專利名稱：：枯草芽孢桿菌丙環唑復配可濕性殺菌粉劑及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種復配可濕性殺菌粉劑及其應用，尤其是一種將枯草芽孢桿菌和丙環唑復配的可濕性殺菌粉劑及其在防治果樹真菌病害中的應用。
背景技術：
：隨著國民經濟的快速發展和人民生活水平的不斷提高，對果品的數量、質量及其安全性提出了越來越高的要求。近20年來，我國的果樹栽培事業有了長足的發展，栽培面積迅速增加，果品產量急速提高，經濟及社會效益比較明顯。尤其是近10多年，農村產業結構的調整，帶來了"千家萬戶種果樹"的喜人局面。然而，當前果品生產的形勢并不令人樂觀，在世界各發達國家已完成從數量市場向質量市場這一轉變的時候，我國的果品質量十分令人擔憂，很難參與國際果品市場的競爭。提高果品質量，開拓國際市場和國內的高檔消費市場，是當前果品生產的關鍵。在影響果品質量的眾多因素中，果樹病害是相當重要的因素之一。在傳統的果樹生產上，防治病害完全依靠化學農藥。由于近年來我國果樹的重大病害頻繁暴發，形成了在果樹生長期連續不斷使用化學農藥的嚴峻局面。以江蘇省為例，據不完全統計，在梨、蘋果的全生育期內用藥在15次以上，徐州地區果園從果樹發芽開始至收獲期間，每隔10天打一次藥；這種化學防治果樹病害的方法不僅造成了生態環境和水質嚴重污染，而且直接增加了有毒化學物質在果品中的殘留量，對人類健康帶來嚴重危害。如何減少果品中的殘留量果品中的化學藥物殘留量，已經成為各級政府以及學者和果農關注的焦點。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一類好氧、產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌；是分布在土壤、植物表面和根際的重要微生物種類，能產生一系列代謝產物抑制其它微生物的生長，具有防治植物病害的作用。目前在全世界保存的野生型枯草芽孢桿菌菌株有幾百種，研究證實枯草芽孢桿菌能夠產生40多種具有不同結構和功能的抗菌物質。江蘇省農科院篩選獲得的、對果樹多種真菌病害有很好防效的枯草芽孢桿菌sf-628于2006年8月1日被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)受理保藏，保藏編號為CGMCCNo.1772，拉丁學名為Bacillussubtilissf-628(本文簡稱sf-628)。其生物學性狀記載為sf-628在YPGA(酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g;葡萄糖5.0g，瓊脂17.0g;水1000ml)培養基平板上生長24h的菌落3-5mm，菌落圓形，四周光滑，米色，表面有皺褶。革蘭氏反應陽性，細胞形狀桿狀，細胞直徑大于lPm，嚴格好氣，L-阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、淀粉水解、明膠液化等利用反應均為陽性。枯草芽孢桿菌sf-628是一株對化學藥劑丙環唑有天然抗性的菌株，用丙環唑進一步抗性誘導處理，能夠在丙環唑含量10000卯m的YGPA培養基上正常生長。枯草芽孢桿菌sf-628還具有許多優良性能，如有較廣的抑菌譜，對多種植物病原菌有很強的抑制作用；生長速度快，適應環境能力強，能在土壤和植物表面定殖，并形成優勢種群；誘導寄主產生抗病性；分泌產生多種抗菌物質；對果樹輪紋病、黑斑病和炭疽病有很好的防治效果。目前，江蘇省蘇科農化有限責任公司利用枯草芽孢桿菌sf-628生產了具有不同含菌量的枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。丙環唑，英文通用名propiconazole;化學名稱為1-〔2_(2，4_二氯苯基)_4_丙基-1，3-二氧戊環-2-甲基〕-l-氫-l，2，4三唑。其他名稱:敵力脫、必撲爾、tilt、Banner等。