專利名稱：：一種深海海旋菌及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及微生物
技術領域：
，具體涉及微生物固氮菌，尤其涉及一種從海草中篩選出的深海海旋菌及其應用。
背景技術：
：海草主要分布在溫帶、亞熱帶和熱帶海域淺水區內，是唯一可以適應海洋生活環境并且開花的單子葉植物，具有較高的生產力水平和十分重要的生態意義和經濟價值。海草床生態系統作為濕地生態系統的重要組成成分，其具有重要的旅游觀光價值以及較高的科學研究價值，海草是一些飼料、化妝品、工藝品的很好的生產原料，海草生長區可以為魚、蝦、貝類等生物提供庇護場所、棲息場所，提供食物，是許多經濟魚類孵育仔稚魚的好場所。目前為止，由于海草床生境面臨的嚴重的威脅，為了保護海濱濕地生態系統，恢復海草床生態系統的生態功能和經濟價值，全球各國相繼展開了一系列的行動。海草床較高的初級生產力水平是熱帶和亞熱帶沿海水域的特征，較高生產力的維持就需要為其提供充足的無機營養物質，通常認為可溶性氮元素是海草床生產力的主要限制營養元素，而在植物葉面的附著生物和根際周圍的固氮生物則可以通過生物固氮(Biologicalnitrogenfixation),把空氣中的氮氣在固氮酶的作用下轉化為可溶性的氨并將其提供給這一系統，是該系統中"新"氮源的重要來源，這樣就在一定程度上減弱了氮素對海草床生態系統生產力的限制。—些研究表明在某些海草床中，有近達50%的氮素需求來自于生物固氮，而Patrquin(1972，NitrogenfixationintherhizosphereofmarineangionspermsMarinebiology.16:49-58.)等報道在寡營養鹽環境下，特別是熱帶海洋地區，推測海草床生物固氮能夠為其提供11.5倍植物生長(6.9-23mgNg1葉)所必需的氮素，可見，生物固氮作用對于海草的生長過程中具有非常重要的作用。關于固氮菌用于菌肥的研制，在禾本科植物的水稻中已有展開應用，智利科學家IrisPereira(2009，Developmentofabiofertilizerbasedonfilamentousnitrogen-fixingcyanobacteriaforricecropsinChile,JournalofAppliedPhycology，21(1)，135-144)通過將固氮藍細菌用于稻田的大面積試驗，結果發現與傳統的氮肥相比較，施用生物菌肥后，可以將施用的氮肥量減少一半，即(50kgNha1)，但仍可以獲得較高的產量(7.4tha1)。
發明內容本發明的目的在于針對現有技術存在的問題，提供一種深海海旋菌Q25-2，該深海海旋菌是Thalassospira屬(海旋菌屬)的新菌株系，具有高效固氮、促生的作用。本發明的另一個目的是提供上述深海海旋菌Q25-2在海草共生固氮中的應用。本發明的另一個目的是提供上述深海海旋菌Q25-2在制備海草促生制劑中的應用。本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的本發明公開的深海海旋菌Q25-2(ThalassospiraprofondimarisQ25-2)已于2009年6月4號保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCNO:M209123。本發明的深海海旋菌Q25-2是首次報道從海草床生態系統中分離出的具有niffl基因的Thalassospira屬(海旋菌屬)的細菌，該深海海旋菌Q25-2為革蘭氏陰性菌，桿狀，不產生孢子，0.2-0.4X1.6-2.5iim，細胞單個，也有較少成對。本發明的深海海旋菌Q25-2其氧化酶反應為陰性，接觸酶陰性，好氧或兼性厭氧，在無氮培養基和LB培養基上生長良好，耐鹽性較好，可以在鹽分為50%。的培養液中正常生長。本發明的深海海旋菌Q25-2可以在無氮培養基上生長呈透明針尖狀，圓形，邊緣整齊，3(TC下培養，三天后菌落直徑約lmm，生長溫度范圍為2540°C，最適生長溫度為37t:，生長鹽度是1933%。，最適合鹽度是25%。，PH生長范圍是810，最適合生長PH為8。乙炔還原法(ARA)表明本發明的深海海旋菌Q25-2可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性。本發明通過富集培養和分離純化得到Q25-2的純培養物，并且采用固氮基因特定的引物PolF/PolR(參考Polyetal.，2001)和細菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(參考Weisenburgetal.，1998)進行PCR擴增，均擴增得到目的條帶，證明該菌株具有固氮基因，將擴增所得到的固氮基因序列(niffl序列)和16SrDNA序列進行測序分析，通過GenBank中的BLAST軟件將niffl序列和16SrDNA序列與GenBank數據庫中的序列進行比對，在數據庫中沒有找到完全相似的序列，表明這2條基因序列為首次發現的新基因序列，向基因庫成功遞交新基因序列得到登錄號為EU884569(固氮基因niffl序列)和FJ875970(16SrDNA序列)。