專利名稱：：一種耐高溫龍須菜優良品系誘變選育方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程
技術領域：
，具體地說，涉及一種耐高溫龍須菜優良品系-秀變選育方法。
背景技術：
：我國藻類栽培有60余年歷史，產量占世界70%以上。栽培物種主要有海帶、紫菜、裙帶菜等。藻類栽培創造了顯著的經濟、社會和生態效益。但是，與海洋經濟動物養殖相比，產業和產品結構更新發展緩慢。瓊膠是食品、化工、醫藥和生物工程等產業不可缺少的重要原料，具有巨大的市場需求。20世紀90年代末世界瓊膠年產量約15000噸(紀明侯《海藻化學》)，目前已超過20000噸。但是我國產瓊膠海藻栽培基本是空白。產瓊膠海藻主要是石花菜屬("ehV/，)和江蘺屬("ac/hr/a),其中三分之二的瓊膠是由江蘺屬海藻生產的。江蘺屬海藻生長速度比石花菜快，瓊膠的含量也很高。因此，在江蘺屬中選擇適宜的物種進行人工栽培，為瓊膠生產提供原料，具有重要的意義。龍須菜(〃rac/7ar/a/e/z7<2/7e//*o_nz7/s),紅藻門江蘺科江蘺屬，原產于山東沿海潮間帶。龍須菜分枝較多，生長快，每年春秋兩季為快速生長期，最適生長溫度為12-23°C。與江蘺屬其他物種性比，龍須菜是一種較好的產瓊膠海藻。目前對原產于我國青島的龍須菜進行了系統的遺傳學研究，包括細胞突變體的遺傳分析、突變體光合特性的變異、瓊膠質量和酶活性的變異等。從20世紀80年代就已經在龍須菜的原產地一青島海區進行人工栽培試驗，獲得成功，標志著從采集野生龍須菜到人工規模栽培的轉變。并且在人工栽培過程中發現了自發突變體，經高溫環境條件下篩選出來耐高溫突變抹野生型龍須菜，具有耐高溫、速生抗逆、3瓊膠含量高質量好等優良性能，2007年獲得國家級原良種種證書。野生型龍須菜選育成功為龍須菜栽培業奠定了基礎。目前在我國已經形成在廣東、福建、浙江、江蘇、山東和遼寧沿海的栽培產業，栽培面積超過20萬畝，年產量超過15萬噸，已成為我國第三大海藻栽培業。龍須菜栽培促進了我國瓊膠制造業的發展，年產瓊膠愈萬噸，消耗龍須菜產量的四分之三。另外龍須菜在鮑魚養殖中是一種重要的飾料，隨著鮑魚養殖業的發展，需求量日益增加，已占龍須菜產量的三分之一。隨著龍須菜養殖業的不斷發展，其耐高溫性、生長速率及瓊膠含量仍亟待提高，以擴大其栽培地域并延長栽培時間，進一步提高產品產量和質量。因此有必要對其進行遺傳改良，選育出更具應用價值的新品種。
發明內容本發明提供了一種耐高溫龍須菜優良品系誘變選育方法，可以解決現有野生型龍須菜的耐高溫性能差、生長速率慢和含膠量較低的問題。為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現一種耐高溫龍須菜優良品系誘變選育方法，所述方法包括下述步驟a、M匪G誘變將龍須菜的藻絲放入MNNG處理液中浸泡，對龍須菜進行誘變，所述MNNG為N-曱基-N'-硝'基-N-亞硝'基胍；b、HYP抗性系篩選將上述經誘變的龍須菜的藻絲放入含HYP的f/2培養基中進行高溫培養，篩選出所需要的耐高溫龍須菜的藻絲，所述HYP為L-羥脯氨酸。在本發明的上述技術方案中，還具有以下技術特征所述浸泡時間為10~60min。在本發明的上述技術方案中，還具有以下技術特征所述MNNG處理液的濃度為25~40mg/L。在本發明的上述技術方案中，還具有以下技術特征所述f/2培養基中HYP的〉農度為0.01~3mmol/L。4在本發明的上述技術方案中，還具有以下技術特征所述高溫為30~45°C。在本發明的上述技術方案中，還具有以下技術特征所述高溫優選范圍為31~33°C。在本發明的上述技術方案中，還具有以下4支術特征在進行MNNG誘變篩選之前可以對龍須菜的藻絲進行預培養，所述預培養是采用f/2培養基，培養溫度為16~3(TC，光強40~60mol/m2s,光暗周期12L:12D,每周更換一次培養基，然后再進4亍MNNG誘變篩選。光暗周期12L:12D指的是在一天24小時內，光照12小時，黑暗12小時。在本發明的上述技術方案中，還具有以下技術特征所述培養溫度優選為20-25°C。在本發明的上述技術方案中，還具有以下技術特征所選用的龍須菜的藻絲是龍須菜的莖尖部分，所述莖尖部分的長度為20~50mm。