專利名稱：一種文蛤快速生長品系的育種方法
技術領域：
本發明涉及一種海水養殖貝類的制種技術，具體講是利用文蛤不同地理群體間存 在的表型和遺傳差異，通過雜交提高群體的遺傳多樣性，獲得養殖生產上生長速度較快的 文蛤新品系。
背景技術：
雜交育種是遺傳改良和新品種培育的有效手段，不僅可以綜合雙親的優良性狀、 增加變異性，還有可能產生超越雙親的雜種優勢。在貝類方面，已有不少種間雜交成功的 先例，如黃海水產研究所的燕敬平等(1999)獲得的皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai) 與日本盤鮑(Haliotis discus discus)的雜交子代在成活率、生長速度等方面表現出 了明顯的雜種優勢；中國海洋大學的孫長森等(2007)發現櫛孔扇貝與華貴櫛孔扇貝 (Chlamysnobilis)的雜交子代幼蟲比親本具有更強的生長優勢。雖然貝類種間雜交可以產 生更大的遺傳變異，但常出現雜交不親和、幼體不成活、雜種Fl代不育或育性差和“瘋狂” 分離等“遠緣雜交綜合征”，影響了推廣應用。地理種群間的“遠距離雜交”，既可克服雜種后代的生殖和發育障礙，也能獲得一 定的雜種優勢。目前，國內已有利用地理群體雜交的制種方法獲得多種貝類的快速生長 品系的報道，如中國科學院海洋研究所的張國范等(2004)開展了皺紋盤鮑中國群體和日 本群體雜交的研究；劉小林等(2003)研究了櫛孔扇貝中國種群和日本種群雜交一代的早 期生長情況；廈門大學的柯才煥等(2005)進行了雜色鮑(Haliotis diversicolor)日本 群體與臺灣群體雜交研究；上海水產大學的李家樂等(2007)開展了三角帆蛘(Hyriopsis cumingii)三個地理種群的雜交研究。文蛤是我國重要的灘涂經濟貝類，近年來人工養殖生產上出現了抗逆能力下降、 生長速度放慢、性成熟個體小型化等性狀退化現象，需要通過一定的育種手段，獲得抗性 強、生長快的文蛤新品種。但迄今為止，還沒有利用文蛤不同地理群體的表型性狀和遺傳背 景差異而通過雜交、雜種優勢利用方法培育出生長快速的新品種(系)的報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種文蛤快速生長品系的育種方法，它利用地 理群體間的雜交方法，獲得具有雜交優勢的雜交組合群體，為培育出具有生長快、抗性強等 優良性狀的文蛤新品種提供育種材料。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種文蛤快速生長品系的育種方 法，其通過地理群體間雜交的方式獲得的有雜交優勢的子一代，然后以雜交子一代中生長 快的個體為基礎群，經連續多代的表型選擇育種，培育生長快速的文蛤新品系，其特征在于 親本選擇是山東群體為母本、江蘇群體為父本。具體操作步驟為(1)親本選擇文蛤親貝分別采自山東東營和江蘇如東海區，隨機取樣殼高4 7cm的3 4齡個體，個體數均在100個以上；(2)促熟將親貝置于鋪沙的水泥池內，通過逐漸升溫和投喂足量活體餌料強化 營養的方法促熟；(3)催產與精卵采集采用陰干、流水刺激和升溫結合的方法催產，然后將文蛤單 個放入IL的燒杯中產卵和排精，嚴防精子污染；(4)雜交授精通過顯微鏡檢測獲得高質量的山東群體的未受精卵和活力強的江 蘇群體的精液，以群交的方式進行人工授精，受精卵在600L的塑料缸中孵化；(5)生長對比設置山東自繁群體、江蘇自繁群體、山東群體為父本與江蘇群體母 本雜交組合為對照，測量活體重、殼長、殼高、殼寬等參數，利用Excel、SPSS等統計軟件分 析雜交群體與自繁群體的差異，評價山東群體為母本(早)X江蘇群體為父本( )雜交 Fl代的雜交優勢。步驟(1)親本選擇，母本來自山東東營沿海自然群體、父本來自江蘇如東沿海自 然群體，殼高4cm以上、3-4齡、健壯無損傷個體。