專利名稱：：一種融合菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種融合菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豆科植物中的紫花苜蓿被稱為牧草之王，隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，以及國內(nèi)外牧草產(chǎn)品市場需求的拉動，以紫花苜蓿為主的牧草種植呈現(xiàn)迅速發(fā)展的態(tài)勢，并逐步向規(guī)模化、集約化的方向發(fā)展。但紫花苜蓿生產(chǎn)中存在的兩個問題在一定程度上嚴重制約了其產(chǎn)量和品質(zhì)的提高。其一是由于根瘤菌與其宿主間的共生有效性，篩選適宜的根瘤菌菌株接種苜蓿品種，才能獲得更佳固氮效果。其二是由于苜蓿鐮刀菌根腐病(月/^w'咖spp.)造成苜蓿根系及主根腐爛，較為嚴重地影響了苜蓿生產(chǎn)。研究結(jié)果表明，由于草地本身的特點及經(jīng)濟、環(huán)境和食品安全等因素，嚴重制約了化學(xué)農(nóng)藥的使用。同時采用化學(xué)防治的方法無法有效的控制土傳苜蓿病害的發(fā)生(Leath，et.al.1971)。生物控制劑(BCA)以其低毒、具有在作物幼苗根際建群的能力，持效期長，有害生物不易對其產(chǎn)生抗藥性等特點得到廣泛的關(guān)注和重視，目前國際上先進的農(nóng)化公司大多積極參與生物控制劑的研究和市場化，特別是有益細菌在土傳和種傳病害的防治中已取得了一定進展，并有系列產(chǎn)品得到成功的應(yīng)用，取得了顯著的經(jīng)濟和生態(tài)效益。其中芽孢桿菌屬(Asw7力wspp)以其分布廣，易分離培養(yǎng)，能產(chǎn)生耐熱耐干燥的內(nèi)生孢子，貯藏期長，使用方便等特點，成為一種理想的生防微生物。芽孢桿菌屬的生物防治作用在苜蓿病害防治中將扮演越來越重要的角色。枯草芽孢桿菌(Sacj77wss^^7is)HL259CGMCCNo.1451是從黑龍江克山縣大豆田間土壤中分離得到的一株具有廣譜殺齒活性的生防菌株，該菌株用作土壤消毒和種子處理對土傳和種傳病原菌引起的根腐病具有良好防治效果。2001~2002年期間在黑龍江省大豆重迎茬田、吉林省和北京郊區(qū)根腐病發(fā)生比較嚴重的多個蔬菜保護地和苜蓿田進行的防治試驗結(jié)果表明HL259及其代謝產(chǎn)物能夠顯著的防治由尸yz^'鵬尸力Wop力"o2^尸^n'咖等引起的爛種、猝倒、立枯和根腐等病害，并兼治部分細菌性病害，具有一定的增產(chǎn)作用，是一株理想的土傳病菌生物控制菌株，在以苜蓿為代表的牧草病害防治中將發(fā)揮重要作用。原生質(zhì)體融合即細胞融合，是20世紀70年代發(fā)展起來的基因重組技術(shù)。通常用酶或機械的方法除去細胞壁，制成原生質(zhì)然后用物理、化學(xué)或生物學(xué)的方法誘導(dǎo)遺傳特性不同的兩親本原生質(zhì)體融合，經(jīng)染色體交換、重組而達到雜交的目的，經(jīng)篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子(Pathak"s丄，1971;施巧琴等，2003)。近年來，該技術(shù)已成為細胞生物學(xué)研究領(lǐng)域迅速發(fā)展的方向之一。1919年Giaja用蝸牛胃液從酵母細胞分離得到原生質(zhì)，特別是1953年Weibull首次用溶菌酶酶解分離5sw7^^的原生質(zhì)體，為微生物原生質(zhì)體研究的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。自Fodore"丄(1976)和Schaeffere"7.(1978)分別報道了巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌種內(nèi)原生質(zhì)體融合，微生物原生質(zhì)體融合現(xiàn)象得到證實，并建立起了相應(yīng)的試驗體系。從此，原生質(zhì)體融合育種廣泛的應(yīng)用于霉菌、酵母菌、放線菌和細菌，并從株內(nèi)株間發(fā)展到種內(nèi)種間，打破了種屬間的親緣關(guān)系，實現(xiàn)了屬間、門間甚至跨界融合。近30年來，由于研究方法的日漸改進和研究手段的不斷更新，圍繞著原生質(zhì)體的研究，已經(jīng)形成了一整套的原生質(zhì)體技術(shù)，這些技術(shù)的日益成熟和發(fā)展，使人們對微生物原生質(zhì)體的研究進入到了一個嶄新的階段(孫劍秋等，2002)。實踐證明，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)可以獲得具有雙親優(yōu)良特性的融合子，如1999年清華大學(xué)余荔華等將克氏固氮菌和枯草芽孢桿菌進行了原生質(zhì)體融合，并在室內(nèi)測定了融合子的生物學(xué)性狀、生理生化性狀以及固氮活性；2002年西北農(nóng)林科技大學(xué)韋革宏等展開苜蓿中華根瘤菌和鷹嘴豆慢生根瘤菌進行原生質(zhì)體融合相關(guān)研究；同年，山東大學(xué)金玉娟以及首都師范大學(xué)黃勤妮分別進行了芽孢桿菌和歐文氏菌以及大腸桿菌和枯草芽孢桿菌之間原生質(zhì)體融合的研究。細菌之間的原生質(zhì)體融合可以克服細菌種屬間的差異而實現(xiàn)基因重組。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種融合菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的融合菌株，是由枯草芽孢桿菌(v^"7^/sHL259CGMCCNo.1451原生質(zhì)體和根瘤菌(5Y加2^^oM咖印.)NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體融合獲得的融合子，已于2009年1月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2885。中華根瘤菌NX2004062是從寧夏田間分離獲得并經(jīng)生物學(xué)和生理生化性狀鑒定確認為根瘤菌菌株，該菌的菌落為圓形，乳白色半透明，隨著培養(yǎng)時間增長，菌落不斷擴展突起，邊緣整齊，菌落表面光滑，生長在其上的細胞物質(zhì)易在液體中分散。