本發明用篩選得到的ThalassospiraprofundimarisQ25-2處理海草，結果發現經過ThalassospiraprofundimarisQ25-2處理的海草其植株高度以及莖粗均有所提高，而且胡蘿卜素含量、類胡蘿卜素含量和可溶性糖含量也均有所提高，說明本發明的ThalassospiraprofundimarisQ25-2對于海草具有較好的促生效果，對于海草床生態系統的保護和恢復具有巨大的潛在意義。本發明的深海海旋菌Q25-2可用于海草共生固氮，還可用于制備海草促生制劑。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.本發明從海草生態系統中分離篩選到純菌株，并通過對該純菌株進行三重篩選無氮培養基菌種生長情況、固氮酶活性測定結果、niffl基因擴增帶有無，從而快速確定菌種是否為固氮菌，最終得到具有高效固氮活性的新菌株——深海海旋菌Q25-2，深海海旋菌Q25-2具有適應能力廣、抗逆性強、以及高效固氮活性的特性，其固氮活性可達4070umolC2H2h—"mg—1鮮重；2.用本發明的深海海旋菌Q25-2處理海草，與未經過本發明深海海旋菌Q25-2處理的海草相比，經過處理的海草其植株高度以及莖粗平均值明顯高于對照組，胡蘿卜素含量和類胡蘿卜素含量也分別比對照組高出69%和144%，可溶性糖含量是對照組的1.84倍，而可溶性蛋白提高不是很明顯，比對照組的含量高出約20%。這些結果表明，該菌對于海草的促生效果較好；3.本發明的深海海旋菌Q25-2具有較高的固氮活性，而且對海草具有顯著的促生作用，可用于海草的保育和生態系統的恢復，有助于復合生態系統的珊瑚礁-海草床的氮素的循環和維持較高的生產力水平。圖1為PCR電泳結果圖；其中，1為菌株的基因組DNA，2為PCR擴增得到的16SrDNA，3為PCR擴增得到的固氮基因niffl，Ml為ADNA/EcoRI+HindIII標準分子量參照物，M2為MarkerDL2000;圖2為ThalassospiraprofondimarisQ25-2在16SrDNA中的系發育樹。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發明做任何限定。實施例1菌株的分離純化樣品采集采樣地點為中國海南省新村灣的海草生態系統的海草(Thalassiahemperichii)(18.24.1'N，109.57.15'E)，樣品采集后，對每個樣品進行分別分類、編號，裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，置于冰盒內帶回實驗室，-201:保存。將上述采集的樣品，取植株(包括葉片，葉鞘，根狀莖)，用滅菌的剪刀剪成2cm左右的小塊，放入選擇性固氮液體培養基(該培養基含有NaCl25g、KC10.56g、MgS04-7H204.8g、MgCl2-6H204.0g、K2HPO40.01g、FeS047H2O0.001g、Tris0.48g、蛋白胨4.0g、2.0g酵母提取物2.0g、甘油2.0mL和蒸餾水1L，終PH為8.2)進行加富培養(30°C，180rpm，恒溫48h)，稀釋不同的梯度l(T3、104和l(T5，從中取出200yL以涂布法接種，每個梯度三個重復，3(TC，48h培養后選擇單一菌落進一步純化。用接種針挑取典型的單一菌落，經涂片染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態，如所分離的菌落不純，應做系列稀釋后再次用平板涂布法分離，直至獲得純菌株，然后將純化的菌株接種至斜面培養基(將常規配方的LB瓊脂培養基滅菌后試管傾斜成斜面凝固制備而得)，以檢測固氮酶活性。本實施例分離得到的純菌株，為革蘭氏陰性，桿狀，不產生孢子，無鞭毛，0.2-0.4X1.6-2.5iim，細胞單個，也有較少成對。本實施例分離得到的純菌株，氧化酶反應陰性，接觸酶陰性，為好氧或兼性厭氧菌。本實施例分離得到的純菌株在無氮培養基(該培養基含有NaCl25g、KC10.56g、MgS04-7H204.8g、MgCl2-6H204.0g、K2HPO40.01g、FeS047H2O0.001g、Tris0.48g、蛋白胨4.0g、2.0g酵母提取物2.0g、甘油2.0mL、瓊脂20g和蒸餾水lL，終PH為8.2)和LB培養基(該培養基含有酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl10g、瓊脂1020g和去離子水1000mL，pH8.0)上生長良好，耐鹽性較好，可以在鹽分為50%。的培養液中正常生長。本實施例分離得到的純菌株在無氮培養基上生長呈透明針尖狀，圓形，邊緣整齊，3(TC下培養，三天后菌落直徑約lmm，生長溫度范圍為2540°C，最適溫度是37°C，鹽度是1933%。，最適合鹽度是25%。，PH生長范圍是810，最適合生長時PH=8。實施例2菌種的固氮酶活力測定本實施例菌種的固氮酶活性采用氣相色譜儀測固氮菌的乙炔還原活性(Acetylene-reducingActivity,ARA)(參考Capone1993，CaponeDG(1993)Determinationofnitrogenaseactivityinaquaticsamplesusingtheacetylenereductionprocedure.AquaticMicrobialEcology,621-631)。