步驟(2)中混合投喂的各種人工培養的新鮮單胞藻可以包括金藻、扁藻、硅藻、小 球藻、角毛藻。步驟(4)中使用的混合精液應來自30個以上雄貝。與現有技術相比，本發明的優點在于它通過親本的選擇，利用地理群體間的雜交 方法，獲得具有雜交優勢的雜交組合群體，為培育出生長快、個體大、抗性強的優良文蛤新 品種提供材料，本發明操作簡便，適用于規模化生產，培育出的文蛤快速生長品系與普通生 產用貝相比，生長速度提高20%以上，這對提高文蛤養殖產量和效益有重要意義。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。一種培育文蛤快速生長品系的育種方法，它利用地理群體間的雜交方法，獲得具 有雜交優勢的雜交組合群體，為培育出生長快、個體大、抗性強的優良文蛤新品系提供材 料。親本選擇是最重要的環節山東群體為母本、江蘇群體為父本。本發明按以下操作技術流程來完成在文蛤育種過程中，解決親貝培育、催產、精 卵采集、雜交受精、生長對比等技術環節。親貝培育與催產技術親貝培育的成功與否直接關系到精、卵質量的高低，繼而會 影響后代的生長情況。應使親貝暫養、人工促熟的總積溫達到1900°C以上，以獲得充分成熟 的卵子。采取方法適合、強度適宜的催產技術，以獲得高質量的精卵。精卵采集與雜交受精技術由于文蛤精、卵排放之前難以鑒別雌雄，所以要獲得不 受交叉污染的精、卵是進行雜交受精的前提條件。在進行群體雜交受精中，應考慮精、卵的 質量和受精的個體數。周年生長對比與雜交優勢評價通過周年生長對比試驗，采集雜交群體和對照組 的可量性狀參數，采用數理分析軟件評價雜交優勢情況。實驗組合各群體的遺傳結構分析采用fAFLP分子標記技術對4個群體的遺傳結 構進行分析，比較與親本的差異。
具體實施方式
(1)親貝培育與催產2006年5月10日，從山東東營、江蘇如東文蛤產區采集文蛤，分別稱為山東群體 (S)和江蘇群體(J)，挑選健康無病、無傷損、殼色有光澤，殼高4 7cm的3-4齡文蛤各100 枚，作為親貝。將親貝置于鋪有IOcm左右細沙的水泥池內，通過逐漸升溫和投喂足量活體 餌料強化營養的方法進行促熟。具體升溫辦法是以升溫前水溫為起始溫度，其后每隔1天 升溫0.5°C，當水溫到達26°C時保持恒定，以調節其性腺同步發育。餌料以投喂足量的金 藻、扁藻、角毛藻等混合餌料為主，保證營養的充足和全面。采用陰干、流水刺激和升溫結合 的方法催產，將親貝在夜間陰干10個小時，流水刺激1個小時，然后單個放入乘有過濾海水 IL的燒杯中產卵和排精，水溫比自然海水高2 ；TC。(2)精卵采集與雜交授精2006年7月18日，對性腺發育成熟的親貝進行催產。催產采用陰干和流水刺激結 合的方法親貝陰干12個小時后流水刺激1個小時，然后為防止意外受精，將單個文蛤放入 IL的燒杯中產卵和排精。1小時后親貝均先后產卵和排精，分別收集卵子和精液。按照完 全雙列設計，文蛤山東群體(S)和江蘇群體(J)的雌雄親貝配成兩個群體間雜交組合和兩 個群體內自繁組合，及時完成各實驗組合的人工授精，鏡檢每個卵子周圍黏附5-10個精子 為宜。由此獲得2個群體間雜交組合和2個群體內自繁組合。(3)幼蟲和稚貝培育每個實驗組設4個平行組，自然水溫(27_29°C )培育。受精后大約14小時，各組合 受精卵發育到D形幼蟲期。用300目的篩絹濾出D形幼蟲，將其大致定量后，分別轉入80L 的塑料中進行幼蟲培養，控制密度為5個/mL左右。培育期間保持連續微量充氣供氧，自然 水溫(27-29°C )，投喂適量的等邊金藻或角毛藻，餌料密度控制在2萬個/ml，投餌頻率為每 8hl次。每天用砂濾海水100%換水1次，浮游期每日換水后用高錳酸鉀消毒培育容器。當 幼蟲生長到180 μ m時，投用高錳酸鉀消毒過的細砂(過80目篩)作為附著基。