專利名稱：：從植物基因組中切除核酸序列的方法從植物基因組中切除核酸序列的方法發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于從植物或植物細胞的基因組切除核酸序列的方法。該方法基于以下步驟用編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶(DSBI)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物品系，實施瞬時測試法以分析該轉(zhuǎn)基因酶的功能性，將該植物品系與含有待切除核酸序列的品系雜交并且進行未成熟胚轉(zhuǎn)換或通過愈傷組織形成進行組織培養(yǎng)再生。該方法也可以反向進行，這意指用編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，并且與含有DSBI的植物品系進行雜交。作為此雜交步驟的備選，也可以進行用第二構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物品系。本發(fā)明也涉及通過這種方法獲得的植物或從這種植物衍生的后代、繁殖材料、部分、組織、細胞或細胞培養(yǎng)物。最后，本發(fā)明涉及從這種方法衍生的植物或后代、繁殖材料、部分、組織、細胞或細胞培養(yǎng)物的用途，用作食物、飼料或種子或用于產(chǎn)生藥物或化學品。
背景技術：
：植物生物技術的目標是產(chǎn)生具備有利的新特性如提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力、改善食品品質(zhì)或用于產(chǎn)生某些化學品或藥物的植物(DunwellJ.M.(2000)J.Exp.Bot.51:487_96)。轉(zhuǎn)基因植物可以由通常涉及導入分別的性狀和選擇標記基因的多種技術(綜述PotrykusI.禾口SpangenbergG編輯(1995)Genetransfertoplants·Springer，桕林)產(chǎn)生。性狀基因或目的基因提供想要的性狀，而選擇標記基因(如除草劑抗性基因)提供在轉(zhuǎn)化過程期間選擇含有所導入DNA的植物的一種手段。一旦已經(jīng)鑒定到轉(zhuǎn)化植物，該選擇標記基因一般不提供有用功能。選擇標記基因的持續(xù)存在成為消費者中不接受這些“基因食品”產(chǎn)品的主要原因。因此，需要開發(fā)這樣的技術，其中借助所述技術可以從植物基因組中以省時和高效方式切除標記DNA。除了改善公眾接受度之外，去除選擇標記可以通過如下方式提高多個性狀組合到單株植物中(性狀堆積)的容易程度，即通過促進用相同的選擇標記再轉(zhuǎn)化或允許多個性狀雜交到單一品系中，同時不導致選擇標記的多重拷貝。技術人員熟悉用于位點定向地除去重組導入的核酸序列的多種系統(tǒng)。一種這樣的系統(tǒng)基于使用序列特異性重組酶(雙鏈斷裂誘導酶或DSBI)和分布于待除去區(qū)域側(cè)翼的所述重組酶的兩個識別序列。DSBI對這種構(gòu)建體的作用引起側(cè)翼序列切除，但具有仍在基因組中保留的所述識別序列之一。描述了多種序列特異性重組系統(tǒng)，如噬菌體Pl的Cre/Iox系統(tǒng)(DaleEC和OwDff(1991)ProcNatlAcadSciUSA8810558-10562；RussellSH等(1992)MolGeneGenet23449-59；OsborneBI等(1995)PlantJ.7，687-701)、酵母FLP/FRT系統(tǒng)(KilbyNJ等(1995)PlantJ8:637_652；LyznikLA等(1996)NucleicAcidsRes24=3784-3789)、Mu噬菌體Gin重組酶、大腸桿菌Pin重組酶或質(zhì)粒pSRl的R/RS系統(tǒng)(OnouchiH等(1995)MolGeneGenet247653-660；SugitaK等(2000)PlantJ.22461-469)。序列特異性重組系統(tǒng)的缺點是反應的可逆性，這就是說，所討論標記序列的切除與整合之間存在平衡。這經(jīng)常因多個連續(xù)插入和切除引起不希望的突變。這不僅對Cre-Iox系統(tǒng)是這樣，對于其他序列特異性重組酶(見上文)也是如此。又一個缺點是這樣的事實，即該重組酶的識別序列之一仍留在基因組中，因而修飾了所述基因組。仍保留的識別序列排除了該重組系統(tǒng)的進一步用途，例如用于第二遺傳修飾，因為不能排除與隨后導入的識別序列相互作用?？赡軐е嘛@著的染色體重排或缺失。鑒定轉(zhuǎn)基因植物品系中雙鏈斷裂(DSB)誘導的同源重組(HR)的常規(guī)方法需要最少約19個月的時間。在i)用編碼DSBI的載體轉(zhuǎn)化植物品系和ii)用編碼待切除序列的載體轉(zhuǎn)化植物品系后，在這兩個植物品系的Ttl至T2世代中鑒定單拷貝純合品系。隨后，將這兩個品系雜交以產(chǎn)生F1品系，并且僅對F2品系分析DSB誘導的HR(見圖9)。發(fā)明詳述本發(fā)明人闡述了一種植物再生新策略的研發(fā)，其中所述的植物再生新策略可以允許縮短獲得DSB介導的修復植物品系、收集比雜交法更多的數(shù)據(jù)(體外組織培養(yǎng)材料對常規(guī)雜交方法)并減少溫室空間和勞動的過程(見圖9)。在本上下文中，本發(fā)明人開發(fā)了用于從植物或植物細胞的基因組切除核酸序列的改良方法。待切除的序列可以是例如標記基因，并且該標記基因可以是例如用于選擇轉(zhuǎn)基因植物的選擇標記基因盒或轉(zhuǎn)基因植物中用于含有性狀這一目的的完整T-DNA區(qū)。本發(fā)明涉及關于建立DSB介導的修復以使用DSBI酶、尤其歸巢核酸內(nèi)切酶(HEN)在植物中切除標記的數(shù)據(jù)。導入的DSB可以優(yōu)選地通過同源重組(HR)、非同源的末端連接(NHEJ)、精確連接(PL)或其他機制修復，從而完全切除目的序列。本發(fā)明因而涉及用于從植物或植物細胞的基因組切除核酸序列的方法，該方法包括a)用編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，b)從步驟a)的細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物品系，c)用步驟b)的植物品系或其細胞或部分實施瞬時測試法以分析該轉(zhuǎn)基因DNA雙鏈斷裂誘導酶的功能性，d)將步驟b)的植物品系與含有待切除核酸序列的植物品系雜交，其中待切除的核酸序列包含對步驟a)的酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中待切除的核酸序列在兩側(cè)鄰接了允許DNA修復機制的重復序列，和e)進行未成熟胚轉(zhuǎn)換或通過愈傷組織形成進行組織培養(yǎng)再生。優(yōu)選地，步驟d)的DNA修復機制是同源重組。術語“DNA雙鏈斷裂誘導酶”(DSBI)—般是指能夠在雙鏈DNA中以序列特異性方式在一個或多個識別序列或識別位點處產(chǎn)生雙鏈斷裂的全部那些酶。DNA斷裂或切割可以產(chǎn)生DNA的平末端或所謂"粘性"末端(具有5’-或3’-突出端)。切割位點可以位于該酶的識別序列內(nèi)部或外部。優(yōu)選地通過同源序列或“重復”序列之間應當由雙鏈斷裂誘導的同源重組實現(xiàn)從植物或植物細胞的基因組中后續(xù)切除該核酸序列。一般方法例如在W003/004659中披露。適合誘導雙鏈斷裂的多種酶是本領域已知的。以下DSBI以舉例而非限制的方式提到1)限制性核酸內(nèi)切酶(例如II型)，優(yōu)選地是如本文中詳細描述的歸巢核酸內(nèi)切酶。2)重組酶(例如，Cre/lox；R-RS；FLP/FTR)。