專利名稱：：一類(取代)苯基丙烯酸修飾的昆蟲抑咽側體素類似物及其在蟑螂防治中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一類(取代)苯基丙烯酸修飾的昆蟲抑咽側體素類似物，及其對蟑螂的防治作用。
背景技術：
：蟑螂是世界性的重要衛(wèi)生害蟲之一，列為四害之一。蟑螂具有種類繁多、繁殖迅速、食譜廣泛、傳播疾病、很難防治等特點。現(xiàn)有的滅蟑方法很多，有環(huán)境防治、物理防治、化學防治和生物防治等。其中，化學防治不失為一種簡單、經濟、有效的方法，目前常用的化學藥劑主要是有機磷和菊酯類農藥。部分農藥如有機磷具有較高的毒性，同時蟑螂對現(xiàn)有的農藥品種已經產生了抗藥性，隨著人類對自身健康以及生態(tài)環(huán)境的日益重視，開發(fā)高效低毒、作用機制新穎、選擇性強、環(huán)境相容性好的防治蟑螂的新藥劑就顯得尤為迫切。抑咽側體素(Allatostatin，簡稱AST)是一類最早從蟑螂中分離得到的具有抑制咽側體合成保幼激素功能的昆蟲神經肽。這些分子同時也表現(xiàn)出其它的生物學功能，例如調節(jié)腸組織和脊導管肌肉活動，抑制脂肪體卵黃蛋白原合成，以及刺激中腸糖酶活性等。AST具有很高的體外抑制保幼激素合成的生物活性，是一類潛在的農藥先導物。但是，它具有活體活性差，容易被降解，合成成本高等缺點(GarsideCS，NachmanRJ，TobeSS.InjectionofDip-allatostatinorDip-allatostatinpseudopeptidesintomatedfemaleDz)/o,ra/ww"她inhibitsendogenousratesofJHbiosynthesisandbasaloocytegrowth,/we"萬/oc/zew.Mo/.5/o/.2000，30:703-710.)，迄今尚未在害蟲治理中得到實際應用。為了開發(fā)具有實用價值的新型調控蟑螂藥劑，一些AST類似物被合成并公開于下列文獻中如1991年Feyereisen等(Allatostatinswhichinhibitinsectjuvenilehormonebiosynthesis.美國專利US5039792)，1994年Hayes等(Structure-activitystudiesofallatostatin4ontheinhibitionofjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallata:theimportanceofindividualsidechainsandstereochemistry.Peptides1994,15，1165-1171.)，1997年Piulachs等(Ketomethyleneandmethyleneaminopseudop印tideanaloguesofinsectallatostatinsinhibitjuvenilehormoneandvitellogeninproductioninthecockroachBlattellagermanica.InsectBiochem.Molec.Biol.1997,27，851-858.)，199總年Nachman等(Synthesis,biologicalactivity,andconformationalstudiesofinsectallatostatinneuropeptideanaloguesincorporatingturn—promoting3moieties.Bioorg.Med.Chem.1998,6,1379-1388.)，1999年Nachman等(Hemoly卿handtissue-boundpeptidase—resistantanalogsoftheinsectallatostatins.Peptides1999，20，23-29.)，2007年Nachman等(Mimeticinsectallatostatinanalogsforinsectcontrol.美國專利US7208476B2)。上述文獻中，對AST結構改造的特點主要有2個1)大多采用天然氨基酸如Ala，或者非天然氨基酸如Aic、Cpa以及芳酸等，替換天然AST中的氨基酸。2)多數化合物保留了AST原有的離體生物活性，提高了化合物抗酶解的能力。但是尚存在以下不足之處1)結構復雜，部分結構甚至比天然肽復雜,合成成本高。2)化合物對蟑螂的活體效果不理想。本發(fā)明正是針對這些缺點，開發(fā)了一類(取代)苯基丙烯酸修飾的抑咽側體素類似物，并發(fā)現(xiàn)它們對蟑螂及其卵均有很好的防治效果。
