專利名稱：：一種北冬蟲夏草誘變菌株及培育方法
技術領域：
：本發明公開一種北冬蟲夏草誘變菌株，該菌株的培育方法，屬于微生物
技術領域：
。為一種新的菌株品種，本發明還提供了
背景技術：
：北冬蟲夏草(Cordycepsmilitaris(L.)Link)，又名蛹蟲草、北蟲草或武式蟲草，與冬蟲夏草同屬子囊菌亞門核菌綱球殼目麥角菌科蟲草屬，主要分布在我國的山西、陜西、吉林、河北、廣東等地。北冬蟲夏草是真菌寄生在昆蟲蛹或幼蟲尸體部分而形成的復合體。中醫常用的冬蟲夏草是珍貴的藥用真菌，但其自然資源稀少，價格昂貴，且人工培養非常困難，至今未能實現規模化生產。目前國內外人工培養北冬蟲夏草多以其中一種或兩種主要成分為評價指標。如果能夠獲得一株北冬蟲夏草菌株，經液態深層發酵培養后，其菌絲體產量、腺苷、蟲草多糖、蛋白質、甘露醇等有效成分含量均較野生北冬蟲夏草有明顯提高，將大大提高該北冬蟲夏草的經濟價值。
發明內容本發明的目的在于提供一種北冬蟲夏草誘變菌株，為一種新的菌株，其有效成分包括腺苷、多糖、蛋白和蟲草酸的含量及菌絲體干重均較原出發菌株有明顯提高。本發明還提供了該菌株的培育方法。本發明還公開了北冬蟲夏草誘變菌株多糖和腺苷提取的最佳工藝條件。本發明的北冬蟲夏草誘變菌株為在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記號為CGMCCNO.2909;保藏日期2009年3月2日；分類蛹蟲草。本發明所述的北冬蟲夏草菌株培育方法，包括以下步驟1)將保藏號為CGMCC5.699北冬蟲夏草菌株，接種于PDA斜面，24-26。C恒溫箱中培養4-8天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為2X107-4X107個/mL的孢子懸液；2)在培養皿中加入亞硝基胍10mg及0.5mL丙酮后，用pH=6.0無菌磷酸緩沖液9mL溶解亞硝基胍，亞硝基胍終濃度為lmg/mL，加入步驟1)中得到的孢子懸液lmL，開始誘變；分別誘變2-20min之后，取菌懸液于無菌蒸餾水中逐級稀釋，至濃度為3X104個/mL，PDA培養基平板培養3-4天后，將菌株于96孔板保存；3)利用平板初步篩選生長迅速的菌株；4)將篩選獲得的菌株在搖瓶中復蘇，傳代后26°C150rpm恒溫搖床中培養35天，得菌絲體。5)獲得的高產誘變北冬蟲夏草誘變菌株經過連續傳代，培養條件為26°C150rpm恒溫搖床中培養84h，測定菌絲體干重、多糖、甘露醇、腺苷以及蛋白質含量，考察誘變菌株的遺傳穩定性，從而最終確定目的菌株。本發明北冬蟲夏草誘變菌株的鑒定將所得到的北冬蟲夏草誘變菌株和野生型原出發菌株的總DNA，并以IO聚核苷酸隨機引物對總DNA進行隨機擴增多態DNA(RAPD)比較，確認DNA變異情況，驗證菌株在DNA水平上與原出發菌株存在差異，是一株能夠穩定遺傳的北冬蟲夏草誘變菌株。用全自動凱氏定氮儀測定北冬蟲夏草菌絲體中蛋白總量。利用分光光度法測定甘露醇含量。北冬蟲夏草誘變菌株的鑒定中，采用苯酚-氯仿法提取北冬蟲夏草誘變菌株CGMCCNO.2909和原出發菌株CGMCC5.699的總DNA。以總DNA為模板，分別以10聚核苷酸隨機引物對其進行PCR擴增反應。反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離。選取的30個隨機引物中，每個引物至少重復兩次PCR反應，從擴增結果中篩選出條帶清晰，重復性良好，并具有差異性條帶的隨機引物。最后，切下北冬蟲夏草誘變菌株和原出發菌株的差異性條帶和空白條帶，凝膠回收差異性條帶后，利用與RAPD相同的擴增體系和擴增引物進行二次PCR擴增，差異性條帶依然存在，說明該北冬蟲夏草突變株和原出發菌株相比，在DNA水平上確實發生了改變，是一株不同于原出發菌株的北冬蟲夏草誘變菌株。