一種來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥及其制備方法

專利名稱：一種來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領域，具體來說是涉及一種利用紫莖澤蘭來制造抗煙草
花葉病毒的生物農(nóng)藥及其制備方法。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病毒病是僅次于真菌的第二大類植物病害(趙善歡(主編).植物 化學保護(第三版)[M].北京農(nóng)業(yè)出版社，2000.)，世界各地的絕大部分作物都不同程度受 其危害，由于防治困難，素有"植物癌癥"之稱。據(jù)相關資料報道(吳拒文，陳建峰.植物源 農(nóng)藥及其安全性[J].植物保護，2002，28(4) :39-41.)，20世紀80年代初，僅美國每年因植 物病毒病造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失就高達15 20億美元，而全世界每年因此造成的經(jīng)濟損失 更是高達200億美元左右。植物病毒種類繁多，分布廣泛，我國植物病毒病害在各省區(qū)都較 為普遍，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大損失，嚴重影響農(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)發(fā)展。 煙草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus, TMV)，病毒粒體為直桿狀，直徑18nm，長 300nm ;粒體分子量為40X107，由外殼蛋白包圍著一個核糖核酸中心軸組成。每個粒體有 2130個蛋白亞基，以左旋螺旋排列成130圈。RNA為單分子線性、正鏈ssRNA，在距螺旋中心 4. Onm處以螺旋形式回旋于蛋白亞基中。TMV增殖的最適溫度為28-3(TC，溫度在37。C以上 時即停止增殖，其毒力和抗逆力均較強。粒體非常穩(wěn)定，稀釋限點為10-6-10-7，致死溫度 為90-93°C，體外保毒期達2個月以上。干燥葉片中病毒經(jīng)14(TC的高溫處理30分種才喪 失侵染力，在自然條件下經(jīng)52年仍有致病力。但在堿性條件下，病毒粒體即發(fā)生降解，從而 失去侵染力。TMV引起的花葉病是煙草、番茄等作物上十分重要的病害，世界各地發(fā)生普遍， 損失嚴重。如在煙草上自苗期至大田期可連續(xù)發(fā)生，幼苗被侵染后，新葉的葉脈顏色變淺， 成半透明的"明脈癥"，而后形成黃綠相間的花葉癥；苗期侵染的植株發(fā)育緩慢，幾乎沒有經(jīng) 濟價值。大田期植株發(fā)病，除顯示明脈、花葉癥狀外，病葉上會形成皰斑，厚薄不勻葉形也 會出現(xiàn)各種畸形，如葉緣反巻、皺縮扭曲，葉緣缺刻或成帶狀。 TMV主要靠病汁液接觸傳播，在農(nóng)事操作中沾染了病株汁液的手或工具通過接觸 煙苗的微傷口侵入。由于病毒的抗逆能力很強，混有病株殘體的肥料、種子、土壤和帶病的 其他寄主植物及野生植物，甚至烤過的煙葉、煙末都可以成為病害的初侵染來源。這些初侵 染源或移入大田的病苗，通過各種接觸媒介引起再侵染，使病害在田間擴展蔓延。病害發(fā) 生與品種的抗病性有密切關系，在干旱少雨、氣溫偏高時發(fā)病重，晚栽的比適時早栽的發(fā)病 重，前茬或本茬套種馬鈴薯、番茄、油菜、蘿卜等地塊發(fā)病重(許志剛主編.普通植物病理學 [M].中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.)。 TMV寄主范圍非常廣，其寄主有33科236種，除侵染煙草 外，還危害番茄、馬鈴薯、茄子、辣椒、菠菜、地黃和油菜等作物，人工接種可侵染十字花科、 覓科、茄科、菊科、豆科等36科，350余種物。 當今植物病毒病的防治主要是依靠化學制劑，雖然具有一定的控制作用，但容易 產(chǎn)生藥害和抗藥性，嚴重影響抗植物病毒制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用。隨著生活水平的提高、 環(huán)保意識的加強，植物源農(nóng)藥的研究與開發(fā)廣泛受到人們重視。我國地域遼闊，植物資源豐富，因而在我國進行植物源生物農(nóng)藥的研制具有明顯的優(yōu)勢和廣闊的應用前景。植物源活 性物質(zhì)易降解，造成環(huán)境污染和毒性殘留問題較小，因此，充分利用豐富的植物資源，研究 開發(fā)高效、無毒或低毒、廣譜的抗植物病毒劑和真菌抑制劑具有重要的意義。