光學(xué)顯微鏡下菌為桿狀，大多數(shù)運動，鞭毛周生，菌大小為0.6-0.8X3-5Wn，革蘭氏染色后染色均勻，并可見菌被染成紅色。中華根瘤菌NX2004062可在苜蓿根際很好地定殖，其與多種紫花苜蓿共生試驗結(jié)果表明其可與多種紫花苜蓿具有較好的共生效果。中華根瘤菌NX2004062已于2009年1月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2883?？莶菅挎邨U菌(^aci^ws犯Mi"'s)HL259CGMCCNo.1451是從黑龍江克山縣大豆田間土壤中分離得到的一株具有廣譜殺菌活性的生防菌株，該菌株用作土壤消毒和種子處理對土傳和種傳病原菌引起的根腐病具有良好防治效果。枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451和中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883菌液可以直接混合使用，但是其在田間應(yīng)用時，由于二者存在的植株根際競爭和定殖等問題，影響使用效果。本發(fā)明應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)，成功地將具有高效固氮活性的中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883和具有良好生防效果的枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451進行原生質(zhì)體融合，從中篩選出具有雙親優(yōu)良特性，即同時具有固氮和生防雙重功效的融合子F17CGMCCNo.2885，為實現(xiàn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草產(chǎn)業(yè)提供有效措施，對于促進苜蓿產(chǎn)量、改善其品質(zhì)和提高其抗逆性等方面具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。將在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及農(nóng)業(yè)生態(tài)基地建設(shè)和區(qū)域經(jīng)濟的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。圖1為四分平板檢測培養(yǎng)2天的F17CGMCCNo.2885菌落形態(tài)和菌落擴展方式。圖2為四分平板檢測培養(yǎng)7天的F17CGMCCNo.2885菌落形態(tài)和菌落擴展方式。圖3為融合子F17CGMCCNo.2885的遺傳穩(wěn)定性檢測。圖4為苜蓿幼苗在接種了苜蓿根腐病病菌的土壤中出現(xiàn)猝倒。圖5為接種融合子F17CGMCCNo.2885后60d的苜蓿固氮和防病試驗結(jié)果。圖6為苜蓿植株根部生長和結(jié)瘤情況。具體實施例方式實施例1、融合子F17CGMCCNo.2885的獲得1)中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體的制備一、根瘤菌(57/oi^z>o&〃/3砂.)NX2004062CGMCCNo.2883的分離a、菌株的分離方法從寧夏市西夏區(qū)蘆花鎮(zhèn)鎮(zhèn)北堡的苜蓿實驗地中采取地上部生長旺盛的苜蓿植株，觀察其根部著生的根瘤，摘取顏色為粉紅色的根瘤置于小采樣瓶中，瓶子底部放入無水硫酸鈉作為干燥劑。將采取的根瘤帶回室內(nèi)后，用無菌水清洗三次，表面使用3X次氯酸鈉消毒5rain，然后再用無菌水清洗一次后將根瘤轉(zhuǎn)移至滅菌的吸水紙上，吸干水份。將根瘤放在滅菌的研缽中搗碎，用接種環(huán)蘸其汁液，采用細菌劃線的方法將其在YMA結(jié)晶紫選擇培養(yǎng)基(含lg/100000ml結(jié)晶紫的YMA培養(yǎng)基)上進行劃線，28'C條件下恒溫培養(yǎng)24h，選擇邊緣整齊，乳白色半透明的單菌落接種到Y(jié)MA(10g甘露醇，酵母粉3g，0.25gK2HP04，0.25gKH2P04，0.2gMgSO廠H20，O.lgNaCl，3gCaC03，10g瓊脂粉，1L蒸餾水，pH值7.2)固體培養(yǎng)基上。進行生物學(xué)和生理生化性狀鑒定，并將獲得的菌株命名為NX2004062。b、菌株的鑒定①顯微和超微形態(tài)觀察將菌株NX2004062在YMA固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，并觀察記錄。培養(yǎng)48h后，菌落為圓形，乳白色半透明，隨著培養(yǎng)時間增長，菌落不斷擴展突起，邊緣整齊，菌落表面光滑，生長在其上的細胞物質(zhì)易在液體中分散。光學(xué)顯微鏡下觀察到菌為桿狀，大多數(shù)運動，鞭毛周生，菌大小為0.6-0.8X3-5Mm，革蘭氏染色后染色均勻，并可見菌被染成紅色。②生理生化鑒定將菌株進行生理生化鑒定，鑒定結(jié)果如表l所示。表l、菌株NX2004062鑒定項目及結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>v-p反應(yīng)一一檸檬酸鹽水解~！-卵黃反應(yīng)一硝酸鹽還原一—5%氯化鈉+十產(chǎn)生吲哚7%氯化鈉色氨酸脫胺——10%氯化鈉酪朊分解—一葡萄糖產(chǎn)酸酪氨酸分解——d-木糖產(chǎn)酸+十石蕊牛奶++阿拉伯糖產(chǎn)酸++明膠水解++甘露醇產(chǎn)酸固氮能力++葡萄糖產(chǎn)黑色素—結(jié)晶紫檢測++注"+"表示陽性結(jié)果；"一"表示陰性結(jié)果。③PCR擴增共生結(jié)瘤Box的nodA基因和NifH基因進行鑒定應(yīng)用根瘤菌特異性引物，對菌株NX2004062的共生結(jié)瘤Box的nodA基因和NifH基因進行PCR擴增。擴增NodA基因的引物序列如下nodA-l:5'-TGCRGTGGAARNTRNNCTGGGAAA-3'，nodA-2:5'-GGNCCGTCRTCRAAWGTCARGTA-3，；擴增NifH基因的引物序列如下nifH-1:5'-AAGTGCGTGGAGTCCGGTGG-3'，nifH-2:5'-GTTCGGCAAGCATCTGCTCG-3'。