3)轉(zhuǎn)座酶，例如P元件轉(zhuǎn)座酶(KaufmanPD禾口RioDC(1992)Cel169(1)27-39)或AcDs(XiaoYL和PetersonT(2000)MolGenGenet263(l):22_29)。原則上，全部轉(zhuǎn)座酶或整合酶是合適的，只要它們具有序列特異性(HarenL等人，(1999)ArmuRevMicrobiol.1999；53245-281；BeallEL,RioDC(1997)GenesDev.11(16):2137_2151)。4)如本文中描述的嵌合核酸酶。5)在免疫系統(tǒng)中誘導雙鏈斷裂的酶，如RAG1/RAG2系統(tǒng)(AgrawalA等人，(1998)Nature394(6695):744_451)。6)II類核酸內(nèi)切酶或第II類內(nèi)含子核酸內(nèi)切酶。對內(nèi)含子序列的修飾允許第II類內(nèi)含子實際上指向雙鏈DNA中的任意序列，其中第II類內(nèi)含子可以隨后通過逆剪接機制插入(Mohr等人，(2000)Genes&Development14:559_573；Guo等人，(2000)Science289452-457)。在這個逆剪接機制期間，雙鏈斷裂被導入靶DNA，切除的內(nèi)含子RNA切割有義鏈，同時第II類內(nèi)含子核酸內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)部分水解反義鏈(Guo等人，(1997)EMBOJ166835-6848)。若僅想要誘導雙鏈斷裂，而不實現(xiàn)徹底的逆剪接，這一點是本發(fā)明中優(yōu)選的情形，則可能求助于例如缺乏逆轉(zhuǎn)錄酶活性的第II類內(nèi)含子核酸內(nèi)切酶。盡管這不能防止雙鏈斷裂產(chǎn)生，但逆剪接機制不能推進至完成。優(yōu)選地，以這樣的方式選擇DSBI，從而其相應的識別序列即便存在，也極少地存在于靶植物生物的未修飾基因組中。理想地，該識別序列在基因組中的僅有的一個拷貝(或多個拷貝)是在待切除核酸內(nèi)部包含的一個序列或多個序列，因而消除了當表達DSBI時，切除或重排此基因組中其他DNA的可能性。術語“表達”指基因產(chǎn)物的生物合成。例如，在結(jié)構(gòu)基因的情況下，表達涉及結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA并且-任選地-隨后mRNA翻譯成一種或多種多肽。術語“基因組”或“基因組DNA”指宿主生物的可遺傳基因信息。所述基因組DNA包含細胞或生物的完整遺傳物質(zhì)，其中所述的遺傳物質(zhì)包括細胞核的DNA(染色體DNA)、染色體外DNA和細胞器(例如線粒體和質(zhì)體如葉綠體的)DNA。優(yōu)選地，術語“基因組”或“基因組DNA”指細胞核的染色體DNA。術語“染色體DNA”或“染色體DNA序列”將理解為獨立于細胞周期狀態(tài)的細胞核基因組DNA。染色體DNA因而可能在染色體或染色單體中組織起來，它們可能是濃縮或解螺旋的。向染色體DNA中的插入可以通過本領域已知的多種方法例如聚合酶鏈反應(PCR)分析、DNA印跡分析、熒光原位雜交(FISH)和原位PCR進行展示和分析。用于選擇合適DSBI的一個標準是該酶相應識別序列的長度。該識別序列具有允許稀有切割(或DSB)、更優(yōu)選僅在本發(fā)明DNA構(gòu)建體中所包含的識別序列處切割的適宜長度。從統(tǒng)計的觀點看，決定該識別序列最小長度的一個因素是宿主植物的基因組大小。在一個優(yōu)選的實施方案中，該識別序列具有至少10堿基對、優(yōu)選地至少14堿基對、更優(yōu)選至少16堿基對、特別優(yōu)選至少18堿基對、最優(yōu)選至少20堿基對的長度。切割10堿基對識別序列的DSBI酶在HuangB.等人，(1996)JProteinChem15(5):481_9中描述。合適的酶不僅有天然酶，還有人工酶。優(yōu)選的酶是其識別序列已知并且可以以其蛋白質(zhì)形式(例如通過純化)獲得或使用其核酸序列表達的全部那些DSBI酶。特別優(yōu)選在特定植物的基因組序列中除了在待切除的核酸中存在的識別序列之外，沒有或還僅有少數(shù)識別序列的那些酶。這避免在該基因組中不希望的基因座處的其他雙鏈斷裂。這是為何非常特別優(yōu)選歸巢核酸內(nèi)切酶的原因(綜述BeifortM.和RobertsR.J.(1997)NucleicAcidsRes253379-3388；JasinΜ.(1996)TrendsGenet.12224-228；Internet:http://rebase.neb.com/rebase/rebase.homing,html)。因所述Sl白勺長識別序列，它們在大多數(shù)情況下在真核生物的基因組DNA中沒有或僅有少數(shù)其他識別序列。編碼歸巢核酸內(nèi)切酶的序列可以例如從衣藻的葉綠體基因組分離(TurmelM等人，(1993)JMolBiol232:446-467)。它們是小分子蛋白(通常18至26kD)并且其可讀框(ORF)具有直接適合在真核生物中胞核表達的“密碼子使用”(MormatR.J.Jr等人，(1999)BiochemBiophysResCom255:88_93)。特別優(yōu)選分離的歸巢核酸內(nèi)切酶是歸巢核酸內(nèi)切酶I-SceI(W096/14408)、I-SceII(SarguielB等人，(1990)NucleicAcidsResl8:5659-5665)、I-SceIII(SarguielB等人，(1991)MolGenGenet.255:340_341)、I-Ceul(Marshall(1991)基因104:241_245)、I-Crel(WangJ等人，(1997)NucleicAcidsRes253767-3776)、I-ChuI(CoteV等人，(1993)Gen129:69_76)、I-TevI(Chu等人，(1990)ProcNatlAcadSciUSA873574-3578；Bell-Pedersen等人，(1990)NucleicAcidsRes18:3763_3770)、I_TevII(Bell-Pedersen等人，(1990)NucleicAcidsRes18:3763-3770)、I-TevIII(Eddy等人，(1991)GenesDev.5:1032-1041)、內(nèi)切SceI(Kawasaki等人，(1991)JBiolChem266:5342_5347)、I-CpaI(TurmelM等人，(1995a)NucleicAcidsRes23:2519-2525)和I-CpaII(TurmelM等人，(1995b)Mol.Biol.Evol.12,533-545)?？梢蕴岬降钠渌麑嵗且韵職w巢核酸內(nèi)切酶，如F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI>I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP>I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-CsmI>I-CvuI>I-CvuAIP,I-DdiI,I_DdiII、I-DirI,I-DmoI,I-HmuI,I-HmuII,I—HspNIP、I-LlaI,I-Msol、I-NaaI,I-Nanl、I-NclIP、1-NgrIP、I-NitI,I-NjaI,I_Nsp236IP、I-PakI,I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI,I-PcuVI,I-PgrIP,1-PobIP、I-PorI,1-PorIIP、1-PpbIP、I-PpoI,I-SPBetaIP、I-ScaI,I-Scel、Ι-SceII、1-SceIII、Ι-SceIV、I-SceV、I-SceVI,I-SceVII、I-SexIP、Ι-SneIP、I-SpomCP、1-SpomIP、1-SpomIIP、I-SquIP、I_Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiS3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAlP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI-Rma43812IP、PI-SPBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII及其組合。