本發明所述的高產優質北冬蟲夏草突變株的特征為(1)北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體干重及腺苷、粗多糖、蛋白質和甘露醇這四種有效成分的含量均有明顯提高，其中，菌體體干重達12.490g/L，較原出發菌提高了103%;腺苷含量可達0.070g/L，較原出發菌提高了536%;多糖含量可達0.780g/L，較原出發菌提高了22.2%;蛋白含量可達6.482g/L，較原出發菌提高了55.5%;甘露醇含量可達1.391g/L，較原出發菌提高了37.5%。表1誘變菌株與原出發菌株有效成分含量齒絲體干i腺IT-含呈多糖含l:虛白含呈甘露醇含itCg/U(g/L)Cg/L)Cg/L)誘變齒株12.4900.0700.7806,4821.391原lMl.株CGMCC5.6996.1500.0110扁4—畫1,012(2)北冬蟲夏草誘變菌株經過20次以上的連續傳代培養不退化，具有遺傳穩定性。(3)北冬蟲夏草誘變菌株與原始菌株在DNA水平上存在差異。從本發明北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體中提取多糖的方法，包括以下步驟液體深層發酵獲得北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體，冷凍干燥至恒重，粉碎，過60目篩。稱取0.1g菌絲體干粉，按液料比(20110):l(mL:g)加入去離子水，水浴中超聲波提取；離心分離得上清液，即得。測定上清中總糖和還原糖的含量。采用蒽銅-硫酸法測定總糖含量；采用DNS法測定還原糖含量。總糖含量減去還原糖含量等于多糖含量。4經響應面法優化后，北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體多糖超聲提取的最佳工藝條件為提取時間8.4min，提取功率466W，液料比104:l(mL:g)。該方法與傳統水提法相比(表2)，提取時間縮短96%，多糖得率提高5.62%。表2超聲提取法和水浸提法比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發明北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體中提取腺苷的方法，包括以下步驟液體深層發酵獲得北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體，冷凍干燥至恒重，粉碎，過60目篩。稱取0.15g經預處理后的菌絲體，按液料比(1050):l(mL:g)加入去離子水，在恒溫水浴鍋內浸提；8000rpm，離心10min，測定上清液中腺苷含量。采用HPLC法測定蟲草菌絲體中腺苷含量；經響應面法優化后，北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體腺苷水提的最佳工藝條件為提取溫度44t:，提取時間2.3h，液料比38:1。在該最佳工藝條件下北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體腺苷得率可達70mg/L。本發明的積極效果在于提供的北冬蟲夏草誘變菌株，經系統考核傳代20次以上不退化，具有遺傳穩定性，其產量和有效成分含量均較原始菌株均有明顯提高，其中，菌體體干重較原出發菌提高了103%，腺苷含量較原出發菌提高了536%，多糖含量較原出發菌提高了22.2%，蛋白含量較原出發菌提高了55.5%，甘露醇含量較原出發菌提高了37.5%，其中腺苷和甘露醇兩種有效成分含量高于目前文獻和專利報道的含量值，該北冬蟲夏草誘變菌株具有較高的實際應用價值，大大提高了人工培養北冬蟲夏草的經濟價值，為珍稀的北冬蟲夏草菌株的發展開辟了一條新的途徑。另外，通過人工培養北冬蟲夏草，對保護野生資源、維護生態平衡起到了一定的輔助作用。