專利名稱：：恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型的建立的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型的制備方法。
背景技術：
：自身免疫型糖尿病1型糖尿病的發病病因不明，至今沒有有效的預防辦法。常用的胰島素治療盡管可以在一定程度上調節血糖水平，但長期使用并不能有效地控制糖尿病并發癥的發生，而且部分患者還有可能發生低血糖休克。如何阻止自身免疫系統對胰島β細胞的攻擊和進行有效的β細胞移植治療，成為糖尿病研究中的關鍵問題。目前糖尿病研究最常用模型動物是嚙齒類。由于嚙齒類在進化關系上與人類相距甚遠，以其為研究對象所獲得的實驗數據對臨床指導意義不大。恒河猴的解剖特點、各系統生理功能及對疾病和治療藥物的反應性與人類極為相近，是進行免疫學相關治療和干細胞移植、異種移植臨床前有效性和安全性評價的敏感動物。利用恒河猴糖尿病模型評價新型糖尿病治療藥物，研究胰島干細胞和異種胰島移植的免疫排斥機理和移植耐受誘導，是國際公認的臨床前實驗體系，對未來這些治療方案的臨床應用具有重要的指導意義。因此建立非人靈長類糖尿病模型成為糖尿病胰島(干)細胞移植治療研究和臨床前藥物評價的迫切需要。現在常用的糖尿病動物模型有實驗性糖尿病動物模型和自發性糖尿病動物模型。自發性模型應用價值較高，但因發病率低，價格昂貴，飼養、繁殖條件要求嚴格，而不能得到廣泛應用。實驗性模型則應用比較廣泛，常用的誘導方法有胰腺切除術、化學藥物誘發、病毒感染、拮抗胰島素因子、食物誘發及催肥等。其中化學藥物誘導方法因為操作簡單、可行性高，而得到眾多研究人員的推崇；而在這些方法中鏈脲佐菌素對機體組織毒性相對較小，動物存活率高，是目前國內外使用較多的制備糖尿病動物模型的方法。鏈脲菌素(str印tozotocin，STZ)是制備糖尿病模型中比較常用的誘導試劑，對一定種屬動物的胰島β細胞有選擇性破壞作用，而使許多動物產生糖尿病，最常用的是大鼠模型。一般常用的誘導方法如下將大鼠禁食12h，按60mg/Kg體重腹腔注射STZ，每日1次，連續2次，成功制備1型糖尿病大鼠模型，并且該模型具有高血糖、體重減輕、多飲多食多尿的特點，與臨床1型糖尿病吻合；但在此實驗中，若造模組只腹腔注射STZ—次，并給予高熱量飼料飼養12周，則可制2型糖尿病動物模型，且按該法制備出的模型具有超重、糖耐量減低、血脂升高、血清胰島素升高及胰島素受體結合力降低伴胰島素抵抗的特點，類似2型糖尿病病人的臨床特征。1型糖尿病與2型糖尿病動物模型的制備可能與STZ注射的劑量有關系大劑量(常為120mg/Kg)注射時，由于直接引起胰島β細胞的廣泛破壞，可造成1型糖尿病模型；而注射較少量STZ時，由于只是破壞一部分胰島β細胞的功能，造成外周組織對胰島素不敏感，同時給予高熱量飼料喂養，兩者結合便誘導出病理、生理改變都接近于人類2型糖尿病的動物模型。因此，鏈脲菌素STZ的用量的多少，直接決定了制備的糖尿病動物模型的類型。STZ制備恒河猴糖尿病模型，也有相關文獻報道，如匡德宣等，不同劑量鏈脲菌素對恒河猴某些常規生理指標的影響，中國實驗動物學報，2003年3月第11卷第1期，報道了研究鏈脲菌素(STZ)對恒河猴攝食、飲水、排尿、體重、血糖及尿糖等生理指標的影響，為建立糖尿病動物模型積累資料。方法通過靜脈給7只恒河猴注射不同劑量的STZ。STZ的使用劑量和方法為低劑量為30mg/Kg，中間間隔15天，重復注射1-2次；中劑量為45mg/Kg，注射STZl次；高劑量為60mg/Kg，注射1次。試驗結果使用不同劑量STZ后，7只恒河猴均在不同時間、不同程度出現與人糖尿病相類似的“三多一少”癥狀，同時對糖尿病猴使用不同劑量胰島素可使其癥狀減輕。尤其是中、高劑量組的動物癥狀較為明顯，而低劑量組體重有一個短時間的增加后又迅速下降。