6天左右， 幼蟲殼長約200 μ m時，開始變態附著。稚貝培育期間隨著個體生長，每天適當增加投喂餌料量，餌料以金藻、角毛藻、扁 藻混合投喂。從稚貝殼長Imm以后，定期進行疏苗培養，具體措施如下第一次分苗9月18日，各實驗組合隨機選取5萬顆稚貝放入IOm2的水泥池中培 育，每10天測量大小一次(多點隨機取樣100顆稚貝)。第二次分苗10月28日，各實驗組隨機選取1萬顆稚貝放入IOm2的水泥池中培 育，每10天測量大小一次(多點隨機取樣100顆稚貝)。第三次分苗2007年1月18日，各實驗組隨機選取4千顆稚貝放入IOm2的水泥池 中培育。以后每隔30天測量大小一次(多點隨機取樣100顆稚貝)。(4)周年生長對比與雜交優勢評價設置山東自繁群體和江蘇自繁群體為對照，在顯微鏡下通過測微尺測量或用數顯 游標卡尺測量獲得殼長、殼高、殼寬參數，用電子分析天平獲得活體重數據，每月測量一次， 得到一周年的數據；利用Excel、SPSS等統計軟件分析雜交群體與自繁群體的差異，發現山 東群體(早)X江蘇群體(3)雜交Fl代群體表現出較大的雜交優勢。表1.文蛤不同地理群體自繁及雜交組合Fl早期(1-12月齡)生長發育雜種優勢 比較
殼高10. 13±3.81Λ11.42±2.88b31.710.25 ±2. 84"18..27. 21 ±3. 35°士 As 冗寬5.52 +1. 24'b6.34 ±1.65b31.85.21 ±1.8°8.34. 10 ±1.92°體重0. 66 ±0. 47-0. 82 ±0. 57"65.70. 53 ±0. 49"7.10. 33 ±0. 58°殼長13. 23±3. 87a14. 44±4. 21b27.213,.09 ±4. 35'14.59. 04 士 4. 14。殼高12. 34士3. 24a13. 46±3.47b22.012..18±3. IT14.38. 98±3. 47°殼寬6. 74± 1.95a7.47 ±2. 17b30.66.78 ±2.43°18.54. 7±2. 06e體重0. 91±0. 75a1. 24±0. 97b85. 10.83 ±0. 70a23.90. 43 ±0. 69°殼長15. 80 士 4. 46"16. 55 ±4. 78"25.415.,01 ±4. 93"13.810. 59±4. 53b殼高13. 65 ±3. 76'14. 59±3.84a26.612.,58±4. 12"9.29. 39±3. 77"士 Cto 冗寬7. 65 ±2. 14*8. 10±2. 35'28.77.05 ±2. 36"12.04. 94 ±2. 26"體重1.26 + 0. 92°1. 54±1. 15"761.12 ±0. 85a280. 49 ±0. 79"注右上角字母相同的表示差異不顯著由表1可見，在第2月各實驗組的殼長、殼高差異顯著，多重比較分析顯示S$xSc 組合的稚貝明顯大于其他3個組，而J xJc 組合的生長速度最慢，且與其他3個組合的差異 程度均達顯著水平。總的表現為8 χ8(^〉8 χ^〉·Ι$χ8( >·Γ χ^。其后2個雜交組合的 生長速度開始加快，至3月齡時與組合接近，多重比較也表明這3個實驗組之間無顯 著差異，但與J ΧJd組合的稚貝大小的差距進一步拉開。從第3個月開始2個雜交組合在各 個性狀上表現出一定的雜交優勢，其范圍在6-168%之間；第6個月開始各性狀在數值上主 要表現為{？^^^？⑶^^權⑶汐^？^^，統計分析表明這4個實驗組合各分析性狀 大多無顯著差異。不同性狀的雜交優勢有明顯的差別，其中活體重的雜種優勢遠大于其他 3個性狀，而后3者之間的差別比較小，各性狀的雜種優勢的平均值表現為活體重85. 6% >殼寬 25. 8%>殼長 24. 殼高 22. 7%。(4)雜交Fl的遺傳結構分析采用fAFLP分子標記技術對雜交F1的遺傳結構分析結果分別見表2、表3。