專利名稱：耐草甘膦的小麥基因型的制作方法
技術領域：
本發明屬于小麥(Triticum aestivum L.)育種領域，尤其是涉及耐除草劑草甘膦的小麥基因型。
背景技術：
雜草競爭是造成小麥生產中產量損失的主要原因。聯合山羊草、雀麥草和野生燕麥是西北太平洋(PNW)的小麥生產系統中的主要雜草問題，直播生產完全依賴于化學除草。用于控制這些雜草的大多數除草劑昂貴并且毒性高。根據環境因素和使用的生產系統，干旱、絲核菌根腐病和雜草競爭造成的產量損失在0%至接近100%的范圍內。發展抵抗或耐受這些問題中的任意一種的變種會顯著降低與小麥生產相關的經濟風險因素。目前，通過使用草甘膦去除上年感染的植株來控制綠色橋梁效應，從而對付絲核菌，綠色橋梁效應通常發生于當在將死的雜草和雜草化作物的根上生長的真菌病害轉移到出現的谷類作物的根部時(Veseth，“ ‘ Green Bridge' Key toRoot Disease Control, “ PNW Conservation Tillage Handbook Series No. 16,chap. 4," Disease Control," pp. 1-8, 1992)。“綠色橋梁效應”現象通常導致顯著的植物發育遲緩、減少分蘗和糧食產量損失 (Smiley and ffilkins, PlantDis. 76 :399-404,1992 ；Hornby et al.，“ Take-all and Cereal ProductionSystems, " in :Take_all Disease of Cereals,Cambridge,U. K. :CAB International, pp. 103_164，1998)。基于市場接受程度的考慮，通過從商業化進程中去除 Roundup Ready 小麥(Monsanto Company, St. Louis，MO)，許多年都不會有耐除草劑轉基因小麥。雜草競爭是商業小麥生產的主要威脅，導致糧食產量降低和糧食質量低劣。盡管可使用耕種來去除雜草，耕種領域的土壤極易受到風和水的侵蝕。由于應用的簡便性和有效性，除草劑處理是優選的雜草控制的方法。除草劑還可以在減少耕種或設計為在土壤表面留下大量剩余從而防止侵蝕的直播作物系統中進行雜草控制。小麥中最主要的雜草競爭來源于有高度親緣關系的草類，如野生燕麥和聯合山羊草。不幸的是，難于設計出有效的與種植作物有親緣關系的問題雜草種類的化學控制方法，因為它們會具有相同的除草劑敏感性。解決該問題的一個方法涉及應用重組基因進行轉化從而通過基因改良(GM)(即通過重組DNA和植物轉化技術在植物中引入外源基因序列)產生抗如草甘膦(即Roundup )的廣譜除草劑的作物。在該系統中，“在作物中”應用除草劑來控制雜草而不會傷害耐除草劑的作物植株。該方法被用于發展Roundup Ready 大豆、棉花、玉米和加拿大油菜品種，其已在美國Roundup Ready 大豆中取得巨大成功，1997年開始商業生產，到2006年，美國生長的七千五百萬英畝中的七千一百萬英畝(95%)的大豆都是種植Roundup Ready 品種， 顯示了該技術的巨大價值(http://nass.usda.gov)。生產者將廣泛接受Roundup Ready 大豆的基本原因歸功于更高的凈利潤、擴大除草劑應用窗口、提高作物安全性和由于去除了耕種而降低土壤侵蝕通過。1997年，Monsanto Corp.開始聯合私營育種公司和美國大學開發RoundupReady 春小麥。因為其它的GM作物已經進入了商業生產，預期Roundup Ready 小麥會容易被接受。但是，小麥的GM技術的消費者知覺顯著不同于其它的作物，因為小麥主要用于人類消費而不是飼養動物；因此，發展GM小麥是非常有爭議的。根據經濟影響評估，研究者認為GM小麥的市場化會導致損失30 %至50 %的美國的出口市場(Wisner，EconomicsStafT Report, Iowa State University Dept. of Economics, Ames, Iowa, 2004)。缺乏消費者的接受，尤其是在美國和亞洲，最終導致包括碾磨工、面包師和農民組織的工業代表禁止在美國生產GM小麥。因此，Monsanto在2004年5月暫停了 Roundup Ready 小麥發展計劃，取消了在商業小麥領域使用該方法來控制問題雜草的可能性。可用于發展耐除草劑作物的代替方法不涉及本身的遺傳改造。突變育種是涉及使用化學突變劑來提高作物植株中的農業價值性狀的遺傳多樣性的非GM方法。該方法涉及將種子接觸化學突變劑，其在該植物的DNA中制造變化，導致新型的可能有用的基因產生， 該基因通過正常的有性繁殖從原始突變植物(Ml)傳遞到其后代(M》。使用傳統的交叉雜交技術將通過突變育種產生的有用的基因整合到改良的品種中。化學誘導的變種不被認為是GM，因為未使用轉化(S卩，基因工程)來將理想的基因插入到宿主植物的DNA中。耐受除草劑咪唑啉酮(Immi)的耐除草劑Clearfield 小麥是通過突變育種產生的最著名的小麥品種。見美國專利第6，339，184號。最初在化學誘導的突變體鑒定的耐受基因來源于法國冬小麥品種(Newhouse et al. ,Plant Physiol. 100 :882_886，1992)，隨后通過傳統育種被轉移到其它品種中。2003年，第一個耐Immi冬小麥品種在Colorado進入商業生產，現在美國的每個冬小麥主產區都有Clearfield品種。(http://www. nass. usda. gov/)。2006年， Oregon州立大學公開的一種Clearfield 品種-0RCF101占到了 Washington州的軟質白色冬小麥種植面積的6%，在以后幾年里預期Clearfield 品種的種植面積會穩定上升。 Clearfield 品種產生的糧食是非管制的；因此，它可以以沒有身份保護或標簽需要的大宗商品銷售。突變育種還被成功用于發展抵抗白粉病(Kinaneand Jones,Euphytica 117 251-260，2001)，葉銹病和桿銹(Williams et al. ,CropScience 32 :612-617,1992, Friebe et al. ， Crop Science 34 :400-404,1994, Kerber and Aung, Crop Science 35 :743-744, 1995)，和黃銹病和褐銹病的小麥品種。美國專利第7，087，809描述了通過在草甘膦溶液中浸泡非誘變的小麥種子并且篩選耐草甘膦的植物來獲得耐草甘膦小麥。熟知的用于通過GM方法制造耐草甘膦大豆和玉米的〃 RoimdupReady "基因是由編碼以草甘膦作為目標的酶-EPSP合成酶的細菌基因的突變造成的(Dill，Pest Manag. Sci. 61 =219-224,2005)。一個或兩個基因中自然產生的突變將草甘膦抗性賦予在大量使用草甘膦的區域中生長的雜草(Zelaya et al.，Theor. Appl. Genet. 110 :58-70,2004 ；Owen and Zelaya,PestManag. Sci. 61 :301_311，2005)。此外，克隆的水稻 EPSR合成酶基因的 PCR 突變顯示單點突變(C317T，P106L ； S卩，核苷酸317的胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶脫氧核苷的單一核苷酸變化導致EPSP蛋白的氨基酸106從脯氨酸變成賴氨酸的氨基酸變化)當被轉化進并且在得到的轉基因植物中表達時賦予草甘膦耐性(Zhou et al. ,Plant Physiol. 140 184-195,2006)。該脯氨酸密碼子在小麥EPSP合成酶中是保守的。但是，該領域中的大多數科學家還是持有優選發展耐草甘膦作物的GM方法的觀點，因為由甲基磺酸乙酯(EMS)誘導的產生耐草甘膦植物的突變至今還未在任何植物種類中得到鑒定(Jander et al.，PlantPhysiol. 131 139-146，2003 ；Dill, Pest Manag. Sci. 61 :219-224,2005)。篩選了 125，000 株突變的擬南芥植物沒有重新找到單耐草甘膦植物(Jander et al. ,Plant Physiol. 131 139-146,2003)。作者認為“可能由EMS誘導的單堿基變化不能在擬南芥中產生草甘膦抗性”。需要新型的耐草甘膦但是不含有通過重組DNA技術引入到植物基因組中的外源DNA 的小麥品種。本發明滿足了該需要和其它需要。
發明內容
發明簡述我們發展了小麥突變和育種方法從而產生耐草甘膦小麥基因型。通過該方法獲得的多種小麥基因型耐受高水平的草甘膦，在某些情況下，是商業施用量的二、三甚至四倍或更多。根據本發明的一個方面，提供了小麥植株或其部分，該小麥植株或其部分耐受大田中3. 36kg/ha或更多的施用量的草甘膦的異丙胺鹽，其中該小麥植株沒有外源重組DNA。 即，沒有通過重組DNA技術操縱(如克隆，與其它的DNA序列，如啟動子或載體序列等連接)的非植物DNA或植物DNA，將其通過轉化直接引入小麥植株或通過弓I入用于小麥植株育種的小麥植株來間接引入小麥植株。根據另外一個實施方案，該小麥植株或其部分包含對 3. 36kg/ha或更多的草甘膦的異丙胺鹽產生抗性的單基因突變。根據本發明的另外一個實施方案，提供了小麥植株或其部分，其包含產生草甘膦抗性的突變，其中所述的突變來源于選自由IGT07002-0、IGT07003-NO. 1_0、 IGT07005-No.卜0、 IGT07006-0、 IGT07011-0-0,IGT07013_0_0、 IGT07022-0-0、 IGT07027-0-0、 IGT07028-0-0、 IGT07029-0-0、 IGT07030-0-0、 IGT07031-0-0, IGT07064-0-0、 IGT07073-0-0、 IGT07074-0-0、 IGT07087-0、 IGT07091-0,IGT07092-0、 EGT07073-0、EGT07081-0、EGT07100-0、EGT07111-0,EGT07118-0、EGT07130-0、EGT07132-0、 EGT07138-0、EGT07139-0、EGT07140-0、EGT07143-0、EGT07146-0、EGT07149-0、EGT07154-0、 EGT07155-0、EGT07156-0、EGT07158-0、EGT07162-0、EGT07180-0、Re-Mut 3. 1 M3Bulk、 Re-Mut 3. 2 M3 Bulk、Re-Mut 3. 3 M3 Bulk、Re-Mut 3. 4 M3 Bulk、Re-Mut 3. 5 M3 Bulk、 Re-Mut GTL 3. 4-10, Macon M2 Bulk FR2 1-10, MaconFRl-16 M4 Bulk、Macon FR3-1 M2、 TaraFRl-15-57、TaraFRl-15-94、TaraFRl_20_2、Tara 0. 4. 1、Tara 0. 4. 2、Tara 0. 4. 3、 Tara 0. 4. 4、Tara 0. 4. 5、Tara 0. 4. 6、Alpowa M2 Bulk FR2 卜32、Louise M2 Bulk FR21-45> Louise Double Mutated M2 Bulk FR2 1-13> Louise FR3-U LouiseFRl-33-6> Louise FR1-42、Louise FR1-43、Louise FR1-62、LouiseFRl-65-2 和 Hollis FR1-9-14 和其后代構成的組中的耐草甘膦小麥基因型。根據另外一個實施方案，這樣的小麥植株或其部分耐受大田中施用量為每公頃 0.84 公斤酸當量(kg ae/ha)，1. 68kg ae/ha、2. 52kg ae/ha 或 3. 36kg ae/ha或更多的草甘膦的異丙胺鹽。根據這樣的小麥植株或其部分的另外一個實施方案，突變是隱性突變。可通過重新誘變具有產生草甘膦耐性的突變的植株，并且選擇具有原始突變和產生草甘膦耐性的第二突變的植株從而在耐草甘膦植株中引入一個以上的突變。或者，在“基因聚合”方法中，可通過植株與其它具有產生草甘膦耐性的不同突變(例如，其基因組中的第二位點上的獨立突變，無論是在相同或是不同的基因中)的植株的交叉雜交，并且在獲得的后代中選擇具有兩種草甘膦耐性突變的植株，從而在具有產生草甘膦耐性的植物中引入第二突變。