以菌株NX2004062的菌液為模板，分別以上述引物進行PCR擴增。PCR擴增結(jié)果表明擴增得到的NodA基因片段的大小接近700bp左右，與目的片斷大小一致，擴增得到的NifH基因片段的大小接近700bp左右，與目的片斷大小一致。上述實驗結(jié)果綜合表明，該根瘤菌細胞無芽孢，通常為桿菌，不運動，好氧。革蘭氏染色陰性，利用多種碳水化合物，在含碳水化合物培養(yǎng)基上生長時通常產(chǎn)生大量的胞外粘液。不利用檸檬酸鹽，溶于氯仿。不生成3-酮基葡萄糖苷。緩慢液化明膠。不水解酪蛋白和洋菜。菌落白色或無色。不利用纖維素和淀粉。能以銨鹽、硝酸鹽、和大多數(shù)氨基酸作為氮源。接觸酶反應(yīng)陽性。將以上菌株NX2004062的部分生理生化性狀檢測結(jié)果與根瘤菌標準菌株相比較，根據(jù)《一般細菌常用鑒定方法》和《根瘤菌屬》中的檢索表進行檢索，可以確定菌株M2004062的生理生化性狀與根瘤菌相應(yīng)性狀較吻合。同時NodA基因和NifH7基因的擴增結(jié)果，進一步確認生化鑒定結(jié)果，鑒定菌株NX2004062為根瘤菌。二、中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體的制備挑取活化的中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883單菌落接入液體酵母粉甘露醇培養(yǎng)基(YMA)培養(yǎng)基中，28°C，150r卿振蕩培養(yǎng)過夜。按1%的比例重新接種于液體YMA培養(yǎng)基中，并加入終濃度為2%的甘氨酸，于相同條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長前期。向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.5^/ml的青霉素，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取10ral培養(yǎng)物于離心管中3500rpra離心15rain收集菌體，制備原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的制備方法如下先用磷酸高滲緩沖溶液(0.6MNaCl，50raM磷酸緩沖液，pH7.2)洗滌菌體一次，再次將菌體懸浮于上述的磷酸高滲緩沖液中，調(diào)菌懸液濃度，使得OD,達l.O(約1.0乂108409活菌/1111)，分別取等量菌懸液于若干試管中，向其中加入融菌酶，融菌酶的濃度梯度為0.2mg/ml，35i:水浴1090min，反復(fù)凍融，于不同時段取樣，鏡檢原生質(zhì)體形成情況。鏡檢結(jié)果表明融菌酶濃度為1.0mg/ml，酶解時間60min時，95%以上的細胞成原生質(zhì)體，此時離心終止酶反應(yīng)，用磷酸高滲緩沖溶液再次懸浮，-2(TC保存?zhèn)溆谩?)枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451原生質(zhì)體的制備挑取活化的枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451單菌落接入液體YMA培養(yǎng)液中，28°C，150rpm振蕩培養(yǎng)過夜。按1%的比例重新接入液體YMA培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取10ml培養(yǎng)物于離心管中3500rpm離心15min收集菌體，制備原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的制備方法如下先用磷酸高滲緩沖溶液洗滌菌體一次，再次將菌體懸浮于磷酸高滲緩沖液中，調(diào)菌懸液濃度，使得OD,達l.O(約1.0乂108~109活菌/ml)，分別取等量菌懸液置于若干試管中，向其中加入融菌酶，融菌酶的濃度梯度為0.2mg/ml，35"水浴1090min，于不同時段取樣，鏡檢原生質(zhì)體形成情況。鏡檢結(jié)果表明融菌酶濃度為0.2mg/ml，酶解時間為20min，95%以上的細胞變成原生質(zhì)體，此時離心終止酶反應(yīng)，用磷酸高滲緩沖溶液再次懸浮，-20°(3保存?zhèn)溆谩?)中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451原生質(zhì)體融合將1ml中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體懸浮液先置于距紫外燈(15W)18cm處處理10min，使原生質(zhì)體充分滅活，然后將滅活后的中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體懸浮液與1ml枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451原生質(zhì)體懸浮液等體積混合，充分懸浮后靜置5min;3500rpm離心15min收集沉淀；向沉淀中加入0.2ml磷酸高滲緩沖液懸浮，加入1.8mlPEG6000和終濃度為5mg/L的融菌酶(上海生工，產(chǎn)品編號LDB0308)，另外再加入新生磷酸鈣(O.5%K2HP04，1.0MCaCl2，分別滅菌，等體積混合)溶液0.2ml，輕輕搖勻，充分懸浮，然后置于紫外燈下28cm處照射90s以誘導(dǎo)重組，37。C靜置20min，3000rpra離心15min，收集沉淀，將沉淀充分懸浮于2ml磷酸高滲緩沖液中，取lml懸浮液加到50°C的半固體再生基本培養(yǎng)基(10g甘露醇，酵母粉3g，0.25gK2HP04，0.25gKH2P04，0.2gMgS04-H20，0.1gNaCl，3gCaC03，5g瓊脂粉，0.6M的NaCl，50mM磷酸緩沖液，1L蒸餾水，pH值7.2)中混勻，迅速傾入底層為再生基本培養(yǎng)基(在YMA培養(yǎng)基中加入終濃度為0.6M的NaCl,50mMpH7.2磷酸緩沖液)的平板上鋪平，于28'C恒溫箱中培養(yǎng)，7d后觀察。