何所述VIP3A蛋白具有至少70%序列同一性的殺昆蟲蛋白的嵌合基因的植物、包含 WO 2007/142840中所述USDAAPHIS申請07_253_01p的MIR162事件的玉米植物、包含 W02004/039986中所述USDA APHIS申請03_155_01p的C0T102事件的棉花植物、包含WO 2005/054479中所述的C0T202事件的棉花植物、和包含WO 2005/054480中所述的C0T203 事件的棉花植物。
8.權利要求2 7中任一項的方法，其中包含CryIA基因的所述植物選自下組包含編 碼CrylAc、CrylAb或CrylA. 105蛋白、或與任何所述CrylA蛋白具有至少90%序列同一性 的殺昆蟲蛋白的嵌合基因的植物、包含US專利6713259中所述USDAAPHIS申請96-017_01p 的M0N810事件的玉米植物、包含US專利6，114，608中所述USDA APHIS申請95_195_01p的 Btll事件的玉米植物、包含WO 2006/128573中所述USDAAPHIS申請07-108_01p的C0T67B事件的棉花植物、包含W02005/103^6中所述USDAAPHIS申請03_036_02ρ的3006-210-23 事件的棉花植物、包含WO 2002/100163中所述的CrylA基因事件，S卩，USDAAPHIS申請 94-308-01p的事件531的棉花植物、包含W02006/U8568-128572中所述的事件T342-142、 1143-14A、1143-51B、CE44-69D或CE46-02A中的任何一個事件的棉花植物、包含PCT專利 申請PCT/EP2008/002667中所述的事件EE-GH5的棉花植物、和包含W02007/140256中所述 的含CrylA基因的事件，即，USDA APHIS申請06_298_01ρ的Μ0Ν890;34事件的玉米植物。
9.權利要求2 8中任一項的方法，其中包含CrylF基因的所述植物選自下組包含編 碼Cryli^a蛋白或與所述Cryli^a蛋白具有至少90%序列同一性的殺昆蟲蛋白的嵌合基因的 植物、包含USDA APHIS申請00-136-01p(W0/2004/099447)的TC1507事件的玉米植物、包含 USDAAPHIS 申請03-181-01p 的 TC4675 事件的玉米植物、包含 USDA APHIS 申請03_036_01ρ 的觀1-對-236事件(W0 2005/103266的含CrylF基因的事件)的棉花植物。
10.權利要求2 9中任一項的方法，其中包含Cry2Ae基因的所述植物選自下組包 含編碼Cry2Ae蛋白或與所述Cry2Ae蛋白具有至少95 %序列同一性的殺昆蟲蛋白的嵌合基 因的植物、包含含有WO 2002/057664的SEQ ID No. 7或9的編碼序列的嵌合基因的植物、 包含要求歐洲專利申請號0707M60的優先權的PCT專利申請中描述的事件EE-GH6的棉花 植物。
11.權利要求2 10中任一項的方法，其中包含Cry2Ab基因的所述植物選自下組包 含編碼Cry2Ab蛋白或與所述Cry2Ab蛋白具有至少95 %序列同一性的殺昆蟲蛋白的嵌合基 因的植物、包含USDA APHIS非管制狀態申請OO-342-Olp中所述的Cry2Ab事件15985的棉 花植物、包含USDAAPHIS非管制狀態申請06-298-01p中所述的Cry2Ab事件M0N89034的玉 米植物。
12.權利要求2 6中任一項的方法，其中所述嵌合Cry或VIP基因包含Cry2Ae、 072々13、￥1 34、07認或07明編碼區，選自包含于權利要求8 12中所述的任一個棉花或 玉米事件中的任何一個(^^^丄巧2六13、￥1 3六、07認或07明編碼區，或其中所述072八13、 Cry2Ae、VIP3、CrylA或CrylF嵌合基因是包含在任何一個所述棉花或玉米事件中的任何一 個 Cry2Ae、VIP3、CrylF 或 CrylA 嵌合基因。
13.權利要求1 12中任一項的方法，其中所述植物選自下組玉米、棉花、稻、大豆、 番茄、向日葵和甘蔗。
14.權利要求1 13中任一項的方法，其中所述方法還包括種植具有不包含編碼Cry 或VIP蛋白的嵌合基因的植物的避難所。
15.權利要求1 14中任一項的方法，其中所述植物提供針對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾 的高劑量的Cry2、Cryl或VIP3蛋白。
16.權利要求1 15中任一項的方法，其中所述Cry2A蛋白是Cry2Ab蛋白，且所述結 合是可飽和且特異性的。