作為另外一個可選的，突變之一可為轉基因性狀，其通過如下詳細描述的重組 DNA技術被引入到小麥植株中。因此，根據另外一個實施方案，這樣的小麥植株或其部分包含至少兩個產生草甘膦耐性的不同突變，其中所述的至少兩個不同的突變之一來源于所述的耐草甘膦小麥基因型。根據這樣的小麥植株或其部分的另外一個實施方案，所述的至少兩個的不同突變都來自于所述的耐草甘膦小麥基因型。根據這樣的小麥植株或其部分的另外一個實施方案，所述的至少兩個不同的突變是不同的小麥基因的突變。根據另外一個實施方案，這樣的小麥植株或其部分包含選自由雄性不育、對草甘膦以外的其它除草劑的抗性、抗蟲性、抗病性(包括，但是不限定于絲核菌根腐病抗性)；蠟質淀粉；改良脂肪酸代謝、改良植酸代謝、改良碳水化合物代謝、改良蠟質淀粉含量、改良面筋含量和改良水脅迫耐性構成的組中的性狀。根據另外一個實施方案，提供了這樣的小麥植株的種子。根據另外一個實施方案， 這樣的種子是純育品系的。根據另外一個實施方案，通過種植這樣的種子產生小麥植株或其部分。根據另外一個實施方案，提供了小麥植株或其部分，其具有如上所述的本發明的小麥植株的所有生理和形態特征。還提供了產生包含產生草甘膦耐性的突變和一個或多個額外的理想性狀(包括草甘膦耐性性狀和其它類型的性狀)的小麥植株的方法。因此，根據本發明的另外一個實施方案，提供了產生耐草甘膦植株的方法，其包含(a)將選擇的小麥品種的植株與如上所述的耐草甘膦小麥植株進行雜交從而產生多個后代；(b)選擇耐草甘膦的后代。根據這樣一個的實施方案，該方法包含(a)將由如上所述的本發明的耐草甘膦小麥植株的種子生長的植株與所述的選擇的小麥品種的植株進行雜交從而產生Fl后代植株；(b)選擇具有草甘膦耐性性狀的F 1后代植株；(c)將選擇的Fl后代植株與所述的選擇的小麥品種的植株進行雜交從而產生回交后代植株；(d)選擇具有草甘膦耐性性狀和所述的選擇的小麥基因型的生理和形態特征的回交后代植株從而產生選擇的回交后代植株； 和(e)連續重復步驟(c)和(d)三次或更多次從而產生選擇的第四或更高的回交后代植株，其包含草甘膦耐性性狀和所述的選擇的小麥基因型的所有生理和形態特征(當在相同的環境條件下種植時，以5%的顯著水平確定的)。根據本發明的另外一個實施方案，提供了產生草甘膦耐性植株的方法，其包含(a)將由權利要求3的耐草甘膦小麥植株的種子生長的植株與所述的選擇的小麥品種的植株進行雜交，從而產生Fl后代植株，其中選擇的小麥品種包含理想性狀；(b)選擇具有理想性狀的Fl后代植株從而產生選擇的Fl后代植株； (c)將選擇的后代植株與所述的耐草甘膦小麥基因型的植株進行雜交從而產生回交后代植株；(d)選擇具有理想性狀和所述的耐草甘膦小麥基因型的生理和形態特征的回交后代植株，從而產生選擇的回交后代植株；和(e)連續重復步驟(c)和(d)三次或更多次，從而產生包含理想性狀和耐草甘膦小麥基因型的所有生理和形態特征的選擇的第四或更高的回交后代植株(當在相同的環境條件下種植時，以5%的顯著水平確定的)。根據另外一個這樣的實施方案，理想性狀選自由雄性不育、除草劑抗性、抗蟲性、抗病性(包括，但是不限定于絲核菌根腐病抗性)和蠟質淀粉構成的組。
技術人員會明白可以應用本發明的方法從而獲得其它禾本種類的耐草甘膦突變體，如包括但是不限定于黑小麥、黑麥、大麥、小米、玉米、水稻、高粱等的谷類糧食作物。通過以下的詳細描述、附圖
和權利要求，本發明的前述和其它方面會變得更清楚。除非另有說明，本發明使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域一般技術人員通常理解相同的意義。雖然與本文中描述的相似或等效的方法和材料可被用于操作或試驗本發明，下文中描述了合適的方法和材料。本文提到的所有的公開、專利申請、專利和其它的參考都通過引用其全文結合到本中作為參考。在有爭議的情況下，包括定義的本說明書會規定約束。此外，材料、方法和實施例只是為了說明而不是要限定。發明詳述根據本發明的一個實施方案，提供了耐草甘膦小麥品種。術語“耐草甘膦”(或者 “抗草甘膦”)在本文中用于表示植株或其部分(如種子)在其抗草甘膦除草劑的作用的能力上顯著異于對照植株，包括，但是不限定于提高存活、更高的生長率、更高的產量等。可用多種分析方法來確定純合穩定性、表型穩定性和小麥品種的鑒定。對于具有商業價值的特殊性狀，如，例如草甘膦耐性，其必須是可遺傳和穩定表達的。最古老和傳統的分析方法是觀察表型性狀。通常在田間實驗中收集數據，檢驗小麥植株的完整生活史。最經常觀察的表型性狀是如種子產量、麥穗結構、穎苞結構、種子結構、抗倒伏性、抗病性、成熟等的性狀。除了表型觀察，還可通過分離分析或應用生物技術來檢驗植株基因型。有多種可用的實驗室技術用于分析、比較和描述植物基因型的特征；其中有凝膠電泳、同工酶電泳、限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、隨機引物聚合酶鏈式反應 (AP-PCR)、DNA擴增指紋(DAF)、序列特異性擴增區(SCAR)、擴增片斷長度多態性(AFLP)、 簡單重復序列(SSR)(其也被稱為微衛星)和單核苷酸多態性(SNP)。凝膠電泳尤其適用于小麥。通過麩朊、麥谷蛋白、清蛋白和球蛋白和總蛋白的提取物的電泳來鑒定小麥品種是可能的(Bietz, pp. 216-228, “ Geneticand Biochemical Studies of Nonenzymatic Endosperm Proteins" In Wheat andffheat Improvement, ed.E.G. Heyne,1987)。小麥品種Louise的說明書通過選擇來源于如實施例1描述的小麥品種Louise的耐草甘膦植株獲得小麥基因型GT Louise。使用傳統技術進行進一步回交從而產生源于小麥基因型GT Louise的純育的耐草甘膦小麥品種。“Louise”軟質白色春小麥(Triticum aestivum L.) (PI 634865)，由于其出色的最終應用品質、高糧食產量能力、對地方種的銹條病(由Puccinia striiformis Westend. f. sp. Tritici造成)的高溫成熟植株抗性和對小麥癭蚊的部分抗性(Mayetiola destructor (say))，于2005年8月在華盛頓州的中到高雨量(年平均降雨量> 400mm)、無灌溉小麥產區作為軟質白色春小麥品種“Zak”的替代品被公開(Kidwell等，Crop Sci. 42 661-662,2002)。Louise 是來源于'Wakanz ‘ (PI 506352)/' Wawawai ‘ (PI 574538)雜交的 F4:5 穗列選擇(F4:5 head row selection)，其產生于1992年。使用以下改良的純系譜-混合育種法來發展早代后代。Fl植株的批量種子(30g)被用于建立F2試驗區。隨機從個體F2 植株選擇100個穗，40g的批量種子的子樣本被用于建立F3試驗區。整批收獲F3試驗區的種子，60g的子樣本被用于建立F4試驗區。大約150個F4植株的單個穗被分別脫粒從而建立F4:5穗列族。在一般適應、植株高度和糧食表觀的列中的選擇之后，整批收獲每個選擇的穗列中的30至50個植株的種子從而獲得用于糧食產量評估試驗的F46種子。在WA， Pullman的苗圃場發展Fl、F2、F4和F5后代，而在WA，Lind的Lind旱地實驗站發展F3后代。根據表型均勻，2003年在WA，Othello從灌溉下生長的1100個F4:11穗列的再選擇產生Louise的原種。選擇的穗列在收獲時被集中起來，產生了 563kg的原種。Louise是中等高度、半矮桿栽培品種。它具有松的、尖端細、斜彎曲的具有白芒和白色穎苞的穗，穎苞為長而寬，具有中度細尖肩和窄喙。Louise具有橢圓形的白色、軟質和光滑的谷粒。Louise的種子具有中等尺寸的胚，其具有窄的中等深度的溝、角頰和中度非卷的麥毛。2003和2004年在從2:00am的4°C至2:00pm的20°C逐漸變化的低晝夜溫差循環下進行的溫室育苗試驗(Chen和Line，Phytopathology82 :1428-1434,1992)中，檢測了對小麥銹條病種類PST-37、PST-43、PST-45、PST-78和PST-98的反應。Louise容易感染所有的種類，顯示其不具有全階段(育苗)抗性。但是，當在成熟植株階段，在從2:00am的10°C 至2:00pm的35°C逐漸變化的高晝夜溫差循環下進行與PST-78和PST-100試驗時，Louise 具有高抗性，顯示它具有高溫、成熟植株(HTAP)抗性(Chen和Line，Phytopathology 85 567-572，1995)。2001年至2004年，在華盛頓州的各個地點進行的大田試驗中，Louise顯示了對目前在美國的太平洋西北地區的主要銹條病類別病毒種類的無種類特異性的HTAP 抗性，包括PST-78、PST-98和PST-100。根據Idaho大學進行的使用了含有在PNW發現的三個主要生物型的集合的昆蟲篩選試驗，Louise對小麥癭蚊生物型E、F和GP的抗性是混雜的(65% )。根據WA，Pullman的品系和自然領地為患評價，Louise不易抵抗俄羅斯小麥 aphid[Diur aphis noxia(Mordvilko)]。在休耕地、未灌溉和灌溉的條件下，重復大田試驗評價Louise。2002至2004年，在Washington、Oregon和Idaho進行的非灌溉和灌溉田的評價中，Lousie的糧食產量通常與參加測試的軟質白色春小麥相等或更高。在Washington 州經過3年進行的51次試驗中，Louise的平均糧食產量是3702kg ha_l，其顯著高于 (P0. 05) Zak (3232kg ha_l 和 Alturas (3581kg ha_l)的平均產量(Souza 等，Crop Sci. 44 1477-1478,2004),可與 Alpowa(3668kg ha_l)、 (PI 566596)和 Nick(3742kg ha_l) (WestBred LLC的專有品種)相比較。根據中度和高雨量地區(年平均降雨量> 400mm) 的M位置-年份的數據，Louise的平均糧食產量0952kg ha_l)與Alpowa0905kg ha_l) ^P Nick (4831kg ha_l)持平，顯著高于(P < 0. 05) Alturas (4690kg ha_l)和 Zal^4280kg ha~l)0根據51次試驗，Louise的平均糧食體積比重是757kg m_3，其顯著高(P0. 05) 于 Zak (750kg m_3)，與 Alturas (756kg m_3)和 Nick (763kg m_3)相似，顯著低于(P0. 05) Alpowa (771kg m_3)。Louise、Zak、Alpowa、Alturas 和 Nick 的千粒重平均值分別是 50. 1,44. 5,44. 7,34. 7 和 36. 4g。Louise 的平均植株高是 80cm,其分別高于 Zak(76cm)、 Alpowa (74cm)、Nick(72cm)禾口 Alturas (71cm) 4cm、6cm、8cm禾口 9cm。灌 既種植時 Louise 的倒伏率(5% 至 10% )與 Alpowa(5% 至 10% )可相比，高于 Nick 至 5% )和 AlturasQ% 至5 % )，低于hk(25 %至30 % )。Louise結穗比年積日(DOY) 168)早一天，與 Alpowa(D0Y 167)相同，比 Alturas (D0Y 166)晚一天，比 Nick(D0Y 165)晚兩天。在WA，Pullman 的 USDA-ARS 美國西部小麥品質實驗室 WesternWheat QualityLaboratory進行的試驗中，使用2002至2004年Washington州的育種和商業品種測試試驗中生產的糧食，Louise的糧食蛋白含量(117gkg-l)與Alpowa和Alturas (116g kg-1) 的相似，低于 Nick(120g kg-1) ^P Zak(123g kg-1) 0 Louise 的出粉率(671g kg-1)可與 Zak (667g kg-1)、Alturas (666g kg-1)和 Nick(665g kg-1)相比較，顯著高于(P0. 01) Alpowa(640gkg-l) Louise 的面粉灰分含量(3. 6g kg-1)與 Alpowa(3. 5g kg-1)相似， 顯著低于(PO. 01) Zak (3. 