一種小報春的花藥培養(yǎng)方法

專利名稱：一種小報春的花藥培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，具體地說，涉及小報春(Primulaforbesii Franch.)的 花藥培養(yǎng)方法。
背景技術：
小報春(Primula forbesii Franch.)為我國特有的報春花科報春花屬二年生草 本植物，原產(chǎn)海拔1500 2000m的我國云南地區(qū)。小報春(Primula forbesii Franch.) 是典型的自交不親和(self-incompatibility)植物，長期的異花授粉使其后代性狀分離 廣泛，難以穩(wěn)定遺傳。傳統(tǒng)的雜交方法費時費力，育種周期較長。 為了縮短育種進程，盡快將優(yōu)異的報春資源進行純化，穩(wěn)定。需要采用花藥培養(yǎng)的 方法獲得小報春單倍體，形成一套完整的花藥培養(yǎng)技術體系，為今后的單倍體加倍獲得雙 單倍體的純合種質(zhì)奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小報春(Primula forbesii Franch.)的花藥培養(yǎng)方法， 以獲得小報春單倍體植株，通過單倍體育種途徑可快速獲得純合材料，增加有益性狀的選 擇幾率，加快育種進程。 本發(fā)明提供一種小報春的花藥培養(yǎng)方法，包括外植體的選擇、外植體的消毒與接 種、愈傷組織誘導與增殖、愈傷組織分化、組培苗生根培養(yǎng)與移栽，其中，所述愈傷組織誘導 與增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA1. 0mg/L+2， 4-D 0. 5mg/L， 30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，pH為5. 9 6. 0 ;所述愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0. 2mg/L+NAA 0. 01mg/L， 40g/L蔗糖，7g/L瓊脂， pH為5. 9 6. 0 ;所述生根培養(yǎng)基為MS， pH為5. 9 6. 0。 所述的外植體為小報春稍露色的花藥；應選擇小孢子發(fā)育時期大多處于單核靠 邊期的花藥進行培養(yǎng)，此時從外觀上花蕾明顯膨大，花瓣微露出花萼，長度在4. 0-5. 0mm之 間。 所述愈傷組織誘導與增殖時，光照條件為人工輔助光1500 2000Lux ;溫度為 24 26。C，光照時間12 14h/d。 所述愈傷組織分化時，光照條件為人工輔助光2000 3000Lux ;溫度為24 26。C，光照時間12 14h/d。 所述生根培養(yǎng)時，光照條件為人工輔助光2000 3000Lux ;溫度為24 26°C ，光 照時間12 14h/d。 所述組培苗的移栽溫度為18 25°C 。 所述外植體采用流水下沖洗lh，70% (體積比)乙醇進行表面消毒，消毒時間為 30s，無菌水沖洗3 5次后，2X次氯酸鈉(重量比)進行表面消毒，消毒時間控制在8 10min，無菌水沖洗3 5次。 所述組培苗經(jīng)在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 3周后，煉苗3 4天移栽至溫室細草炭
3土中培養(yǎng)。 本發(fā)明所述的小報春的花藥培養(yǎng)方法，具體為選取小報春的稍露色、長度在 4. 0 5. 0mm之間的花藥為外植體，經(jīng)流水下沖洗lh， 70%乙醇進行表面消毒，消毒時間為 30s，無菌水沖洗3 5次后，2%次氯酸鈉進行表面消毒，消毒時間控制在8 10min，無菌 水沖洗3-5次；接種到花藥愈傷組織誘導培養(yǎng)基，MS+6-BA 1. 0mg/L+2，4-D 0. 5mg/L，30g/L 蔗糖，6g/L瓊脂，pH為5. 9 6. 0 ;光照條件為人工輔助光1500 2000Lux ;溫度為24 26t:，光照時間12 14h/d ;之后移至相同培養(yǎng)基進行增殖，繼代2 3次后轉(zhuǎn)入愈傷組織 分化培養(yǎng)基，MS+6-BA 0. 2mg/L+NAA 0. 01mg/L， 40g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH為5. 9 6. 0 ;光 照條件為人工輔助光2000 3000Lux ;溫度為24 26。C，光照時間12 14h/d ;將分化的 組培苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS， pH為5. 9 6. 0 ;光照條件為人工輔助光2000 3000Lux ;溫 度為24 26°C ，光照時間12 14h/d ;生根培養(yǎng)2 3周，煉苗3 4天后，移至細草炭土 中培養(yǎng)，保持濕度高于80%，每天噴水2 3次。 