觀察結(jié)果表明，培養(yǎng)7d后即有單菌落生長，大多數(shù)單菌落的表型特征兼有中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451特點，但更接近于枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451，其菌落為圓形，乳白色不透明，隨著培養(yǎng)時間延長，菌落變厚凸起，邊緣不整齊，菌落表面有皺褶狀凸起，但并不干燥，菌落產(chǎn)生淺桔紅色的色素，菌體較易在水中分散，光學(xué)顯微鏡下觀察為桿狀菌體。將上述單菌落轉(zhuǎn)接于含氯霉素(5(￥g/ml)抗性平板，28'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后平板上只有部分菌落擴散生長，而且在菌落顏色等表型性狀和擴散速度等方面存在很大差異。初步將表型兼有兩親本特點，擴散生長正常的單菌落初步作為中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451原生質(zhì)體融合子。4)中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451原生質(zhì)體融合子的篩選中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883對氯霉素有抗性，而枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451則沒有，即使含量很低(5Pg/ml)時枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451也不生長。因此可用氯霉素篩選融合子。將含氯霉素50Pg/ml平板分成4份，分別接種中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883、枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451和GFP標記的枯草芽孢桿菌HL259和初步鑒定的融合子進行培養(yǎng)。培養(yǎng)2d和7d后結(jié)果如圖l和2所示，初步鑒定的融合子在菌落形態(tài)和菌落擴展方式等方面與兩親本均有相似和差異。培養(yǎng)2d后，初步鑒定的融合子的菌落形態(tài)和顏色與中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883相似，但隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落表面呈現(xiàn)一定程度的鈹縮但并不干燥，而親本中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883單菌落表面光滑。圖1為培養(yǎng)2d后枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451，中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883及其融合子F17，GFP標記的枯草芽孢桿菌HL259在氯霉素(50l^g/ml)抗性平板上的培養(yǎng)性狀比較。其中"A"代表枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451;"B"代表融合子F17;"C"代表GFP標記的枯草芽孢桿菌HL259;"D"代表中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883。圖2為培養(yǎng)7d后枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451，中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883及其融合子F17，GFP標記的枯草芽孢桿菌HL259在氯霉素(50Pg/ml)抗性平板上的培養(yǎng)性狀比較。其中"A"代表枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451;"B"代表融合子F17;"C"代表GFP標記的枯草芽孢桿菌HL259;"D"代表中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883。GFP標記的枯草芽孢桿菌HL259的構(gòu)建方法如下(1)挑取新長出的HL-259單菌落于5mlLB培養(yǎng)液的試管中，加入18W1MMgS04.7H20溶液，于33。C，180rpm過夜搖培；將過夜培養(yǎng)物以1:20的比例接入HL259感受態(tài)細胞培養(yǎng)基GE中繼續(xù)搖培。培養(yǎng)基GE的組份為葡萄糖50.5MM、谷氨酸鉀9.8MM、pH7.0的磷酸緩沖液lOOmM、檸檬酸三鈉3raM、MgS047H203mM、檸檬酸鐵銨45MM、色氨酸245,，補足重蒸水100ml。(2)開始搖培3.5hr時第一次取0.5mlGE搖培液于1.5ml印pendorf管中，之后每15min取樣一次，共取四次，備用。(3)分別使用以上不同時間段制備好的0.5ralGE新鮮感受態(tài)細胞，加入pGFP22質(zhì)粒(綠色熒光蛋白基因標記野生型生防枯草芽孢桿菌的研究，生物工程學(xué)報，2003年19巻5期，頁碼P551-556，作者姚震生，陳中義等)(中國農(nóng)業(yè)大學(xué))的ddH20溶液于其中，并向1.5ml印pendorf管再加入0.8ralLB培養(yǎng)液，上下顛倒充分混勻，置于37。C水浴中30min。(4)將0.2ml混合物涂布于含5Pg/ml氯霉素(購自北京友誼中聯(lián)生物科技工程公司)的抗性YMA平板上，33。C培養(yǎng)過夜，觀察菌落生長情況；采用365nmUV激發(fā)，肉眼直接進行HL259菌株發(fā)光表型觀察，進行轉(zhuǎn)化子的酶切鑒定后確認gfp基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化至HL259上，命名帶有綠色熒光標記的菌株為GFP-HL259，該菌株10可以在含有5Pg/ml的氯霉素YMA平板上正常生長。