專利名稱：一種楊樹四倍體植株的誘導方法
技術領域：
本發明涉及一種植物四倍體植株的誘導方法，尤其涉及一種誘導楊樹四倍體 植株的誘導方法，屬于植物遺傳育種領域。
背景技術：
利用四倍體植株與二倍體雜交是獲得楊樹三倍體植株最直接有效的途徑。在 北歐和美國的有些地區，甚至把育成的四倍體山楊雌株直接栽在優良的山楊林分 中自由授粉，每年在四倍體山楊雌株上采種、育苗(徐緯英.楊樹.哈爾濱黑 龍江人民出版社，1988)。
楊樹四倍體選育可采取利用三倍體與二倍體雜交的方法(Nilsson-Ehle H. Production of forest trees with increased chromosome number and increased timber yield. Svensk Papp, Tidn., 1938， 2: 5; Bergstrom I. On the progeny of diploid x triploid尸o/ m/ms ,;-e附w/a with special reference to the occurrence of tetraploid. Hereditas, 1940, 26: 191-201; Winton L， Einspahr DW. Tetraploid aspen production using unreduced triploid pollen. Forest Science, 1970, 16(2): 180-182; Harder ML, Verhagen S, Winton L, Einspahr DW. Tetraploid Aspen production using unreduced pollen from triploid males. Forest Science, 1976, 22(3): 329-330)或通過秋水仙堿等 處理誘導種子、芽、幼胚或合子等體細胞染色體加倍(Mattila RE. On the production of the tetraploid hybrid Aspen by colchicine treatment. Hereditas, 1961, 47(3/4): 631-640; Einspahr DW. Colchicine treatment of newly formed embryos of quaking aspen. Forest Science, 1965, 11(4): 456-459; Pesina K. Experimental induction of polyploidy in poplars. Preslia, 1963, 35(2): 101-109; Ganchev P. Genetic investigation of some Aspen and hybrid (尸o/ w/tw a腸x _p加腦/a) forms obtained by treating seeds with rays (60Co) and colchincine solution. Gorskostopanska Nauka, 1976, 13(1): 3-15; Bakulin VT. Producing polyploid forms of some poplar species by means of colchicine treatment Izv. Sib. Otd. AN SSSR, ser. biol. n., 1977,2: 68-75; Mashkina OS， Burdaeva LM， V，yunova LN. Experimental mutagenesis and polyploidy in breeding forest trees. Lesnaya Genetika， 1989, 136-137; 李云.白楊雌
配子及體細胞染色體加倍誘導三倍體和四倍體技術的研究.北京北京林業大學, 1997)。其中，三倍體與二倍體雜交的前提是首先要獲得三倍體植株；而利用秋 水仙堿等處理萌發種子或芽等材料容易形成混倍體或嵌合體。
合子作為一個單一細胞，合子染色體加倍后形成純合四倍體，而不易形成 混倍體或嵌合體植株，是人工誘導四倍體植株的最理想選擇。迄今，只有Mashkina 等(Mashkina OS， Burdaeva LM, V，yunova LN. Experimental mutagenesis and polyploidy in breeding forest trees. Lesnaya Genetika, 1989， 136-137)明確報道禾(j用 秋水仙堿溶液處理銀白楊第一次分裂過程的合子獲得了四倍體植株。但是相關研 究未解決合子染色體加倍有效處理時期的判別問題，而是采用對大量材料進行逐 日處理，工作量大且重復性差，而誘導效率卻很低。可見，如何快速地判別楊樹 受精后合子的第一次有絲分裂時期是限制合子染色體加倍高效誘導楊樹四倍體 的關鍵問題，相關問題的解決對于楊樹四倍體誘導技術及三倍體高效選育具有重 要意義。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有楊樹四倍體誘導方法所存在的不足， 提供一種新的楊樹四倍體植株的誘導方法，該方法解決了楊樹合子染色體加倍有 效處理時期的判別問題，無需對材料進行逐日處理，可有效增加理化處理誘導合 子染色體加倍的準確性和穩定性，提高四倍體誘導效率，節約了誘導試劑和實驗 材料。