植物源抗病毒劑的開發(fā)研究始于20世紀初，1913年ALLARD首次發(fā)現(xiàn)TMV侵染商 陸(Phytolaccacea)后，不能用它的汁液摩擦接種到煙葉上，其后又發(fā)現(xiàn)CMV侵染商陸后不 能接種到黃瓜上(候玉霞，李重九，馬力新.中草藥中抗植物病毒TMV活性物質(zhì)PZ1作用機 理研究.中國農(nóng)業(yè)大學學報，2000， 5(1) ;21-24.)。 1925年DUGGER發(fā)現(xiàn)商陸中有一種抗病 毒物質(zhì)，用它來處理TMV或黃瓜花葉病毒(Cucumber MosaicVirus， CMV)，就能使病毒失去
對非商陸寄主的侵染力，由此引發(fā)了對病毒浸染活性抑制的一系列研究，并將植物病毒病 的防控引向了生物防治的軌道。到1988年已發(fā)現(xiàn)180多種被子植物具有強烈的抑制植物 病毒侵染作用，它們主要分布于商陸科、藜科、莧科、紫茉莉科等植物中(邱并生，王敏.植 物病毒學研究進展.中國病毒學，2004，19(3) :309-312) ，20世紀90年代以來又不斷有新 的發(fā)現(xiàn)。我國科研工作者已從500余種中草藥中篩選出近30種對植物病毒病有明顯治療 和保護作用的品種。 紫莖澤蘭(Eupatorium adenophrum)又名飛機草，屬菊科澤蘭屬，原產(chǎn)于美洲的墨 西哥至哥斯達黎加一帶，現(xiàn)已廣泛分布于亞、澳、美大陸和加列那等群島的70多個國家，成 為危害嚴重的世界性惡性雜草。紫莖澤蘭大約在20世紀40年代由中緬邊境傳入我國云 南南部，目前在云南、貴州、廣西、四川、西藏、臺灣、重慶等7個省(市、區(qū))的108個縣、市 (區(qū))發(fā)生并造成嚴重危害，是國家環(huán)保局公布的我國首批16種外來入侵性有害生物之一， 其入侵性位居前列(候太平，劉世貴.有毒植物紫莖澤蘭研究進展[J].國外畜牧學-草原 與牧草，1999， (4) :8.)。 由于紫莖澤蘭具有廣泛的適應性、適生性、競爭性、抗逆性和毒害性，因此對農(nóng)業(yè)、 林業(yè)和畜牧業(yè)及生態(tài)環(huán)境造成了極大的危害。紫莖澤蘭在入侵耕地、輪歇地后造成耕作困 難，成本加大，入侵田邊地埂與莊稼爭水、爭肥、爭陽光，造成糧食減產(chǎn)；入侵林地后，導致更 新造林保存率明顯下降，影響苗木生長，經(jīng)濟林推遲投產(chǎn)；侵占草場后，造成牧草嚴重減產(chǎn)， 載畜量下降，天然草地失去放牧利用價值，給畜牧業(yè)發(fā)展造成了極大的阻礙。目前人們主要
采取人工防除、植被替代、化學防除、昆蟲控制、病原菌防除等幾種方法對紫莖澤蘭進行治 理。同時也積極地尋求方法對紫莖澤蘭進行利用，現(xiàn)階段已經(jīng)運用紫莖澤蘭成功研制了殺 蟲劑，制作染料，生產(chǎn)人造板、精油、白僵菌等。 而隨著對植物源生物農(nóng)藥的不斷研究與開發(fā)，又為紫莖澤蘭的利用提供了新的思 路。由于該外來入侵生物的抗逆性強，體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì)，因此可以考慮利用其活 性物質(zhì)來開發(fā)生物農(nóng)藥而防治我國主要的病毒病。目前，已有關于此方面的初步研究(傅 軍，宋啟示，方綺軍.紫莖澤蘭化學成分及其生物學活性研究進展.云南農(nóng)業(yè)大學學報， 1999,14(4) :411-414.)，對生長紫莖澤蘭的土壤所作的抑菌分析表明它對土壤中細菌類
抑制作用最大，真菌次之，這表明紫莖澤蘭中確實存在生物活性物質(zhì)；另據(jù)報道(李麗，尹 芳.張無敵.紫莖澤蘭不同水提物抑制植物病原菌的研究.農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2008(4): 22-23.)，利用紫莖澤蘭提取物來防治病蟲害也具有較好的殺毒作用；戴元寧等用紫莖澤蘭 為原料開發(fā)生物農(nóng)藥，已完成小試和中試(戴元寧，紫莖澤蘭生物農(nóng)藥的制造，2003)。實際 應用中，有關利用紫莖澤蘭提取物來抑制植物病原菌的報道還比較少，張培花等利用紫莖