原藥外觀為淡黃色粘綢液體，沸點(13.3Pa)18(TC，蒸汽壓(20°C)0.133mPa，折光率1.5468，比重(20°C)1.27g/cm3。在水中溶解度為110mg/L，易溶于有機溶劑。320°C以下穩定，對光較穩定，水解不明顯。在酸性、堿性介質中較穩定，不腐蝕金屬。貯存穩定性三年。屬于中等毒性殺菌劑。原藥對大鼠急性經口LD50〉1517mg/kg，急性經皮膚LD50〉4000mg/kg。對家兔眼睛和皮膚有輕度剌激作用。丙環唑具有治療和保護雙重作用，內吸性強，可被根、莖、葉部吸收，并能很快地在植物株體內向上傳導，能有效地防治多數高等真菌引起的病害。丙環唑殘效期在l個月左右。作用機理是影響淄醇的生物合成，使病原菌的細胞膜功能受到破壞，最終導致細胞死亡，從而起到殺菌、防病和治病的功效。丙環唑對梨(蘋果)黑斑病、輪紋病和炭疽病均有較好的防效。目前，將枯草芽孢桿菌和丙環唑復配的可濕性殺菌粉劑并未見諸報道。
發明內容本發明的目的在于針對目前生產上大量使用化學農藥防治果樹病害、嚴重污染果園生態環境、導致農藥殘留超標、影響果品品質的問題，提出一種對多種果樹真菌病害均具有良好防治效果的枯草芽孢桿菌丙環唑微生物復配的可濕性殺菌粉劑及其在防治果樹真菌病害中的應用。枯草芽孢桿菌sf-628和丙環唑復配后，形成優勢互補的作用，既能發揮化學藥劑高效、快速的抑菌作用，又能發揮sf-628在誘導果樹抗病性、大量繁殖后微生物群落合理分布的調整功能等作用。通過使用該微生物復配劑，在果園生態環境引進大量有益微生物，惡化病原菌的生存環境，結合栽培管理等農業措施，形成一個穩定的、平衡的、生物多樣化的果園生態系統，達到一藥多治、藥效增加、減少化學藥劑使用量、持久地控制果樹病害流行的目的。本發明的目的是這樣實現的一種枯草芽孢桿菌丙環唑復配可濕性殺菌粉劑，成品藥劑中包括有效活性成分、助劑以及填充輔料，其特征在于有效活性成分占成品藥劑的重量百分比為1085%，所述的有效活性成分由枯草芽孢桿菌和丙環唑組成，在有效活性成分中，枯草芽孢桿菌的重量百分比為10-90%。在本發明中有效活性成分中，枯草芽孢桿菌的最佳重量百分比為20-70%。在本發明中助劑為農藥中可濕性粉劑的常規助劑，填充輔料為農藥中可濕性粉劑的常規填充輔料；在成品藥劑中助劑和填充輔料所占的重量百分比分別為120%和1075%。—種上述復配可濕性殺菌粉劑的應用，其特征在于將成品藥劑稀釋后噴灑在果樹上用于防治果樹真菌病害。在所述復配殺菌粉劑的應用中，所述的果樹真菌病害是指真菌引起的果樹輪紋病、或黑斑病、或炭疽病。在所述復配殺菌粉劑的應用中，將成品藥劑稀釋5001500倍，稀釋后有效藥物成分的含量至少為300mg/L。在所述復配殺菌粉劑的應用中稀釋后有效藥物成分的最佳含量為300mg/L■mg/L。本發明的優點在于通過引進對人畜安全、對多種果樹病害病原菌具有較強抑制作用的枯草芽孢桿菌sf-628，將其與化學藥劑丙環唑按一定比例混合使用，不僅能發揮化學藥劑丙環唑抑菌速度快、對果樹輪紋病、黑斑病、炭疽病防治效果穩定的優勢，同時還能保持生防微生物枯草芽孢桿菌sf-628能在植物根葉圍定殖、分泌抗生素、誘導植物產生抗病性等特點，通過復配、協同作用，達到互補優勢、擴大防治范圍，減少化學藥劑用藥量、降低用藥成本，在提高防治效果的同時，改善了果園生態環境、減少了化學藥劑在果品中的殘留量。具體實施例方式實施例1、枯草芽孢桿菌sf-628對梨輪紋病菌、黑斑病菌和炭疽病菌生長的抑制作用。供試真菌病原菌菌株梨輪紋病菌、黑斑病菌、炭疽病菌，由江蘇省農科院植保所提供。將供試病原菌移植PSA培養基(200g馬鈴薯、20g蔗糖、20g瓊膠和1000ml蒸餾水，pH5.66.6)上，置于28t:培養箱中培養5d，備用。將江蘇省農業科學院篩選獲得的生防菌枯草芽孢桿菌sf-628在NA斜面(3g牛肉浸膏、lg酵母浸膏、5g蛋白胨、10g蔗糖、20g瓊膠和1000ml蒸餾水，pH6.87.0)上進行活化，然后移入50mlNA培養液中，在28t:下振蕩(150r/m)培養48h，備用。