9g kg-1), Alturas (3. 7g kg-1)和 Nick (3. 8g kg-1)。Louise 的平均磨粉品質(84. 0)高于 Zak (81. 4)、Alpowa (80. 6)、Alturas (82. 4)和 Nick (81.5)。 Louise 的 Mixograph 吸水率與 Zak 和 Nick(531g kg-1)的相同，略低于 Alpowa(534g kg-1)，顯著低于(P < 0. ODAlturas (544g kg_ll)。當在各個生產區比較時，Louise的平均餅干直徑(9. 7cm)可與 Zak (9. 7cm)相比較，大于 Alpowa (9. 3cm)、Alturas (9. 5cm)和 Nick(9. 5cm) ,Louise 的平均松糕體積(1305cm3)小于 Zak(1322cm3)和 Alpowa(1362cm3)， 大于 Alturas (1225cm3)和 Nick (1230cm3)。Louise的基礎種子由糧食和土壤科學部和Washington州農業研究中心管理下的 Washington州糧食提高協會(Washington State Crop ImprovementAssociation)保存，并且存放于美國國家植物種質體系(National PlantGermplasm System)。區域適應性當提到區域適應性，該術語被用于描述具有非常適合于該小麥基因型的環境條件的地點。區域適應性基于多個因素，例如抽穗期、耐冬性、抗蟲性、抗病性和耐旱性。區域適應性不表示小麥基因型會在適應區域內的每個地點生長，或它在該區域外不生長。例如， 美國的適應區域(使用標準的二字母代號表示州)包括(a)北部區域，包括DE、IL、IN、MI、 M0、NJ、NY、OH、PA、WI 州禾口 Ontario、加拿大；(b)中南部，包括 AR、KY、MO boot heel 禾口 TN 州；(c)東南部，包括NC、SC和VA州；和(c)美國南部諸州，包括AL、GA、LA和MS州。但是， 本發明的小麥基因型可以在適應區域之內和之外生長，無論是在美國或在美國之外。小麥育種通過利用植物授粉方法的技術來育種大田作物。如果花粉從一朵花傳遞到同一植株的相同的或另外一朵花，該植株是自花授粉的。當同一家族或品系中的個體被用于授粉， 植株是同胞授粉的。如果花粉來自不同家族或品系的不同植株上的花朵，植株是異花授粉的。本文中的術語“異花授粉”不包括自花授粉或同胞授粉。小麥植物(Triticum aestivum L.)被公認為是天然自花授粉的，但是能夠進行異花授粉，在自然中很少發生(小麥的天然異型雜交水平是大約5% )。因此，介入授粉控制機制對于建立優良的品種是關鍵的。兩個不同的純合品系之間的雜交產生均一的雜交植株群體，其多個基因位點是雜合的。兩個在多個基因位點不同的雜合植株的雜交產生基因不同而且不均一的植株群體。 不管其親本，自花授粉并且經過多代選擇類型的植株在幾乎所有的基因位點上變成純合的了，并且產生純育后代的均一群體。術語“純合植物”在這里定義了在其位點具有95%或更多的純合基因的植物。術語“同系交配”或“純育”在本文中用于表示純合植物或純合植物類。育種或選擇方法的選擇取決于植物繁殖的模式、要被提高的性狀的遺傳性、商業應用品種的類型(例如，Fl雜交品種、純系品種等)。對于高度遺傳的性狀，選擇在單一位置評價的優秀個體植株就會是有效的，而對于低遺傳性的性狀，選擇應基于從相關植株的家族的重復評價獲得的平均值。常用的選擇方法包括系譜選擇法、改良的系譜選擇法、混合選擇和輪回選擇。遺傳的復雜性影響育種方法的選擇。一般來說，育種以兩個基因型的雜交(雜交育種)開始，每個基因型具有一個或多個理想的特性，該特性在另外一種基因型中是缺失的或者與另外一種基因型互補。如果兩個原始的親本不提供所有需要的特性，可以通過更多的雜交包括進來其它源。在每個連續的雜交后代中，F1 — F2 ；F2-F3 ；F3-F4 ；F4-F5, 等，植株自交從而提高該品系的純合性。一般，在育種計劃中，進行五代或者更多的選擇，并且自交從而獲得純合植株。系譜育種通常用于提高自花授粉的作物。具有理想的、互補的性狀的兩個親本雜交從而產生F1。通過自交或者與一或多個Fl同胞相交產生F2群體。可開始在F2群體中進行最優個體的選擇，然后開始在F3中，選擇最優家族中最優個體。可在F4代中開始家族的重復測試從而提高低遺傳性狀的選擇有效性。在同系繁殖(即F5、F6和F7)的后期，測試最優品系或表型相似品系的混合物作為新品種公開的可能性。回交育種法已用于將遺傳簡單的品質性狀從供體親本傳遞給理想的純合品種，其被用作回交親本。要被轉移的性狀的來源被稱為供體親本。在最初的雜交之后，選擇具有理想性狀或供體親本的性狀的個體，然后與回交親本重復雜交(回交)。得到的植株被認為具有回交親本的特性(例如，品種)以及理想的性狀或從供體親本轉移的性狀。該方法被廣泛用于育種抗病品種。每個育種計劃應包括育種程序的有效性的周期性、目標性評價。評價標準根據對象和目標變化，但是應包括根據與合適的標準比較的選擇品種的年度收獲，后期育種品系的總體值，每單位投入(例如，每年、每花費一美元等)產生成功品種的數量。多種輪回選擇技術被用于提高多個基因控制的數量遺傳性狀。自花授粉作物中的輪回選擇的應用取決于授粉的容易性和從每個成功雜交收獲的雜交后代的數量。回交選擇可被用于提高自花授粉或異花授粉作物的群體。通過雜交幾個不同的親本來確定或創造雜合個體的遺傳可變群。根據個體的優異性、出色的后代或優秀的組合能力選擇最佳的植株。 選出的植株雜交從而產生新的群體，其中繼續進行選擇輪回。可從群體中選擇植株，自花授粉從而產生新的品種。另外一個育種方法是單粒傳法。在嚴格的意義上來說，該方法是指種植分離群體， 從每個植株收獲一粒種子的樣本，使用單粒樣本來種植下一代。當該群體從F2發展到純育的理想水平，來源于該品系的植株會分別追溯到不同的F2個體。每一代中，群體中的植株數量會下降，這是因為某些種子不能發芽，或某些植株不能產生至少一粒種子。因此，當世代進度完成，不是所有群體中原始抽樣的F2植株都能由有后代代表。在多種子法中，小麥育種者通常從群體中的每個植株收獲一個或多個麥穗，并且將它們一起脫粒形成混合。該批種子中的一部分被用于種植另一代，一部分備用。該方法已被稱為改良的單粒傳法。在收獲時期，多種子法被用來節省勞力。通過機器脫粒麥穗顯著快于單粒法通過手工從每一個麥穗分離一顆種子。多粒法還使每一純育世代種植同等數量的種子類群成為可能。收獲足量的種子從而彌補那些不能發芽或不產種子的植株。還可采用混合育種法。在混合育種法中，種植F2群體。成批收獲該類群的種子，種子的樣本用于種植下一季。可重復該輪回數次。一般來說，當認為個體植株具有高水平的純合度時，為了可能作為品種應用而選擇、測試和提高個體植株。如淀粉凝膠電泳、同工酶電泳、限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、隨機引物聚合酶鏈式反應(AP-PCR)、DNA擴增指紋(DAF)、序列特異性擴增區(SCAR)、擴增片斷長度多態性(AFLP)、簡單重復序列(SSR)(其也被稱為微衛星) 和單核苷酸多態性(SNP)的分子標記技術可被用于植物育種方法中。一種應用的分子標記是數量性狀座位(QTL)定位。QTL定位是標記的應用，已知其緊密連接于在數量性狀上具有可測量效果的等位基因。育種方法中的選擇是基于連接于植物基因組的正影響等位基因的標記的累積和/或連接于負影響等位基因的標記的消滅。在育種過程中，分子標記還可被用于數量和數量性狀的選擇。例如，緊密連接于等位基因的標記或包含感興趣的實際等位基因中的序列的標記可被用于在回交育種程序過程中選擇包含感興趣的等位基因的植株。該標記還可用于選擇回交親本的基因組，以供體親本的標記為比較。使用該方法可將保留在選擇植株的供體親本的基因組的量最小化。它還可被用于降低回交方法中與回交親本回交的數量(Openshaw 等.Marker-assistedSelection in Backcross Breeding. In !Proceedings Symposium of the Analysisof Molecular Marker Data,5-6Aug. 1994，pp. 41-43.Crop Science Society ofAmerica，CorValliS，0R)。選擇方法中的分子標記的應用通常被稱為遺傳標記增強選擇(Genetic Marker Enhanced Selection)或遺傳標記輔助選擇 Marker-Assisted Selection。雙單倍體的產生也可在育種計劃中被用于發展純合品系。通過將純合植株的一套染色體二倍化產生雙單倍體，從而產生完全純合的個體。這是優選的，因為該方法省略了從雜合源獲得純合植株所需要的自交世代。已經在小麥中發展了制造雙單倍體的多種方法(Laurie, D. Α.和 S. Reymondie, Plant Breeding, 1991，V. 106 :182-189. Singh, N. et al. , Cereal ResearchCommunications, 2001, v. 29 :289-296 ；Redha, A. et al. , Plant Cell Tissue andOrgan Culture, 2000, v. 63 167-172 ；U. S. Pat. No. 6, 362, 393) 盡管純系品種是用于商業小麥生產的小麥主導形式，也使用雜交小麥。借助于細胞質雄性不育、 核基因雄性不育或化合物來產生雜交小麥。以將這三種雄性不育體系的各種組合應用于產生雜交小麥。可在幾種參考書籍之一中找到其它的通常用于不同的性狀和作物的育種方法的描述(例如，Allard, Principles ofPlant Breeding，1960 ；Simmonds，Principles of Crop Improvement，1979 ；editor Heyne, Wheat and Wheat Improvement，1987 ； Allan，“ Wheat“，18 章，Principles of Crop Development,vol. 2,Fehr editor，1987)。徹底檢測有希望的高代育種品系，并且與代表商業目標區的環境中的合適標準進行比較。最好的品系作為新品種的候選；那些在一些性狀上仍有缺陷的可被用作產生用于進一步選擇的新群體的親本。最困難的任務是識別遺傳上優良的個體，因為真正的遺傳型值會被其它的混雜植物性狀或環境因素掩蓋。識別優良的基因型的一個方法是觀察其相對于其它實驗基因型和廣泛種植的標準品種的表現。一般，單一的觀察不是決定性的，所以必須重復觀察從而提供對其遺傳價值的更好的估量。育種者使用多種方法來幫助確定應該從分離的群體中選擇哪個植株和最終哪個品系會被用于商業化。除了種質的知識和育種者使用的其它技術，部分選擇程序取決于實驗的設計以及統計分析的應用。實驗設計和統計分析被用于輔助確定哪個植株、哪個植株族和最終哪個品系在感興趣的一個或多個性狀上顯著更好或顯著差異。實驗設計方法被用于控制誤差，從而更精確地確定兩個品系之間的差異。統計分析包括計算平均值，確定變異來源的統計顯著性，和計算適當的方差分量。通常，百分之五或百分之一的顯著水平被用于確定特定性狀產生的差異是真實的或是由于環境或實驗誤差。植物育種是植物的遺傳操作。小麥育種的目標是發展新型的、獨特的和優良的小麥品種。在小麥育種計劃的實際應用中，育種者最初選擇并且雜交兩個或多個親本品系，隨后重復自交和選擇，產生多個新的遺傳組合。理論上，育種者通過雜交、自交和自然誘導的突變可以產生數以十億計的不同遺傳組合。育種者在細胞水平上不能直接控制。因此，兩個育種者永遠不會發展兩個完全相同的品系。每年，植物育種者選擇種質來發展下一代。在獨特和不同的地理、氣候和土壤條件下種植該種質，然后在生長季節的過程中和結束時進一步進行選擇。正確的測試應該檢測主要缺點并且建立相對于目前品種優越或更高的水平。除了顯示優異的表現，還必須具有對新品種的需求。新品種必須適合工業標準，或者必須創造新的市場。引入新品種可能還給種子生產者、種植者、加工者和消費者造成用于特別的廣告和銷售的附加費用，改變種子和商業生產操作，和新產品應用。新品種公開前的測試應該考慮研究和發展的成本以及最終品種的技術優越性。簡單、經濟地生產種子也必須是可行的。 這些通向銷售和分布的最終步驟的過程從進行第一次雜交的時間起會花費六至十二年。因此，發展新品種是一個費時的過程，其必需精確的前瞻性規劃、資源的有效利用和最小化重點方向的變化。小麥(Triticumaestivum L.)是重要和有價值的大田作物。因此，小麥育種者堅持的目標是發展穩定、高產的小麥品種，其在農藝上是可靠的并且在其預期應用上具有良好的磨粉和烘焙特性。為了實現這個目標，小麥育種者必須選擇和發展具有產生優良品種的性狀的小麥植株。任何已知的性狀可以通過使用具有理想性狀的供體親本的育種來被引入到小麥品種中。這樣的理想性狀的一個實施例是對絲核菌根腐病的抗性。共同美國臨時專利申請第60/771，402號，其通過引用結合到本文中，描述了通過突變育種來發展對絲核菌根腐病具有抗性的小麥植株，并且其可以用于具有草甘膦耐性和絲核菌根腐病抗性的小麥的育種。草甘膦配制和噴射測試在一個實施方案中，進行草甘膦耐性的溫室或大田評價。術語“草甘膦”在本文中被用于共同表示母體除草劑N-膦酰甲基甘氨酸(或被稱為草甘膦酸)，其鹽或酯，或在植物組織中轉化為N-膦酰甲基甘氨酸或提供離子形式的N-膦酰甲基甘氨酸(或被稱為草甘膦離子)的化合物。直觀地，Franz的美國專利第3，799，758和4，405，531號中公開了可用于本文的水溶性草甘膦鹽，其公開通過引用結合到本文中作為參考。可用于本發明的草甘膦鹽包括但是不限定于堿金屬鹽，例如鈉或鉀；銨鹽；C1-16烷基銨鹽，例如二甲基胺或異丙胺；C1-16烷醇銨鹽，例如單乙醇胺；C1-16烷基锍鹽，例如三甲基锍；其混合物等。草甘膦酸分子有三個具有不同PKa值的酸位；因此，可以使用單、雙和三元鹽，或其任意的混合物， 或任意的中和中間水平的鹽。草甘膦鹽類具有商業重要性，部分是因為它們是水溶性的。多種銨、烷基銨、烷醇銨、烷基锍和堿金屬鹽是高度水溶性，從而使配制劑可以為高度濃縮的水溶液，其可在使用時在水中稀釋。