4澤蘭汁液及其萃取物對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用進行了研究；云南師范大學云南省農(nóng)村 能源工程重點實驗室研究發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭提取液對某些植物病原菌具有很好的抑制效果；田 宇等發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭揮發(fā)油提取液在濃度為3000mg/kg時對4種真菌的抑制率均大于60%， 其中對番茄灰霉菌抑制作用最強，其EC50值為580. 15mg/kg(田宇，何蘭，曹坳程.紫莖澤 蘭揮發(fā)性成分及抑菌活性研究.農(nóng)藥學學報，2007，9(2) :137-142.)。但目前國內(nèi)外尚未見 有關紫莖澤蘭提取物抗植物病毒活性研究的報道，因此有必要利用紫莖澤蘭不同有機相提 取物對植物病毒進行更加深入的探究，研發(fā)出新型的抗病毒制劑，為豐富植物源的生防制 劑品種，綜合開發(fā)利用紫莖澤蘭提供重要的理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決已有傳統(tǒng)化學試劑農(nóng)藥在防治植物病毒時會對環(huán)境造 成破環(huán)，且農(nóng)藥本身不易降解；而現(xiàn)有的一些植物來源的生物農(nóng)藥本身并不是一些入侵性 的植物，對環(huán)境和農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)并未有嚴重威脅，應用價值意義不大的缺陷，提供一種利用侵 入性植物紫莖澤蘭來制作的生物農(nóng)藥及其制備方法。 實現(xiàn)上述目的本發(fā)明的技術(shù)方案為，一種來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，該農(nóng) 藥是將紫莖澤蘭粉末通過有機溶劑浸提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、定容后得到的提取物，該提取物是質(zhì)量 濃度為lg/ml。 對紫莖澤蘭粉末浸提采用的有機溶劑可以是乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、 正丁醇、丙酮、氯仿或二氯甲烷。 該紫莖澤蘭的提取物用水稀釋后可以用于防治煙草花葉病毒，用水稀釋的濃度以 2倍為最佳。 本發(fā)明的技術(shù)方案還包括一種來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，該生 物農(nóng)藥按以下步驟制備， (1)紫莖澤蘭鮮葉經(jīng)陰干，烘至恒重，粉碎為粉末； (2)在紫莖澤蘭粉末中按體積比為1 : 10加入有機溶劑后超聲波浸提得到濾液；
(3)將步驟(2)得到的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為膏狀物提取物； (4)將(3)步的膏狀提取物定容得到質(zhì)量濃度為lg/ml的紫莖澤蘭提取物。 上述步驟(1)中的紫莖澤蘭粉末是40目。 上述步驟(2)中的浸提次數(shù)為3次，每次浸提時間是30分鐘。 上述步驟(2)中浸提有機溶劑可以采用乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁
醇、丙酮、氯仿或二氯甲烷，其中，經(jīng)過乙醇浸提后得到的紫莖澤蘭提取物防治煙草花葉病
毒的效果最佳。 本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點，利用本發(fā)明所述的來源于紫莖澤蘭來源的生物 農(nóng)藥，對煙草花葉病毒枯斑寄主抑制率高，易重復。本發(fā)明所述農(nóng)藥的實施中，對煙草花葉 病毒系統(tǒng)寄主進行了抗病毒活性試驗和田間小試以及抗病機理分析，證明該來源生物農(nóng)藥 可成功的進行對煙草花葉病毒的防治，本發(fā)明所述來源紫莖澤蘭的生物農(nóng)藥，制備方法簡 單，生產(chǎn)成本低，無任何毒害污染。