發(fā)明內容本發(fā)明針對天然AST的結構復雜、活體活性差等缺點，通過模擬天然AST核心五肽(Y/FXFGU)的化學結構，開發(fā)了一類(取代)苯基丙烯酸修飾的抑咽側體素類似物。本發(fā)明所提供的一類(取代)苯基丙烯酸修飾的抑咽側體素類似物的結構通式為式A:o'Giy-Phe-Giy-Leu-NH2式A式A中，X為氫，單或者多取代的鹵素，硝基，甲基，乙基，甲氧基，羥基。優(yōu)選的式A化合物，其中X代表H，4-F，4-C1，4-Br，3-F，3-Q，3-Br，2-F，2-C1，2-Br，4-N02，3-N02，2-N02,4-Me,3-Me,2-Me，4-0H，3-0H，2-0H，4-0Me，3-0Me，2-0Me，2'4-2F，2,4-2C1，2,4-2Br，3,4-2F，3,4-2C1，3,4-2Br。特別優(yōu)選的式A化合物，其中X代表H，4-F，4-Br，4-亂，2,4-2C1。本發(fā)明所提供的式A化合物，均按照多肽固相合成法得到(參考文獻ChanWG，WhitePD.FmocsolidphasepeptidesynthesisAPracticalApproach,OxfordUniversityPress,2000;pp.9-74.)。本發(fā)明采用Tobe等人的離體放射化學測定方法(a.Tobe,S.S.;Clarke,N.Theeffectof^-methionineconcentrationonjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthecockroachDiplopterapunctata.InsectBiochem.1985,15，175-179.b.Tobe,S.S.;Pratt,G.E.Theinfluenceofsubstrateconcentrationsontherateofinsectjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthedesertlocustinvitro.Biochem.J.1974，144,107-113.)，測試了式A化合物抑制太平洋折翅蠊(歷》/叩tera保幼激素合成的離體活性。本發(fā)明進一步釆用Garside等人的蟑螂體內注射藥劑的方法(GarsideCS，NachmanRJ,TobeSS.InjectionofDip-allatostatinorDip-allatostatinpseudopeptidesintomatedfemale;rowctotoinhibitsendogenousratesofJHbiosynthesisandbasaloocytegrowth,/nse"說'oc/^/wM/歷o/2000，30:703-710.)，測試了式A化合物對太平洋折翅蠊(ZipA^terap〃/7cfata)的活體活性。同時本發(fā)明還采用體表測試方法，測試了部分化合物對太平洋折翅蠊(Z力。7opterap朋ctata)的活體活性。生測結果表明，部分式A化合物在活體水平上可以高效地抑制蟑螂保幼激素的合成。另外，本發(fā)明還測試了式A化合物對蟑螂卵發(fā)育的影響。結果發(fā)現(xiàn)經式A化合物處理的蟑螂，卵的發(fā)育明顯受到抑制。正常情況下，第七天卵發(fā)育成熟；而經式A化合物處理的蟲子的卵發(fā)育緩慢。以本發(fā)明的式A化合物為活性成分的防治蟑螂的藥物也屬于本發(fā)明的保護范圍。在需要的時候，在所述藥物中還可以加入一種或多種農藥制劑中可接受的載體，所述載體包括農藥制劑中常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑等。制成的藥物的劑型也是多樣的，可以是粉劑、微乳劑、鉺劑、微膠囊劑、乳油等。本發(fā)明的式A化合物模擬了抑咽側體素核心五肽(Y/FXFGLa)的化學結構，具有結構簡單，合成成本低的特點；同時，式A化合物不僅保留了離體活性，部分化合物的離體活性甚至遠高于天然的核心五肽，而且最為重要的是具有天然肽不具備的活體活性，進一步的應用研究表明，該類化合物明顯影響雌性蟑螂的生殖系統(tǒng)，抑制蟑螂卵的生成。符合昆蟲生長調節(jié)劑的特性，具有很好的開發(fā)應用前景。本發(fā)明為蟑螂的化學防治提供了一類新型的藥劑。圖l、化合物A2活體抑制曲線(注射方法)。圖2、化合物A11活體抑制曲線(注射方法)。圖3、化合物A4的活體活性(體表測試)。圖4、化合物A11的活體活性(體表測試)。圖5、化合物A11對蟑螂卵的發(fā)育影響。具體實施例方式本發(fā)明可用以下實施例作進一步詳細說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。制備實施例本發(fā)明中的式A化合物的制備，均按照多肽固相合成法得到。以化合物A1為例，其合成方法如下(1)樹脂活化稱取200mgRinkAmide-AMresin，DCM洗4次，加入15mlDCM溶漲活化3h，DMF洗4次，加入20^哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's試劑檢測。(2)接Leu:DMF洗3次，加入106mgFmoc-Leu-OH(3倍量)，114mgHBTU(3倍量)，41mgHOBt(3倍量)，105ulDIEA(6倍量)，溶于15mlDMF，室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20X哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s試劑檢測。