這樣的濃縮水溶液可含有每升約50至約500克的草甘膦，表達為酸當量(g a,e, /1)。也可使用更高濃度的草甘膦，例如約300至約500g a, e, /1。選擇針對環境的合適的量和使用合適的添加劑是取得對草甘膦產品的一致的控制的關鍵考慮。目前銷售幾種不同濃度的草甘膦，因此重要的是根據使用的產品來調整量。 草甘膦的標簽通常以兩種方式來表示濃度(a)磅/gal的草甘膦和(b)磅/gal的酸當量的草甘膦。例如，Roundup Ultra 含有4磅/gal的草甘膦的異丙胺鹽，但是只有3磅/gal 的酸當量草甘膦。第一個值包括了與草甘膦配制的鹽的重量，而第二個只測量存在多少的草甘膦。因為鹽類對野草控制沒有作用，酸當量是表示濃度和滅野草能力的更準確的方法。草甘膦鹽還可以例如粉末、小顆粒、小丸或藥片的形式配置成水溶性或水分散組合物。這樣的組合物通常被稱為干制劑，盡管術語“干”不應在本文中理解為表示完全沒有水。一般，干制劑含有少于按重量計5%的水，例如按重量計約0.5%至約2%的水。這樣的制劑在使用時溶解或分散在水中。預期的草甘膦干制劑可包含按重量計約5%至約80%的草甘膦，表示為酸當量 (%a. e.)0優選以上范圍內更高的草甘膦濃度，例如約50%至約80% a. e。尤其可用于制造干制劑的草甘膦鹽是鈉或鉀鹽。本發明的植物處理組合物和液體干濃縮組合物可可選地包含一種或多種需要的賦形劑成分。尤其有用的草甘膦組合物的賦形劑成分是表面活性劑，其有助于水噴霧劑保持在植物葉子相對不沾水的表面上，還有助于草甘膦穿透葉子的蠟質外層(外皮)，從而接觸葉子中的活組織。表面活性劑還可執行其它有用的功能。對于可用于本發明的草甘膦組合物的活性劑的類型和化學類別沒有限制。非離子、陰離子、陽離子和兩性類型或這些類型中的超過一種的組合都可以應用于特定情況。但是，通常的情況是如果有活性劑的話，活性劑中的至少一種應該為陰離子以外的，即，活性劑中的至少一種應該為非離子型、陽離子型或兩性型。通過其所屬領域的一般技術人員可選擇合適的表面活性劑(不限定于以上所述的類別)的標準參考來源包括Gower出版的Handbook of hdustrialSurfactants (第二版， 1997), MC Publishing Company 出片反白勺 McCutcheon' sEmulsif iers and Detergents (北美和國際版，1997)，美國化妝品和香料協會出版的hternational Cosmetic Ingredient Dictionary (第六版，1995，卷 1 和 2)。本發明的組合物的其它可選成分包括改良顏色、粘性、凝膠特性、冰點、收濕性、結塊行為、溶解速度、分散性或其他制劑特性的藥劑。市售的草甘膦制劑的實施例包括，但是不限定于，那些由Monsanto公司出售的 Roundup 、Roundup Ultra 、Roundup CT 、Roundup Extra 、Roundup Biactive Roundup Bioforce 、Rodeo 、Polaris 、Spark ⑧和 Accord ⑧除草劑，它們全部含有作為其異丙銨鹽的草甘膦；Monsanto公司出售的Roundup Dry和Rival除草劑，其含有作為其銨鹽的草甘膦；Monsanto公司出售的Roundup Geoforce ，其含有作為其鈉鹽的草甘膦； Zeneca Limited銷售的Touchdown 除草劑，其含有作為其三甲基锍鹽的草甘膦。選擇對生物有效的草甘膦制劑施用量是在一般農業技術人員的能力范圍內的。所屬領域的技術人員也會認識到個體植株條件、天氣條件和生長條件會影響在操作本發明的方法中取得的結果。草甘膦超過20年的應用和相關于這種應用的出版的研究提供了大量的信息，通過其控制雜草的操作者可選擇在特定環境條件下對處于特定生長階段的特定種類具有殺滅效用的草甘膦施用量。在一個實施方案中，將含草甘膦的除草劑施用于具有本發明的耐草甘膦性狀的植物，評價該植物對草甘膦除草劑的耐性。草甘膦的任意制劑可被用于測試植物。例如，可使用如Roundup Ultra 的草甘膦組合物。評價植物的草甘膦耐性的測試參數會根據因素的數量改變。因素應包括，但是不限定于，草甘膦制劑的類型、制劑中使用的草甘膦的濃度和量、植物的類型、應用過程中植物的發展階段、環境條件、施用方法、特定制劑的施用次數。 例如，可在溫室環境下使用噴霧方法來測試植物。使用RoimdupUltra. 的測試范圍可包括， 但是不限定于8oz/英畝至256oz/英畝。優選的商業效益的范圍可為根據作物和植物發展階段的16oz/英畝至64oz/英畝Roundup Ultra。可以以至少一次的草甘膦制劑施用用來噴霧作物。對于小麥的測試，可以在3至5葉期施用32oz/英畝Roundup Ultra，根據被測試的小麥的類型，隨后可為收獲前或收獲后的施用。對于每種作物可優化測試參數從而找到包含產生理想的具有商業效益的草甘膦耐受水平的本發明構建的特殊植株。基于參考的目的，商業施用量是32oz/A的Roundup Ultra ，其相當于0. 84kg ae/ha或0. 751bs. ae/A。例如，在北卡羅來納州州立大學的Alar^ork的《Sorting Through the Glyphosate Jungle》中提供了對于草甘膦各種制劑、其草甘膦濃度和當量應用率的討論，，JAL http://www. ces. ncsu. edu/martin/gl yphosate. html。組織培養和再生可通過組織培養和再生來進行本發明的耐草甘膦小麥基因型的進一步繁殖。 各種小麥組織的組織培養和由其的再生是熟知的和被廣泛出版的。關于各種小麥組織培養方法的綜述可見 Maheshwari 等的《h Vitro Cultureof Wheat and Genetic Transformation-Retrospect and Prospect)) (CriticalReviews in Plant Sciences, 14(2) :ppl49-178，19卯)。因此，本發明的另外一個方面提供了從其上生長并且分化產生能夠具有本發明的耐草甘膦小麥基因型的生理和形態特征的小麥植株的細胞。如本文所用，術語“植物部分”包括植物原生質體，從其再生小麥植株的植物細胞組織培養物，植物愈傷組織，植物塊和植物或植物部分中完整的植物細胞，如胚、花粉、果皮、種子、花、小花、穗 (head)、穗(spike)、葉、根、根尖、花藥等。該術語還包括植物的產品，包括但是不限定于面粉、淀粉、油、麥芽等。分離的耐草甘膦基因序列及其應用本發明還考慮的是包含當在小麥植株中表達時提供小麥植株除草劑抗性的基因。 無論是來自不同種類或是來自同一種類的，通過使用轉化被插入到基因組中的任何DNA序列在本文中都被稱為“轉基因”。所屬領域的一般技術人員可遺傳定位、識別、分離和測序包含負責產生小麥植株草甘膦耐性的突變的基因序列。見，例如Plant Genomes =Methods for Genetic and Physical Mapping, J. S. Beckmann 禾口 Τ· C. Osborn,1992, Kluwer Academic Publishers ； Genome Mapping in Plants, Paterson,1996, Harcourt Brace and Co. ；Wheat Genome Mapping, A. Kalinski, 1996, Diane Publishing Co.；禾口 Methods in Molecular Biology, Vol. 82, ArabidopsisProtocoIs,Martinez Zapater 禾口 Salinas, 1998, Humana Press。分離的編碼產生自然產生的除草劑耐性的核酸編碼負責造成植物耐受除草劑的蛋白質。然后，該分離的核酸可被用于(1)識別其它的可能包含自然產生的提供小麥植株除草劑抗性的突變的核酸；( 通過基因工程，將該分離的核酸引入到缺乏除草劑抗性的小麥植株；(3) 將該分離的核酸插入到合適的載體中，該載體可以在小麥植株中表達；和(4)將該載體插入到植物細胞中(例如，小麥植物細胞)。本發明還考慮制造DNA構建體，其包含具有編碼產生除草劑抗性的基因、可操作地連接到植物基因表達控制序列的分離核酸序列。“DNA構建體”在本文中被定義為構建的 (非自然產生的)可用于在宿主細胞中引入DNA的DNA分子，該術語包括嵌合基因、表達盒和載體。如本文所用，“可操作地連接”表示以編碼的蛋白質能夠被表達的方式連接DNA 序列(包括序列的順序、序列的方向、多種序列的相對間距)。可操作地將表達控制序列連接到編碼序列的方法在所屬領域中是熟知的。見，例如Maniatis et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, N. Y.,1982 ；；禾口 Sambrook et al., Molecular Cloning :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989。“表達控制序列”是以任何方式參與轉錄和翻譯控制的DNA序列。合適的表達控制序列和制造和使用它們的方法在所屬領域是熟知的。表達控制序列包括啟動子。啟動子可以為誘導型或組成型。它可以是自然產生的，可以由多種自然產生的啟動子的部分構成，或者可以是部分或完全合成的。對于啟動子結構的研究提供了啟動子設計的指導，如Harleyand Reynolds, Nucleic Acids Res.，15， 2343-2361,1987。而且，啟動子相對于轉錄起始的位置可以被優化，見，例如Roberts等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 =760-764,1979。許多適合用于植物的啟動子在所屬領域中是熟知的。例如，用于植物的合適的組成型啟動子包括植物病毒啟動子，如花生褪綠條紋病毒(PCISV)啟動子(美國專利第5，850，019號)；花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S和19S啟動子 (Odell等.，I 313 =3810-812,1985)；小球藻病毒甲基轉移酶基因的啟動子(美國專利第 5，563，3 號)；玄參花葉病毒(FMV)的全長轉錄啟動子(美國專利第5，378，619號)；來自如水稻actin(McElroy et al. ,Plant Cell 2 :163_171，1990)、遍在蛋白質(Christiansen 等，Plant MoI. Biol. 12 :619-632,1989)，and (Christiansen 等，Plant MoI. Biol. 18 675-689，1992)、pEMU(Last 等，Theor. App 1. Genet. 