具體實施例方式圖1是紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化前的結(jié)構(gòu)照片圖；
圖2是紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化30min的結(jié)構(gòu)照片圖；
圖3是紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化60min的結(jié)構(gòu)照片圖；
圖4是紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化90min的結(jié)構(gòu)照片圖；
下面對本發(fā)明的技術(shù)方案進行具體描述，(1)來源紫莖澤蘭生物農(nóng)藥的制備過程， 紫莖澤蘭鮮葉陰干處理后，6(TC烘干至恒重，粉碎機粉碎后過40目篩，得到的粉末于4t: 保存?zhèn)溆谩Ｈ?0g紫莖澤蘭粉末加入10倍體積(100ml)的供試有機試劑，實驗中分別采 用了乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、氯仿和二氯甲烷9種有機試劑分 別實驗，超聲波提取30min，之后用循環(huán)式真空泵進行抽濾，收集濾液，然后再向濾渣中注 入100ml有機溶劑，進行第二次提取，超聲波浸提30min后抽濾，收集濾液，按照同樣的方 法共提取三次，之后合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機溶劑蒸發(fā)掉得到膏狀物，再將其定容到 10ml，即得到質(zhì)量濃度為lg/ml的紫莖澤蘭提取物，保存于4t:備用。(2)紫莖澤蘭提取物
抗病毒活性測定，利用半葉枯斑法進行紫莖澤蘭提取物抗病毒活性測定，具體操作如下選 取生長一致，6-8葉期的三生煙，用濕潤的紗布包裹住葉柄位置，用喉頭噴霧器對準葉脈中 央噴灑200目金剛砂，之后左半葉接種處理液，右半葉接種對照液，每個處理作10個重復，3 天后待枯斑顏色和數(shù)目穩(wěn)定后統(tǒng)計枯斑數(shù)目，計算抑制率。其中病毒粗提液是將TMV病葉 加10倍體積PBS緩沖液研磨過濾制得，而處理液是將病毒粗提液與不同稀釋倍數(shù)的紫莖澤 蘭提取液混合配成，以清水代替紫莖澤蘭提取液作為對照。抑制率=(對照半葉枯斑數(shù)-處 理半葉枯斑數(shù))/對照半葉枯斑數(shù)X100% 具體不同有機溶劑的提取結(jié)果對抑制率的影響如下表 由上表可以看出，在供試濃度為O. 5g/ml時，紫莖澤蘭各有機相提取物對TMV病毒 均表現(xiàn)出一定的鈍化作用，乙醇、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿提取液抑制率在50%以上， 其它石油醚、丙酮、甲醇和二氯甲烷等四種提取物的抑制率在50%以下。其中效果最弱的 是丙酮提取物，抑制率為35. 7% ;而鈍化效果最好的是乙醇提取物，抑制率達到了 92. 8%。 因此，紫莖澤蘭來源抗煙草花葉病毒生物農(nóng)藥最佳劑型為乙醇且其可有效在體外對煙草花
葉病毒進行鈍化。
提取試劑接種葉數(shù)處理半葉平均枯斑數(shù)對照半葉平均枯斑數(shù)抑制率
乙醇1081121692.8%
石油醚10591104443.3%
乙醚1025755653.8%
乙酸乙酯1043691852.5%
丙酮1046672535.7%
正丁醇1025588171.1%
甲醇1047977638.3%
氯仿1021764266.2%
二氯甲垸1028544736.2%
6
對來源紫莖澤蘭生物農(nóng)藥的抗煙草花葉病毒有效性進行驗證
2. 1紫莖澤蘭提取物對系統(tǒng)寄主的預防效果試驗
2. 1. 1方法 選取生長健壯的TMV系統(tǒng)寄主普通煙植株，噴灑不同濃度的紫莖澤蘭乙醇提取液 進行第一次處理，5天后噴灑藥劑進行第二次處理，再過5天進行第三次處理，3次處理后的 第2天接種TMV病毒，3周后調(diào)查病級，計算病情指數(shù)和防效。 病情指數(shù)二E [(各級病葉數(shù)X相對級數(shù)值)]/(調(diào)查總?cè)~數(shù)X9) X100%