在本發明的上述技術方案中，還具有以下技術特征所述HYP抗性系篩選步驟中的培養時間為3~14天。戶斤述MNNG是N—曱基一N'_石肖基一N—亞石宵基脈(N—methyl—N'-nitro-N-nitrosoguanidine);MNNG是一種強誘變劑，具有強致癌性，應該在實驗過程多加注意防護措施，并且做好后期實驗藥品的處理。所述HYP是L-羥脯氨酸f/2培養基的配方如下工作液(mg/L)A:NaN0375mgB:NaH2P04.H205mg母液(g/L)75gC:Na2Si03.9H2020mgDNa2EDTA4.36mg20g4.36g3.16g0.Olg0.023g0.012g0.18gE:FeCh.6H203.16mgF:CuS04.5H200.OlmgZnS04.7H200.023mgCoCL2.6H200.012mgMnCL.4H200.18mgNa2Mo042H200.07mg0.07gG:維生素Bl0.lg0.lmg維生素B120.5g0.5mg生物素0.5g0.5mg自然海水(0.4m孔徑濾膜過濾)1升，在121°C下滅菌20min。具體選育步驟如下1、材料的采集和培養將采集的材料用毛刷進行刷洗，除去雜藻。選取生長旺盛的藻林于三角瓶中通氣培養。采用f/2培養基，培養溫度為20~22°C。光強40~60mol/m2s。光暗周期12L:12D，每周更換一次培養基。2、M腦誘變處理(1)誘變劑濃度為30mg/L的MNNG。(2)誘變處理取長20~30mm的莖尖作為誘變材料，于250ml三角瓶中培養一周，然后置于MNNG處理液中進行-秀變，處理時間分別為0、10、20、30、40和50min,每組莖尖100條。誘變處理完畢先用蒸餾水沖洗，再用消毒海水沖洗3遍。處理后的材料于f/2培養基中暗培養24小時后移至光下培養，培養條件同上。將存活的藻體莖尖繼續培養，觀察其活性，選擇生長旺盛的處理組進行下一步耐高溫篩選。3、耐高溫藻抹的選擇(1)篩選培養基加入不同濃度HYP的f/2培養基(HYP濃度為0.5、1、1.5、2、2.5和3畫1/L)。(2)HYP處理將上述經30minMNNG誘變的莖尖再加入不同濃度HYP的f/2培養基中進行初篩，每組30條，根據莖尖的死亡率選擇HYP的適宜濃度。然后在含有此濃度的HYP培養基上繼續培養。最后將存活的植抹在31°C下高溫篩選，得到的成活植林就是所要篩選的耐高溫品系。以981龍須菜開始i秀變稱為出發品系，以出發品系為對照，才全測新品系的耐高溫性能和生長狀況。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是本發明采用化學誘變劑N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-methy1—N'—nitro—N—nitrosoguanidineMNNG)誘變的方法，對龍須菜進行誘變，然后對其進行L-羥脯氨酸(HYP)抗性系的篩選，篩選出具有耐高溫等優良性狀的新品種，不但能提高野生型藻體的耐高溫性能、而且還提高生長速率和含膠量。本發明提出了一種全新的誘變方法，這種通過人工栽培方法得到的龍須菜品種具有優良性狀，不但耐高溫，這樣在南方通常水溫比4交高的環境下同樣也可以大量繁殖龍須菜，而且生長速率快，其含膠量也比較高，為龍須菜栽培提供了新品系，對于促進瓊膠制造業的發展也有重要意義。圖1為野生型龍須菜經不同時間誘變處理后的存活率；圖2為不同劑量HYP處理后藻抹的存活率；圖3為4(TC脅迫72h后野生型龍須菜和07-2生長狀態比較；圖4為07-2和野生型龍須菜藻體長度的比較；圖5為30°C高溫脅迫對07-2和野生型龍須菜體內游離脯氨酸含量的影響；圖6為不同溫度條件下07-2和野生型龍須菜中a-半乳糖苷酶活性比較；圖7為2種龍須菜日平均生長速率的比較；圖8為07-2和野生型龍須菜日平均生長速率比較。具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。實施例1:1)龍須菜的誘變選育方法取長20-50mm的莖尖作為誘變材料，然后置于30mg/L的MNNG處理液中進行誘變，處理時間分別為0、10、20、30、40和50min,處理后的材料于f/2培養基中暗培養24小時后移至光下培養。