81 :581-588,1991)、MAS(Velten 等， Embo J. 3 :2723-2730,1984)、小麥組蛋白(L印etit e 等，MoI. Gen. Genet. 231 :276-285, 1992)和 Atanassova 等，Plant Journal 2 J91-300，1992)、甘藍型油菜 ALS3 (國際專利申請第WO 97/412 號)的基因的啟動子；多種土壤桿菌屬基因的啟動子(見美國專利第 4，771，002 ；5，102，796 ；5，182，200 ；和 5，428，147 號)。用于植物的合適誘導型啟動子包括響應銅的ACEI系統的啟動子(Mett等，Proc. Natl. Acad. Sci. 90 :4567-4571,1993)；小麥的兩個響應苯磺酰胺滅草安全劑的基因的啟動子(美國專利第 5，364，780 號和 Gatz 等，MoI. Gen. Genet. 243 :32-38,1994)和 TnIO 的 Tet 抗體的啟動子(Gatz et al.，MoI. Gen. Genet. 227 :229-237,1991)。根據一個實施方案，用于植物的啟動子是響應于植物通常不響應的誘導劑的啟動子。這種類型的示例誘導型啟動子是類固醇激素基因的誘導型啟動子，其轉錄能力受到糖留激素Gchena等，Proc. Natl. Acad. Sci. 88 :10421,1991)或用于被雌二醇激活的雌激素受體誘導型植物表達系統的嵌合轉錄激活因子XVE應用(Zou等，Plant J. 24265-273，2000)的誘導。其它的用于植物的誘導型啟動子在歐洲專利第332104號、國際公布第WO 93/21334和WO 97/06269號中進行了描述，在 Lenk Trends Plant ki.，3 :352_358，1998，以及 hu 和 Chua，Curr. Opin. Biotechnol.，11 :146-151,2000 中進行了討論。最后，可使用由其它啟動子的部分構成的啟動子和部分或完全合成的啟動子。見， 例如Ni等，Plant J. 7 :661_676，1995，和國際公布第WO 95/14098號，其描述了這樣的用于植物的啟動子。啟動子可包括，或被改良從而包括一個或多個增強子元件。優選，啟動子包括多個增強子元件。含有增強子元件的啟動子與不包括它們的啟動子相比提供更高的轉錄水平。適合用于植物的增強子元件包括PCISV增強子元件(美國專利第5，850，019號)、 CaMV35S增強子元件(美國專利第5，106，739和5，164，316號)和FMV增強子元件(Maiti 等，Transgenic Res.，6 :143_156，1997)。還見，國際公布第 WO 96/23898 號 Enhancers andEukaryotic Expression(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1983)。為了有效表達，編碼序列還優選可操作地連接到3’非編碼序列。3’非編碼序列包括轉錄終止序列和聚腺苷酸序列。3’非編碼序列可從土壤桿菌屬、植物病毒、植物和其它真核生物的側翼區獲得。適合用于植物的3’非編碼序列包括花椰菜花葉病毒35S基因、菜豆蛋白種子儲藏蛋白基因、豌豆核酮糖1，5- 二磷酸羧化酶小亞基E9基因，小麥7S儲藏蛋白基因、章魚堿合成酶基因和胭脂堿合成酶基因的。也可以使用5’非編碼前導序列。5’非編碼前導序列是從5’帽位點延伸至翻譯起始密碼子的mRNA的部分。mRNA的這部分區域對于植物的翻譯起始是必須的，并且在調控基因表達中起到作用。適合用于植物的5’非編碼前導序列包括苜蓿花葉病毒、黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因和煙草花葉病毒的。DNA構建體可以為載體。載體可包含一個或多個復制系統，其可以使載體在宿主細胞中復制。自我復制的載體包括質粒、黏粒和病毒載體。或者，載體可以為整合載體，其可以將編碼除草劑抗性基因產品的DNA序列整合到宿主細胞的染色體中。理想的是載體還具有插入DNA序列的獨特的限制性酶切位點。如果載體不具有獨特的限制性酶切位點，它可以被改良從而引入或去除限制性酶切位點從而使其更適合于進一步的操作。適合用于表達當在植物中表達時產生除草劑抗性的核酸的載體包括，但是不限定于 pM0N979、pM0N977、pM0N886、pCaMVCN 禾Π Rogers 等，Meth. Enzymo 1.，153 253-277， 1987描述的來源于農桿菌腫瘤誘導(Ti)質粒的載體。核酸被插入到載體中，這樣它就可操作地連接到合適植物活性啟動子。適合用于核酸的植物活性啟動子包括，但是不限定于 CaMV35S、ACTJN, FMV35S、NOS和PCSLV啟動子。可使用多種已知的方法將包含核酸的啟動子插入到植物細胞中。例如，植物細胞的DNA轉化包括，但是不限定于農桿菌介導的植物轉化、原生質體轉化、電穿孔、基因轉移到花粉、注射入生殖器、注射入未成熟的胚和粒在粒子轟擊。在美國專利第.5，756，290號中更充分地描述了這些方法，在美國專利第6，153，812 號和引用的參考中描述了對小麥尤其有效的方法。還可以使用位點特異性重組系統從而減少拷貝數量和核酸在棉花植物基因組中的隨機整合。例如，Cre/lox系統可被用于植物細胞的直接的LOX位點特異性重組。至少在Choi等，Nuc. Acids Res. 28 :B19，2000)中可見到該方法。已發展了多種植物轉化的方法，包括生物的和物理的植物轉化方法。見，例如 ((Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology))中的((Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants)),Glick,B. R.禾口Thompson，J· E· Eds· (CRC Press， Inc. , Boca Raton，1993)pp. 67-88。此外，已有植物細胞或組織轉化和植物再生的表達載體禾口體夕卜培養方法。見，例如 Gruber 等，《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology〉〉中的〈〈Vectors for Plant Transformation))inGlick, B. R. and Thompson, J.E.Eds· (CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)pp。89-119。可使用傳統的育種技術將已經通過使用轉化技術被設計到特殊小麥植株中的遺傳性狀轉移到另外一個品系中，這樣的育種技術在植物育種領域中是熟知的。例如，回交法可被用于將轉基因從被轉化的小麥植株轉移到優良小麥品種中，產生的后代包含轉基因。通過轉化引入具有農藝價值的轉基因農藝性狀基因可在轉化植物中表達。例如，可通過基因工程改造植物從而表達多種具有農藝價值的表型，或者可通過育種用具有轉基因的植株將轉基因引入植物。通過小麥的轉化，可調控基因的表達從而增強抗病性、抗蟲性、除草劑抗性、水脅迫和農藝性狀以及作物品質性狀。轉化還可被用于插入控制或有助于控制雄性不育的DNA序列。小麥的天然的或非天然的DNA序列可被轉化到小麥中并且被用于調控天然的或非天然蛋白質的水平。基于調控蛋白質表達的目的，反義技術、多種啟動子、目標序列、增強序列和其它的DNA 序列可被插入到小麥的基因組中。涉及此方面的示例基因包括，但是不限定于以下類別。1.產生抗蟲性或抗病性的基因(A)植物的防御通常被植抗病性基因(R)的產物與病原體相應的無毒(Avr)基因的產物之間的相互作用激活。可以以克隆的抗性基因轉化植物品種基因，將其改造成對特定病原菌具有抗性的植物。見，例如Jones等，Science 266 :789 (1994) (cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance toCladosporium fulvum) ；Martin 等，Science 262 1432(1993)(tomato Pto genefor resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato encodes a protein kinase) ；Mindrinos 等，Cell 78 :1089,1994(Arabidopsis RSP2gene for resistance toPseudomonas syringae)。赤霉病以及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇都是由病原體造成的。鐮刀菌已對小麥生產造成毀滅性損失。具有抗真菌作用的基因表達蛋白可以轉基因被用于防止赤霉病。已鑒定了多種類別的蛋白質。實施例包括內切幾丁質酶、外切幾丁質酶、葡聚糖酶、硫堇、類甜蛋白、滲透蛋白、核糖體失活蛋白、黃酮、抗菌肽。在感染鐮刀菌的過程中，產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。證實脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的產生提高病害的毒力。 已將具有消除脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒性的特性的基因(Adam和Lemmens，InInternational Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions,1996 ；McCormick 等.App1. Environ. Micro. 65 :5252-5256,1999)進行基因工程用于小麥。已識別了與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇競爭的合成肽(Yuan等，Appl. Environ. Micro. 65 :3279-3286,1999)。改變宿主的染色體，從而它們降低對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的親和力，這也已被用于降低鐮刀菌的毒性。 用于幫助降低赤霉病的基因包括，但是不限定于Τ \01 (鐮刀霉)、PDR5 (酵母)、tip-1 (燕麥)、tip_2 (燕麥)、leaftip-l (小麥)、tip (水稻)、tip_4 (燕麥)、內切幾丁質酶、外切幾丁質酶、葡聚糖酶(鐮刀霉)、permatin (燕麥)、種子hordothionin (大麥)、α -硫堇(小麥)、酸葡聚糖酶(苜蓿)、幾丁質酶(大麥和水稻)、β 11-1，3-葡聚糖酶(大麥)、冊5/ tip(擬南芥)、抗真菌蛋白(玉米)、1類型RIP(大麥)、NPR1(擬南芥)、乳鐵蛋白(哺乳動物)、乙二酰-CoA脫羧酶(細菌)、IAP(桿狀病毒)、ced-9(線蟲)和葡聚糖酶(水稻和大麥)。(B)提供抗蟲性，如小麥癭蚊、小麥稈軟伏(wheat stem soft fly)、殼葉甲蟲和/ 或綠蝽的基因，例如H9、HlO和H21基因。(C)提供抗病性的基因，包括小麥銹病、小麥葉斑病病原菌、小麥穎斑病病原菌、白粉病、孺孢病、黑粉病、小麥腥黑穗病、鐮刀菌病、細菌病害和病毒病害。(D)蘇云金芽孢桿菌蛋白、其衍生物或以其為模型的合成多肽。見，例如Geiser 等，Gene 48 109 (1986)，其公開了 Bt δ -內毒素基因。此外，可從美國模式培養物保藏所 ATCC購買編碼Bt δ -內毒素基因的DNA分子(Manassas, Va.)，例如以ATCC登錄號40098、 67136,31995 和 31998。(E)昆蟲特異性激素或信息素，如蛻皮和保幼激素，其變體，基于其的模擬物，或其拮抗劑或激動劑。見，例如Hammock等，Nature 344 :458，1990公開的克隆的保幼激素酯酶的桿狀病毒表達，保幼激素的滅活劑。(F)昆蟲特異性肽或神經肽，其通過表達破壞感染的昆蟲的生理。例如，見，Regan， J.Biol Chem. 269 9,1994 (表達克隆得到的編碼昆蟲利尿激素受體DNA)，和I^ratt等， Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 :1243,1989(甲蟲蟑螂中識別的昆蟲神經肽咽側體抑制激素)。還見Tomalski等的美國專利第5，266, 317號，其公開了編碼昆蟲特異性麻痹神經