5)中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451原生質(zhì)體融合子遺傳穩(wěn)定性測定原生質(zhì)體融合過程中，在形成融合子的同時也會產(chǎn)生一些異核體或二倍體，它們會在融合子檢出與篩選時產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。用普通YMA平板繼代培養(yǎng)和氯霉素抗性平板篩選檢測其遺傳穩(wěn)定性。將初步鑒定的融合子在無抗性(不含氯霉素)平板上連續(xù)繼代培養(yǎng)10代，然后在抗性平板上進行檢測，能正常生長的被認為具有遺傳穩(wěn)定性。試驗結(jié)果如圖3所示，表明初步鑒定的融合子在普通YMA平板上生長正常，生長速度和菌落表型性狀等方面沒有表現(xiàn)出很大差異。繼代培養(yǎng)10代后，將這些單菌落轉(zhuǎn)接到含有氯霉素的抗性平板上培養(yǎng)5d后觀察，各個菌落之間在菌落表型特征上呈現(xiàn)出差異一部分單菌落能夠正常生長擴展，另一部分生長擴展緩慢，還有一部分不能生長擴展成菌落。在氯霉素抗性選擇平板上生長緩慢或者不能正常生長擴展的菌落，可能是異核體或二倍體，不是融合子；能正常生長擴展為單菌落的進一步確定為融合子，并認為具有穩(wěn)定的遺傳特性，試驗獲得有穩(wěn)定的遺傳特性融合子F17、F18、F21、F22和F24。6)融合子F17的鑒定細菌的菌落形態(tài)、菌落擴展方式、革蘭氏染色、芽孢染色及其各項生理生化測定指標都是確定其分類地位的重要依據(jù)。16SrRNA序列在屬水平上具有很高的保守性，是目前細菌分類的重要參考標準。全細胞可溶性蛋白是其基因表達的產(chǎn)物，電泳圖譜在一定程度上能反映細菌之間的親緣關(guān)系。本發(fā)明根據(jù)《一般細菌常用方法》、《芽孢桿菌屬》及《革蘭氏陰性桿菌編碼鑒定手冊》中提供的檢測方法對供試菌中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451以及它們的融合子F17的多項生理生化指標進行了測定進一步確定融合子F17的分類地位?？莶菅挎邨U菌為有芽孢橢圓形或柱狀、中生或偏中生、運動，革蘭氏陽性，接觸酶試驗陽性，V-P試驗陽性，質(zhì)量百分含量為5%-10%氯化鈉中生長，在葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸，水解淀粉，利用檸檬酸鹽作為碳源，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，分解酪素，石蕊牛奶產(chǎn)堿胨化，卵黃反應(yīng)陰性，在葡萄糖和酪氨酸洋菜上不形成黑色素，不水解馬尿酸鹽，不利用丙酸鹽和不分解酪氨酸。生理生化指標實驗結(jié)果表明，融合子F17的各項生理生化性狀中大多與枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451相同，而在固氮培養(yǎng)液生長和結(jié)晶紫培養(yǎng)基檢測試驗中與中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883表現(xiàn)相同，在V-P試驗中F17反應(yīng)呈現(xiàn)出介于二親本之間的淺紅色反應(yīng)現(xiàn)象。全細胞可溶性蛋白定性分析結(jié)果表明，融合子F17的聚丙烯酰氨凝膠電泳圖譜與枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451更為相似?？莶菅挎邨U菌HL259CGMCCNo.1451、中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2885及融合子F17的16SrRNA序列分析試驗結(jié)果表明融合子F17的16SrRNA序列為序列表中的序列3，枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451的16SrRNA序列為序列表中的序列1，中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883的16SrRNA序列為序列表中的序列2。融合子F17和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451有較近的親緣關(guān)系，16SrRNA序列同源性達89.68%;而融合子F17與中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883的16SrRNA序列同源性僅為62.44%。16SrRNA基因序列進行同源性比較結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451和融合子F17分別與GenBank中芽孢桿菌^3w'h'〃si"仏strain1,504的16SrRNA基因序列同源性達到99.52%和92.56%，初步確定融合子F17為芽孢桿菌屬(勘w7^a)?？莶菅挎邨U菌HL259和根瘤菌NX2004062原生質(zhì)體融合菌F17已于2009年1月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2885。實施例2、F17CGMCCNo.2885的防病和固氮效果1)F17CGMCCNo.2885的抑菌作用牛津杯法測定枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451和融合子F17CGMCCNo.2885對12種植物病原真菌和6株植物病原細菌的抑菌作用。12種植物病原真菌為番茄口十毒病菌("aobsjDioriwz/k/i/〃邁)、番節(jié)灰毒病菌(Aoz^T70'scioeres)、蘋果腐爛病菌(Ka^sa/za7i)、蘋果輪紋病菌(尸力j^g7o5"porapirj'coh)、玉米彎孢菌葉斑病(Curn/Jar/a2y/ata)、棉花黃妻病菌(rartici72iw/wok/Wiae)、棉花枯菱病菌(/7.ay7spar"/z7f.sp.ra57'/2/ecfw/z)、小麥紋枯病菌(7力izocfo/2iac&rea7ia)、水稻稻瘟菌(尸iric〃2ariaaryzae)、茄病鐮刀菌(尸iAsari"歷、苜蓿根腐病纟廉刀菌(尸wsarz.w歷3F6773ce3/b)禾口番莉早疫病菌(月7tei77ariascL/ai)。