防治效果(％ ) = (CK 0_ptl)/CK0X100% CKO:空白對照藥后病情指數(shù)










Ptl :藥劑處理藥后病情指數(shù) 2. 1.2結(jié)果
稀釋倍數(shù)
1
病情指數(shù)
2
平均預防效果
3
2倍 5倍 10倍 CK
預防效果 1 2 3
39.77 38.01 33.33 33.98% 31.58% 42.31% 35.96% 43.86 37.22 37.22 27.18% 33.00% 35.58% 31.92% 46.20 40.35 42.78 23.30% 27.37% 25.96% 25.54% 60. 23 55. 56 57. 78 _— —— —— ——
2. 2紫莖澤蘭提取物對系統(tǒng)寄主的治療效果試驗 2. 2. 1方法
選取生長健壯的TMV系統(tǒng)寄主普通煙植株，接種TMV病毒，第二天噴灑不同濃度的 紫莖澤蘭乙醇提取液作為第一次處理，5天后噴灑藥劑進行第二次處理，再過5天進行第三 次處理，3周后調(diào)查病級，計算病情指數(shù)和防效。
2. 2. 2結(jié)果 稀釋倍數(shù) 病情指數(shù) 治療效果 平均治療效果
1231 2 3
43.21 39.18 35.80 31.37% 31.01% 38.30% 33.56% 47.53 40.35 38.01 24.51% 28.95% 34.49% 29.32% 48.77 43.82 42.78 22.55% 22.83% 26.28% 23.89% 62. 96 56. 79 58. 02—— —— —— ——
綜合以上對系統(tǒng)寄主的治療和預防試驗結(jié)果，可見在適宜的條件下施用紫莖澤蘭 可以達到35. 96%的防效。這樣的防效的確比國內(nèi)報導的商品抗病毒藥劑都低，但是商品抗 病毒藥劑的防治效果大多是大田應用數(shù)據(jù)，并且藥劑經(jīng)過復配，存在多種成分。大田施用， 因為接種不均一或無人為接種等原因，會導致藥劑防治效果偏高。而最為一種新的植物源 抗TMV制劑，其在溫室接種TMV條件下能達到35. 96%的防治效果，應該說是一種十分有希 望的抗TMV藥齊U，在今后的大田施用中將可能會有很高的應用價值。
2. 3紫莖澤蘭提取物對煙草花葉病毒病的大田防病試驗
2. 3. 1方法 在田間選取生長健壯的TMV寄主番茄若干株，噴灑不同濃度紫莖澤蘭乙醇提取物 進行處理，每隔5天噴灑一次，共處理4次，以不噴灑藥劑的的作為對照，最后一次噴灑后待




2倍 5倍 10倍 CK其在田間自然發(fā)病，調(diào)查病級計算病情指數(shù)和防效c





2. 3. 2結(jié)果
植株數(shù)0 2倍 0 5倍 0 10倍 0 CK 0
1 7 6 4
2
3 5
4 4 3
5 3 3 5 3
7
0
1
2 5
9
0
1 0 2
病情指數(shù)
27. 41
36. 30
40. 74 58. 52
防效 53. 16% 37. 97% 30. 38%
由上表可以看出，紫莖澤蘭乙醇提取物對TMV番茄大田防效隨著提取液濃度的增 大而增強，將提取液進行10倍稀釋時，防效為30. 38% ;5倍稀釋時，防效為37. 97% ;2倍稀 釋時，防效可達53. 16%，可見紫莖澤蘭乙醇提取物的大田實施效果較好。
此試驗結(jié)果表明，紫莖澤蘭提取物大田實施效果要好于溫室對系統(tǒng)寄主的防效， 這也與之前的預測結(jié)果一致，可能由于田間無人為接種而是待其自然發(fā)病的原因，導致藥 劑防治效果比溫室對系統(tǒng)寄主的防效偏高，這一結(jié)果也為繼續(xù)利用紫莖澤蘭來源的生物農(nóng) 藥提供了一種新的可能。 2. 4紫莖澤蘭提取物對煙草花葉病毒粒子形態(tài)的影響
2. 4. 1方法 取已稀釋的提純病毒滴于parafilm上，將鋪有Formar膜的銅網(wǎng)倒置在液滴上，吸 附5min后用濾紙吸去多余液體，雙蒸水洗滌；銅網(wǎng)(有膜的一面向上)用2%磷鎢酸(PTA) 負染3-5min，吸去多余溶液。待銅網(wǎng)干燥后立即置JEM-1200EX型透射電鏡下觀察病毒粒體 形態(tài)。 其中紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化時間進行一個梯度試驗，鈍化時間分別為 30min、60min、90min。