酶可以從其來源生物以技術人員熟悉的方式分離，和/或可以克隆其編碼核酸序列。多種酶的序列在GenBank保藏。可以通過舉例方式提到的其他合適的DSBI酶是包含非特異性催化性核酸酶結(jié)構(gòu)域和由鋅指組成的序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合核酸酶(BibikovaM等人，(2001)MolCellBiol.21:289-297)?？梢孕薷倪@些結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)域以適應任何DNA序列。描述了用于制備合適鋅指結(jié)構(gòu)域的合適方法并且是技術人員已知的(BeerliRR等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；97(4)1495-1500；BeerliR.R等人，J.Biol.Chem2000；275(42)32617-32627；SegalD.J.禾口BarbasCF.3rd.，Curr.Opin.Chem.Biol.2000；4(1)34-39；KangJS和KimJS,JBiolChem2000；275(12):8742_8748；BeerliRR等人，ProcNatlAcadSciUSA1998；95(25)14628-14633；KimJS等人，ProcNatlAcadSciUSA1997；94(8):3616_3620；KlugA,JMolBiol1999；293(2):215_218；TsaiSY等人，AdvDrugDelivRev1998；30(1-3):23_31；MappAK等人，ProcNatlAcadSciUSA2000；97(8)3930-3935；SharrocksAD等人，IntJBiochemCellBiol1997；29(12)1371-1387；ZhangL等人，JBiolChem2000；275(43):33850_33860)。在本發(fā)明的一些方面，可以使用分子進化來產(chǎn)生改良的DSBI。編碼候選DSBI酶的多核苷酸可以例如用DNA改組方法修改。DNA改組法是一個遞歸的重組和突變的方法，通過使相關基因的匯集物隨機片段化，隨后通過聚合酶鏈反應樣過程再裝配所述片段進行。見，例如，Stemmer(1994)ProcNatlAcadSciUSA9110747-10751；Stemmer(1994)Nature370:389-391；和US5，605，793、US5，837，458、US5，830，721和US5,811，238。用于修飾DSBI的DNA改組法的備選方案是合理設計。合理設計涉及基于對DNA和/或蛋白質(zhì)相互作用的現(xiàn)有理解而定向突變基因，從而預見了突變的結(jié)果。DSBI酶也可以表達為具核定位序列(NLS)的融合蛋白。這種NLS序列能夠促進運輸?shù)郊毎酥胁⑻岣咧亟M系統(tǒng)的效力。多種NLS序列是技術人員已知的并且尤其由JicksGR禾口RaikhelNV(1995)Annu.Rev.CellBiol.11:155_188描述。對于植物生物，優(yōu)選例如SV40大抗原的NLS序列。由于許多DSBI酶(例如歸巢核酸內(nèi)切酶)的大小是小的，因而實際上不要求有NLS序列。這些酶可能能夠穿過核孔，無需NLS介導的運輸過程。對于本發(fā)明，DNA雙鏈斷裂誘導酶優(yōu)選地選自由歸巢核酸內(nèi)切酶、限制性核酸內(nèi)切酶、II類核酸內(nèi)切酶、重組酶、轉(zhuǎn)座酶和嵌合核酸內(nèi)切酶組成的組。更優(yōu)選地，DNA雙鏈斷裂誘導酶選自由I-SceI、F-Scel、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI、I-CrepsbIP、Ι-CrepsbIIP、Ι-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP,I-CsmI,I-CvuI,I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HspNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI,I-NclIP、1-NgrIP、I-NitI,I-NjaI,I_Nsp236IP、I-PakI,I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI,I-PcuVI,I-PgrIP、1-PobIP、I-PorI,1-PorIIP、1-PpbIP、I-PpoI,1-SPBetaIP、I-Scal、I-SceII、1-SceIII、Ι-SceIV、I-SceV,I-SceVI、I-SceVII、I-SexIP、1-SneIP、I-SpomCP,I-SpomIP、1-SpomIIP、I-SquIP、I_Ssp6803I、I-SthPhiJP,I_SthPhiST3P、I-SthPhiS3bP、I-TdeIP、I-TevI,RTII_TevII、I_TevIII、I-UarAP,I-UarHGPAlP,I-UarHGPA13P,1-VinIP、I-Zbilp、PI-MtuI,PI-MtuHIP、PI-MtuHIIP,PI-PfuI,PI-PfuII,PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI-Rma43812IP、PI-SPBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-Thyl、PI-TliI和PI-TliII組成的組。最優(yōu)選地，DNA雙鏈斷裂誘導酶選自由具有如SEQIDNO26或27或其基本的同源物中所述核苷酸序列的酶組成的組。如本文中所用，術語“氨基酸序列”指一串代表氨基酸殘基的縮寫、字母、字符或詞。氨基酸可以在本文中由其通常所知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的單字母符號指稱。同樣,核苷酸可以由其通常接受的單字母代碼指稱。術語“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因產(chǎn)物”、“表達產(chǎn)物”和“蛋白質(zhì)”在本文基的聚合物或寡聚物。術語“核酸”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其處于單鏈或雙鏈形式、有義或反義形式的聚合物或雜合體。除非另外說明，特定的核酸序列也隱含地包括其保守方式修飾的變體(例如簡并密碼子置換)和互補序列，以及明確指出的序列。術語“核酸”可以代表例如基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸。術語“核苷酸序列”指脫氧核糖核苷酸堿基或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物，通常從5’端閱讀到3’端。