本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的
一種楊樹四倍體植株的誘導方法，包括用楊樹父本的花粉對楊樹母本的雌
花序進行授粉；形成果序；對果序施加理化處理；選育四倍體植株，即得；其中， 對果序施加理化處理的時期為當果序子房內的絮狀纖維已經形成并開始包裹胚 珠時對果序施加理化處理。
為了達到更好的誘導效果，優選的，當果序子房內的絮狀纖維開始包裹胚 珠基部但尚未充滿整個子房室時對果序施加秋水仙堿處理；所述的秋水仙堿處理優選為采用重量百分比濃度為0.5%的秋水仙堿溶液浸泡果序24小時；或者是當 果序子房內的絮狀纖維包裹胚珠基部和中部但尚未充滿整個子房室時對果序施 加高溫處理；所述的高溫處理優選為采用38-44'C的溫度處理果序4小時。
至于確定子房內部絮狀纖維發育至何種狀況或形態，本領域技術人員可通 過肉眼觀察進行確定，也可借助放大鏡等工具進行觀察并確認，這些方式均為本 領域技術人員所熟練掌握。
所述的楊樹母本優選為小葉楊(尸o; m/m 5z'附ow7 )、小青楊(戶 /wewfifo-w'mow'z')、 響葉楊(/! at/ew// ofif")、毛新楊(_P to附eMtora x _p 6a〃eawa)或 哲弓I3號楊(P戸油-W歸w','x i3 "—var./,cflf)等，更優選為哲弓l 3號楊；所 述的父本優選為小青楊、小葉楊、響葉楊、新疆楊(戶^〃ea朋)或北京楊(尸x 6e^w取ra^)等，更優選是北京楊。
所述的理化處理可以是各種誘導四倍體的處理手段，例如，可以是用秋水 仙堿溶液進行處理，也可以是采用高溫對果序進行誘導處理，這些技術手段都為 本領域技術人員所通曉。
本發明人結合石蠟切片等技術手段最終發現，當楊樹果序子房內的絮狀纖 維已經形成并開始包裹胚珠基部(或者是包裹基部和中部)但尚未完全覆蓋胚珠 時，此時果序內多數合子進入第一次有絲分裂過程，此時為施加理化處理誘導合 子染色體加倍的最佳處理時期，增強施加理化處理的時效性，可有效提高四倍體 誘導效率。本發明方法無需經歷對胚珠的固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、染色、
顯微觀察等繁瑣環節，還可有效增加理化處理誘導合子染色體加倍的準確性和穩 定性，節約誘導試劑和實驗材料，降低生產成本。
圖1楊樹子房內絮狀纖維包裹胚珠基部但尚未完全覆蓋胚珠的形態。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描 述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。 本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范 圍內。
實施例1
以哲引3號楊x北京楊為例，對授粉后一定時期的果序用FAA (F (70%乙 醇)F (乙酸)F (38%甲醛)=卯:5:5)進行固定，并觀察子房內部絮狀纖維 發育狀態，通過常規石蠟切片觀察合子發育進程，由于其發育存在一定的不同步 性，對大量胚珠內合子發育進行統計，消失試驗誤差，共統計胚珠213個，表明 哲引3號楊子房內絮狀纖維的發生、發育與其雙受精及合子發育進程存在密切關 系(表1)。當子房內絮狀纖維開始包裹胚珠基部(圖1)，或者是進一步開始包 裹胚珠中部但尚未完全覆蓋胚珠時，此時，多數合子進入第一有絲分裂過程。
以子房內絮狀纖維發育狀態為參照，當授粉后哲引3號楊x北京楊果序中子 房內的絮狀纖維開始包裹胚珠基部(此時為授粉后的第7天)時對果序施加秋水 仙堿處理，具體的處理方法是采用重量百分比濃度為0.5%的秋水仙堿溶液浸 泡果序24小時；當子房內的絮狀纖維進一步包裹胚珠的中部但尚未完全覆蓋胚 珠時(此時為授粉后的第8天)時對果序進行高溫處理，具體的高溫處理方法 為采用38-44。C的溫度處理果序4小時；處理結果在上述時期對果序分別進行 理化處理，總共誘導獲得了8株楊樹四倍體植株。
當果序子房內的絮狀纖維完全覆蓋株柄并開始伸長至胚珠時(此時為授粉 后的第6天)；或者是當子房內的絮狀纖維包裹大部分胚珠，但尚未完全覆蓋時 (此時為授粉后的第9天)，在上述時期內對果序分別施加秋水仙堿或高溫處理， 處理結果未獲得一株楊樹四倍體植株(表2、表3)。
上述試驗結果說明，當楊樹果序中子房內的絮狀纖維包裹胚珠基部或者是 進一步開始包裹胚珠的中部但尚未完全覆蓋胚珠時分別施加秋水仙堿或高溫處 理，可顯著增加理化處理誘導合子染色體加倍的準確性和穩定性，提高四倍體的 誘導效率。
6表1 哲引3號楊X北京楊合子胚初期發育進程
授粉后 合子發育進程(％)
時間絮狀纖維發育狀態8核胚囊休眠2細胞4細胞8細胞16細胞
(d)及雙受精合子原胚原胚原胚原胚
6絮狀纖維完全覆蓋 株柄，并開始伸長 至胚珠36,36 (16)56.82 (21)6.82 (3)000
絮狀纖維已觸及胚 珠下部，并開始包 裹胚珠基部055.81 (24)30.23 (13)11.63 (5)2.33 (1)0
8絮狀纖維包裹胚珠 的基部和中部036.96 (17)43.48 (20)19,57 (9)00
9絮狀纖維包裹大部 分胚珠，但尚未完 全覆蓋013.04 (6)32.61 (15)34.78 (16)17.39 (8)2.17 (1)
10絮狀纖維完全包裹 胚珠，但尚未充滿 子房室05.26 (2)18.42 (7)39.47 (15)28.95 (11)7.89 (3)
注括號外為各發育時期所占百分率(％);括號內為各發育時期統計數量.