2. 4. 2結(jié)果 如圖1、圖2、圖3和圖4所示，經(jīng)紫莖澤蘭乙醇提取物處理后，TMV病毒粒子受到
一定程度破壞，粒體明顯變短，有解聚現(xiàn)象，且隨著時間的增長作用效果越明顯。這可能是
破壞了某些化學鍵，從而影響了 TMV病毒粒子對寄主的侵入和病毒的復制。 2. 5紫莖澤蘭提取液對病毒外殼蛋白的影響 2. 5. 1紫莖澤蘭提取物對病毒外殼蛋白抗原結(jié)合位點的影響 2. 5. 1. 2方法 提純TMV粒體與紫莖澤蘭提取液混合作為抗原，將TMV病毒與等體積蒸餾水混合 作為陽性對照，將紫莖澤蘭提取液與等體積蒸餾水混合作為陰性對照，以ELISA法測定紫 莖澤蘭提取物對TMV外殼蛋白抗原位點的影響
2. 5. 1. 2結(jié)果 ELISA法測定陽性對照與處理0D405值之比均大于2，結(jié)果表明，紫莖澤蘭提取物 對TMV外殼蛋白抗原位點有明顯作用，可能影響其抗原簇，使TMV抗體與抗原之間的反應受 阻。 2. 5. 2紫莖澤蘭提取物對病毒外殼蛋白體外脫衣殼作用的影響 提純TMV與紫莖澤蘭提取液混合經(jīng)RNase處理后，用半葉枯斑法接種，結(jié)果表明，
RNase處理后TMV的侵染率為65. 54% ，枯斑抑制率為34. 46% ，表明紫莖澤蘭提取液對TMV的外殼蛋白具有明顯的破壞作用，使TMV的RNA暴露而被降解。
2. 5. 3紫莖澤蘭提取物對病毒外殼蛋白體外聚合作用的影響
2. 5. 3. 1方法 將外殼蛋白用磷酸鉀緩沖液配成相應濃度，將紫莖澤蘭提取液加入到外殼蛋白溶 液中，以等濃度的病毒外殼蛋白溶液作對照，在UV-1600紫外分光光度計下測定320nm處的 OD值，在10°C _401:之間，每隔51:測定一次00320值
2. 5. 3. 2結(jié)果 結(jié)果表明，隨著溫度的升高，對照組TMV外殼蛋白在320nm下的吸光值逐漸升高， 體外聚合作用明顯，而在紫莖澤蘭提取物處理后，隨著溫度的升高，TMV-CP吸光值雖有升 高，但幅度沒有對照明顯，由此可見，紫莖澤蘭提取物對TMV-CP的體外聚合作用可能具有 一定程度的影響。 2.6.紫莖澤蘭提取物對病毒復制過程的影響
2. 6. 1不同濃度提取物抑制病毒增殖作用測定
2. 6. 1. 1方法 在健康的普通煙上接種病毒24h后，用打孔器從葉肉部分打取直徑為12mm的圓 片，分別飄浮于lg/ml，0. 5g/ml，0. 25g/ml，0. 125g/ml，4個濃度提取物和蒸餾水中作為處 理和對照，同時設置健康葉圓片飄浮于蒸餾水中作陰性對照，48h后用抽提緩沖液研磨葉圓 片，以ELI SA法測定0D405值，計算抑制率
2. 6.1.2結(jié)果 以葉碟法測定不同濃度紫莖澤蘭提取物對TMV增殖的抑制作用，結(jié)果表明，紫莖 澤蘭提取物對TMV在系統(tǒng)侵染普通煙體內(nèi)的增殖有很強的抑制活性，濃度為lg/ml時，紫莖 澤蘭提取物對TMV增殖的抑制率達到100% ，與抑制TMV侵染枯斑寄主三生煙一樣，紫莖澤 蘭提取物對TMV增殖的抑制作用也呈現(xiàn)明顯的劑量_效應相關性，濃度越低，抑制活性越 弱。 2. 6. 2接種病毒不同時間后提取物抑制病毒增殖作用測定
2. 6. 2. 1方法 在普通煙上接種病毒12h，24h，36h和48h后，用打孔器從葉肉部分打取直徑為 12mm的圓片，分別用紫莖澤蘭提取物和蒸餾水作為處理和陽性對照，同時設置健康葉圓片 飄浮于蒸餾水中作陰性對照，48h后用抽提緩沖液研磨葉圓片，以ELISA法測定0D4。5值，計 算抑制率 2. 6. 2. 2結(jié)果 在接種病毒12h，24h，36h和48h后的抗病毒作用測定結(jié)果表明，紫莖澤蘭提取物 在接種病毒后12_36h以內(nèi)處理對病毒增殖均有明顯的抑制作用，抑制率都在70%以上，隨 著時間的延長，提取物對病毒增殖的抑制作用逐漸下降，在接種48小時之后處理，提取物 對病毒增殖的抑制率僅為56%。由此可見，紫莖澤蘭提取物可能主要作用于病毒增殖的早 期階段，對病毒增殖后期抑制效果則不理想。
上述技術(shù)方案僅體現(xiàn)了本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)選技術(shù)方案，本技術(shù)領域的技術(shù)人員對其 中某些部分所可能做出的一些變動均體現(xiàn)了本發(fā)明的原理，屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