在PSA平板中央放置病原菌菌絲塊，直徑為7mm;培養皿四周呈對角線放置4個濾紙片(離培養皿中心距離為22.5mm)，加入不同稀釋倍數的生防菌sf-628菌液7iU;設無生防菌sf-628菌液處理為對照。每處理重復3次。待對照病原菌菌落長滿平板時，測量處理菌落生長直徑。計算抑制率抑制率(％)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)]X100X。表1不同稀釋倍數的生防菌sf-628對梨病原菌菌絲生長的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2不同配比的有效藥物成分對梨輪紋病菌的毒力測定(1)供試病菌以梨輪紋病菌為供試菌(江蘇省農業科學院植保研究所提供)。(2)供試藥劑A、25X丙環唑EC由江蘇豐登農藥有限公司生產提供。B、600億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑由江蘇省蘇科農化有限責任公司生產提供。室內增效生物測定將25%丙環唑EC配成0.01iig/ml、0.1iig/ml、liig/ml、10iig/ml帶藥的PSA培養基平板；將600億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑配成6X106cfu枯草芽孢桿菌/ml、6X105cfu枯草芽孢桿菌/ml、6X104cfu枯草芽孢桿菌/ml、6X103cfu枯草芽孢桿菌/ml帶菌的PSA培養基平板；將A、B按照有效藥物成分重量比i:3;i:2;i:i;2:i;3:l共5個配比對梨輪紋病菌進行毒力測定，分別稀釋2500倍、5000倍、10000倍、20000倍、40000倍，制備成帶不同梯度藥液的PSA培養基平板。再將梨輪紋病菌(直徑7mm)接入帶毒平板，丙環唑單劑和枯草芽孢桿菌單劑做對照，同時設立清水對照平板，待清水對照平板長滿時，測量菌落直徑。計算抑制率抑制率(％)=[(對照菌落直徑_藥劑處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)]X100%將抑制率觀察值轉化為抑制率的等值偏差，以各處理的培養基中殺菌劑的濃度對數為X，以相應處理對病原菌菌絲生長抑制率的等值偏差為Y，應用統計回歸方法，擬合出濃度對數_抑制百分率機率值毒力曲線，計算EC5。值和SR。參考Wadley公式(增效指數SR=混合物的理論EC5。/混合物的實測EC5。，SR>1.5為增效作用，O.5《SR《1.5為相加作用，SR〈0.5為拮抗作用)。實驗結果見表2。表2不同配比的枯草芽孢桿菌丙環唑復配殺菌劑抑制梨輪紋病菌菌絲生長的增效測定<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例38%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的配制有效藥物25X丙環唑EC和600億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的來源與實施例2相同。助劑選擇NNO(亞甲基二萘磺酸鈉)。填充輔料輕質碳酸牽丐將各組分按照重量百分比備料25%丙環唑32%;600億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑16.7%;NNO(亞甲基二萘磺酸鈉)8%;輕質碳酸鈣43.3%。制備過程將丙環唑、枯草芽孢桿菌按上述比例置于混合器中，加入NNO(亞甲基二萘磺酸鈉)，用輕質碳酸鈣填充至100%，所有物料在混合器中混合均勻后，經氣流粉碎機粉碎，即成8%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。