表2 秋水仙堿誘導'哲引3號楊'X'北京楊'合子染色體加倍選育四倍體
編號授粉后時間處理持續時種子數存苗數四倍體數四倍體得率
(d)間(h)(粒)(株)(株)(%)
16242104500
27244746423.13
724462150.00
48245282800
59241493700
對照54914300
合計19563193表3高溫誘導'哲引3號楊'X '北京楊'合子染色體加倍選育四倍體
授粉后時溫度處理持續時間種子數成苗數四倍體數四倍體得率
間(d)(°C)(h)(粒)(株)(株)(%)
3842196800
64142412900
4441507100
384855311.89
了414511000
444734124.88
3842145900
84141224712.13
444672114.76
3842017600
94141503400
444662400
對照39117600
合計20307095
說明表2和表3中對照均指未進行處理而正常培養的果序，目的是為排除 合子不經處理而發生自發加倍以及天然未減數配子融合形成多倍性合子的可能 性。
權利要求
1、一種楊樹四倍體植株的誘導方法，該方法包括以下步驟用楊樹父本的花粉對楊樹母本的雌花序進行授粉，形成果序；對果序施加理化處理，選育四倍體植株；其特征在于當果序子房內的絮狀纖維已經形成并開始包裹胚珠時對果序施加理化處理。
2、 按照權利要求1所述的誘導方法，其特征在于當果序子房內的絮狀纖維開始包裹胚珠的基部但尚未完全覆蓋胚珠時對果序施加秋水仙堿處理。
3、 按照權利要求2所述的誘導方法，其特征在于所述的秋水仙堿處理是采用重量百分比濃度為0.5%的秋水仙堿溶液浸泡果序24小時。
4、 按照權利要求1所述的誘導方法，其特征在于當果序子房內的絮狀纖維包裹胚珠的基部和中部但尚未完全覆蓋胚珠時對果序施加高溫處理。
5、 按照權利要求4所述的誘導方法，其特征在于所述的高溫處理是采用38-44'C的溫度處理果序4小時。
6、 按照權利要求l-5任何一項所述的誘導方法，其特征在于所述的楊樹父本選自小青楊、小葉楊、響葉楊、新疆楊(i5 或北京楊(P x6ez)7"ge"w、)；所述的楊樹母本選自小葉楊(Po;w/ws w7wo"http://)、小青楊(P/wewc/o-w'mom7)、 響口十楊(^R afife"/; ot/")、 毛lf 楊(/! x 6a〃eawa)、哲弓l 3號楊/wewtfo-w'附o"'7 x /! w'gra var. //ca)。
7、 按照權利要求6所述的誘導方法，其特征在于所述的楊樹父本是北京楊x 6e詢g冊&);所述的楊樹母本是哲弓l 3號楊(/!,油-s/附畫7 x p "/gravar. //ca)。
全文摘要
本發明公開了一種楊樹四倍體植株的誘導方法，屬于植物遺傳育種領域。本發明方法包括用楊樹父本的花粉對楊樹母本的雌花序進行授粉，形成果序，當果序子房內的絮狀纖維已經形成并包裹胚珠時，對果序施加理化處理，選育四倍體植株，即得；本發明人通過試驗發現，當子房內絮狀纖維開始包裹胚珠但尚未完全覆蓋胚珠時，楊樹多數合子處于第一次有絲分裂過程，此時為施加理化處理誘導合子染色體加倍的有效時期，可提高四倍體植株的誘導效率。本發明方法無需經歷對胚珠的固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、染色、顯微觀察等繁瑣環節，從而增強施加理化處理的時效性，節約誘導試劑和實驗材料，增加了合子染色體加倍的準確性和穩定性。
文檔編號A01H1/06GK101595841SQ20091008677
公開日2009年12月9日 申請日期2009年6月29日 優先權日2009年6月29日
發明者峰 吳, 康向陽, 君 王, 敏 魯 申請人:北京林業大學