利用響應法對北冬蟲夏草誘變菌株中多糖超聲提取工藝進行優化，與傳統水提法相比，提取時間縮短96%，多糖得率提高5.62%。利用響應法有效的優化了誘變菌株中多糖超聲提取工藝，以提高其腺苷得率，為北冬蟲夏草腺苷產業化生產奠定了一定的理論基礎。圖1、本發明菌株和野生型原出發株CGMCC5.699的RAPD擴增結果，隨機引物為0PH16，共有三條差異性條帶，從左向右的上樣順序為空白、CGMCC5.699、誘變菌株的八次重復結果、100bpLadderMarker;圖2、本發明菌株和野生型原出發株CGMCC5.699的RAPD擴增結果，隨機引物為OPG07，共有三條差異性條帶，從左向右的上樣順序為誘變菌株的八次重復結果、CGMCC5.699、空白、lOObpLadderMarker。圖3、隨機引物為0PH16擴增的差異性片段中，1000bp左右的差異性片5段經過膠回收后PCR擴增的結果，從左向右的孔道依次為lOObpLadderMarker、CGMCC5.699、誘變菌株、誘變菌株、空白。圖4、隨機引物為OPG07擴增的差異性片段中，500bp左右的差異性片段經過膠回收后PCR擴增的結果，從左向右的孔道依次為lOObpLadderMarker、CGMCC5.699、誘變菌株、空白。圖5、隨機引物為OPG07擴增的差異性片段中，1500bp性片段經過膠回收后PCR擴增的結果，從左向右的孔道依次為lOObpLadderMarker、CGMCC5.699、誘變菌株、空白。圖6、響應面法優化菌絲體中多糖提取條件3D圖；(a)Y=f(Xl，X2)(b)Y=f(Xl，X3)(c)Y=f(X2，X3)的響應面及等高線圖。圖7、響應面法優化菌絲體中腺苷提取條件3D圖；(a)Y=f(Xl，X2)(b)Y=f(Xl，X3)(c)Y=f(X2，X3)的響應面及等高線圖。具體實施方法實施例1:北冬蟲夏草突變株的誘變和選育方法(1)北冬蟲夏草的誘變將保藏號為CGMCC5.699北冬蟲夏草菌株，接種于PDA斜面，26。C恒溫箱中培養5天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水1.5mL，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為3Xl(f個/mL的孢子懸液。在培養皿中加入亞硝基胍10mg及0.5mL丙酮后，用無菌磷酸緩沖液9mL(pH二6.0)，待亞硝基胍充分溶解后，加入孢子懸液lmL，進行誘變。誘變10min后，取菌懸液于無菌蒸餾水中逐級稀釋，至濃度為3Xl(^個/mL，PDA培養基平板培養4天后，將菌株于96孔板保存。用滅菌的牙簽將96孔板中菌株挑到PDA培養基的平板上，每板20個菌落，26t:恒溫培養箱中培養3天；將生長較迅速的菌落，再次挑到PDA培養基中，每板10株左右，26t:恒溫培養箱中培養3天；將生長較迅速的菌落挑到盛有北冬蟲夏草培養基的搖瓶中復蘇5天；將菌株傳代培養，在盛有100mL北冬蟲夏草培養基的250mL錐形瓶中，接種北冬蟲夏草2mL，26。C恒溫搖床中培養84h。將誘變得到的突變菌株保存于48孔板中，離心菌絲體，5000rpm，離心10min，水洗一次，菌絲體鋪于平板凍干，凍干粉末稱重，粉碎，過60目篩。(2)四種有效成分的提取及含量的測定依照本發明的優化后的北冬蟲夏草菌絲體腺苷及多糖的提取工藝條件提取腺苷及蟲草多糖。采用蒽銅-硫酸法測定總糖含量；用全自動凱氏定氮儀測定蟲草菌絲體中蛋白總量；采用HPLC法測定蟲草菌絲體中腺苷含量；利用分光光度法測定甘露醇含量。(3)高產突變體的篩選和鑒定從誘變的北冬蟲夏草突變體中，篩選出菌絲體干重和四種有效成分含量明顯提高的優質菌株(見表l)，然后進行傳代培養，每隔一代測定菌株干重及四種有效成分含量，測量方法同步驟(2)。共培養14代。從中篩選八株突變體，均具有穩定遺傳特征。采用苯酚-氯仿法提取北冬蟲夏草誘變菌株和野生型原出發菌株的總DNA。