ο(G)造成單萜烯、倍半萜烯、留類化合物、用羥肟酸、苯丙類衍生物或其它的具有殺蟲活性的非蛋白分子超積累的酶。(H)參與修飾生物活性分子的酶，包括翻譯后修飾；例如，糖解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酶、環化酶、轉氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質酶、葡聚糖酶，無論是天然或合成的。見以kott等名義的PCT申請WO 93/02197， 其公開了胼胝質酶基因的核酸序列。例如可從ATCC以登錄號39637和67152獲得含有幾丁質酶編碼序列的 DNA分子。還可見Kramer 等，Insect Biochem. Molec. Biol. 23 :691 (1993)， 其傳授了編碼鉤蟲煙草幾丁質酶的cDNA的核酸序列，和Kawalleck等，Plant Molec. Biol 21 673,1993，其提供了西芹ubi4_2泛素的核酸序列。(I)激活信號轉導的分子。例如，見 Botella 等，Plant Molec. Biol. 24 =757,1994 公開的綠豆鈣調蛋白cDNA克隆的核酸序列，和Griess等，PlantPhysiol. 104 :1467，1994， 其提供了玉米鈣調蛋白cDNA克隆的核酸序列。(J)疏水力矩蛋白。見PCT申請W095/16776(公開了抑制植物真菌病害的抗菌肽 Tachyplesin的肽衍生物)和PCT申請W095/18855 (傳授了提供抗病性的合成抗菌肽)，其內容分別通過引用結合到本文中作為參考。(K)膜通道、通道離子載體或通道阻斷劑。例如，見Jaynes等，PlantSci. 89 :43， 1993公開了提供轉基因煙草植物青核菌抗性的抗菌肽裂解肽模擬物的異源表達。(L)病毒侵入蛋白或源于其的復合毒素。例如，病毒外殼蛋白在轉化的植物細胞中的積累賦予對病毒感染和/或外殼蛋白來源的病毒造成的病害發展的抗性，以及相關的病毒。見Beachy等，Ann. Rev. Phytopathol. 28 :451,1990。外殼蛋白介導的抗性已被賦予轉化植物抗苜蓿花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、土豆病毒X、土豆病毒Y、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒。(M)昆蟲特異性抗體或來源于其的免疫毒素。因此，針對于昆蟲腸道的主要代謝功能的抗體可使被作用的酶失活，殺死昆蟲。Cf. Taylor等，Abstract #497，kventh Int' 1 Symposium on Molecular Plant-MicrobeInteractions (Edinburgh, Scotland, 1994 (
單鏈抗體片斷的產生在造成轉基因煙草中的酶失活)。(N)病毒特異性抗體。見，例如Tavladoraki等，Nature 366 :469,1993顯示了表達重組抗體的轉基因植物免予被病毒進攻。(0)由病毒或寄生蟲自然產生的停止發育蛋白。因此，內切α-1，4_多聚半乳糖醛酸酶有助于真菌定殖和通過溶解植物細胞壁homo- α-1,4-半乳糖醛酸酶而使植物營養物質外泄。見 Lamb 等，Bio/Technology 10 :1436,1992。iToubart 等，Plant J. 2 :367,1992 描述了編碼豆科內切多聚半乳糖醛酸酶-抑制蛋白的基因的克隆和特征。(P)由植物自然產生的發育停止蛋白。例如，Logemann等，Bio/Technology 10: 305，1992已顯示了表達對真菌病害具有提高的抗性的大麥核糖體失活基因的轉基因植物。(Q)參與系統獲得抗性(SAR)反應的基因和/或發病相關基因。Briggs，Current Biology,5(2)，1995(R)抗真菌基因(Cornelissen 和 Melchers，Plant Physiol. 101 :709-712,1993 ； Parijs 等，Planta 183 :258-264,1991 ；和Bushnell 等，Can. J. of PlantPath. 20 :137-149, 1998)(S)解毒基因，如煙曲霉毒素、白僵菌素、串珠鐮刀菌素和玉米烯酮以及它們的結構相關衍生物。例如，見美國專利第5，792，931號。(T)半胱氨酸蛋白酶抑制劑。(U)防御素基因。見 W003000863。(V)提供線蟲抗性的基因。見 WO 03/033651 和 Urwin 等，Planta204 :472-479， 1998。2.提供除草劑抗性的基因(A)發現乙酰羥酸合成酶使表達該酶的植物耐受多種類型的昆蟲，其已被引入多種植物中(見，例如Hattori等，MoI Gen Genet 246:419,1995)。其它提供昆蟲耐性的基因包括編碼大鼠細胞色素P4507A1和酵母NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的嵌合蛋白的基因(Siiota等，PlantPhysiol. 106 :17，1994)，谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aono等，Plant Cell Physiol 36 :1687，1995)和各種磷酸轉移酶的基因(Datta等， PlantMoI Biol. 20 :619，1992)。(B)抑制生長點或分裂組織的除草劑，如咪唑啉酮或磺酰脲。這個類別的示例基因編碼突變體 ALS 和 AHAS 酶，例如 Lee 等，EMBO J. 7 1241，1988 和 Miki 等，Theor. Appl. Genet. 80 :449,1990 所描述的。還可見美國專利第 5, 605, 011 ；5，013，659 ；5，141,870 ； 5，767，361 ；5，731，180 ；5，304，732 ；4，761，373 ；5，331，107 ；5，928，937 ；和 5，378，824 號和國際公布WO 96/33270，其通過引用結合到本文中作為參考。
(C)草甘膦(分別由突變體5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSP)和aroA 基因提供的耐性或抗性)或其它的膦化合物，如草銨膦(草丁膦乙酰轉移酶，PAT)和吸水鏈霉菌草丁膦乙酰轉移酶，bar基因)，和吡啶氧基和苯氧基丙酸和六氫化苯(乙酰輔酶A羧化酶抑制劑編碼基因)。見，例如，Shah等的美國專利第4，940，835號公開了 EPSPS —種形式的核酸序列，其能提供草甘膦抗性。在Barry等的美國專利第5，627，061號中表述了編碼EPSPS的基因。在美國專利2002/0062503中，Al Chen等描述了耐草甘膦的小麥植物。 DNA構建體pM0N30139通過轉化被插入到小麥中，其具有EPSPS基因以及其它元件。還可見美國專利第 6，248，876B1 ；5，804，425 ；5，633，435 ；5，145，783 ；4，971，908 ；5，312，910 ； 5，188，642 ；4，940，835 ；5，866，775 ；6，225，114B1 ；6，130，366 ；5，310，667 ；4，535，060 ； 4，769，061 ；5, 633，448 ；5，510，471 ；Re. 36，449 ；RE 37，287E ；和 5，491，288 號；和國際公布 WO 97/04103 ；WO 00/66746 ；WO 01/66704 ；和 W000/66747，其通過引用結合到本文中作為參考。表達編碼草甘膦氧化還原酶酶基因的植物也具有草甘膦抗性，在美國專利第 5，776，760和5，463，175號中進行了更詳細的描述，其通過引用結合到本中作為參考。此外，可通過過量表達編碼草甘膦N-乙酰轉移酶基因可賦予植物草甘膦抗性。例如，見美國申請第 60/244，385 ；60/377，175 和 60/377，719。可以ATCC登錄號39256獲得編碼突變aro基因的DNA分子，在Comai的美國專利第4，769，061號公開了該突變基因的核酸序列。Kumada等的歐洲專利申請第0333033 號和Goodman等的美國專利第4，975，374號公開了谷氨酸合成酶基因的核酸序列，其提供對如L-草胺膦的除草劑的抗性。在Leemans等的歐洲專利第0M2246號中提供了草胺膦-乙酰轉移酶基因的核酸序列。De Greef等，Bio/Technology 7 :61,1989描述了表達編碼草胺膦乙酰轉移酶活性的嵌合，bar基因的轉基因植物。還可見美國專利第 5，969，213 ；5，489，520 ；5，550，318 ；5，874，265 ；5，919，675 ；5，561，236 ；5，648，477 ； 5，646，024 ；6, 177，616B1 ；和5，879，903號，其通過引用結合到本文中作為參考。Vasil等 (Bio/Technology 10 667,1992)報道了通過粒子轟炸和使用bar基因來開發耐受草銨膦的小麥植物。Bar基因的應用還可產生對除草劑雙丙氨磷的抗性。提供對苯氧基丙酸和六氫化苯，如稀禾定和吡氟氯禾靈的抗性的示例基因為Marshall等，Theor. Appl. Genet. 83 435，1992 描述的 Ace I-SUAce 1-S2 和 Ace 1-S3 基因。(D)抑制光合作用的除草劑，如三嗪(psbA和gs+基因)和氰苯(腈水解酶基因)。 Przibilla等，Plant Cell 3 :169，1991描述了通過編碼突變psbA基因的質粒轉化衣滴蟲。 在Malker的美國專利第4，810，648號中公開了腈水解酶基因的核酸序列，以ATCC登錄號 53435,67441 和 67442 可獲得編碼這些基因的 DNA 分子。Hayes 等，Biochem. J. 285 :173， 1992描述了編碼谷胱甘肽-S-轉移酶的DNA的克隆和表達。(E)產生葉綠素必須的原卟啉原氧化酶，其對于所有植物的生存都是必需的。原卟啉原酶成為多種除草劑化合物的目標。這些除草劑還抑制存在的所有不同種類的植物， 造成它們完全的毀壞。在美國專利第6，288，306B1 ；6, 282，837B1和5，767，373 ；和國際公布WO 01/12825中描述了具有改變的原卟啉原活性的耐受這些除草劑的植物的開發，其通過引用結合到本中作為參考。3.賦予或提高糧食品質的基因(A)高分子量的谷蛋白亞基(HMW-GS)的含量。已分離了不同的HMW亞基的基因克隆(Anderson等，In Proceedings of the 7th InternationalWheat Genetics Symposium, IPR, pp. 699-704,1988 ；Shewry 等 In OxfordSurveys of Plant Molecular and Cell Biology,pp. 163-219，1989 ;Shewry等 Journal of Cereal Sci. 15 :105-120,1992)oBlechl 等(J. Plant Phys. 152 :703-707,1998)用編碼改良的HMW-GS的基因轉化了小麥。還可見美國專利第 5,650, 558 ；5，914，450 ；5，985，352 ；6，174，725 ；和 6，252，134，其通過引用結合到本文中作為參考。(B)改良的脂肪酸代謝，例如，通過硬脂酰ACP脫飽和酶的反義基因轉化植物從而提高植物的硬脂酸含量。見 Knultzon 等，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 89 :2624,1992.(C)降低植酸含量，例如引入植酸酶編碼基因可提高植酸的分解，給被轉化植物提供更多的游離磷酸。例如，見Van Hartingsveldt等，Genel27 :87，1993公開了黑曲霉植酸酶基因的核酸序列。還可見美國專利申請第10/255，817和10/042，894號和國際公布WO 99/05298，WO 03/027M3，和WO 02/059324，其通過引用結合到本中作為參考。