它可以具有從僅幾個核苷酸至多個千堿基的任意長度并且包括染色體DNA、自我復制型質(zhì)粒、DNA或RNA的感染性聚合物和主要履行結(jié)構(gòu)作用的DNA或RNA。術語“編碼區(qū)”指被轉(zhuǎn)錄成mRNA并且指導特定蛋白質(zhì)序列翻譯的核酸部分。最終該mRNA以序列特異性方式翻譯以產(chǎn)生特定的多肽或蛋白質(zhì)。稱該編碼區(qū)編碼這種多肽或蛋白質(zhì)。真核生物中，編碼區(qū)在5’側(cè)以編碼起始物甲硫氨酸的核苷酸三聯(lián)體“ATG”為界并且在3’側(cè)以特定終止密碼子(即TAA、TAG、TGA)的3種三聯(lián)體之一種為界。除含有內(nèi)含子之外，基因的基因組形式也可以包括在RNA轉(zhuǎn)錄物中存在的位于序列5’-和3’-末端的序列。這些序列稱作非翻譯區(qū)或UTR;這些UTR位于mRNA編碼區(qū)的5’或3’。5’-UTR可含有能夠控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列如增強子。3’-側(cè)翼區(qū)可以含有這樣的序列，其中所述序列可以提供對于mRNA加工、穩(wěn)定性和/或表達相關的信息，以及指導轉(zhuǎn)錄終止和涉及正確的mRNA加工(包括轉(zhuǎn)錄后切割和聚腺苷酸化)的后續(xù)功能。術語“基因”指與能夠以一些方式調(diào)節(jié)多肽表達的適宜調(diào)節(jié)序列有效連接的編碼區(qū)?；虬―NA中位于編碼區(qū)(可讀框，0RF)之前(上游)和之后(下游)的非轉(zhuǎn)錄和/或非翻譯的調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子、增強子、阻抑物等)，以及根據(jù)需要，在各個編碼區(qū)(即外顯子)之間的間插序列(即內(nèi)含子)。如本文中所用的術語“結(jié)構(gòu)基因”意指轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列，其中所述的mRNA隨后翻譯成作為具體多肽的特征的氨基酸序列。(多核苷酸)“構(gòu)建體”指至少部分地由重組方法產(chǎn)生的核酸。術語“DNA構(gòu)建體”指由脫氧核糖核苷酸組成的多核苷酸構(gòu)建體。該構(gòu)建體可以是單鏈的或優(yōu)選是雙鏈的。該構(gòu)建體可以是環(huán)狀或線狀的。技術人員熟悉多種獲得和產(chǎn)生DNA構(gòu)建體的方式。構(gòu)建體可以通過例如在T.Maniatis，Ε.F.Fritsch禾口J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中、在Τ·J.Silhavy,Μ.L.Berman禾口L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)中、禾口在Ausubel,F.Μ.等人’CurrentProtocolsinMolecular.Biology,GreenePublishingAssoc,andWileyInterscience(1987)中描述的慣用重組和克隆技術制備。當談及雙鏈核酸序列如cDNA或基因組克隆使用時，術語“基本上同源的”或“基本的同源物”指可以在如下文中所述的低嚴格條件下與雙鏈核酸序列的兩條鏈之一或這兩條鏈雜交的任意探針。當談及單鏈核酸序列使用時，術語“基本上同源的”指可以在如下文中所述的低嚴格條件下與單鏈核酸序列雜交的任意探針。如本文中所用，術語“雜交”包括核酸鏈通過堿基配對作用與互補鏈結(jié)合的任意過程(Coombs1994)。雜交和雜交的強度(即核酸之間結(jié)合的強度)受此類因素影響，如核酸之間的互補性程度、所涉及條件的嚴格性、所形成雜合體的Tm和核酸內(nèi)部的G=C比。如本文中所用，術語“Tm”用來指“解鏈溫度”。解鏈溫度是這樣的溫度，在該溫度處雙鏈核酸分子群體的50%解離成單鏈。用于計算核酸Tm的等式是本領域熟知的。如標準參考文獻所示，當核酸在IMNaCl水溶液中存在時，可以通過等式Tm=81.5+0.41(%G+C)計算，簡單估計Tm值[見例如,Anderson禾口Young,QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization(1985)]。其他參考文獻包括考慮結(jié)構(gòu)特征及序列特征以計算Tm的復雜計算法。當談及核酸雜交使用時，低嚴格條件包含這樣的條件，其等同于當使用約100至約1000個核苷酸長度的DNA探針時，在68°C，在由5xSSPE(43.8g/LNaCl,6.9g/LNaH2PO4,H2O和1.85g/LEDTA,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4)、1%SDS、5xDenhardt，s試劑[50xDenhardt，s，每500mL含有5g菲可(400型，Pharmacia)、5gBSA(第V級分；Sigma)]和100μg/mL變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在室溫于包含0.2xSSPE和0.SDS的溶液中洗滌。當談及核酸雜交使用時，高嚴格條件包含這樣的條件，其等同于當使用約100至約1000個核苷酸長度的DNA探針時，在68°C，在由5xSSPEU%SDS,5xDenhardt，s試劑和100μg/mL變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在68°C于包含0.IxSSPE和0.1%SDS的溶液中洗滌。術語“等同”當因涉及目的雜交條件而談及雜交條件時，意指所述雜交條件和目的雜交條件導致具有相同范圍的同源性百分數(shù)(％)的核酸序列雜交。例如，若目的雜交條件導致第一核酸序列與對該第一核酸序列具有80%至90%同源性的其他核酸序列雜交，那么若另外的雜交條件也導致第一核酸序列與對該第一核酸序列具有80%至90%同源性的其他核酸序列雜交，稱這種另外的雜交條件等同于所述目的雜交條件。當談及核酸雜交使用時，本領域熟知可以使用許多等同條件來包含低嚴格條件或高嚴格條件；考慮了這樣的因素，如探針的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和靶的性質(zhì)(0嫩、1嫩、堿基組成、存在于溶液中或被固定等)以及鹽和其他組分的濃度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或缺乏)并且可以變動雜交溶液以產(chǎn)生區(qū)別于、但等同于以上所列條件的低嚴格性或高嚴格性雜交條件。本領域技術人員知道盡管可以優(yōu)選較高的嚴格性以降低或消除非特異性結(jié)合，然而可以優(yōu)選較低的嚴格性以檢測更大數(shù)目的具有不同同源性的核酸序列。DSBI由可以優(yōu)選地是核酸構(gòu)建體的構(gòu)建體編碼。使用包含編碼DSBI酶的核酸的表達盒產(chǎn)生DSBI酶。將該表達盒導入植物細胞或植物。術語“表達盒”-例如當指DSBI酶的表達盒時，還涉及本發(fā)明待表達的任何其他序列時-意指其中待表達的“編碼序列”DNA與引起或調(diào)節(jié)其表達(即轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的至少一個遺傳控制元件有效連接的那些構(gòu)建體。這里，表達可以是例如穩(wěn)定的或瞬時的，組成型或誘導型的。為導入表達盒，技術人員可以借助于多種直接方法(例如轉(zhuǎn)染、粒子轟擊、微量注射)或間接方法(例如用農(nóng)桿菌或病毒感染)，全部這些方法在下文進一步詳述。以下關于表達盒、遺傳控制元件、啟動子、增強子等的詳細說明指編碼DSBI的構(gòu)建體以及可以在本發(fā)明范圍內(nèi)可能被表達的任何其他核酸序列，如待切除的序列、標記基因序列、針對抗生素或除草劑的抗性基因等。