組培苗移栽時的溫度應控制在18 25t:之間，過高或過低都不利于組培苗的成 活，夏季不宜進行組培苗的移栽。 —般來說，盛花期的小報春著花量很大，每株植株可以產(chǎn)生200朵以上的花朵數(shù) 量，因此花藥的取材十分充足。通過小報春(Primulaforbesii Franch.)花藥培養(yǎng)再生的 組培苗生長良好。 與傳統(tǒng)技術相比，本發(fā)明小報春(Primula forbesii Franch.)的花藥培養(yǎng)方法具 有以下有益效果 1)建立了一種小報春(Primula forbesii Franch.)的花藥培養(yǎng)方法，相比傳統(tǒng)的 自交獲得純合系的方法比，后者至少需要3-5年才可獲得純系，而花藥培養(yǎng)擺脫了季節(jié)與 氣候的限制因素，只需10-12個月就可獲得大批量的單倍體，大大縮短了育種進程，為今后 的單倍體直接加倍成純合雙單倍體奠定基礎； 2)本發(fā)明方法中，生根率為70%左右，移栽成活率達到80%以上。通過組織培 養(yǎng)方法得到的幼苗，成長良好，一致性強，適應性較強，病蟲害少，易于管理，易于規(guī)?；?產(chǎn)； 3)利用花藥培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)的報春花資源，可以保持該優(yōu)良種質(zhì)的特性不變，之后直接 染色體加倍后即可形成具有特異性、一致性、穩(wěn)定性的新品種。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 小報春(Primula forbesii Franch.)小孢子發(fā)育時期的觀察。
花期時采集不同大小的花蕾，分別測量花蕾長，觀察花蕾發(fā)育時期等指標。用鑷子 剝?nèi)ポ嗥?、花瓣，剝出花藥置于載玻片上，加一小滴卡寶品紅，用鑷子搗碎，去除殘渣，蓋上 蓋玻片，顯微鏡鏡檢，總結(jié)花蕾長度、外觀等與小孢子發(fā)育時期的關系。經(jīng)過試驗觀察發(fā)現(xiàn)， 小報春(Primula forbesii Franch.)小孢子發(fā)育可分為4個時期，分別為四分體時期、單 核中期、單核靠邊期和成熟期?；ɡ俨伙枬M，長度小于3. Omm，此時萼片包裹著花冠的小孢子 發(fā)育處在四分體時期；花蕾長在3. 0 4. Omm，飽滿，花萼與花瓣等長的花藥小孢子發(fā)育處于單核中期；花蕾明顯膨大，花瓣微露出花萼，長度在4. 0 5. 0mm之間的花蕾，其小孢子發(fā) 育時期大多處于單核靠邊期，滿足花藥培養(yǎng)的發(fā)育條件?；ɡ匍L度大于5. 0mm，花萼充分膨 大，花瓣明顯露出花萼的花藥小孢子處于成熟期。
實施例2 以小報春(Primula forbesii Franch.)小孢子發(fā)育時期為單核靠邊期的花藥為 外植體進行愈傷組織誘導培養(yǎng)。探討愈傷組織誘導的最佳基本培養(yǎng)基以及激素濃度最佳配 比。 天氣晴朗、干燥的上午9時左右，采集溫室內(nèi)生長的單核靠邊期的花蕾備用。先用 70%的酒精浸泡30s，然后用2%的次氯酸鈉溶液消毒10分鐘，用無菌水沖洗3 4次。在 超凈工作臺上用小鑷子剝出花藥，去除花絲，盡量避免花藥受到傷害，接種于培養(yǎng)皿中，用 保險膜封口。每個培養(yǎng)皿接種20個花藥，每個處理接種5個培養(yǎng)皿。 選取MS、 B5、 N6三種培養(yǎng)基作為小報春花藥培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。加入不同濃度配 比的6-BA和2，4-D激素，以愈傷組織誘導率為依據(jù)選取最佳激素配比。6-BA的濃度設為 1. 0mg/L和2. Omg/L兩個梯度，2，4-D的濃度設為0. 5mg/L、1. 0mg/L、1. 5mg/L、2. Omg/L四 個梯度，采用三因素完全隨機試驗設計，組合了 24組培養(yǎng)基配方。30g/L蔗糖，6g/L瓊脂， pH為5. 9 6. 0。光照條件為人工輔助光1500 2000Lux。溫度為24 26。C，光照時間 12 14h/d。 不同的基本培養(yǎng)基以及不同激素濃度配比影響著小報春(Primulaforbesii Franch.)花藥愈傷組織的形成。接種60天左右，花藥上開始形成淺黃綠色的愈傷組織，將 產(chǎn)生愈傷組織的花藥轉(zhuǎn)入相同培養(yǎng)基，愈傷組織逐漸增大。經(jīng)統(tǒng)計證明，MS、Bs、Ne的愈傷誘 導率分別為1.2%、0.3%、0.5%?？梢钥闯觯琈S是小報春花藥培養(yǎng)的最為適合的基本培養(yǎng) 基。MS+6-BA 1. 0mg/L+2， 4-D 0. 5mg/L的培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導率最大，為2. 3% ，該激素