(D)例如，通過以編碼改變淀粉分支模式的酶的基因轉化植物來實現改良碳水化合物組分。見Siiroza等，J. Bacteriol. 170 810,1988 (變形鏈球菌果糖基轉移酶的核酸序列)Jteinmetz等，MoI. Gen. Genet. 200 :220，1985 (枯草芽孢桿菌6-果糖基轉移酶基因的核酸序列)；Pen等，Bio/Technology 10 :292，1992 (表達地衣芽胞桿菌α -淀粉酶的轉基因植物的產生)；Elliot等，Plant Molec. Biol. 21 :515，1993 (番茄轉化酶基因核酸序列)，Sogaard等，J. Biol. Chem. 268 :22480,1993(大麥α -淀粉酶基因的定點突變)，和 Fisher 等，Plant Physiol. 102 1045，1993 (玉米胚乳淀粉分支酶 II)。4.控制雄性不育的基因(A)在氈層特異啟動子控制下應用化合物N-Ac-PPT引入脫乙酰酶基因(W0 01/29237)。(B)引入多種雄蕊特異啟動子(W0 92/13956，WO 92/13957)。(C)引入芽胞桿菌RNA酶和芽胞桿菌RNA酶抑制劑基因(Paul等，Plant MoI. Biol. 19 :611-622,1992)。5.提供農藝改良、營養改良或工業改良的基因。(A)提高對干旱或高鹽分水條件的水脅迫的耐性。HVAl蛋白屬于3類LEA蛋白，3類LEA蛋白包括其它的成員，如小麥pMA2005、棉花 D-7、胡蘿卜Dc3和油菜pLEA76。這些蛋白質的特征在于Ilmer氨基酸結構域的串聯重復， 其可形成可能的雙染性α-螺旋結構，該結構具有帶有疏水條紋的親水表面。大麥HVAl基因和小麥ΡΜΑ2005基因在核酸水平和預測的氨基酸水平上高度相似。這兩個單子葉基因與棉花D-7基因和胡蘿卜Dc3基因密切相關，它們共用相似的結構基因構成。因此LEA基因表達或LEA蛋白積累與多種植物的耐逆性之間具有聯系。例如，在嚴重脫水的小麥幼苗中， 高水平的3類LEA蛋白的積累與組織的脫水耐受性相關(Ried和Walker-Simmons，1993)。 對水稻的幾種秈稻品種的研究顯示2類LEA蛋白(也稱為脫水素)和3類LEA蛋白在根中的水平與敏感品種相比顯著高于耐鹽品種的。大麥HVAl基因被轉化到小麥種。被轉化的小麥植株對水脅迫表現出耐受性提高(Sivamani et al. Plant Sciencel55 :1-9, 2000, and U. S. Pat. No. 5，981，842.)。(B)另外一個實施例，通過細菌甘露醇-1-磷酸脫氫酶基因來提高甘露醇水平從而提高水脅迫耐性。為了產生具有對付缺水的遺傳基礎的植物，Tarczynski等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :2600,1992 ；WO 92/19731，公開的 No. 12,1992 ；Science 259 :508， 1993)通過土壤桿菌介導的轉化在煙草細胞中引入細菌甘露醇-1-磷酸脫氫酶基因，mtlD。 從這些被轉化煙草細胞再生的轉基因植物的根和葉組織含有多達IOOmM的甘露醇。對照植物不含有可檢測到的甘露醇。為了確定轉基因煙草植株是否對缺水表現出提高的耐受性， Tarczynski等將在有250mM的NaCl的存在下的轉基因植物的生長與非轉化對照植物進行了比較。在接觸250mM的NaCl 30天之后，轉基因植物的重量損失減少，相對于其非轉基因的對照重量提高。作者得出這些轉化煙草植物中的甘露醇有助于細胞水平的缺水耐受性。 還可見美國專利第5，780，709號，和國際公布WO 92/19731，其通過引用結合到本中作為參考。已經發展了多種植物轉化的方法，包括生物的和物理的植物轉化方法。見，例如Miki 等，((Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology)), Glick and Thompson, eds 中的〈〈Procedures for IntroducingForeign DNA into Plants)) (CRC Press, Inc. ,Boca Raton, 1993)pp. 67-88。此外，現有表達載體和植物細胞的體外培養或植物的組織轉化和再生。見，例如 Gruber 等，《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》 Glick, B. R. and Thompson, J.E.Eds·中的〈〈Vectors for Plant Transformation)) (CRC Press, Inc.，Boca Raton,1993)P :89_119。以上所述的轉基因還可通過傳統的育種法使用具有感興趣的轉基因的植物作為一個親本來引入到本發明的耐草甘膦植物中。本發明的耐草甘膦植物的突變本發明的其它實施方案是用突變劑處理本發明的耐草甘膦小麥基因型和通過這樣的突變產生的植物。在IAEA' s Manual on Mutation Breeding (IAEA, 1977)中有關于突變劑和誘變種子或花粉的信息，可在C. F. Konzak，《Wheat and Wheat Improvement》第二版，ed. Heyne, 1987的7B章《Mutations and Mutation Breeding》中找至Ij關于突變育禾中的其它信息。回交轉換本發明的其它實施方案是本發明的耐草甘膦小麥基因型的回交轉換。當通過傳統育種技術(非轉化)引入DNA序列時，進行回交轉換，如回交。無論是天然產生的或轉基因 DNA序列可使用這些傳統的育種技術被引入。通過這些方法轉移的理想性狀包括，但是不限定于營養改良、工業改良、抗病性、抗蟲性、除草劑抗性、農藝改良、糧食品質改良、蠟質淀粉、育種改良、種子生產改良和雄性不育。在K. A. Lucken的《Hybrid Wheat))(《Wheat and Wheat Improvement))ed. Heyne, 1987的pp. 444-452中討論了胞質雄性不育基因、核雄性不育基因、化學雜交劑、雄性不育恢復基因和后面提到的使用的方法。其它性狀基因的實施例包括葉銹病抗性基因(Lr 系列，如 LrI、LrI0、Lr21、Lr22、Lr22a、Lr32、Lr37、Lr41、Lr42、和 Lr43)，赤霉病抗性基因(QFhs. ndsu-3B和QFhs. ndsu_2A)，白粉病抗性基因(Wsml)，普通腥黑穗病抗性基因(Bt-IO)，和小麥條紋花葉病毒抗性基因(Wsml)，小麥雙尾蚜抗性基因(Dn 系列，如DnI、Dn2、Dn4、Dn5)、稈銹病抗性基因(Sr38)，黃銹病抗性基因(Yr系列，如YrI、 YrSD,Yrsu,YrI 7,YrI 5、YrH52)、耐鋁性基因(Alt (BH))，矮桿基因(Rht)，春化基因(Vm)， 小麥癭蚊抗性基因(H9、H10、H21、H29)，糧食顏色基因(R/r)，草甘膦抗性基因(EPSPS)，草銨膦基因(bar、pat)和水脅迫耐性基因(Hval、mtID)。將感興趣的性狀從供體親本轉移到回交親本，在這種情況下，本文公開的小麥植株。單基因性狀可來源于顯性等位基因或隱性等位基因。通過直接選擇與顯性等位基因相聯系的性狀來選擇具有感興趣的性狀的后代。具有通過隱性等位基因轉移的性狀的后代的選擇必須種植和銷售第一回交代從而確定哪個植株攜帶該隱性基因。隱性性狀可能需要連續回交代中的額外的后代測試從而確定感興趣的基因的存在。本發明的另外一個實施方案是發展本發明的耐草甘膦小麥基因型的小麥植株的回交轉換的方法，其涉及與本發明的耐草甘膦小麥基因型之一反復回交。回交的次數可以為2、3、4、5、6或更多，使用的回交的特定數目取決于供體親本的遺傳學和在回交設計中是否使用分子標記。見，例如《Principles of Cultivar Development》，Fehr，ff. R. Ed. (Macmillan PublishingCompany,New York, 1987)pp. 722-723 的《Wheat》，其通過引用結合本文中作為參考。通過使用回交法，所屬領域的一般技術人員可發展具有至少70%、75%、 79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90% 91 92%,93%, 94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的理想的小麥品種的或用于回交的基因型的遺傳概貌。 可通過系譜分析或通過使用遺傳技術，如分子標記或電泳來測量回交轉換中具有的遺傳百分比。在系譜分析中，在與另外一個品系雜交之后平均50 %的起始種質會被傳遞給后代，回交一次之后是75%，回交兩次之后是87. 5%，等等。分子標記也被用于證實和/或確定使用的回交親本。從這種方法發展的回交轉換會與回交親本的相似。可通過表型逐一比較來測量這種相似性，以5%的顯著水平來確定差異和相似。任何這樣的比較都應是在造成被轉移性狀的環境條件下進行。主體衍生品種本發明的另外一個實施方案是任意本發明的耐草甘膦小麥基因型的主體衍生品種。根據UPOV公約規定，主體衍生品種可以通過，例如選擇自然或誘導的突變體，或體細胞無性系變異體，從原始品種的植株選擇變異個體，回交，或通過基因工程轉化獲得。進一步，將任意本發明的耐草甘膦小麥基因型的主體衍生品種定義為其生產必須重復使用這樣的小麥基因型的或主要來源于這樣的小麥基因型的(《International Convention for theProtection of New Varieties of Plants》1991 年 3 月 19 日，修正，V 章，14 文章，5 (c) 部分)·。植物育種本發明還涉及在植物育種中應用本發明的耐草甘膦小麥基因型的方法。這樣的一個實施方案是將本發明的耐草甘膦小麥基因型之一與小麥的其它品種雜交從而產生Fl植株的第一代群體。通過這種方法產生第一代Fl植株群體也是本發明的實施方案。該Fl植株第一代群體應該包含所選的本發明的小麥基因型的一套基本完整的等位基因。所屬領域的一般技術人員可使用育種手冊或細胞學方法來確定這種方式中產生的特定Fl植株，任意這樣的個體植株也包含在本發明中。這些實施方案還包含應用轉基因或回交轉換本發明的耐草甘膦小麥基因型之一來產生第一代Fl植株。本發明的另外一個實施方案是發展后代小麥植株的方法，其包含將本發明的耐草甘膦小麥基因型之一與第二個小麥植株雜交。產生源于本發明的耐草甘膦小麥基因型之一的品系的特殊方法如下。所屬領域的一般技術人員將本發明的耐草甘膦小麥基因型之一與另外一個小麥品種，如優良品種進行雜交。可種植通過該雜交產生的Fl種子從而形成同類群體。Fl種子含有一套選擇的本發明的耐草甘膦小麥基因型的等位基因，和一套另外一個小麥品種的等位基因。Fl基因組由50%的所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型和50%的優良品種構成。種植Fl種子，并且使其自交，從而形成F2種子。平均來說，F2種子會具有 50%的所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型的等位基因和50%的另外一個小麥品種的，但是該群體的多個個體植株具有比例更多的來源于所選的本發明的小麥基因型的等位基因 (Wang J.禾口 R. Bernardo，2000，Crop Sci. 40 :659-665 ；Bernardo, R.禾口 A. L. Kahler，2001， Theor. App 1. Genet 102 :986-992)。種植F2種子，根據表觀觀察和/或性狀測量來選擇植物。選擇表現一個或多個來源于所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型的理想性狀的后代， 如草甘膦耐性，并且分別收獲每個植株。以獨立的行來種植每個植株的F3種子，并且使其自交。收獲選擇的行或行中的植株，單獨脫粒。再次根據表觀觀察和/或測量需要的植株性狀(如草甘膦耐性)來進行選擇。重復種植和選擇過程數次，直到獲得源于所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型的純合小麥植株。