結果顯示莖尖經M匪G誘變后仍具有正常的萌發和成長能力。但其存活率與誘變時間有一定的關系。由圖1可以看出M麗G對野生型龍須菜有明顯的抑制作用，誘變時間越長，莖尖的存活率越低，當7誘變時間達到30min以上時，50%的莖尖無法存活。處理后第3天，10min處理組的存活率為90%，而5Omin處理組的存活率<又為75%。處理后第12天，30min處理組的存活率為48%,50min處理組已經全部死亡。經MNNG誘變后的藻體在短時間的培養的藻體中可見生長速度差異，并偶爾出現色素突變體。30min處理組的藻體較早出現分枝，生長速度明顯高于其他各組，收集莖尖進行下一步HYP篩選。2)HYP抗性系的篩選方法將上述經30minMNNG誘變的莖尖在加入不同濃度HYP(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.Ommol/L)的f/2培養基中進行初篩，每組30條，根據莖尖的死亡率選擇HYP的適宜濃度。然后在含有此濃度的HYP培養基上繼續培養。篩選結果經HYP處理后第1、3、7天的藻抹存活率見圖2。可見HYP對藻林的存活率有明顯的影響，不同濃度處理后藻抹的存活率都明顯低于對照組，尤其高濃度對藻株表現出強烈的致死作用。處理l天后，0.5mmo1/L組存活率達到92。/。，3mmo1/L組《又為20。/。，處理7天后，0.5mmo1/L組存活率下降到70°/。，3mmo1/L組已經全部死亡。2mmol/L組第1天存活率為73%,第7天下降到51°/。接近半致死率。因此經過0.5~3mmo1/LHYP濃度的初始篩選后，得到適宜的篩選濃度為2mmol/L。用含有此濃度的篩選培養基進行培養，取存活藻株在31。C高溫條件下培養24h進行二次篩選。最后將存活的9抹藻抹放入燒杯中通氣培養，采用f/2培養基，培養溫度為21°C士rC，光強40~60mol/m2s，光暗周期12L:12D。每周更換新鮮培養基。四周后觀察有一抹材料分枝較多、色澤均勻、生長迅速，命名為07-2。實施例22個品系耐高溫特性的測定野生型龍須菜和07-2分別選取3林藻體置于100ml的三角瓶中加80ml培養基，在4(TC的光照恒溫培養箱中培養，觀察藻體的形態及色素變化。相同的高溫脅迫條件(40°C)對07-2和野生型龍須菜造成的損傷和病爛程度并不相同，07-2發生病爛的時間和程度明顯晚于野生型龍須菜。脅迫12h，二者形態都無明顯變化，枝條保持完整，無病爛現象(退色和爛梢)。24h時，野生型龍須菜分枝開始出現退色變白，07-2僅有少量分枝發白死亡。48h時，野生型龍須菜的退色區域擴大主枝呈現粉紅色，07-2主枝仍呈現深紅色。72h時，野生型龍須菜全部變白死亡，07-2分4支全部死亡^f旦主沖支為紅色(如圖3所示)。實施例32個品系線生長速度的比較野生型龍須菜和07-2分別選取長度為10mm的幼嫩藻尖50根，置于100ml的三角瓶中加入80ml培養基，培養一周后測定長度，如有分枝，將所有分枝加入總長，連續測四周，計算平均線生長速度。每周更換培養基。07-2和野生型龍須菜的生長狀態見圖4，顯示出較為明顯的差異。07-2平均線生長速率為0.90mm/d;野生型龍須菜為0.77mm/d,兩者之間差異顯著(p<0.05)。兩個品系的藻抹起始長度都為10mm，隨著培養時間延長07-2和野生型龍須菜的藻體長度差異逐漸明顯。7天時07-2和野生型龍須菜的藻體長度并無顯著差異(p>0.05)，28天時二者已經顯示出明顯的差異(p<0.05)，野生型龍須菜藻體平均長度為40.85mm，07-2藻體平均長度為45.90mm，表現出較明顯的生長優勢。實施例42個品系藻體分枝數和直徑的比較隨機選取野生型龍須菜和07-2的末級分枝20段，長度0.5mm。計算每個品系的分枝數。并從中選取長度超過lcm的莖尖，用刀片從其基部切斷。每20根為一組，計算每個品種的藻枝直徑。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*代表差異極其顯著(pSO.01)分枝數和直徑的比較見上表，2個品系藻體分枝數和直徑的比較。