濃度為小報春花藥愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)激素配比。
實施例3 小報春(Primula forbesii Franch.)愈傷組織分化培養(yǎng)基的篩選。
將增殖后的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中。分化培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，以 6-BA和NAA為激素種類，6-BA的濃度梯度為0. Img/L、0. 2mg/L、0. 5mg/L、l. 0mg/L、2. Omg/L， NAA的濃度梯度為0. 01mg/L、0. Img/L、0. 2mg/L、0. 5mg/L，組合了 10種分化培養(yǎng)基，探討其 對小報春愈傷組織分化的影響。40g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH為5.9 6.0。光照條件為人工 輔助光2000 3000Lux。溫度為24 26。C，光照時間12 14h/d。 愈傷組織接入分化培養(yǎng)基后40 60d，6-BA 0. 2mg/L+NAA 0. Olmg/L的分化培 養(yǎng)基上分化出腋芽，不斷抽出新葉，并在愈傷上不斷大量形成不定芽，后長出葉片；而6-BA 1. Omg/L+NAA 0. 5mg/L、6-BA2. Omg/L+NAA 0. lmg/L以及6-BA 2. Omg/L+NAA 0. 2mg/L這三 種培養(yǎng)基上均分化出根，而抑制了芽的分化，最終組織變褐死亡。
實施例4 小報春(Primula forbesii Franch.)花藥培養(yǎng)組培苗的生根培養(yǎng)。
當不定芽在分化培養(yǎng)基上長出3-4片真葉時，將其從愈傷組織上切除，轉(zhuǎn)入生根 培養(yǎng)基上，配方為MS、 MS+IBA(0. 05mg/L、0. Img/L、0. 2mg/L) ，40g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH為 5. 9 6. 0。光照條件為人工輔助光2000 3000Lux。溫度為24 26。C，光照時間12 14h/d。各培養(yǎng)基均可使組培苗生根，觀察發(fā)現(xiàn)，隨著IBA濃度的增大，根逐漸變得粗短，MS
培養(yǎng)基中的生根量最大且須根長而密集，生根率為70%左右，是花藥培養(yǎng)組培苗的最佳生
根培養(yǎng)基。 實施例5 小矛艮春(Primula forbesii Franch.)花藥培養(yǎng)組培苗的移栽。 生根培養(yǎng)兩周以后，待組培苗平均每株生根4 5條，根長達到1cm時，即可開始
為移栽作準備。煉苗是組培苗移栽前的過渡，可以幫助組培苗逐步適應外界環(huán)境，使組培苗
更健壯，葉色更加深綠，從而提高成活率。小報春(Primula forbesii Franch.)組培苗煉
苗3 4天后，移栽至溫室細草炭土中，草炭土提前鋪滿穴盤，清水浸透；組培苗移栽后保持
濕度80%以上，覆薄膜并每天噴水2 3次，2周以后即可逐步進行正常管理，移栽成活率
達到80%以上。 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
一種小報春的花藥培養(yǎng)方法，包括外植體的選擇、外植體的消毒與接種、愈傷組織誘導與增殖、愈傷組織分化、組培苗生根培養(yǎng)與移栽，其特征在于，所述愈傷組織誘導與增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，pH為5.9～6.0；所述愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，40g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH為5.9～6.0；所述生根培養(yǎng)基為MS，pH為5.9～6.0。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的花藥培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的外植體為小報春稍露色 的花藥，長度在4. 0 5. Omm之間，此時的大部分小孢子的發(fā)育時期為單核靠邊期。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的花藥培養(yǎng)方法，其特征在于，所述愈傷組織誘導與增殖時，光 照條件為人工輔助光1500 2000Lux ;溫度為24 26。