該純合小麥植株具有源于所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型的理想性狀，其中的一些性狀未被與所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型的雜交的另外一個原始小麥品種表現出來，而一些由倆各種小麥品種都表現出來，但是目前處于與所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型表現的相同或更高的水平上。這樣獲得的純合小麥植株，平均上其基因的50%來源與所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型，但是該群體的多個個體植株具有的等位基因更大比例地來源于所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型。 可重復雜交、自交和選擇的育種過程從而產生另外一個小麥植株群體，平均來說其基因的 25%來源于所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型，但是該群體的多個個體植株具有的等位基因更大比例地來源于其。本發明的另外一個實施方案是接受了一個或多個來源于本發明的耐草甘膦小麥基因型之一的性狀的純合小麥植株，性狀包括但是不限定于草甘膦耐性。 可以以數種方式來改良前述的實施例，例如可在每一個自交代及逆行那個或不進行選擇， 可在確實的自花授粉過程發生之前或之后進行選擇，或者在所描述的育種過程的任何時間點通過收獲個體麥穗、植株、行或地塊來進行個體選擇。此外，可在該過程的任何步驟中使用雙單倍體育種法。在每一個和任何自交代產生的植株群體也是本發明的實施方案，每個這樣的群體由其基因的50%來源于所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型，其基因的25% 來源于第二輪雜交、自交和選擇中所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型，其基因的12. 5% 來源于第三輪輪雜交、自交和選擇中所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型，等等的植株構成。本發明的另外一個實施方案是獲得來源于本發明的草甘膦小麥基因型的純合小麥植株的方法，該方法是通過將所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型與另外一個小麥品種雜交，并且對Fl種子或Fl植株或通過該雜交的自交獲得任意世代的小麥應用雙單倍體法。此外，本發明還涉及來源于本發明的耐草甘膦小麥基因型的純合小麥植株的方法，該方法是通過將所選的本發明的草甘膦小麥基因型與小麥植株進行雜交，種植后代種子，隨著種植步驟，重復與所選的本發明的耐草甘膦小麥基因型進行雜交或自交1至2次， 1至3次，1至4次，或1至5次。因此，任意和所有的使用本發明的耐草甘膦小麥基因型的方法是本發明的一部分，包括自交、系譜育種、回交、產生雜交植物以及群體雜交。所屬領域的一般技術人員可應用獨特的淀粉譜、分子標記譜和/或育種記錄來鑒定從這些育種法得到的后代品系或群體。
此外，本發明還包含與本發明的耐草甘膦小麥基因型相同的或更高的草甘膦耐性、產量、耐寒性和/或抗倒性的后代。可通過逐一的表型比較來測量這些性狀的表現，以 5%的顯著水平來確定差異或相似性。任意這樣的比較應該在相同的環境條件下進行。通過參考以下的實施例能更好地理解本發明，這些實施例只是要顯示目前所知的操作本發明的最佳模式。也不應認為本發明的范圍限定于其。
具體實施例方式實施例1 通過大量篩選分離的草甘膦抗性突變體2006年，在溫室和大田中，對誘變的小麥植株進行大規模的草甘膦抗性篩選工作 (表1)。在溫室評價中，對用EMS誘變的四個春小麥品種的總計349，000個M2植株進行對草甘膦抗性的評價，噴霧施用和溶液培養都被采用。其中，20個植株耐受草甘膦；但是，以 18oz/A Roundup ULTRA 再次進行檢測，沒有M3后代存活下來。2006年6月，在Pullman， WA的Spillman農場進行了 Louise、Hollis、Tara 2002和Macon的一百五十萬M2植株的大田評價。以草甘膦噴霧M2小麥植株兩次:1)6月2號，60Z/AR0undup ULTRA ；和2)6月 20號，9oz/A Roundup ULTRA 。總共157個M2植株存活(表2)。6月四號，這些假定為耐草甘膦植株被從大田移植到溫室，8月收獲每個自花授粉品系得到的M3。再次以ISoz/ ARoundup ULTRA 測試這些M3植株。其中，74株顯示出不同程度的草甘膦耐性(表1)。具有高存活比例的M3家族中，還根據用于育種工作的雜交親本的適當性將植株歸類。基于作為切實可行的草甘膦抗性候選的考慮，去除了在草甘膦處理之后植物活力弱或生長速率慢的植株。例如，LouiseFRl-04和LouiseFRl_05都具有高存活百分率；但是，LouiseFRl-04 的表型健康正常，而LouiseFRl-05具有不理想的短桿、多葉的外觀，會限制繁殖能力。表1. 2005和2006年在溫室和大田試驗中篩選草甘膦耐性的EMS誘變的M2小麥植株的數量。還有假定的M2存活株的M3后代的再一次測試的數據。
權利要求
1.一種小麥植株或其部分，耐受田間以草甘膦的異丙胺鹽施用的3. 36kg ae/h或更多酸當量的施用量，其中所述的小麥植株沒有外源重組DNA。
2.根據權利要求1所述的小麥植株或其部分，包含單基因突變，對以草甘膦的異丙胺鹽施用的3. 36kg ae/h或更多酸當量產生草甘膦耐性。
3.一種小麥植株或其部分，包含產生草甘膦耐性的突變，其中所述的突變來源于選自由 IGT07002-0、IGT07003-No. 1-0、IGT07005-No. 1-0、IGT07006-0, IGT07011-0-0、 IGT07013-0-0、 IGT07022-0-0、 IGT07027-0-0、 IGT07028-0-0、 IGT07029-0-0、 IGT07030-0-0, IGT07031-0-0、IGT07064-0-0, IGT07073-0-0,IGT07074-0-0, IGT07087-0、 IGT07091-0、IGT07092-0、EGTO7073-0、EGT07081-0、EGT07100-0、EGT07111-0、EGT07118-0、 EGT07130-0、EGT07132-0、EGT07138-0、EGT07139-0、EGT07140-0、EGT07143-0、EGT07146-0、 EGT07149-0、EGT07154-0、EGT07155-0、EGT07156-0、EGT07158-0、EGT07162-0、EGT07180-0、 Re-Mut 3. 1 M3 Bulk、Re-Mut 3. 2 M3 Bulk、Re-Mut 3. 3 M3 Bulk、Re-Mut 3. 4 M3 Bulk、 Re-Mut 3. 5 M3 Bulk、Re-MutGTL 3. 4-10, Macon M2 Bulk FR2 1-10, MaconFRl-16 M4 Bulk、MaconFR3-l M2、TaraFRl_15_57、TaraFRl_15_94、TaraFRl_20_2、Tara 0. 4. U Tara 0. 4. 2、Tara 0. 4. 3、Tara 0. 4. 4、Tara 0. 4. 5、Tara 0. 4. 6、Alpowa M2Bulk FR2 1-32、 Louise M2 Bulk FR2 1—45、Louise Double Mutated M2 BulkFR2 1—13、Louise FR3-U Louise FR1-33-6、Louise FR1-42、LouiseFRl-43、Louise FR1-62、Louise FR1-65-2 禾口 Hollis FR1-9-14和它們的后代組成的組中的耐草甘膦小麥基因型。
4.根據權利要求3所述的小麥植株或其部分，其中所述的小麥植株耐受大田中以草甘膦的異丙胺鹽施用的0. 84kg ae/h或更多酸當量的施用量。
5.根據權利要求3所述的小麥植株或其部分，其中所述的小麥植株耐受大田中以草甘膦的異丙胺鹽施用的1. 68kg ae/h或更多酸當量的施用量。
6.根據權利要求3所述的小麥植株或其部分，其中所述的小麥植株耐受大田中以草甘膦的異丙胺鹽施用的2. 52kg ae/h或更多酸當量的施用量。
7.根據權利要求3所述的小麥植株或其部分，其中所述的小麥植株耐受大田中以草甘膦的異丙胺鹽施用的3. 36kg ae/h或更多酸當量的施用量。
8.根據權利要求3所述的小麥植株或其部分，其中所述的突變是隱性突變。
9.根據權利要求3所述的小麥植株或其部分，包含至少兩個不同的產生草甘膦耐性的突變，其中所述的至少兩個不同的突變中的至少一個來源于所述的耐草甘膦小麥基因型。
10.根據權利要求9所述的小麥植株或其部分，其中所述的至少兩個不同的突變中的每一個均來源于所述的耐草甘膦小麥基因型。
11.根據權利要求9所述的小麥植株或其部分，其中所述的至少兩個不同的突變是不同的小麥基因的突變。
12.根據權利要求3所述的小麥植株或其部分，包含選自由雄性不育，對草甘膦以外的除草劑的抗性、抗蟲性、抗病性；蠟質淀粉；改良的脂肪酸代謝，改良的植酸代謝，改良的碳水化合物代謝，改良的蠟質淀粉含量，改良的面筋含量和改良的水脅迫耐性組成的組中的性狀。
13.根據權利要求12所述的小麥植株或其部分，包含抗病性性狀。
14.根據權利要求13所述的小麥植株或其部分，包含對絲核菌根腐病的抗性。
15.一種根據權利要求3所述的的小麥植株的種子。
16.一種根據權利要求15所述的純育種子。
17.一種小麥植株或其部分，通過種植根據權利要求15所述的種子產生。
18.一種小麥植株或其部分，具有根據權利要求3所述的小麥植株的所有生理和形態特征。
19.一種產生耐草甘膦植物的方法，包含(a)將選擇的小麥品種的植株與根據權利要求3所述的耐草甘膦小麥植株進行雜交，從而產生多個后代；(b)選擇耐草甘膦的后代。
20.根據權利要求19所述的方法，包含；(a)將權利要求3所述的耐草甘膦小麥植株的種子生長的植株與所述的選擇的小麥品種的植株進行雜交產生Fl后代植株；(b)選擇具有所述的耐草甘膦性狀的Fl后代植株；(c)將所述的選擇的Fl后代植株與所述的選擇的小麥品種的植株雜交產生回交后代植株；(d)選擇具有所述的耐草甘膦性狀和所述的選擇的小麥基因型的生理和形態特征的回交后代植株，從而產生選擇的回交后代植株；和(e)連續重復步驟(c)和(d)三次或更多次從而產生選擇的第四或更高的回交后代植株，所述回交后代植株包含當在相同的環境條件下生長時以5 %顯著水平確定的耐草甘膦性狀和所述的選擇的小麥基因型的所有生理和形態特征。
21.根據權利要求19所述的方法，包含(a)將權利要求3所述的耐草甘膦小麥植株的種子生長出的植株與所述的選擇的小麥品種的植株進行雜交產生Fl后代植株，其中所述的選擇的小麥品種包含所需的性狀；(b)選擇具有所述的所需性狀的Fl后代植株，從而產生選擇的Fl后代植株；(c)將所述的選擇的后代植株與所述的耐草甘膦小麥基因型的植株進行雜交，從而產生回交后代植株；(d)選擇具有所述的所需性狀和所述的耐草甘膦小麥基因型的生理和形態特征的回交后代植株，從而產生選擇的回交后代植株；和(e)連續重復步驟(c)和(d)三次或更多次，從而產生選擇的第四或更高的回交后代植株，所述回交后代植株包含當在相同的環境條件下生長時以5%顯著水平確定的所述的所需性狀和所述的選擇的小麥基因型的所有生理和形態特征。
22.根據權利要求19所述的方法，其中所述的所需性狀選自由雄性不育、除草劑抗性、 抗蟲性、抗病性和蠟質淀粉組成的組。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述的所需性狀是抗病性性狀。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述的所需性狀是絲核菌根腐病抗性。
全文摘要
本發明提供了通過誘變產生耐草甘膦小麥基因型的方法，通過這種方法產生耐草甘膦小麥植株和相關的組合物和方法。
文檔編號A01H1/06GK102215668SQ200880110385
公開日2011年10月12日 申請日期2008年8月7日 優先權日2007年8月7日
發明者加里·布魯斯·謝爾頓, 卡米爾·瑪麗·斯泰伯, 維克多·路易斯·德馬肯, 艾德麗安·布萊恩·伯克, 金伯利·卡·基德韋爾 申請人:華盛頓州立大學, 由農業部部長代表的美利堅合眾國