以總DNA為模板，分別以IO聚核苷酸隨機引物對其進行PCR擴增反應，每個引物至少重復兩次PCR反應，反應產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，每個引物至少重復兩次PCR反應。從擴增結果中篩選出條帶清晰，重復性良好，并具有差異性條帶的隨機引物2個(見表2)。切下北冬蟲夏草誘變菌株和原出發菌株的差異性條帶和空白條帶(見圖1-圖2)，凝膠回收差異性條帶后，利用與RAPD相同的擴增體系和擴增引物進行二次PCR擴增(見圖3-圖5)。表2隨機引物序列及其擴增結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>經RAPD反應后，30個隨機引物中有l個引物不產生任何條帶，有4個引物不擴增條帶不清晰或重復性較差，篩選到兩個引物能夠擴增出差異性條帶，共得到6個差異性片段。經二次PCR鑒定，其中有3個差異性片段依然具有差異性，可認為北冬蟲夏草誘變菌株和野生型原出發菌株相比較，確實發生了DNA水平上的改變，是一株不同于原出發菌株的北冬蟲夏草誘變菌株。實施例2:北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體中多糖提取條件的優化(1)菌絲體多糖的超聲提取方法液體深層發酵獲得北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體，冷凍干燥至恒重，粉碎，過60目篩。稱取0.1g菌絲體干粉，按一定水料比加入一定量去離子水，水浴中超聲波提取一定時間。提取液經12000rpm，4°C，離心10min，測定上清中總糖和還原糖的含量。采用蒽銅-硫酸法測定總糖含量；采用DNS法測定還原糖含量。總糖含量減去還原糖含量得到多糖含量。(2)菌絲體多糖提取單因子實驗在提取過程中，利用單因子試驗對影響多糖提取率的水料比、超聲功率、提取時間三個主要因素進行考察。提取時間對菌絲體多糖提取率的影響。在水料比40:1，提取功率300w水浴中分別超聲提取60、120、180、240、300、360、420、480、540、600s，然后測定菌絲體多糖提取率。超聲功率對菌絲體多糖提取率的影響。菌絲體干粉按水料比40:l加入蒸餾水，分別于功率200、240、280、320、360、400、440、480、520W下水浴中超聲波提取180s。不同超聲功率下測定菌絲體多糖得率。水料比對菌絲體多糖提取率的影響。菌絲體干粉分別按水料比20:1、30:1、40:i、50:i、60:i、70:i、80:i、90:i、ioo:i、iio:i加入蒸餾水，超聲功率440W，水浴中提取480s，測定菌絲體多糖提取率。(3)菌絲體多糖提取中心組合實驗根據單因素探索的實驗結果，以水料比、超聲功率、提取時間三個因素為自變量，菌絲體多糖提取率為響應值，采用響應面分析法在三因素三水平上對菌絲體多糖提取過程進行優化，建立了影響多糖提取率的二次多項數學模型，依據回歸分析結果，北冬蟲夏草菌絲體多糖超聲提取的最佳工藝條件為提取時間8.4min，提取功率466W，液料比104:l(mL:g)。實施例3:北冬蟲夏草誘變菌株菌絲體中腺苷提取條件的優化(l)將液體深層發酵獲得的北冬蟲夏草菌絲體真空冷凍干燥，粉碎，過60目篩用于實驗。準確稱取0.15g經預處理后的菌絲體，加蒸餾水在恒溫水浴鍋內浸提一定的時間。8000rpm，離心10min，分離上清液用于腺苷含量測定。根據2005版《中國藥典》中介紹的方法，利用高效液相色譜法測定腺苷的含量。流動相為pH6.5的磷酸鹽緩沖液甲醇(體積比)=85:15。HPLC的測定條件為色譜柱C-18，流速lmL/min，檢測波長260nm，柱溫35°C，進樣量lOyL。腺苷得率(W/W)=腺苷質量(mg)/菌絲體質量(g)。(2)菌絲體腺苷單因素提取實驗分別以不同的提取溫度、料水比、提取時間作單因素實驗，考察各單因素對腺苷得率的影響。