6株才直物病原細菌為馬鈴薯軟腐病菌(^nw'w'acar"o「ora),根癌病菌(^gro力a"ei^'w/zr/izo^67e)，黃瓜角珍王病菌(/^e〃o^/z70/3351577^'/^3e)'禾帛花角藎王病菌(ik^t6o歷o/as歷s7yacearwff),番琉遺蕩病(CZ3va'力sctar/w'c六X^3/7e/757'5subsp.i/ic力j'ga/7ey757'51,簡稱'琉青枯病菌yfeJstOTYaso/朋sceara瓜牛津杯法的具體步驟如下A.融合子F17CGMCCNo.2885對真菌和卵菌的抑菌作用采用平板培養(yǎng)法，融合子F17在LB培養(yǎng)基斜面28"C下活化，培養(yǎng)48h后，用0.85。/。生理鹽水制成菌懸液，用麥克比濁法確定最終菌懸液濃度為109cfu/mL，備用。供試真菌在PDA平板上25"活化5d，使其形成一定直徑菌落，用打孔器(05mm)制取菌餅，將菌絲面朝下接菌于PDA平板中央。將高溫滅菌的牛津杯(08.5mm)分別均勻擺放在PDA平板上，并在每個牛津杯內(nèi)加入100叱的菌懸液，以牛津杯內(nèi)加入100叱的無菌水的PDA平板為對照，每皿4個，距離均勻，每個處理4次重復(fù)，25'C下黑暗培養(yǎng)4、5、6d、7d后分別測量真菌菌落擴展直徑(菌落擴展直徑=菌落直徑一菌餅直徑)，并計算抑制生長率。真菌抑制生長率二對照菌落擴展直徑一處理菌落擴展直徑X100%對照菌落擴展直徑測定實驗結(jié)果見表1，枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451和融合子F17CGMCCNo.2885對番茄葉霉病菌，番茄灰霉病菌，棉花黃萎病菌和苜蓿根腐病鐮刀菌均有很好的抑制作用，抑制率均在在70%以上；對小麥紋枯病菌，棉花枯萎病菌，玉米彎孢菌，蘋果輪紋病菌的抑制率均大于50%;對番茄早疫病菌，水稻稻瘟菌，蘋果腐爛病菌，茄病鐮刀菌的抑制率在39-48%。上述結(jié)果表明枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451和融合子F17CGMCCNo.2885均具有廣譜殺菌活性。表1.牛津杯法測定親本菌株HL259和融合子F17對供試病原真菌的抑制效果菌株菌落直徑(cm)對照菌落直徑(cm)HL259抑制率％菌落直徑(cm)F17抑制率％番茄葉霉病菌3.831.3772.911.3772.91番茄灰霉病菌2.780.6775.890.6476.97棉花黃萎病菌3.181.0478.161.1076.11玉米彎孢病菌2.150.9073.681.0068.42小麥紋枯病菌2.671.3759.921.2066.9413苜蓿根腐病鐮刀菌棉花枯萎病菌尸.ary5/ar咖f.sp.rasi/2/"e"WT7蘋果輪紋病菌蘋果腐爛病菌番茄早疫病菌水稻稻瘟菌茄病鐮刀菌尸.so7朋i3.092.652.072.812.043.182.830.881.511.011.71.472.092.0071.5253.7566.4849.2240.2242.3237.980.821.491.241.731.372.031.9773.4654.5853.8548.0545.8144.3739.15B.融合子F17CGMCCNo.2885對細菌的抑菌作用將融合子F17和靶標細菌活化48h后制成菌懸液，用麥克比濁法將菌懸液調(diào)整到1.5X109cfU/mL，吸取0.lmL靶標菌菌懸液加到培養(yǎng)基平板上用涂布鏟鋪平。將牛津杯放在培養(yǎng)基上，在每個牛津杯內(nèi)加入100叱的菌懸液，以牛津杯內(nèi)加入100叱的無菌水的平板為對照，每皿4個，距離均勻，每個處理4次重復(fù)。培養(yǎng)皿在4i:下保存16h后，移至28i:培養(yǎng)箱內(nèi)，在黑暗條件下培養(yǎng)24h、8h，測量抑菌圈直徑。測定實驗結(jié)果見表2，表明，融合子F17及其親本菌株HL259均對馬鈴薯軟腐、水稻白葉枯、K27這三種病原細菌有較好的抑制效果；對番茄潰瘍、茄青枯、番茄瘡痂、棉花角斑有效果，但抑制不明顯。對黃瓜角斑幾乎無效。表2.親本菌株HL259和融合子F17對供試病原細菌的抑制作用供試親本菌株HL259融合子F17菌株抑菌圈直徑抑菌圈直徑供試親本菌株HL259融合子F17菌株抑菌圈直徑抑菌圈直徑注牛津杯的直徑為0.85m;2)F17CGMCCNo.2885對苜蓿根腐病的防治將沙子、田間自然土壤和草炭分別進行滅菌處理，然后按沙土草炭=6:2:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1的比例充分混合，制成混合土壤。將已接種苜蓿鐮刀根腐病菌的玉米沙在25°C-28'C的條件下培養(yǎng)7d后，按照l:20(玉米沙混合土壤的比例，將其充分與上述土壤混勻。加入3/4體積的接種苜蓿鐮刀根腐病菌的混合土壤于容積13cmX13cmX13cm的塑料花盆中。挑選發(fā)芽一致的已分別經(jīng)濃度為109cfu/mL的枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451、融合子F17、中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883菌懸液浸種30min后的苜蓿種子(品種為CW787)，用無菌鑷子夾取，植入裝有混合土壤的花盆中，每盆種植10粒發(fā)芽一致的種子。分別再向其中加入相應(yīng)菌液(枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451、融合子F17或中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.288)5mL，使各個處理每個重復(fù)中含菌量達到5.0X10"'cfu。并設(shè)置無菌水浸種的處理作為對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)。接種完畢將其轉(zhuǎn)入溫室條件下生長培養(yǎng)，播種7d后統(tǒng)計紫花苜蓿CW787不同接種處理的出苗率和發(fā)病率。