實驗組中血糖和尿糖均出現不同程度的升高，以中、高2個劑量組的動物變化較大。因此，采用中、高劑量組(45-60mg/Kg)的STZ可誘導類似人類糖尿病的急性動物模型，而使用胰島素治療或低劑量STZ可使該動物模型疾病病程延長，有禾丨J于進行其并發癥的石幵究°Biochemicalchangesinrhesusmonkeyduringthefirstdaysafterstreptozotocinadministrationareindicativeofselectivebetacelldestruction/TakimotoG，JonesC,LandsW,BaumanA,JeffreyJ,JonassonO·//Metabolism.1988Apr；37(4):364_70·選用22只恒河猴，靜脈注射STZ(45to55mg/Kg)，約半數的恒河猴在注射后的5天內誘生胰島素依賴性糖尿病，剩余實驗恒河猴中的4只在給藥后6個月內未產生胰島素依賴性糖尿病，被認為誘生了非胰島素依賴型糖尿病，其余8只恒河猴未對外源性胰島素產生需求。自身免疫性糖尿病可以分為青少年型(Diabetesinchildrenandadolescents)和成年隱匿性(latentautoimmunediabetesinadults，LADA)，屬于1型糖尿病的亞型，其特點為1.青少年型起病年齡小于15歲，LADA可以在15歲以后的任何年齡段，發病半年內不依賴胰島素，無酮癥發生；2.發病時多為非肥胖；3.體內胰島B細胞抗體(ICA、GAD和胰島素自身抗體等)常持續陽性；4.具有1型糖尿病的易感基因(如HLA-DR3、HLA-DR4、BW54及DQ-131-57-Non-ASp等)；5.常伴有甲狀腺和胃壁細胞等器官特異性抗體陽性。LADA—經診斷應早期采用胰島素治療以保護殘存的β細胞。歐美人資料報告LADA約占2型糖尿病10%15%，在非肥胖的2型糖尿病患者中有報道高達50%；有文獻報告-2型糖尿病患者GAD-Ab的陽性率達14.2%。這一類型的病因是由胰島β細胞的自身免疫性破壞而引起的胰島素缺乏。自身免疫過程的標記物包括胰島的淋巴細胞浸潤和胰島細胞自身抗體、胰島細胞抗原自身抗體以及胰島素自身抗體的檢測。目前文獻報道的是中、高劑量組(45_60mg/Kg)STZ誘導胰島素依賴性糖尿病的恒河猴動物模型，沒有將低劑量STZ(小于30mg/Kg)用于制備自身免疫性1型糖尿病靈長類動物模型的相關報道。
發明內容本發明的技術方案是提供了低劑量的鏈脲菌素在制備用于篩選治療自身免疫性1型糖尿病的動物模型中的用途。本發明的另一技術方案是提供了恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型的建立。本發明提供了低劑量的鏈脲菌素在制備用于篩選治療自身免疫性1型糖尿病的動物模型中的用途，其中鏈脲菌素的施用劑量為15-30mg/Kg/次。其中，鏈脲菌素的施用方法和劑量為連續5天靜脈給予小劑量鏈脲菌素每次15-30mg/Kg;末次給藥后第7和14天再次給藥。進一步優選地，鏈脲菌素的施用劑量為20-25mg/Kgo本發明還提供了一種制備自身免疫性I型糖尿病的動物模型的方法，它是將鏈脲菌素施用于靈長類動物，鏈脲菌素的施用方法和劑量為靜脈給予，15-30mg/Kg/次。其中，所述靈長類動物為恒河猴。其中，所述的鏈脲菌素的施用方法和劑量為連續5天靜脈給予小劑量鏈脲菌素每次15-30mg/Kg；末次給藥后第7和14天再次給藥。進一步優選地，鏈脲菌素的施用劑量為20-25mg/Kg。本發明還提供了該方法制備得到的自身免疫性1型糖尿病動物模型。本發明還提供了該動物模型在篩選治療自身免疫性1型糖尿病的藥物中的應用。本發明還提供了一種篩選治療自身免疫性1型糖尿病的藥物的方法，包括如下步驟a、它是將鏈脲菌素施用于靈長類動物，鏈脲菌素的施用劑量為15-30mg/Kg/次；b、將候選物施用于a步驟所述的靈長類動物；C、用自身免疫性1型糖尿病動物模型評價潛在的治療自身免疫性1型糖尿病的藥物。