料水比對菌絲體腺苷得率的影響。菌絲體按料水比i:io、i:20、i:30、1:40、1:50分別加入蒸餾水，8(TC水浴浸提2h，測定腺苷得率。提取溫度對菌絲體腺苷得率的影響。菌絲體按料水比l:40加入蒸餾水，分別于提取溫度20、30、40、50、60、7(TC下水提2h。不同提取溫度下測菌絲體腺苷得率。提取時間對菌絲體腺苷得率的影響。在料水比l:40、提取溫度4(TC條件下，分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5、3、4h，不同提取時間下得菌絲體腺苷得率。(3)菌絲體腺苷提取的中心組合實驗采用響應面分析方法進行優化提取條件。根據單因素實驗結果，以料水比、提取溫度、提取時間三個因素為自變量，菌絲體腺苷得率為響應值，采用響應面分析法在三因素三水平上對菌絲體腺苷提取過程進行優化，以達到最大限度提取菌絲體腺苷的目的。依據回歸分析結果，北冬蟲夏草菌絲體腺苷水提的最佳工藝條件為提取溫度44°C，提取時間2.3h，液料比38:l(mL:g)。權利要求一種北冬蟲夏草誘變菌株，其保藏號為CGMCCNO.2909。2.獲得權利要求1所述北冬蟲夏草菌株的方法，包括以下步驟完成1)將保藏號為CGMCC5.699北冬蟲夏草菌株，接種于PDA斜面，24-26。C恒溫箱中培養4-8天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為2X107-4X107個/mL的孢子懸液；2)在培養皿中加入亞硝基胍10mg及0.5mL丙酮后，用pH=6.0無菌磷酸緩沖液9mL溶解亞硝基胍，亞硝基胍終濃度為lmg/mL，加入步驟l)中得到的孢子懸液lmL，開始誘變；分別誘變2-20min之后，取菌懸液于無菌蒸餾水中逐級稀釋，至濃度為3乂104個/mL，PDA培養基平板培養3-4天后，將菌株于96孔板保存；3)利用平板初步篩選生長迅速的菌株；4)將篩選獲得的菌株在搖瓶中復蘇，傳代后26°C150rpm恒溫搖床中培養35天，得菌絲體。3.權利要求1所述北冬蟲夏草誘變菌株提取菌絲體多糖的方法，包括以下步驟將權利要求2的菌絲體冷凍干燥至恒重，粉碎，過60目篩；稱取0.1g菌絲體干粉，按液料比(20110):l(mL:g)加入去離子水，水浴中超聲波提取；離心分離得上清液，即得。4.權利要求3所述菌絲體多糖的提取方法，其特征在于超聲波提取功率466W，提取時間8.4min，液料比104:l(mL:g)。5.權利要求1中所述北冬蟲夏草誘變菌株提取菌絲體腺苷的方法，包括以下步驟將權利要求2的菌絲體冷凍干燥至恒重，粉碎，過60目篩，稱取0.15g經菌絲體干粉，按液料比(1050):l(mL:g)加入去離子水，在恒溫水浴鍋內浸提，離心分離得上清液，即得。6.權利要求5所述菌絲體腺苷的提取方法，其特征在于恒溫水浴提取溫度44t:，提取時間2.3h，液料比38:l(mL:g)。全文摘要本發明提供一種北冬蟲夏草誘變菌株及培育方法，通過化學誘變得到一株高產北冬蟲夏草新菌株，其保藏號為CGMCCNO.2909，菌絲體干重較原出發菌提高了103％，腺苷含量提高了536％，多糖含量提高了22.2％，蛋白含量提高了55.5％，甘露醇含量提高了37.5％。本發明的北冬蟲夏草新菌株經20次以上傳代培養不退化，具有遺傳穩定性，并利用隨機擴增多態DNA(RAPD)的研究，驗證菌株在DNA水平上與原出發菌株存在差異。本發明還公開了北冬蟲夏草多糖和腺苷提取的最佳工藝條件。文檔編號A01H15/00GK101690463SQ200910067440公開日2010年4月7日申請日期2009年8月21日優先權日2009年8月21日發明者任曉冬,劉海雕,姜麗艷,孟慶繁,張凱明,張嬡莉,朱明光,李珊珊,杜研,林鳳,沈畏,滕利榮,王彥峰,王貞佐,王迪,白冰,翟景波,逯家輝,郭偉良,金璐,高朝輝,高陸申請人:吉林大學