防治效果結(jié)果表明，融合子F17CGMCCNo.2885以及親本枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451對苜蓿根腐病有很好的防治效果，對照的出苗率僅在70%左右，而融合子F17CGMCCNo.2885和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451處理的苜蓿出苗率都在100%;對照和中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883處理的苜蓿幼苗猝倒率分別為33.3%和32.7%，融合子F17CGMCCNo.2885和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451處理幼苗生長健康，無猝倒現(xiàn)象；收獲時對照和中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883處理苜蓿根部呈現(xiàn)不同程度的變褐發(fā)病狀況，而融合子F17CGMCCNo.2885和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451處理的苜蓿根部幾乎沒有病害發(fā)生，表明融合子F17CGMCCNo.2885和枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451均具有良好的防病保苗效果。圖4所示為對照出苗率低以及幼苗出現(xiàn)猝倒。3)融合子F17CGMCCNo.2885與苜蓿共生的溫室盆栽試驗沙子、田間自然土壤和草炭分別進行滅菌處理，然后按沙土草炭二6:2:1的比例充分混合均勻，制成混合土壤，將已接種苜蓿鐮刀根腐病菌的玉米沙在25。C-28T:的條件下培養(yǎng)7d后，按照l:20(玉米沙混合土壤)的比例，將其充分與上述土壤混勻。在容積30cmX30cmX30cm的塑料花盆中加入3/4體積的接種苜蓿鐮刀根腐病菌的混合土壤。紫花苜蓿種子(品種為CW787)分別用濃度為109Cfu/mL的枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451、融合子F17、中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883菌懸液浸種30min后進行接種處理，并設(shè)置不接種任何菌的處理作為對照，15每個處理設(shè)3個重復(fù)。挑選發(fā)芽一致的苜蓿種子，用無菌鑷子夾取，植入裝有無菌混合土壤的花盆中，每盆種植25粒。分別再向其中加入相應(yīng)菌液(枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451、融合子F17或中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.288)15mL，使各個處理每個重復(fù)中含菌量達到5Xl(Tcfu/mL。接種完畢將其轉(zhuǎn)入田間自然條件下生長培養(yǎng)。播種45d后測定各個處理的葉綠素含量；播種60d后收獲，測量各處理植株的株高、根長、觀察根部發(fā)育狀況，測量地上部分和地下部分生物量，測量固氮酶活性，明確供試融合子的防病和促生效果。葉綠素含量測定盆栽試驗至45d時，隨機從每個處理摘取24片葉，每個重復(fù)8片。稱量葉片的鮮重后立即裝入含有95%乙醇的lOmL螺口刻度試管中。在85。C水浴中處理0.5h-lh至葉片完全失綠，然后定容至10mL，以95%乙醇做參比液，分別測定它們在645nm和663nm處的吸光值，根據(jù)公式，可以計算出葉片葉綠素C的含量(20.21AM5+8.02A663)X10C1000X樣品鮮重(g)固氮酶活性測定將一個重復(fù)的所有植株根部(包括所有根瘤)剪下，用水沖洗干凈，并用吸水紙吸干。立即置入100mL玻璃瓶中，將橡皮塞塞緊；用注射器抽出10raL空氣，然后注入10mL乙炔，28"C下反應(yīng)lh。反應(yīng)完成后，同時用注射器抽出lOmL反應(yīng)氣體注入備好的小瓶中備用。立即將所有的根瘤剪下，統(tǒng)計瘤數(shù)，測量鮮重。用微量進樣器吸取反應(yīng)后氣體100uL在氣相色譜儀上測定乙烯峰值。在同樣條件下按照以下比例純乙炔；純乙炔和純乙烯按體積比10000:l混合；純乙炔和純乙烯按體積比1000:l混合；純乙炔和純乙烯按體積比100:1混合；純乙炔和純乙烯按體積比10;l混合；純乙炔和純乙烯按體積比l:1混合；純乙炔和純乙烯按體積比l:IO混合；純乙炔和純乙烯按體積比l:100混合；純乙炔和純乙烯按體積比l:1000混合；純乙炔和純乙烯按體積比1:1000混合；純乙炔和純乙烯按體積比l:10000混合；純乙烯，繪制標準曲線。由此計算不同處理根瘤菌樣品的固氮酶活性。固氮酶活件—_反應(yīng)產(chǎn)生的CA(,0l)U炎、鵬厄l土-根瘤鮮重(g)X反應(yīng)時間(h)親本中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883和融合子F17CGMCCNo.2885與苜蓿CW787有很好的共生效果(表3)。在苜蓿植株地上和地下部分生物量、固氮酶活性、葉綠素含量、根瘤數(shù)量、根留重等測定指標上，中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883和融合子F17CGMCCNo.2885處理明顯優(yōu)于對照和其他幾個處理。其中，融合子F17CGMCCNo.2885處理的地上部分鮮重較對照凈增約1.68倍，地上部分干重較對照凈增約1.63倍，地下部分鮮重較對照凈增約2.14倍，地下部分干重較對照凈增約1.75倍。中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883處理也高于對照，但是低于融合子F17CGMCCNo.2885處理。播種后45天，對照的葉綠素含量值是2.0319，枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451處理的苜蓿的葉綠素含量最低，為1.9240,融合子F17CGMCCNo.2885處理的苜蓿的葉綠素含量最高，為2.5621。