從表2可見兩雜交群體的遺傳多樣性接近母本而又比母本稍高，這一方面說明雜 交后代遺傳結構偏向母本，也說明經過雜交增加了群體的遺傳多樣性；從表3可見，SJ與JS 群體間的遺傳距離最大，說明地理群體間雜交使文蛤群體的遺傳結構變異增加，這對雜交 優勢的產生十分有利。分析結果表明，雜交后代接受父、母親本的遺傳物質并非均等，而以 偏母本的方式遺傳，S早XJ $與J早XS $間的遺傳距離最大，可見地理群體間雜交使文 蛤群體的遺傳結構變異增加，雜交后代的遺傳多樣性水平與生長性狀有時表現相一致。表2. 4個F1代群體的多態位點比例、Nei (1973)基因多樣性和香儂信息指數
群體擴增位點數多態位點數多態微點比例Nei基因多樣性Shannon信息指數JJ25324797.63%0.3022 士 0.14720.4632 ±0.1872SS24924995.18%0.3288 ±0.14270.4948 ±0.1843S$xJc 24222693.39%0.3407 ±0.15930.5038 ± 0.2096J xS( 24223597.11%0.3085 ±0.15510.4682 ± 0.2000 表3. 4個群體的群體間遺傳相似性系數和相對遺傳距離
權利要求
一種文蛤快速生長品系的育種方法，其通過地理群體間雜交的方式獲得的有雜交優勢的子一代，然后以雜交子一代中生長快的個體為基礎群，經連續多代的表型選擇育種，培育生長快速的文蛤新品系，其特征在于親本選擇是山東群體為母本、江蘇群體為父本。
2.照權利要求1所述的選育方法，其特征在于所述的雜交其步驟依次為(1)親本選擇文蛤親貝分別采自山東東營和江蘇的東海區，隨機取樣殼高4 7cm的 3 4齡個體，個體數均在100個以上；(2)促熟將親貝置于鋪沙的水泥池內，通過逐漸升溫和投喂足量活體餌料強化營養 的方法促熟；(3)催產與精卵采集采用陰干、流水刺激和升溫結合的方法催產，然后使文蛤單個進 行產卵和排精，嚴防精子污染；(4)雜交授精通過顯微鏡檢測獲得高質量的山東群體的未受精卵和活力強的江蘇群 體的精液，以群交的方式進行人工授精，然后受精卵孵化；(5)生長對比設置山東自繁群體和江蘇自繁群體、以及山東群體為父本與江蘇群體 母本雜交組合為對照，測量活體重、殼長、殼高、殼寬參數，分析雜交群體與自繁群體的差 異，評價山東群體早X江蘇群體 雜交Fl代的雜交優勢。
3.按照權利要求2所述的選育方法，其特征在于步驟(1)親本選擇，母本來自山東 東營沿海自然群體、父本來自江蘇如東沿海自然群體，殼高4cm以上、3-4齡、健壯無損傷個 體。
4.按照權利要求2所述的選育方法，其特征在于步驟(2)中混合投喂的各種人工培 養的新鮮單胞藻包括金藻、扁藻、硅藻、小球藻、角毛藻。
5.按照權利要求2所述的選育方法，其特征在于步驟(4)中使用的混合精液應來自 30個以上雄貝。
6.按照權利要求2所述的選育方法，其特征在于步驟(5)中是利用Excel、SPSS統計 軟件分析雜交群體與自繁群體的差異。
全文摘要
一種文蛤快速生長品系的育種方法，主要應用不同地理群體文蛤雜交結合選擇育種的制種策略。首先用文蛤山東群體雌貝與江蘇群體雄貝進行雜交，獲得有生長快雜交優勢的雜交子一代群體；以雜交子一代中生長快的個體為基礎群，進行表型連續多代的選擇育種，培育出文蛤快速生長品系，本發明操作簡便，適用于規模化生產，培育出的文蛤快速生長品系與普通生產用貝相比，生長速度提高20％以上，這為文蛤養殖產量的提高有重要意義。
文檔編號A01K61/00GK101926293SQ200910100159
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者劉保忠, 張炯明, 林志華, 柴雪良, 肖國強, 董迎輝 申請人:浙江萬里學院