取上述40ii1L反應后氣體在GC-17A型氣相色譜儀(島津)上測定乙烯峰值，標準氣乙烯的濃度為138ppm。氣相色譜儀的工作條件設置為檢測室溫度10(TC，柱溫60°C，進樣口60，柱長lm，表頭載氣壓力氮氣為0.95kg'cm-2，氫氣為0.8kg'cm-2，空氣為0.6kgcm—2。乙炔還原活性計算方法為ARA(腿olCHH1.Culture1)=VstXCstXAsaXVtu/Vsa/Ast/H/22.4其中，Vst是注入標準氣的體積(ml)，Cst是標準氣的濃度，Vtu是所用試管體積(mL)，Asa是樣品乙烯峰的面積(cm)，Vsa是樣品注入體積(mL)，Ast是標準氣峰面積(cm)，H是培養時間。本實施例分實驗組和空白對照組。實驗組實施例1分離純化得到純菌株，并且保存在斜面培養基上，將該純菌株接種于10mL選擇性液體無氮液體改良培養基內，3(TC搖床振蕩培養48小時，取lmL于滅菌的5mL小瓶中，蓋上橡皮塞，瓶蓋邊緣以石蠟封口，用注射器將lmL的乙炔注入5mL小瓶中，于3(TC反應12h，然后取40y1L反應后氣體，待測；每個實驗組設三個重復。空白對照組對照容器中不加入乙炔氣體。所有樣品于3(TC反應12h，用SQ-204氣相色譜檢測乙烯的生成量。檢測結果表明實施例1分離純化得到的純菌株可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養條件下平均固氮活性為4070umolC2H2h—'mg—1鮮重。本實施例的選擇性液體無氮液體改良培養基，其配方為NaCl25g，KC10.56g，MgS04-7H204.8g，MgCl2-6H204.0g，K2HP04O.Olg，FeS047H2O0.001g，Tris0.48g，蛋白胨4.0g，酵母提取物2.0g，甘油2.0mL，蒸餾水1L，終PH為8.2;固體培養基中加入20g的瓊脂；液體培養基采用0.22um抽濾法滅菌，固體培養基采用高溫高壓滅菌。實施例3菌株的序列鑒定模板制備選擇實施例1分離純化得到的純菌株進行DNA提取和純化，本實施例DNA的提取與純化，其操作方法參考東秀珠《常見細菌系統鑒定手冊》P4。9。1、niffl基因的擴增采用固氮細菌的niffl基因通用引物PolF/PolR(參考Polyetal.，2001，ComparisonofnifflGenePoolsinSoilsandSoilMicroenvironmentswithContrastingProperties,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2001，67(5)2255-2262)進行PCR擴增PCR反應體系如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR反應條件為預變性95。C5min;變性95。C30s，退火55。C30s，延伸72°C40s，共30個循環；后延伸72°ClOmin。取2iiLPCR反應產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果如圖1所示，剩余的PCR產物直接交與Invitrogen生物技術有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統測序，得到321bp的niffl序列，將序列直接遞交Genbank數據庫，序列號為FJ875970。2、16SrDNA全序列的擴增采用細菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(Weisenburgetal.，1991，16SribosomalDNAamplificationforphylogeneticstudy.Journalofbacteriology,1991173(2):697-70)，進行PCR擴增。PCR反應體系如表2所示。表2PCR反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR反應條件為預變性95。C5min;變性95。C30s，退火55。C30s，延伸72°Clmin，共30個循環;后延伸72°ClOmin。反應完畢后，取2iiLPCR反應產物用0.8X的瓊脂撒鄉交電泳檢測，電泳結果如圖l所示.圖1中，1為實施例1分離純化所得純菌株的基因組DNA，2為PCR擴增得到的16SrDNA，3為PCR擴增得到的固氮基因niffl，Ml為ADNA/EcoRI+HindIII標準分子量參照物(Marker),M2為MarkerDL2000。其余PCR產物直接交與Invitrogen生物技術有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統測序，得到的16SrDNA序列直接遞交Genbank數據庫，序列號為EU884569。