(3)接Gly:DMF洗3次，加入90mgFmoc-Gly-0H，114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF,室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s試劑檢測。(4)接Phe:DMF洗3次，加入116mgFmoc-Phe-0H，114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF，室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min,5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s試劑檢測。(5)接Gly:DMF洗3次，加入90mgFmoc-Gly-OH，114mgHBTU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF,室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，加入20%哌啶DMF溶液切割20min,5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser's試劑檢測。(6)接苯基丙烯酸DMF洗3次，加入45mg苯基丙烯酸，114mg朋TU，41mgH0Bt，105ulDIEA，溶于15mlDMF，室溫攪拌2h，5mlDMF洗4次，5mlDCM洗4次，Kaiser，s試劑檢'、(7)切割、解側鏈保護基產物加入250mg苯酚，0.25ml水，0.25ml苯甲硫醚，4.OmlTFA，室溫攪拌2.5h，溶液由黃色變?yōu)榧t色，過濾，N2吹去TFA，加入30ml冷的無水乙醚，4000N/min離心5min，得白色沉淀，30ml冷的無水乙醚如此洗3次，真空干燥，質譜檢測。質譜檢測結果MNa':544.3。(8)粗肽用HPLC分離純化。色譜柱為C18半制備柱。收集的溶液脫去乙腈后，凍干制得純肽?；衔顰2-A28均按照上述方法制備得到。所有式A化合物的結構及其質譜數據，理化性狀列于表l中。表l、(取代)苯基丙烯酸修飾的抑咽側體素類似物的結構__<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Al2Al3Al4Al5Al6Al7Al8Al9A20A2Gly-Phe-Gly-Leu-NH2Gly-Phe-Gly-Leu-NH2■Gly-Phe-Gly-Leu-NH2'Gly-Phe-Gly-Leu-NH2566.6MNa+:589.3白色粉末566.6MNa+:589.3白色粉末535.6MNa+:558.3白色粉末535.6MNa+:558.3白色粉末0535.6MNa+:558.3■Gly-Phe-Gly-Leu-NH20537.6MNa+:560.5■Gly-Phe-Gly-Leu-NH20537.6MNa*:560.5'Gly-Phe-Gly-Leu-NH20537.6MNa+:560.5'Gly-Phe-Gly-Leu-NH2Q565.7MH+:566.5■Gly-Phe-Gly-Leu-NH2Q565.7MH+:566.5■Gly-Phe-Gly-Leu-NH2A22、一O^^Gly-Phe-Gly-Leu-NH2565.7MH+:566.5白色粉末白色粉末白色粉末白色粉末白色粉末白色粉末白色粉末、0A20557.6MH+:558.4白色粉3J人Gly-Phe-Gly-Leu-NH2末A2590.5MIT:591.2白色粉4。ZGly-Phe-Gly-Leu-NH2末、Cl0A2679.4MIT:680.3白色粉5、BrAG|y-Phe-Gly-Leu-NH2末A2O557.6MlT:558.4白色粉6pr人Gly隱Phe-Gly-Leu-NH2末A20590.5MH':591.2白色粉7cKCl^""^GIy-Phe"Gly-Leu-NH2末A20679.4MfT:680.3白色粉8Br,Br^GIy-Phe-Gly-Leu-NH2末應用實施例1、化合物的離體活性本發(fā)明采用Tobe等人的離體放射化學測定方法(參考(1)Tobe,S.S.;Clarke,N.TheeffectofmethionineconcentrationonjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthecockroachDiplopterapunctata.InsectBiochem.1985,15，175-179.(2)Tobe,S.S.;Pratt,G.E.Theinfluenceofsubstrateconcentrationsontherateofinsectjuvenilehormonebiosynthesisbycorporaallataofthedesertlocustinvitro.Biochem.J.1974,144,107-113.)