一種來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于該農(nóng)藥是將紫莖澤蘭粉末通過有機溶劑浸提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、定容后得到的提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于，將紫莖澤蘭 粉末中加入有機溶劑后浸提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的膏狀物進行定容為質(zhì)量濃度是lg/ml液體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于，對紫莖澤蘭 粉末浸提采用的有機溶劑可以是乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、氯仿或 二氯甲烷。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于，該紫莖澤蘭 的提取物用水稀釋后可以用于防治煙草花葉病毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于，用于防治煙 草花葉病毒的紫莖澤蘭提取物用水稀釋的濃度以2倍為最佳。
6. —種來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于，該生物農(nóng)藥按以下 步驟制備，(1) 紫莖澤蘭鮮葉經(jīng)陰干，烘至恒重，粉碎為粉末；(2) 在紫莖澤蘭粉末中按體積比為1 : 10加入有機溶劑后浸提得到濾液；(3) 將步驟(2)得到的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為膏狀物提取物；(4) 將(3)步的膏狀提取物定容得到質(zhì)量濃度為lg/ml的紫莖澤蘭提取物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于， 步驟(1)中的紫莖澤蘭粉末是40目。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于， 步驟(2)中的浸提次數(shù)為3次，每次浸提時間是30分鐘。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于， 步驟(2)中浸提有機溶劑可以采用乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、氯仿 或二氯甲烷，其中，經(jīng)過乙醇浸提后得到的紫莖澤蘭提取物防治煙草花葉病毒的效果最佳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，該農(nóng)藥是將紫莖澤蘭粉末通過有機溶劑浸提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、定容后得到的提取物，該提取物的質(zhì)量濃度為1g/ml，該生物農(nóng)藥按以下步驟制備，(1)紫莖澤蘭鮮葉經(jīng)陰干，烘至恒重，粉碎為粉末；(2)在紫莖澤蘭粉末中按體積比為1∶10加入有機溶劑后浸提得到濾液；(3)將步驟(2)得到的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為膏狀物提取物；(4)將(3)步的膏狀提取物定容得到質(zhì)量濃度為1g/ml的紫莖澤蘭提取物。本發(fā)明的技術(shù)方案解決已有傳統(tǒng)化學試劑農(nóng)藥在防治植物病毒時會對環(huán)境造成破環(huán)的缺陷，且制備方法簡單，生產(chǎn)成本低，無任何毒害污染。
文檔編號A01N65/12GK101790996SQ20091023787
公開日2010年8月4日 申請日期2009年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月12日
發(fā)明者張妙直, 曹坳成, 謝響明 申請人:謝響明