其中，a步驟所述靈長類動物為恒河猴。鏈脲菌素的施用方法和劑量為連續5天靜脈給予小劑量鏈脲菌素每次15-30mg/Kg；末次給藥后第7和14天再次給藥。其中，c步驟所述的評價指標主要有動物糖尿病的發病時間、發病率和β細胞的損傷的程度。本發明動物模型可以用于嚙齒類動物模型無法完成的生物技術新藥的評價和干細胞移植治療技術的評價。以下通過具體實施方式對本發明作進一步的詳細描述，但并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變和變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范圍。圖1血清抗胰島細胞抗體檢測結果(其中，圖IA為抗胰島素抗體陽性對照、圖IB為陰性對照、圖IC為本發明動物模型(編號05539)血清抗胰島細胞抗體檢測結果；圖ID為本發明動物模型(編號05572)血清抗胰島細胞抗體檢測結果)，標尺為50μm。圖2猴胰腺組織切片HE染色(圖2A為正常猴胰腺(標尺為50μm)；圖2B為本發明動物模型組胰腺在胰島周圍觀察到淋巴細胞浸潤(標尺為50μπι))圖3本發明動物模型胰腺組織切片的免疫組化結果(圖3Α胰島素表達細胞的分布；圖3Β胰高血糖素表達細胞的分布(標尺均為100μm))具體實施例方式實施例1本發明動物模型的制備1、材料與方法1.1實驗材料2-3歲雌性和雄性恒河猴6只，無B皰疹病毒、猴逆轉錄病毒、猴白血病病毒和免疫缺陷病毒感染；購自成都平安動物繁育基地。1.2主要試劑鏈脲菌素(STZ)購自成都宇洋高科技發展有限公司其他藥品和耗材均購自華西醫院利康藥房1.3主要溶液的配制鏈脲菌素溶液的配制0.lmol/L枸櫞酸鈉緩沖液配制A液(0.lmol/L枸櫞酸溶液)稱取2.Ig枸櫞酸(C6H8O7·H2OFff210.14)溶于IOOml雙蒸水中。B液(0.IM枸櫞酸鈉溶液)稱取2.94g枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H20Fff294.10)溶于IOOml雙蒸水中。工作液用時取28mlA液加22mlB液(按照1.321的比例)，雙蒸水稀釋到100ml，調pH=4.5。鏈脲菌素溶液按動物重量比稱取STZ，用上述A、B混合工作液以的濃度溶解STZ，隨用隨配，該液要求4°C配置、保存，盡量在30分鐘內注射完畢。1.4主要儀器1)麻醉機=Excel210SE,Datex-Ohmeda2)呼吸機配心電監護儀M/206B，Philips公司3)高頻電刀(H.F.ELECTR0T0ME)⑶_350_P型，上海滬通電子有限公司4)血糖檢測儀羅康全活力型血糖檢測儀，羅康全活力型血糖試紙5)全波長分光光度計1.5實驗方法1.5.1恒河猴靜脈葡萄糖耐受實驗通過靜脈葡萄糖耐受實驗(Theintravenousglucosetolerancetest,IVGTT)測試動物胰腺功能，了解血糖波動范圍，排除動物患有自發性糖尿病的可能。1)動物禁食10_12h，不禁水；2)根據動物購買時體重，按15mg/Kg肌肉注射氯氨酮(50mg/ml)；3)待動物麻醉后，準確稱量體重，并記錄；4)將恒河猴上下肢固定于手術臺上，下肢小腿后側備皮暴露大隱靜脈，碘氟消毒；5)20G留滯針穿刺大隱靜脈，5ml注射器抽血6ml(分別做生化、血常規、血糖和空腹胰島素，并標記為0分鐘數值)；6)立即用5ml注射器靜脈推注50%葡萄糖高滲溶液0.5g/Kg(在30sec內推完)，并開始記時，再注射生理鹽水5ml，向留滯針內推肝素(250U/ml)Iml；7)分別于記時后的第l，3，5，10，30min時采血1.5ml，放入紅頭采血管，測定胰島素水平;同時分別于第0，1，3，5，10，30，60，120111士11時測定血糖；8)檢測結束，將動物放回飼養籠中，觀察動物狀況至蘇醒。