與野生型龍須菜相比，07-2分枝數增加，藻枝直徑增大。07-2比野生型龍須菜分枝數增多了約36%,t-檢驗結果表明存在顯著差異(PSO.01)。07-2與野生型龍須菜相比直徑增大約50%。t-檢驗結果表明存在顯著差異(p^O.01)。實施例52個品系高溫脅迫條件下游離脯氨酸含量的比較野生型龍須菜和07-2分別稱取鮮重2.5g的藻體，置于500ml的三角瓶中加入300ml培養基，在30。C的光照培養箱中培養，連續四天測其含量。Pro含量的測定采用》黃基水楊酸提取法；稱取0.5g待測藻林，加5mL3%磺基水楊酸沸水浴浸提10min，酸性茚三酮染色，曱苯萃取后520nm處比色。圖5表示了07-2和野生型龍須菜在30°C高溫脅迫條件下脯氨酸含量隨著時間的變化情況。由圖6可以看出，在高溫脅迫下龍須菜藻體內的脯氨酸含量都發生了顯著的變化，前3天內逐漸升高，第4天突然回落。常溫下07-2和野生型龍須菜體內脯氨酸含量為11.17±0.51和5.24±0.47,t-test結果表明不存在顯著差異(p〉0.05)。高溫脅迫后二者含量變化明顯，第3天二者體內脯氨酸含量為23.28±0.20和16.88±0.40，t-test結果表明存在顯著差異(p<0.05)。在高溫脅迫條件下培養3天時，07-2體內的含量比初始值提高了約108%,明顯高于野生型龍須菜(p<0.05);當培養時間到3天后，脯氨酸含量急劇下降，但07-2的含量仍明顯高于野生型龍須菜。實施例62個品系oc-半乳糖苦酶活性的比較野生型龍須菜和07-2分別在10°C、15°C、20°C、25°C、30°C的光照恒溫培養箱中培養3天后測酶活。鑒于酶活性在1天之內有明顯的改變，所以實-驗都要在每天相同時刻測定。準確稱取0.3g待測藻才朱。液氮研磨力口《爰沖液(50mmol/LGly—NaOH，0.1%(v/v)|3-巰基乙醇，pH8.25)。4。C離心，取上清進行活性分析。蛋白質濃度測定參照Bradford的方法。以牛血清白蛋白作為標準。一個酶活單位(U)定義為在上述條件下lmin內催化liamol底物或生成1jlimol產物的酶量。酶的活性用酶的比活表示，即U/mg蛋白。圖6表示07-2和野生型龍須菜分別在10°C、15°C、20°C、25。C、30。C條件下07-2和野生型龍須菜中oc-半乳糖苷酶活性比較。由圖6看出，在1020。C之間，a-半乳糖苷酶活性變化呈下降趨勢；20~3(TC則呈現顯著上升趨勢。從整體變化上看，07-2體內酶的活性要高于野生型龍須菜。對于07-2來說，在20~25。C下酶活有一個顯著提高的過程(p<0.05)，與20。C相比，提高了47%。在25~30°C下，酶活趨于穩定。實施例7廣東汕頭南澳養殖區的生長狀況為了驗證07-2的優良性狀能否在大規模栽培中得到表現，從2007年12月份開始在廣東汕頭南澳島首先進行了栽培試驗。2007年12月26曰由青島空運種苗到汕頭，先在海水池里暫養，的優良性狀，將青島養殖區的野生型龍須菜和07-2在同等條件下栽培。2008年2月21日下海，對照野生型龍須菜16繩，07-219繩(苗繩長5米，每繩加藻4米重約50克)。取兩種龍須菜各4繩(重約200克)，每周稱重一次，連續測六周，按照下列公式進行計算龍須菜的日平均生長速率(SpecificGrowthRate,SGR):SGR(%)/d=(lnWn-lnW0)/nxi00%式中Wn為第n天的藻體重量(g);WO——初始夾苗量(g)經過42天的栽培時間，07-2的平均藻體重量為1007.0g，野生型龍須菜的平均藻體重量為954.7g。經過方差分析，2個品系的藻體重量的增長差異程度顯著(P<0.05)。07-2移植到南澳島14天后已增重60%，栽培42天后，總增重比達到5倍。而野生型龍須菜在14天后僅增重40%,42天后總增重比僅為3.5倍，如下表所示，2個龍須菜品系平均藻體重量的比較栽培天數07-2野生型龍須菜(天)藻體重量(g)藻體重量(g)0200.0200.07281.7±16.0269.0±6.614370.1±25.2330.7±23.821474.3±34.7416.0±29.028608.9±40.1540.2±45.635936.1±114.1682.2±94.6421077.0±104.7749.7±114.1112個龍須菜品系的藻體日平均生長速率的變化如圖7所示。