實施例4、8%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑抑制梨輪紋病菌、黑斑病菌和炭疽病菌生長的增效作用測定被測藥劑由實施例3提供的8%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。對比藥劑25%丙環唑EC(江蘇豐登農藥有限公司提供)；600億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(江蘇省蘇科農化有限責任公司生產提供)。室內增效生物測定將25%丙環唑EC配成0.01iig/ml、0.1iig/ml、liig/ml、10iig/ml帶藥的PSA培養基平板；將600億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑配成6X106cfu枯草芽孢桿菌/ml、6X105cfu枯草芽孢桿菌/ml、6X104cfu枯草芽孢桿菌/ml、6X103cfu枯草芽孢桿菌/ml帶菌的PSA培養基平板；將8%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑稀釋1000倍、2500倍、5000倍、10000倍、20000倍，制備成帶不同梯度藥液的PSA培養基平板。再將梨輪紋病菌、黑斑病菌、炭疽病菌(直徑7mm)接入帶毒平板，丙環唑單劑和枯草芽孢桿菌單劑做對照，同時設立清水對照平板，待清水對照平板長滿時，測量菌落直徑。抑制率和增效指數SR計算與實施例2相同。實驗結果分別記載于表3、表4和表5中。表38%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑抑制梨輪紋病菌菌絲生長的增效測定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表48%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑抑制梨黑斑病菌菌絲生長的增效測定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表58%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑抑制梨炭疽病菌菌絲生長的<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例5、8%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑防治果樹輪紋病、黑斑病、炭疽病的田間小區效果試驗時間于2009年3月15日左右(梨樹開花期)在豐縣孫樓鎮大洼村一承包戶的梨園內進行。試驗品種黃金梨。試驗藥劑由實施例3提供的8%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑。對比藥劑25%丙環唑可濕性粉劑(江蘇豐登農藥有限公司生產提供)；600億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(江蘇省蘇科農化有限責任公司生產提供)。田間藥效試驗采用噴霧法防治梨輪紋病、黑斑病和炭疽病。梨樹落花后(4月15日左右)每隔兩周(15d)噴一次藥。梨樹整個生長期共需要打藥8-9次。按每畝兌水量400Kg均勻噴霧，每小區一畝667m2;每個處理設2次重復，設保護行。6月上旬調查各個小區的梨黑斑病發病指數，每小區均調查四株，每株分東、南、西、北、中五點取樣，每點取當年生枝條的20片葉調查。目測葉片的發病狀況，根據病害癥狀描述，記載病情級別。計算防治效果。梨黑斑病病情分級標準如下0級無病斑1級病斑面積占整個葉面積的5%及以下；3級病斑面積占整個葉面積的5.1%-15%;5級病斑面積占整個葉面積的15.1%-33.3%;7級病斑面積占整個葉面積的33.4%-50%;9級病斑面積占整個葉面積的50.1%及以上。