中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883、枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451和融合子F17CGMCCNo.2885處理的苜蓿的固氮酶活性均高于對照，其中融合子F17CGMCCNo.2885處理的苜蓿的固氮酶活性最高，為對照的1.97倍。融合子F17CGMCCNo.2885處理的苜蓿株高比對照凈增35.57%，根長較對照凈增最多為13.82%，且主根粗而長、側(cè)根和須根旺盛、根瘤也很多；對照植株根部主根較細、側(cè)根和須根少、幾乎沒有根瘤(圖6);枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451處理稍優(yōu)于對照相當，側(cè)根較對照多。融合子F17CGMCCNo.2885對紫花苜蓿CW787植株生長表現(xiàn)為促進作用(圖5)。圖6中，"A"為對照的根，"B"為中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883處理的紫花苜蓿CW787的根，"C"枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451處理的紫花苜蓿CW787的根，"D"融合子F17CGMCCNo.2885處理的紫花苜蓿CW787的根。表3融合子F17與紫花苜蓿CW787的共生效果調(diào)查項目供試菌株對照NX2004062HL259F17葉綠素含量2,03192.31681.92402.5621株高平均值(cm)24,2930.0427.3432.93根長平均值(cm)22.4322.5722.3823.41固氮酶活性0.67811.25801.17822,0151根瘤數(shù)67.392.057.0219.3平均根瘤重(g)0.00080.00230.00110.0014地上部分鮮重(g)4.08646.77054.537810.9568<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>苜蓿生長受到多種因素制約，其中病害防治和肥料利用是重要的兩個環(huán)節(jié)。根腐病是一種防治難度較大的根部病害，一旦發(fā)生就可能給苜蓿生產(chǎn)帶來慘重損失。氮肥是苜蓿生長所需的大量元素，對植株的生長發(fā)育具有較大影響。單純的生防菌和單純的固氮根瘤菌均不能完美的解決這些問題，枯草芽孢桿菌HL259CGMCCNo.1451是一株對苜蓿根腐病具有良好防治效果的生防菌，中華根瘤菌NX2004062CGMCCNo.2883具有高效固氮活性，二者原生質(zhì)體融合后的產(chǎn)物融合子F17CGMCCNo.2885兼有固氮和防病的特點。實驗結(jié)果表明，融合子F17CGMCCNo.2885是一株具有高效固氮和防病活性的工程菌資源。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>—種融合菌株及其應(yīng)用〈160〉2〈210〉1〈211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈230〉〈400〉1aagtgcgtggagtccggtgg20〈210〉2<211>20〈212〉薩〈213〉人工序列〈220〉<230〉〈400〉2gttcggcaagcatctgctcg2019權(quán)利要求1、一種融合菌株，是由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL259CGMCCNo.1451原生質(zhì)體和根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體融合獲得的融合子。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合菌株，其特征在于所述融合菌株的保藏編號為CGMCCNo.2885。3、權(quán)利要求1或2所述的融合菌株在苜蓿固氮中的應(yīng)用。4、權(quán)利要求1或2所述的融合菌株在苜蓿病害防治中的應(yīng)用。5、權(quán)利要求1或2所述的融合菌株在苜蓿固氮和病害防治中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種融合菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的融合菌株，是由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL259CGMCCNo.1451原生質(zhì)體和根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)NX2004062CGMCCNo.2883原生質(zhì)體融合獲得的融合子，其保藏編號為CGMCCNo.2885。本發(fā)明的融合菌株CGMCCNo.2885為實現(xiàn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草產(chǎn)業(yè)提供有效措施，對于促進苜蓿產(chǎn)量、改善其品質(zhì)和提高其抗逆性等方面具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。將在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及農(nóng)業(yè)生態(tài)基地建設(shè)和區(qū)域經(jīng)濟的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。文檔編號A01P3/00GK101565686SQ20091008117公開日2009年10月28日申請日期2009年4月3日優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日發(fā)明者劉西莉,劉鵬飛,盧志軍,朱書生,李健強,羅來鑫,賈小紅,黃中喬申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)