07-2的日平均生長速率為4.09H，野生型龍須菜的藻體日平均生長速率為3.20%。實施例8山東榮城養殖區的生長狀況為了進一步驗證07-2的優良性狀能否在大規模栽培中得到表現，從2008年7月開始在山東榮城再次進行了栽培試—驗。2008年7月由汕頭空運種苗(野生型龍須菜和07-2)到榮城，先在海水池里暫養。2008年8月25日進行分苗，取兩種龍須菜各10繩(重約200克)，每10天稱重一次，連續測四次，計算日平均生長速率(計算方法同實施例7)。2個品系的起始重量都是200g,經過40天的栽培時間，野生型龍須菜的平均藻體重量為4549g，07-2的平均藻體重量為7721g，比野生型龍須菜高69.7%。圖8表示07-2和野生型龍須菜日平均生長速率的變化曲線，其中07-2的日平均生長速率為6.21%,野生型龍須菜的日平均生長速率為4.11%,經方差分析，差異顯著(P<0.05)。實施例92個品系瓊膠特性比較取上述2個龍須菜品系的鮮藻，曬干后，按照紀明侯的方法分別對龍須菜品系的瓊膠含量和凝膠強度等特性進行測定。07-2和野生型龍須菜的瓊"交含量分別為20.6%和18.0%，瓊^交的凝膠強度分別為1260g/cm2和1100g/cm2，07-2的瓊膠呈現澄清，而野生型龍須菜的瓊膠呈現淡黃色，如下表所示，2個龍須菜品系的瓊膠特性比較。07-2的瓊膠含量比野生型龍須菜提高14.4%,凝膠強度也提高了14.5%。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。權利要求1、一種耐高溫龍須菜優良品系誘變選育方法，其特征在于所述方法包括下述步驟a、MNNG誘變將龍須菜的藻絲放入MNNG處理液中浸泡，對龍須菜進行誘變，所述MNNG為N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍；b、HYP抗性系篩選將上述經誘變篩選后的龍須菜的藻絲放入含HYP的f/2培養基中進行高溫培養，篩選出所需要的耐高溫龍須菜的藻絲，所述HYP為L-羥脯氨酸。2、根據權利要求1所述的誘變選育方法，其特征在于所述浸泡時間為10~60min。3、根據權利要求1所述的誘變選育方法，其特征在于所述MNNG處理液的濃度為25~40mg/L。4、根據權利要求1所述的誘變選育方法，其特征在于所述f/2培養基中HYP的濃度為0.01~3mmol/L。5、根據權利要求1所述的誘變選育方法，其特征在于所述高溫為30~45°C。6、根據權利要求5所述的誘變選育方法，其特征在于所述高溫優選范圍為31~33°C。7、根據權利要求1所述的誘變選育方法，其特征在于在進行匪NG誘變篩選之前可以對龍須菜的藻絲進行預培養，所述預培養是采用f/2培養基，培養溫度為16~30°C，光強40-60mol/m2s,光暗周期12L:12D，每周更換一次培養基，然后再進行MNNG誘變。8、根據權利要求7所述的誘變選育方法，其特征在于所述培養溫度優選為20~25°C。9、根據權利要求1所述的誘變選育方法，其特征在于所選用的龍須菜的藻絲是龍須菜的莖尖部分，所述莖尖部分的長度為20~5Omm。10、根據權利要求1所述的誘變選育方法，其特征在于所述HYP抗性系篩選步驟中的培養時間為3~14天。全文摘要本發明提供了一種耐高溫龍須菜優良品系誘變選育方法，可以解決現有技術存在的野生型龍須菜的耐高溫性能差、生長速率慢和含膠量較低的問題。所述誘變選育方法包括下述步驟a.MNNG誘變將龍須菜的藻絲放入MNNG處理液中浸泡，進行誘變；b.HYP抗性系篩選將上述經誘變的龍須菜的藻絲放入含HYP的f/2培養基中進行高溫培養，篩選出所需耐高溫藻株。本發明得到的龍須菜品種不但耐高溫，而且生長速率快，其含膠量也比較高，為龍須菜栽培提供了新品系，對于促進瓊膠制造業的發展也有重要意義。文檔編號A01H1/04GK101564004SQ200910013758公開日2009年10月28日申請日期2009年1月8日優先權日2009年1月8日發明者琳孟,張學成,滌徐,臧曉南申請人:中國海洋大學