E(各級病葉數X代表級值)病情指數=-X100調査總葉數X最高代表級值處理區平均病情指數防治效果=(1--)X100對照區平均病情指數7月5日_8月23日每隔一周(7d)分別統計調查梨輪紋病、炭疽病引起的爛果，共調查8次。梨輪紋病病癥是梨果表面產生水漬狀褐色近圓形斑點，后漸擴大，暗紅褐色，呈明顯的同心輪紋狀，病斑上產生黑色小粒點。梨炭疽病病癥是發病初期果面出現淡褐色水漬狀的小圓斑，以后病斑逐漸擴大，色澤加深，并且軟腐下陷，病斑顏色深淺交錯，具明顯的同心輪紋。在病斑表面形成無數小斑點，溫暖潮濕時呈現一層粉紅色的粘質物。每小區爛果數病情指數=-X100每小區總果數處理區平均病情指數防治效果(％)=(1--)X100對照區平均病情指數田間試驗結果(表6)表明畝用量800克(稀釋500倍)的8%丙環唑*100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對梨輪紋病、黑斑病和炭疽病的防治效果分別為82.21%、70.44%和82.50%;畝用量500克(稀釋800倍)的8%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對梨輪紋病、黑斑病和炭疽病的防治效果分別為69.58%、56.81%和68.84%。復配殺菌粉劑800克/畝的防治效果優于25%丙環唑乳油(畝用量400毫升，稀釋1000倍)和600億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(畝用量250g，稀釋1600倍)的防治效果(見表6)。表68%丙環唑100億枯草芽孢桿菌可濕性粉劑防治果樹輪紋病、黑斑病、炭疽病的田間小區效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權利要求一種枯草芽孢桿菌丙環唑復配可濕性殺菌粉劑，成品藥劑中包括有效活性成分、助劑以及填充輔料，其特征在于有效活性成分占成品藥劑的重量百分比為10～85％，所述的有效活性成分由枯草芽孢桿菌和丙環唑組成，在有效活性成分中，枯草芽孢桿菌的重量百分比為10-90％。2.根據權利要求1所述的枯草芽孢桿菌丙環唑復配可濕性殺菌粉劑，其特征在于在有效活性成分中，枯草芽孢桿菌的最佳重量百分比為20-70%。3.根據權利要求1或2所述的枯草芽孢桿菌丙環唑復配可濕性殺菌粉劑，其特征在于助劑為農藥中可濕性粉劑的常規助劑，填充輔料為農藥中可濕性粉劑的常規填充輔料；在成品藥劑中助劑和填充輔料所占的重量百分比分別為120%和1075%。4.一種如權利要求1所述復配可濕性殺菌粉劑的應用，其特征在于將成品藥劑稀釋后噴灑在果樹上用于防治果樹真菌病害。5.根據權利要求4所述的復配殺菌粉劑的應用，其特征在于所述的果樹真菌病害是指真菌引起的果樹輪紋病、或黑斑病、或炭疽病。6.根據權利要求4或5所述的復配殺菌粉劑的應用，其特征在于將成品藥劑稀釋5001500倍，稀釋后的有效藥物成分含量至少為300mg/L。7.根據權利要求6所述的復配殺菌粉劑的應用，其特征在于稀釋后有效藥物成分的最佳含量為300mg/L480mg/L。全文摘要本發明涉及一種枯草芽孢桿菌丙環唑復配可濕性殺菌粉劑，成品藥劑中包括有效活性成分、助劑以及填充輔料，其特征在于有效活性成分占成品藥劑的重量百分比為10～85％，所述的有效活性成分由枯草芽孢桿菌和丙環唑組成。在有效活性成分中，枯草芽孢桿菌的重量百分比為10-90％。應用時，將成品藥劑稀釋后噴灑在果樹上用于防治果樹真菌病害。其優點是將枯草芽孢桿菌與化學藥劑丙環唑按一定比例混合使用，能充分發揮微生物和化學藥劑的協同作用，達到優勢互補、擴大防治范圍，減少化學藥劑用藥量、降低用藥成本，在提高防治效果的同時，改善了果園生態環境、減少了化學藥劑在果品中的殘留量。文檔編號A01P3/00GK101697736SQ200910212778公開日2010年4月28日申請日期2009年11月9日優先權日2009年11月9日發明者劉永鋒,劉郵洲,陳志誼申請人:江蘇省農業科學院