用于根據(jù)本發(fā)明方法步驟a)轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體可以是與至少一個遺傳控制元件有效連接的編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶的任意核酸分子。優(yōu)選地，編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶的構(gòu)建體選自由載體、質(zhì)粒、粘粒、細菌構(gòu)建體或病毒構(gòu)建體組成的組。載體是能夠被導入細胞的遺傳構(gòu)建體。存在例如克隆載體、表達載體、基因融合載體、穿梭載體、靶向載體等。若所述構(gòu)建體是載體，則該載體優(yōu)選地選自由PCB系列、pLM系列、PJB系列、pCER系列、pEG系列、pBR系列、pUC系列、M13mp系列和pACYC系列組成的組中的載體。質(zhì)粒是環(huán)狀的DNA雙鏈分子。它可以設計成允許用重組DNA技術克隆和/或表達DNA0粘粒(由CollinsJ.和HohnB.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1978年9月；75(9)4242-6首次描述)是從λ細菌病毒(噬菌體)衍生的載體。它通常含有至少一個或兩個粘性("cos")位點。粘粒的克隆容量高達約47kb。術語“約”在本文中用于指大約、大致、左右和在......范圍內(nèi)。當術語“約”與一個數(shù)字范圍使用時，它通過使界限值延伸高于和低于所述數(shù)值而修飾該范圍。通常，術語“約”在本文中用來修飾高于和低于所述數(shù)值20%以上或以下(更高或更低)、優(yōu)選15%、更優(yōu)選10%并且最優(yōu)選5%變異的數(shù)值。“有效連接”通常理解為意指這樣的排列，其中遺傳控制序列能夠?qū)Υ磉_、例如同時編碼DSBI酶的核酸序列發(fā)揮其功能。在本上下文中，功能可以意指例如控制核酸序列(例如編碼DSBI酶的核酸序列)的表達，即轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。在本上下文中，控制包括例如起始、提高、掌控或抑制表達，即，轉(zhuǎn)錄和(根據(jù)需要)翻譯?？刂瓶梢越酉聛砝缡墙M織和/或時間特異性的。它也可以是誘導型的，例如由某些化學品、脅迫、病原體等誘導。有效連接理解為意指例如啟動子、待表達的核酸序列_在本發(fā)明的情況下例如編碼DSBI酶的核酸序列_和根據(jù)需要的其它調(diào)節(jié)元件例如終止子以如下方式順序排列，以致當核酸序列_例如編碼DSBI酶的核酸序列-表達時，所述調(diào)節(jié)元件的每一種均能夠?qū)崿F(xiàn)其功能。這不一定需要化學意義上的直接連接。遺傳控制序列例如增強子序列也能夠從位于遠距離的位置或甚至從其它DNA分子對靶序列發(fā)揮它們的功能。優(yōu)選的排列是這樣的排列，其中待表達的核酸序列_例如編碼DSBI酶的核酸序列-位于充當啟動子的序列之后，從而這兩個序列彼此共價地連接。啟動子序列與該核酸序列(例如編碼DSBI酶的核酸序列)之間的距離優(yōu)選地小于200堿基對、特別優(yōu)選小于100堿基對、非常特別優(yōu)選小于50堿基對。技術人員熟悉多種旨在獲得這種表達盒的方式。例如，它優(yōu)選地通過充當啟動子的核酸序列與待表達的核苷酸序列(例如編碼DSBI酶的核酸序列)直接融合來制備。有效連接可以通過例如在T.Maniatis，E.F.和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)中、在Τ.J.Silhavy,Μ.L.禾口L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1984)中、禾口在Ausubel,F.Μ.等人，CurrentProtocolsinMolecular.Biology,GreenePublishingAssoc,andWileyInterscience(1987)中描述的慣用重組和克隆技術實現(xiàn)。然而，表達盒也可以用這種方式構(gòu)建，從而例如通過同源重組或通過隨機插入，使待表達的核酸序列(例如編碼DSBI酶的核酸序列)處于內(nèi)源性遺傳控制元件例如啟動子的控制下。這類構(gòu)建體同樣理解為是本發(fā)明目的的表達盒。技術人員知道核酸分子也可以使用鋅指蛋白型人工轉(zhuǎn)錄因子表達(BeerliRR等人，(2000)ProcNatlAcadSciUSA97(4)1495-500)?？梢孕薷倪@些因子以適應任意序列區(qū)并且能夠獨立地表達某些啟動子序列。術語“遺傳控制序列”將在廣泛含義上理解并且指影響本發(fā)明表達盒的存在或功能的全部那些序列。例如，遺傳控制序列確保在生物中的轉(zhuǎn)錄和根據(jù)需要翻譯。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達盒包含待表達的相應核酸序列5’-上游的啟動子和3’-下游的終止子序列作為額外的遺傳控制序列，和根據(jù)需要，還包含其他慣用調(diào)節(jié)元件，在每種情況下，它們均與待表達的核酸序列有效連接。遺傳控制序列在例如“Goeddel；GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)，，或"Gruber禾口Crosby,在MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,CRCPress,BocaRaton,FIa.，編者Glick和Thompson，第7章，89-108”及其中引用的參考文獻中描述。此類控制序列的實例是與誘導物或阻抑物結(jié)合并且因而調(diào)節(jié)核酸表達的序列。除這些新的控制序列之外或取代這些序列之外，在實際的結(jié)構(gòu)基因之前的所述序列的天然調(diào)節(jié)作用仍可以存在，并根據(jù)需要，可以用這樣的方式遺傳地修飾，從而關閉這種天然調(diào)節(jié)作用并增加基因表達。然而，表達盒也可以在結(jié)構(gòu)上更簡單，也就是說在上文提到的基因之前不插入額外的調(diào)節(jié)信號，并且不消除天然啟動子連同其調(diào)節(jié)作用。取而代之的是，以這樣的方式突變該天然控制序列，從而調(diào)節(jié)作用不再發(fā)生并且增加基因表達。這些修飾的啟動子也可以本身位于天然基因之前以提高活性。多種控制序列是適用的，這取決于在本文中更詳細描述的宿主生物或起始生物，其中所述的生物因表達盒或載體的導入而變成基因修飾生物或轉(zhuǎn)基因生物?！稗D(zhuǎn)基因”、“轉(zhuǎn)基因的”或“重組”指由人操作過的多核苷酸或由人操作過的多核苷酸的副本或互補物。例如，包含與第二多核苷酸有效連接的啟動子的轉(zhuǎn)基因表達盒可以包括由于人操作包含該表達盒的分離核酸而對于所述第二多核苷酸為異源的啟動子(例如通過Sambrook等，MolecularCloning-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,(1989)或CurrentProtocolsinMolecularBiology第1-3卷，Johnffiley&Sons,Inc.(1994-1998)中描述的方法)。在另一個實例中，重組表達盒可以包含以這樣方式組合的多核苷酸，從而所述多核苷酸極不可能在自然界中找到。例如，由人操作過的限制性位點或質(zhì)粒載體序列可以分布于側(cè)翼或?qū)幼优c第二多核苷酸隔開。技術人員會認識到可以用許多方式操作多核苷酸并且不限于如本文中描述的實例。