1.5.2小劑量STZ誘導造糖尿病模型連續5天靜脈給予小劑量STZ每次15-30mg/Kg；末次給藥后第7和14天再次給藥；每周觀察空腹血糖一次，以連續2天空腹血糖高于11.lmmol/L,C-肽水平低于0.5nmol/L，抗胰島細胞抗體和抗胰島素抗體陽性為建模成功。以下為兩組實驗的動物給藥方案<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6只恒河猴按本發明方法造模，有4只造模成功。1.5.3恒河猴血清胰島素測定(放射免疫分析法)使用北京北方生物技術研究所胰島素檢測試劑盒，按照操作說明書要求程序，分析動物血清中胰島素含量。1.5.4恒河猴血清胰島細胞抗體檢測(免疫組織化學法)使用正常猴胰腺組織切片，分別與試驗組猴血清、正常猴血清(陰性對照)和抗胰島素抗體(陽性對照)反應后，再與HRP酶標二抗結合，加入底物顯色后，顯微鏡下觀察胰島細胞著色情況，判斷血清中有無抗胰島細胞抗體存在。1.5.5恒河猴血清胰島素抗體檢測(酶聯免疫分析法)使用北京北方生物技術研究所胰島素抗體檢測試劑盒，按照操作說明書要求程序，分析動物血清中有無胰島素抗體。1.5.6胰腺、肝、腎活檢手術1)動物麻醉15mg/Kg氯氨酮(50mg/ml)基礎麻醉，麻醉后稱動物體重；2)動物固定于手術臺上，仰臥位，雙下肢備皮，建立靜脈通道；3)手術區域皮膚準備，備皮區域為雙側乳頭連線以下、腹股溝以上、腋前線以前。4)通過靜脈通道，進行靜脈全麻，氣管插管，使用呼吸機、麻醉機。貼電極片，進行心電監護。監測氧飽和度、呼吸及體溫；建立股動脈通道，測動脈血壓；5)手術人員洗手消毒，手術區域消毒艾力克紗布對以手術切口(上腹正中切口)為中心向周圍至少15cm皮膚無遺漏地涂擦。待艾力克涂液自然干燥后，再用70%酒精棉球將艾力克擦去；6)鋪無菌巾單和無菌大單和大洞單，無菌大單上端應蓋過麻醉架，下端蓋過動物足部。大洞單洞口要對準手術野皮膚；7)上腹正中切口，切口前用70%酒精再次消毒切口皮膚，依次切開皮膚、皮下脂肪、肌層、腹膜進入腹腔；8)胰腺探查，切開胃結腸韌帶，進入小網膜腔；9)胰腺活檢組織獲取從胰體與十二指腸部分鈍性剝離1cm，1號絲線結扎血管后切取胰腺組織(約0.5g)；10)肝臟活檢組織獲取1號絲線結扎肝葉邊緣，做楔形切割獲取組織約Ig；11)腎臟活檢組織獲取1號絲線結扎腎邊緣，做楔形切割獲取組織約0.3g；12)清洗腹腔，按層縫合腹壁切口；13)手術蘇醒及術后護理動物術后禁食1天。手術蘇醒后24h內肌肉注射曲馬多鎮痛治療，頭孢噻肟鈉抗感染治療5天；14)術后檢測動物血糖，7天后拆線，生化血常規檢查；2.實驗結果恒河猴靜脈注射STZ后空腹血糖在3.2-17.6mmol/L之間波動，動物的空腹血糖持續高于11.lmmol/L，血清C-肽檢測低于0.5nmol/L，血清抗胰島細胞抗體(見圖1C，1D)和抗胰島素抗體檢測陽性；動物胰腺組織病理活檢顯示胰島周圍有淋巴細胞浸潤(圖2B)，胰島組織中僅有極少量胰島素表達陽性細胞殘存(圖3A)，90%以上為胰高血糖素表達陽性細胞(圖3B)，判斷為自身免疫性1型糖尿病模型建模成功。實施例2本發明動物模型的藥物干預試驗一、受試藥物環孢霉素(免疫抑制藥物，可降低小鼠自身免疫性糖尿病的發生率)；二、試驗方法環孢霉素對自身免疫性糖尿病發病過程的干預作用實驗分為生理鹽水空白對照組和環孢霉素干預組在STZ誘導自身免疫性糖尿病的過程中，干預組同時每天給予環孢霉素(2.5mg/Kg)，比較空白對照組和干預組動物糖尿病的發病時間、發病率和β細胞的損傷的程度。通過免疫抑制藥物干預自身免疫性糖尿病的發病過程，觀察到動物模型中β細胞的損傷程度降低，進一步證明本發明動物模型為自身免疫性1型糖尿病模型，且采用本發明的造模方式可成功造模。