，測定了式A化合物抑制太平洋折翅蠊(歷'/^o/^erapw7"ata)保幼激素合成的離體活性。部分化合物離體生測結果見表2。表2、部分(取代)苯基丙烯酸物修飾的抑咽側體素類似物的離體活性結構IC50AlO39.6n!l^Y^"^GIy-Phe-Gly-Leu-NH2M9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2結果表明式A化合物顯著抑制太平洋折翅蠊(歷》7o/^ersp朋cta&)保幼激素的合成。化合物A1，A2，A4，A11和A24的離體活性優(yōu)于天然AST核心五肽。Al的活性比天然五肽提高3.3倍，A2提高12倍，A4提高72.6倍，All提高10.8倍，A24提高12.7倍。應用實施例2、注射方法測定化合物的活體活性。配制0.001nM，0.01liM，0.1liM，1iiM,10nM，100uM的抑咽側體素類似物水溶液(如果不溶解，需要加入少于2%的DMSO)，從蟑螂(雌蟲，成蟲羽化后第一天)腿部關節(jié)處，注射5uL的溶液，注射好后，將蟑螂置于27'C，濕度80%，充足食物和水，無光的環(huán)境下培養(yǎng)到第三天；采用離體放射化學測定方法測定受試蟑螂合成保幼激素的能力。化合物A2的活體IU值為859.8nM。其抑制曲線如圖1?；衔顰ll的活體ICs。值為33.3nM。其抑制曲線如圖2。結果表明部分式A化合物具有顯著抑制太平洋折翅蠊(歷'pJop"i^/7W7"ata)保幼激素合成的體外活性。應用實施例3、體表測試方法測定化合物的活體活性。配制100nM的類似物的DMSO溶液；并與丙酮配制成混合溶液(比例l:5)。取5uM混合溶液涂布于蟑螂(雌蟲，成蟲羽化當天)，每頭試蟲的施藥量為0.lnmol，將蟑螂置于27°C，濕度80%，充足食物和水，無光的環(huán)境下培養(yǎng)到第三天；采用離體放射化學測定方法測定受試蟑螂合成保幼激素的能力?；衔顰4和A11的測試結果分別如圖3和圖4。所有結果用t檢驗方法統(tǒng)計。其中，求料為P〈0.001;柱形圖上數字n為重復次數。圖3和圖4結果表明，每頭試蟲施藥量為0.lnmol的條件下，化合物A4和All顯著抑制了蟑螂保幼激素的合成。t檢驗方法統(tǒng)計的結果發(fā)現(xiàn)它們的P值都低于0.001。應用實施例4、化合物對蟑螂卵的發(fā)育影響。配制100yM的Al1類似物的DMSO溶液，再與丙酮配制成混合溶液(比例1:5)。取5uM混合溶液涂布于蟑螂(雌蟲，成蟲羽化當天)，于27'C，濕度80%，充足食物和水，無光的環(huán)境下培養(yǎng)。每天檢査蟑螂卵巢的發(fā)育情況，測量卵母細胞的長度?；衔顰11對蟑螂卵的發(fā)育抑制結果見圖5.從圖5可以看出，與溶劑DMSO對照相比，All處理的蟑螂的卵發(fā)育速度明顯降低，說明All顯著抑制了蟑螂卵的發(fā)育。1權利要求1、一類(取代)苯基丙烯酸修飾的、結構式為式A的昆蟲抑咽側體素類似物式A式A中，X為氫，單或者多取代的鹵素，硝基，甲基，乙基，甲氧基，羥基。2、權利要求1所述的式A化合物中，優(yōu)選的式A化合物，其中X代表H，4-F，4-Cl，4-Br，3-F，3-Cl，3-Br，2-F，2-Cl，2-Br，4-N02，3-N02，2-N02，4-Me，3-Me,2-Me，4-0H，3-0H，2-0H，4-0Me，3-0Me，2-0Me，2，4-2F，2，4-2C1，2,4-2Br，3,4-2F，3,4-2C1，3,4-2Br。3、權利要求2中，特別優(yōu)選的式A化合物，其中X代表H，4-F，4-Br,4-N02，2,4-2C1的化合物。4、權利要求1所述的化合物的制備方法。5、權利要求l所述化合物在蟑螂防治中的應用。6、以權利要求1所述化合物為活性成分的藥物。7、根據權利要求6所述的藥物，其特征在于所述藥物是用于防治蟑螂的藥物。全文摘要本發(fā)明公開了一類(取代)苯基丙烯酸修飾的昆蟲抑咽側體素類似物及其在蟑螂防治中的應用。本發(fā)明所提供的化合物結構通式為式A，其中，X為氫，單或者多取代的鹵素，硝基，甲基，乙基，甲氧基，羥基。式A化合物模擬了抑咽側體素核心五肽(Y/FXFGLa)的化學結構，具有結構簡單，合成成本低的特點；同時，式A化合物不僅保留了天然抑咽側體素的離體活性，部分化合物的離體活性還遠高于天然的核心五肽，有些還具有天然肽不具備的活體活性。進一步的應用研究表明，該類化合物明顯影響雌性蟑螂的生殖系統(tǒng)，抑制蟑螂卵的生成。符合昆蟲生長調節(jié)劑的特性，具有很好的開發(fā)應用前景。文檔編號A01N37/44GK101519433SQ200910080618公開日2009年9月2日申請日期2009年3月20日優(yōu)先權日2009年3月20日發(fā)明者云凌,開振鵬,張金蕊,斯蒂芬.斯.陶博,楊新玲,勇謝,趙懿琛,陳馥衡,娟黃申請人:中國農業(yè)大學