當談及細胞時使用的術語“轉(zhuǎn)基因的”或“重組的”指含有轉(zhuǎn)基因的或其基因組已經(jīng)因?qū)朕D(zhuǎn)基因而改變的細胞。當談及組織或植物時使用的術語“轉(zhuǎn)基因的”分別指包含一個或多個這樣細胞的組織或植物，其中所述的細胞含有轉(zhuǎn)基因或其基因組已經(jīng)因?qū)朕D(zhuǎn)基因而改變。轉(zhuǎn)基因細胞、組織和植物可以由幾種方法產(chǎn)生，所述方法包括通過人類干預如通過本文中描述的方法，將包含核酸(通常DNA)的“轉(zhuǎn)基因”導入靶細胞中或?qū)⒃撧D(zhuǎn)基因整合到靶細胞的染色體中。原則上，優(yōu)選的啟動子是能夠控制基因、尤其外來基因在植物中表達的任意啟動14子。優(yōu)選的啟動子是能夠在植物中組成型表達的那些啟動子(Benfey等人，(1989)EMBOJ.8:2195-2202)。優(yōu)選使用的啟動子特別是植物啟動子或從植物病毒衍生的啟動子。尤其優(yōu)選花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄物的啟動子(Franck等人，(1980)Cell21:285-294;Odell等人，(1985)Nature313:810_812；Shewmaker等人，(1985)Virology140:281_288；Gardner等人，1986，PlantMol.Biol.6，221-228)或19SCaMV啟動子(美國專利號5，352，605和WO84/02913)。已知這種啟動子包含轉(zhuǎn)錄效應物的多個識別序列，從而在整體上引起所導入基因的持久和組成型表達(Benfey等人，(1989)EMBOJ8:2195_2202)。又一個合適的組成型啟動子是Rubisco小亞基(SSU)啟動子(美國專利號4，962，028)。合適啟動子的又一個實例是豆球蛋白B啟動子(GenBank登錄號X03677)。其他優(yōu)選的組成型啟動子例如是農(nóng)桿菌胭脂堿合酶啟動子、TR雙重啟動子、農(nóng)桿菌OCS(章魚堿合酶)啟動子、遍在蛋白啟動子(HoltorfS等人，(1995)PlantMolBiol29:637_649)、液泡ATP酶亞基的啟動子或小麥富含脯氨酸的蛋白的啟動子(W091/13991)。表達盒也可以包含誘導型、優(yōu)選化學誘導型啟動子(AoyamaT和ChuaNH(1997)PlantJ11:605_612；CaddickMX等人，(1998)Nat.Biotechnoll6:177_180；綜述=Gatz,AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol1997，48:89_108)，其中借助所述啟動子可以在特定時間點上控制植物中外源基因的表達。同樣可以使用此類啟動子，例如PRPl啟動子(Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、水楊酸誘導型啟動子(W095/19443)、苯磺酰胺誘導型啟動子(EP-A-0388186)、四環(huán)素誘導型啟動子(Gatz等人，(1992)PlantJ.2，397-404)、脫落酸誘導型啟動子(EP-A335528)、水楊酸誘導型啟動子(W095/19443)或乙醇誘導型啟動子(SalterMG等人，(1998)PlantJ16127-132)或環(huán)己酮誘導型啟動子(W093/21334)。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，特別地在誘導型啟動子的控制下表達編碼DSBI酶的核酸。這導致受控的、可掌控的表達和缺失_例如在植物中_，并且避免了由組成型表達DSBI酶所致的任何潛在有害作用。其他優(yōu)選的啟動子是通過生物脅迫或非生物脅迫誘導的啟動子，例如PRPl基因的病原體誘導型啟動子(Ward等人，PlantMolBiol1993，22:361_366)、番茄熱誘導型hsp80啟動子(美國專利號5，187，267)、馬鈴薯寒冷誘導型α-淀粉酶啟動子(W096/12814)或創(chuàng)傷誘導的pinll啟動子(ΕΡ375091)。其他優(yōu)選的啟動子是對花藥、子房、花粉、分生組織、花、葉、莖、根和種子具有特異性的啟動子。受發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子尤其由Baerson等人(BaersonSR,LamppaGK(1993)PlantMolBiol22(2):255_67)描述。尤其優(yōu)選的啟動子是這些啟動子，它們在進行淀粉和/或油類或其前體的生物合成或有利地積累所述產(chǎn)物的組織或植物部分中確保表達。淀粉生物合成的細胞位置是葉的葉綠體或貯藏組織(如種子、果實或塊莖)的淀粉質(zhì)體。在這些器官內(nèi)部，合成過程正是在胚乳細胞或胚的子葉中優(yōu)勢地進行。除上文提到的組成型啟動子之外，優(yōu)選的啟動子因此尤其是種子特異性啟動子，例如菜豆蛋白啟動子(美國專利號5，504，200，BustosMM等，PlantCell.1989；1(9)839-53)、2S白蛋白基因的啟動子(JoseffsonLG等人，(1987)JBiolChem26212196-12201)、豆球蛋白啟動子(ShirsatA等人，(1989)MolGenGenet.215(2):326_331)、USP(未知種子蛋白質(zhì))啟動子(BumleinH等人，(1991)Molecular&GeneralGenetics225(3):459_67)、油菜籽蛋白基因啟動子(美國專利號5，608，152;StalbergK，等人，(1996)L.Planta199:515_519)、蔗糖結(jié)合蛋白啟動子(W000/26388)或豆球蛋白B4啟動子(LeB4；BumleinH等人，(1991)MolGenGenet225121-128;Baeumlein等人，(1992)PlantJournal2(2)233-239；FiedlerU等人，(1995)生物技術(Biotechnology)(NY)13(10)1090-1093)、Ins擬南芥油質(zhì)蛋白啟動子(W09845461)、蕓苔屬(Brassica)Bce4啟動子(W091/13980)。其他合適的種子特異性啟動子是編碼“高分子量麥谷蛋白”(HMWG)、麥醇溶蛋白、分支酶、ADP-葡萄糖焦磷酸酶(AGP酶)或淀粉合酶的基因的那些啟動子。進一步更優(yōu)選的啟動子是在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等中能夠種子特異性表達的那些啟動子。可以有利使用的啟動子是lpt2或Iptl基因的啟動子(W095/15389,WO95/23230)或WO99/16890中描述的啟動子(大麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、谷醇溶蛋白基因、麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、kasirin基因或黑麥堿基因的啟動子)。此外，優(yōu)選作為遺傳控制元件的啟動子是花粉特異性啟動子，例如小白菜(B.campestris)bgpl基因的啟動子(GenBank登錄號X68210；XuH等人，(1993)MolGenGenet239(1-2)58-65；WO94/13809)、稻orysi基因的啟動子(GenBank登錄號AJ012760；XuH等人，(1995)Gene164(2):255_259)、花粉特異性玉米基因ZM13的啟動子(HamiltonDA等人，(1998)PlantMolBiol38(4):663_669；美國專利號5，086，169)、歐洲油菜(B.napus)基因BplO的啟動子(GenBank登錄號:X64257；AlbaniD(1992)PlantJ2(3):331-342;美國專利號6，013，859)和此類啟動子的功能性組合。