實施例3用治療自身免疫性1型糖尿病的藥物驗證自身免疫性1型糖尿病恒河猴動物模型并初步建立相關藥物篩選平臺目前自身免疫性1型糖尿病的治療方法主要以注射胰島素治療，本實驗將胰島素用于恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型，具體方式為1、根據恒河猴每天進食兩餐的習慣，應用一天兩次(9:30am&16:30pm)注射不同劑量不同種類胰島素的方法，施用于實施例1制備的本發明自身免疫性1型糖尿病模型①長效胰島素萬邦(徐州)產豬胰島素(精蛋白鋅胰島素)和②短效胰島素萬邦(徐州)產豬普通胰島素的聯合治療；2、為了防止低血糖發生，從小劑量(0.4U/Kg)開始皮下注射胰島素；3、監測空腹和餐后血糖水平，根據血糖水平調整給藥劑量，最終可將動物的空腹和餐后血糖控制在低于10mmol/L水平，糖化血紅蛋白低于6.5%。試驗結果胰島素對自身免疫性1型糖尿病具有較佳的治療效果。該實驗證明，本發明動物模型適用于身免疫性1型糖尿病的治療研究和糖尿病并發癥的發生和治療研究，可用于篩選治療自身免疫性1型糖尿病的藥物及治療方法。綜上所述，本發明制備的自身免疫性1型糖尿病動物模型建模成功，可以用于嚙齒類動物模型無法完成的生物技術新藥的評價和干細胞移植治療技術的評價。權利要求低劑量的鏈脲菌素在制備用于篩選治療自身免疫性1型糖尿病藥物的動物模型中的用途，其中鏈脲菌素的施用劑量為15-30mg/Kg/次。2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于鏈脲菌素的施用方法和劑量為連續5天靜脈給予小劑量鏈脲菌素每次15-30mg/Kg；末次給藥后第7和14天再次給藥。3.一種制備權利要求1或2所述的自身免疫性1型糖尿病動物模型的方法，其特征在于它是將鏈脲菌素施用于靈長類動物，鏈脲菌素的施用劑量為15-30mg/Kg/次。4.根據權利要求3所述的自身免疫性1型糖尿病動物模型的制備方法，其特征在于所述靈長類動物為恒河猴。5.根據權利要求3或4所述的自身免疫性1型糖尿病動物模型的制備方法，其特征在于所述的鏈脲菌素的施用方法和劑量為連續5天靜脈給予小劑量鏈脲菌素每次15-30mg/Kg；末次給藥后第7和14天再次給藥。6.權利要求3-5任一一項所述的方法制備得到的自身免疫性1型糖尿病動物模型。7.權利要求6所述的動物模型在篩選治療自身免疫性1型糖尿病的藥物中的應用。8.一種篩選治療自身免疫性1型糖尿病的藥物的方法，包括如下步驟a、它是將鏈脲菌素施用于靈長類動物，鏈脲菌素的施用劑量為15-30mg/Kg/次；b、將候選物施用于a步驟所述的靈長類動物；c、用自身免疫性1型糖尿病動物模型評價潛在的治療自身免疫性1型糖尿病的藥物。9.根據權利要求8所述的篩選藥物的方法，其特征在于a步驟所述靈長類動物為恒河猴。10.根據權利要求8或9所述的篩選藥物的方法，其特征在于a步驟所述的鏈脲菌素的施用方法和劑量為連續5天靜脈給予小劑量鏈脲菌素每次15-30mg/Kg；末次給藥后第7和14天再次給藥。全文摘要本發明提供了低劑量的鏈脲菌素在制備用于篩選治療自身免疫性1型糖尿病藥物的動物模型中的用途，其中鏈脲菌素的施用方法和劑量為靜脈給予，15-30mg/Kg/次。本發明還提供了一種制備恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型的方法，及該方法制備的自身免疫性1型糖尿病動物模型。本發明動物模型可以用于嚙齒類動物模型無法完成的生物技術新藥的評價和干細胞移植治療技術的評價。文檔編號A01K67/027GK101804211SQ200910058330公開日2010年8月18日申請日期2009年2月13日優先權日2009年2月13日發明者喬超鋒,任艷,何斯榮,張文勝,曾力,李宏霞,王莉,田伯樂,程驚秋,鄧紹平,金熙,陸燕蓉,陳又南,魏玲玲,麥剛申請人:四川大學華西醫院;成都華西海圻醫藥科技有限公司