將上述測序分析得到的固氮基因序列niffl(Genbank登錄號為FJ875970)和16SrDNA序列(Genbank登錄號為EU884569),通過GenBank中的BLAST與GenBank數據庫中的序列進行比對，在數據庫中沒有找到完全相似的序列，表明這2條基因序列為首次發現的新基因序列。由實施例2和3的分析可以看出，實施例l分離純化得到一棵新的菌株，該菌株屬于Thalassospira屬(海旋菌屬)，命名為深海海旋菌Q25-2(ThalassospiraproftmdimarisQ25-2)，并且將該菌株于2009年6月4號保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCNO:M209123。在GenBank數據庫中選取了部分與測定的16SrDNA序列相似性較高的代表性基因序列，通過ClustalW軟件和Mega軟件以Neibor-joining方法構建系統進化樹(如圖2所示)，進行系統發育分析，從系統發育樹可以看出與深海海旋菌Q25-2的16SrDNA序列具有較近親緣關系的序列均來自Thalassospirasp，并且與已知菌種ThalassospiraprofundimarisWP0211T的的16SrDNA序列具有99%的相似性，其生理生化結果顯示兩者還是有一定差異的，如表3所示。表3ThalassospiraprofundimarisWP02111禾口ThalassospiraproftindimarisQ25-2指標比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述表3中，+表示陽性反應；-表示陰性反應。上述表3中，ThalassospiraproftmdimarisWP0211T的資料來自于Thalassospiraxiamenensissp.nov.andThalassospiraprofundimarissp.nov.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology(2007)，57，316-320ChenliLiu。實施例4菌株制劑在土壤中的有效性試驗本實施例的有效性試驗選擇在中科院南海熱帶生物實驗站進行，實驗用的的海草(Cymodocearotundata)是從原樣品采集地新村灣，選取長勢相同的(具體指標有植株高度，莖粗相同，長勢健康的)二十株海草進行試驗，十株為一組，分別為實驗組和對照組。海草盆栽實驗的土壤以及生長用水都來自于海草樣品采集地——新村灣，其中海草生長區的土壤以及海水都經過滅菌處理。將實施例1分離純化得到的強壯類芽孢桿菌深海海旋菌Q25-2在LB液體培養基(本領域技術人員進行菌種培養時的常規培養基)中，30°C，180rpm，培養18小時，取所得生長菌液，將實驗組的海草根以及根狀莖都浸泡于該生長菌液中34小時，然后栽種入塑料盆；對照組不做任何處理。上述兩組均置于室外進行培養，60天后，進行各項指標測定(即植株高度，莖粗、葉綠素含量、類胡蘿卜素、可溶性糖以及可溶性蛋白等)，觀察該菌是否對海草的生長具有促生作用，各項指標測定結果如表4所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注表中值均為10組平行樣平均值。通過實驗組和對照組的生長60后的實驗結果對比可以發現，如表4所示，實驗組的植株高度以及莖粗平均值明顯高于對照組，胡蘿卜素含量和類胡蘿卜素含量也分別比對照組高出69%和144%，可溶性糖含量是對照組的1.84倍，而可溶性蛋白提高不是很明顯，比對照組的含量高出約20%。這些結果表明，該菌對于海草的促生效果較好，對于海草床生態系統的保護和恢復具有巨大的潛在意義。權利要求一種深海海旋菌Q25-2，于2009年6月4號保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCCNOM209123。2.根據權利要求1所述深海海旋菌Q25-2，其特征在于該深海海旋菌Q25-2在無氮培養基上生長所需的溫度為2540°C，鹽度為1933%。，PH為810。3.根據權利要求2所述深海海旋菌Q25-2，其特征在于該深海海旋菌Q25-2在無氮培養基上生長所需的溫度為37t:，鹽度為25%。，PH為8。4.權利要求1所述的深海海旋菌Q25-2在海草共生固氮中的應用。5.權利要求1所述的深海海旋菌Q25-2在制備海草促生制劑中的應用。全文摘要本發明公開一種深海海旋菌Q25-2及其應用，深海海旋菌Q25-2已于2009年6月4號保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNOM209123，該菌株是從海草生態系統中分離篩選到的，具有高效固氮活性的純菌株。用本發明的深海海旋菌Q25-2處理海草，其植株高度、莖粗平均值、胡蘿卜素含量、類胡蘿卜素含量以及可溶性糖含量均高于未經過處理的對照組，表明該菌對海草具有較好的促生效果。本發明的深海海旋菌Q25-2可用于海草的保育和整個生態系統的恢復，有助于海草床生態系統的氮素的循環和維持較高的生產力水平。文檔編號A01N63/02GK101691556SQ20091019264公開日2010年4月7日申請日期2009年9月25日優先權日2009年9月25日發明者凌娟,張燕英,楊斌,王友紹,董俊德,黃良民申請人:中國科學院南海海洋研究所