其他優(yōu)選的啟動子是用于雄性配子中細胞特異性表達的Lcgl啟動子(W099/05281;XUH等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.962554-2558)和AtDMCl基因的啟動子(K1imyukVI等人，(1997)PlantJ11(1):1_14)。其他合適的啟動子是例如塊莖、貯藏根或根的特異性啟動子，例如I類patatin啟動子(B33)、馬鈴薯組織蛋白酶D抑制劑啟動子、淀粉合酶(GBSSl)啟動子或甘薯塊根特異蛋白(sporamin)啟動子，和果實特異性啟動子，例如番茄果實特異性啟動子(EP-A409625)。此外，還合適的啟動子是確保葉特異性表達的那些啟動子?？梢蕴岬降膯幼邮邱R鈴薯胞質(zhì)FBP酶的啟動子(W098/18940),Rubisco(核酮糖_1，5-二磷酸羧化酶)SSU(小亞基)啟動子、馬鈴薯ST-LSI啟動子(Stockhaus等人，(1989)EMBOJ8(9)=2445-2451)或此類啟動子的功能性組合。其他優(yōu)選的啟動子是掌控種子和植物胚中表達的那些啟動子。其他合適的啟動子是例如果實成熟特異性啟動子例如番茄果實成熟特異性啟動子(W094/21794)、花特異性啟動子例如八氫番茄紅素合酶啟動子(W092/16635)或P_rr基因的啟動子(W098/22593)，或者可以有利地使用如EP-A249676中所述的另一種結(jié)節(jié)特異性啟動子。原則上，全部天然啟動子連同其調(diào)節(jié)序列，如上文提到的那些，可以用于本發(fā)明的方法。另外，也可以有利地使用人工啟動子。遺傳控制序列也包括能夠調(diào)節(jié)表達特異性特征的其他啟動子、啟動子元件或最小啟動子。因此，例如，組織特異性表達可以此外因遺傳控制序列而與某些脅迫因素有關地發(fā)生。例如對水脅迫、脫落酸(LamE和ChuaNH(1991)JBiolChem266(26)17131-17135)和熱脅迫(SchofflF等人，(1989)Molecular&GeneralGenetics217(2-3):246_53)描述了此類元件。另外，能夠在其他植物組織或其他生物(例如大腸桿菌(E.coli))中表達的其他啟動子可以與待表達的核酸序列有效連接。適合的植物啟動子原則上是全部上述啟動子。優(yōu)選地，本發(fā)明的啟動子選自由以下組成的組組成型啟動子、發(fā)育依賴性啟動子、植物病毒衍生的啟動子、誘導型啟動子、化學誘導型啟動子、生物脅迫或非生物脅迫誘導型啟動子、病原體誘導型啟動子、組織特異性啟動子、對胚、盾片、胚乳、胚軸、花藥、子房、花粉、分生組織、花、葉、莖、根、種子、果實和/或塊莖具有特異性的啟動子、能夠在包括玉米、大麥、小麥、黑麥和稻在內(nèi)的單子葉植物中進行種子特異性表達的啟動子、超級啟動子和此類啟動子的功能性組合。更優(yōu)選地，啟動子選自由以下組成的組遍在蛋白啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、菜豆蛋白啟動子、35SCaMV啟動子、19SCaMV啟動子、短或長USB啟動子、Rubisco小亞基啟動子、豆球蛋白B啟動子、胭脂堿合酶啟動子、TR雙重啟動子、章魚堿合酶啟動子、液泡ATP酶亞基啟動子、富含脯氨酸的蛋白的啟動子、PRPl啟動子、苯磺酰胺-誘導型啟動子、四環(huán)素-誘導型啟動子、脫落酸-誘導型啟動子、水楊酸-誘導型啟動子、乙醇誘導型啟動子、環(huán)己酮誘導型啟動子、熱誘導型hsp80啟動子、寒冷誘導型α-淀粉酶啟動子、創(chuàng)傷誘導的pinII啟動子、2S白蛋白啟動子、豆球蛋白啟動子、未知種子蛋白啟動子、油菜籽蛋白啟動子、蔗糖結(jié)合蛋白啟動子、豆球蛋白Β4啟動子、油質(zhì)蛋白啟動子、Bce4啟動子、高分子量麥谷蛋白啟動子、麥醇溶蛋白啟動子、分支酶啟動子、ADP-葡萄糖焦磷酸酶啟動子、合酶啟動子、bgpl啟動子、lpt2或Iptl啟動子、大麥醇溶蛋白啟動子、谷蛋白啟動子、水稻素啟動子、谷醇溶蛋白啟動子、麥醇溶蛋白啟動子、谷蛋白啟動子、玉米醇溶蛋白啟動子、kasirin啟動子、黑麥堿啟動子、orysi啟動子、ZM13啟動子、BplO啟動子、Lcgl啟動子、AtDMCl啟動子、I類patatin啟動子、B33啟動子、組織蛋白酶D抑制劑啟動子、淀粉合酶啟動子、GBSSl啟動子、甘薯塊根特異蛋白(sporamin)啟動子、番茄果實特異性啟動子、胞質(zhì)FBP酶啟動子、ST-LSI啟動子、CP12啟動子、CcoMTl啟動子、HRGP啟動子、超級啟動子、與賦予內(nèi)含子介導增強作用(IME)的內(nèi)含子組合的啟動子(優(yōu)選地位于啟動子與“結(jié)構(gòu)”基因(即待表達的序列)之間)和此類啟動子的功能性組合。最優(yōu)選地，該啟動子包含如SEQIDNO6的第1至1112位核苷酸中描述的核酸序列。此外，遺傳控制序列還包括5’_非翻譯區(qū)、內(nèi)含子或基因的非編碼3’區(qū)域。已經(jīng)證實它們可以在調(diào)節(jié)基因表達中發(fā)揮重要作用。因此，已經(jīng)證實5’-非翻譯序列能夠增強異源基因的瞬時表達。另外，它們可以促進組織特異性(RousterJ等人，PlantJ.1998，15:435-440.)。相反，不透明二號基因的5’-非翻譯區(qū)抑制表達。缺失所討論的該區(qū)域?qū)е禄蚧钚蕴岣?LohmerS等人，PlantCell1993，5:65_73)。遺傳控制序列也可以包括用于起始翻譯的核糖體結(jié)合序列。當待表達的核酸序列不提供合適的序列或當它們與表達系統(tǒng)不兼容時，這是特別優(yōu)選的。遺傳控制序列進一步理解為還包括產(chǎn)生融合蛋白的序列，其包含指導蛋白質(zhì)亞細胞定位的信號肽序列。表達盒可以有利地包含與啟動子有效連接的能夠增加核酸序列的轉(zhuǎn)基因表達的一個或多個所謂增強子序列。也可以在待重組表達的核酸序列的3’末端插入額外的有利序列，如其他調(diào)節(jié)元件或終止子。待重組表達的核酸序列的一個或多個拷貝可以存在于基因構(gòu)建體中。適合作為遺傳控制序列的聚腺苷酸化信號是植物聚腺苷酸化信號、優(yōu)選是基本上與來自根癌農(nóng)桿菌的T-DNA聚腺苷酸化信號、尤其Ti質(zhì)粒pTiACHS的T-DNA(章魚堿合酶)中基因3的T-DNA聚腺苷酸化信號或其功能等同物相對應的那些聚腺苷酸化信號(Gielen等，EMBOJ.3(1984)，835etsec·)。特別適合的終止子序列實例是OCS(章魚堿合酶)終止子和NOS(胭脂堿合酶)終止子。如本文中所用的術語“轉(zhuǎn)化”指將核酸分子(例如轉(zhuǎn)基因)導入植物細胞。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化方法選自由農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、生物射彈轉(zhuǎn)化法(基因槍)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇轉(zhuǎn)化粉、電穿孔法、超聲處理法、微量注射法、大量注射法、真空抽濾法、感染法、在含DNA的溶液中孵育干燥胚、滲透壓休克法、二氧化硅/碳纖維法、激光介導的轉(zhuǎn)化法、分生組織轉(zhuǎn)化法(浸花法、真空滲入法)和花粉轉(zhuǎn)化法組成的組。技術人員熟悉的用于轉(zhuǎn)化植物細胞/植物和用于從植物組織或植物細胞再生出植物的方法用于瞬時轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。