C，光照時間12 14h/d。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的花藥培養(yǎng)方法，其特征在于，所述愈傷組織分化時，光照條件 為人工輔助光2000 3000Lux ;溫度為24 26。C，光照時間12 14h/d。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的花藥培養(yǎng)方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)時，光照條件為人 工輔助光2000 3000Lux ;溫度為24 26。C，光照時間12 14h/d。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 5任意一項所述的花藥培養(yǎng)方法，其特征在于，所述組培苗的移栽 溫度為18 25°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1 6任意一項所述的花藥培養(yǎng)方法，其特征在于，所述外植體采用流 水下沖洗lh，70X乙醇進行表面消毒，消毒時間為30s，無菌水沖洗3 5次后，2%次氯酸 鈉進行表面消毒，消毒時間控制在8 10min，無菌水沖洗3 5次。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1 7任意一項所述的花藥培養(yǎng)方法，其特征在于，所述組培苗經(jīng)在生 根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 3周后，煉苗3 4天移栽至溫室細草炭土中培養(yǎng)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1 8任意一項所述的花藥培養(yǎng)方法，其特征在于，選小報春的稍 露色、長度在4. 0 5. Omm之間的花藥為外植體，經(jīng)流水下沖洗lh， 70 %乙醇進行表面消 毒，消毒時間為30s，無菌水沖洗3 5次后，2%次氯酸鈉進行表面消毒，消毒時間控制在 8 10min，無菌水沖洗3-5次；接種到花藥愈傷組織誘導培養(yǎng)基，MS+6-BA 1. 0mg/L+2，4-D 0. 5mg/L， 30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，pH為5. 9 6. 0 ;光照條件為人工輔助光1500 2000Lux ; 溫度為24 26t:，光照時間12 14h/d ;之后移至相同培養(yǎng)基進行增殖，繼代2 3次后 轉(zhuǎn)入愈傷組織分化培養(yǎng)基，MS+6-BA 0. 2mg/L+NAA 0. 01mg/L， 40g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH為 5. 9 6. 0 ;光照條件為人工輔助光2000 3000Lux ;溫度為24 26°C ，光照時間12 14h/ d ;將分化的組培苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS， pH為5. 9 6. 0 ;光照條件為人工輔助光2000 3000Lux ;溫度為24 26°C ，光照時間12 14h/d ;生根培養(yǎng)2 3周，煉苗3 4天后，移 至細草炭土中培養(yǎng)，保持濕度高于80%，每天噴水2 3次。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小報春的花藥培養(yǎng)方法，包括外植體的選擇、外植體的消毒與接種、愈傷組織誘導與增殖、愈傷組織分化、組培苗生根培養(yǎng)與移栽，其中，所述愈傷組織誘導與增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，pH為5.9～6.0；所述愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，40g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH為5.9～6.0；所述生根培養(yǎng)基為MS，pH為5.9～6.0。利用本發(fā)明方法得到的幼苗，成長良好，一致性強，適應性較強，病蟲害少，易于管理，易于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號A01H4/00GK101766121SQ200910244440
公開日2010年7月7日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者孫明, 張啟翔, 潘會堂, 程堂仁, 董玲玲, 賈茵 申請人:北京林業(yè)大學