17.包含至少Cry2A和Cryl或VIP3轉基因的植物或種子，其中每個轉基因編碼不同 的、對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的、可飽和且特異性地結合所述昆蟲中腸中的 結合位點的蛋白質，其中所述蛋白質在該昆蟲中不競爭相同的結合位點，且其中所述Cry2A 蛋白是包含Cry2Aa或Cry2Ae蛋白的最小毒性片段的蛋白質，且所述Cryl或VIP3蛋白是 包含CrylAb、CryIAc, CrylFa或VIP3A蛋白的最小毒性片段的蛋白。
18.權利要求17的植物或種子，其是包含至少2個選自下組的轉化事件的組合的玉 米或棉花植物或種子玉米事件M0N89034、玉米事件MIR162、包含編碼Cry2Ae蛋白的轉基 因的玉米事件、玉米事件TC1507、玉米事件Btll、玉米事件M0N810、棉花事件EE-GH6、棉花 事件C0T102、棉花事件C0T202、棉花事件C0T203、棉花事件T342-142、棉花事件1143-14A、 棉花事件1143-51B、棉花事件CE44-69D、棉花事件CE46-02A、棉花事件C0T67B、棉花事件 15985、棉花事件3006-210-23、棉花事件531、棉花事件EE-GH5和棉花事件沘1-對_236。
19.權利要求18的植物或種子，其中所述玉米或棉花植物或種子包含至少3個選自 下組的轉化事件的組合玉米事件M0N89034、玉米事件MIR162、含有編碼包含Cry2Ae蛋 白的最小毒性片段的蛋白質的轉基因的玉米事件、玉米事件TC1507、玉米事件Btll、玉米 事件M0N810、棉花事件EE-GH6、棉花事件C0T102、棉花事件C0T202、棉花事件C0T203、棉 花事件T342-142、棉花事件1143-14A、棉花事件1143-51B、棉花事件CE44-69D、棉花事件 CE46-02A、棉花事件C0T67B、棉花事件15985、棉花事件3006-210-23、棉花事件531、棉花事 件EE-GH5和棉花事件沘1-對_236。
20.用于獲得種植或商品化表達對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質的植 物的監管部門批準的方法，其包括以下步驟引用、提交或依賴顯示Cry2A蛋白在該昆蟲中 不競爭Cry 1A、CrylF或VIP3蛋白的結合位點的昆蟲試驗結合數據。
21.用于減少種植區中含有不產生對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的任何蛋白 質的植物的結構避難所的方法，該方法包括以下步驟引用、提交或依賴顯示Cry2A蛋白在 該昆蟲中不競爭Cry 1A、CryIF或VIP3蛋白的結合位點的昆蟲試驗結合數據。
22.權利要求20或21的方法，其還包括以下步驟引用、提交或依賴顯示Cry2A蛋白 可飽和地結合谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾中腸中的結合位點的直接可飽和性試驗。
23.權利要求20 22中任一項的方法，其中所述Cry2A蛋白是包含Cry2Ae蛋白的最 小毒性片段的蛋白質，且其中所述CrylA、CrylF或VIP3蛋白是權利要求7 9中所定義的 任何一種該蛋白質。
24.控制谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾昆蟲的昆蟲抗性轉基因植物的種植區，其中所述種植 區具有小于20%、小于15%、小于10%或小于5%的結構避難所，或不具有結構避難所，其 中所述植物組合表達對棉鈴實夜蛾或谷實夜蛾昆蟲具有殺昆蟲性的Cry2Ae或Cry2Ab蛋白 和對棉鈴實夜蛾或谷實夜蛾昆蟲具有殺昆蟲性的Cry 1A、CrylF或VIP3A蛋白，特別是對棉 鈴實夜蛾或谷實夜蛾昆蟲具有殺昆蟲性的Cry2Ae和CryIAb、CryIAc或VIP3A蛋白，優選對 棉鈴實夜蛾或谷實夜蛾昆蟲具有殺昆蟲性的Cry2Ae、CrylAb和VIP3蛋白。
全文摘要
本發明涉及在昆蟲抗性管理計劃中組合應用不同的對谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾具有殺昆蟲性的蛋白質，其中所述蛋白質為a)Cry2A蛋白，例如Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae和b)Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白，特別是其中所述蛋白質可飽和地結合谷實夜蛾或棉鈴實夜蛾的昆蟲中腸膜；還涉及表達此類蛋白質組合的植物和種子，其用于延緩或防止此類昆蟲物種群體中的抗性發展。
文檔編號A01H5/10GK102066566SQ200980122165
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月16日 優先權日2008年6月13日
發明者弗里埃特 A·范, C·S·赫爾南德茨, J·F·曼扎納羅, 里 J·范 申請人:拜爾生物科學公司