適用的DNA遞送的直接方法尤其是用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或借助聚乙二醇誘導的DNA攝取而用于完整細胞和組織的那些方法、生物射彈方法如基因槍(“粒子轟擊”方法)、電穿孔法、干胚在含有DNA的溶液中孵育法、超聲處理和微量注射法、組織或胚的微量或大量注射法、組織電穿孔法、干胚在含有DNA的溶液中孵育法或種子的真空滲入法。在將DNA注射或電穿孔到植物細胞中的情況下，所用質(zhì)粒不需要滿足任何特殊要求。可以使用簡單質(zhì)粒如PUC系列的那些質(zhì)粒，進行或不進行線性化。若將從轉(zhuǎn)化的細胞再生完整植物，則質(zhì)粒中存在額外的選擇標記基因是有用的。任意植物組織可以充當靶材料。同樣，表達可以發(fā)生在愈傷組織、胚發(fā)生的組織或體細胞胚中。除了這些“直接”轉(zhuǎn)化技術之外，也可以通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)實施轉(zhuǎn)化。這些菌株含有質(zhì)粒(Ti或Ri質(zhì)粒)。在農(nóng)桿菌感染后，這種質(zhì)粒中稱作T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)的部分轉(zhuǎn)移至植物并整合到植物細胞的基因組中。術語“農(nóng)桿菌”指引起冠癭的土源、革蘭氏陰性、桿狀植物病原性細菌。術語“農(nóng)桿菌”包括但不限于根癌農(nóng)桿菌菌株(其通常在感染的植物中引起冠癭)和發(fā)根農(nóng)桿菌菌株(其在感染植物中引起毛狀根病)。用農(nóng)桿菌感染植物細胞通常引起感染的細胞產(chǎn)生冠癭堿(例如胭脂氨酸、農(nóng)桿堿、章魚堿等)。術語細菌“感染”指目標生物樣品(例如細胞、組織等)與細菌在這樣的條件下共孵育，從而將該細菌中所含的核酸序列導入目標生物樣品的一個或多個細胞。通常，細胞的轉(zhuǎn)化可以是穩(wěn)定或瞬時的。術語“瞬時轉(zhuǎn)化”或“瞬時地轉(zhuǎn)化”指在轉(zhuǎn)基因沒有整合到宿主細胞基因組中的情況下，將一種或多種轉(zhuǎn)基因?qū)爰毎Ｋ矔r轉(zhuǎn)化可以通過例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測，其中所述的酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測由一種或多種轉(zhuǎn)基因編碼的多肽的存在性。備選地，瞬時轉(zhuǎn)化可以通過評估如本文中所示的轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)的活性進行檢測(例如，通過用X-葡糖醛酸糖苷酶染色對GUS酶活性進行組織化學測定，其中所述的X-葡糖醛酸糖苷酶在GUS酶的存在下產(chǎn)生藍色沉淀物；以及使用GUS-光試劑盒(Tropix)對GUS酶活性進行化學發(fā)光測定)。術語“瞬時轉(zhuǎn)化體”指短暫含有一種或多種轉(zhuǎn)基因的細胞，而未將導入的DNA并入其基因組。相反，術語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”或“穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化”指將一種或多種轉(zhuǎn)基因?qū)牒驼系郊毎幕蚪M中，優(yōu)選地導致染色體整合以及經(jīng)受有絲分裂和減數(shù)分裂的穩(wěn)定遺傳性。細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可以在發(fā)生轉(zhuǎn)基因整合到植物基因組的一段時間后，通過細胞的基因組DNA與能夠結(jié)合至一種或多種轉(zhuǎn)基因的核酸序列進行DNA印跡雜交來檢測。備選地，也可以通過擴增轉(zhuǎn)基因序列的細胞基因組DNA的聚合酶鏈式反應檢測細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。術語“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體”指已經(jīng)將一種或多種轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合到基因組DNA中的細胞。因此，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體與瞬時轉(zhuǎn)化體的區(qū)別在于來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的基因組DNA含有一種或多種轉(zhuǎn)基因，但是來自瞬時轉(zhuǎn)化體的基因組DNA不含有轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)化也包括遺傳物質(zhì)以植物病毒載體形式導入植物細胞，涉及可以相對于減數(shù)分裂穩(wěn)定性表現(xiàn)可變屬性的染色體外復制和基因表達。DNA構(gòu)建體可以通過多種常規(guī)技術導入植物培養(yǎng)物或植物器官中的細胞內(nèi)。例如，DNA構(gòu)建體可以使用射彈法如DNA粒子轟擊法直接導入植物細胞，或DNA構(gòu)建體可以使用技術如電穿孔法和細胞微量注射法導入。粒子介導的轉(zhuǎn)化技術(又稱作“生物射彈法”)在例如Klein等人，(1987)Nature32770-73；VasilV等人，(1993)Bio/Techno111:1553-1558；和BeckerD等人，(1994)PlantJ5:299_307中描述。這些方法包括用在小珠或粒子的基質(zhì)內(nèi)部或表面上具有核酸的小粒子穿透細胞。術語“轟擊”和“生物射彈轟擊”指將粒子向目標生物樣品(例如細胞、組織等)加速運動以實現(xiàn)損傷目標生物樣品中細胞的細胞膜和/或使粒子進入目標生物樣品的過程。用于生物射彈轟擊的方法在本領域是已知的(例如US5，584，807)并且是市售的(例如氦氣驅(qū)動的微拋射體加速儀(PDS-1000/He)(BioRad)。生物射彈PDS-1000基因槍(Biorad，Hercules，CA)使用氦氣壓力來使DNA涂覆的金或鎢微載體向靶細胞加速運動。該方法適用于廣泛類型的來自生物(包括植物)的組織和細胞。當提到植物組織時，術語“致微型創(chuàng)傷”指在該組織中導入微型創(chuàng)傷。致微型創(chuàng)傷可以由例如如本文中描述的粒子轟擊法實現(xiàn)。微量注射技術是本領域已知并在科學及專利文獻中充分描述。細胞也可以被化學透化，例如使用聚乙二醇，從而DNA可以通過擴散進入細胞。DNA也可以通過采用含DNA的其它單元如微細胞、細胞、溶酶體或脂質(zhì)體的原生質(zhì)體融合而導入。在Paszkowski等人，(1984)EMBOJ32717中描述了使用聚乙二醇(PEG)沉淀法導入DNA構(gòu)建體?；谥|(zhì)體的基因遞送法例如在WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques6(7)682-691；US5,279,833；W091/06309；和Feigner等人，(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:7413-7414)中描述。導入DNA的另一種合適方法是電穿孔法，其中用電脈沖來可逆地透化細胞。電穿孔法技術在Fromm等人(1985)ProcNatlAcadSciUSA82:5824中描述。在LazzeriP(1995)MethodsMol.Biol.49:95_106中也討論了植物原生質(zhì)體的PEG介導的轉(zhuǎn)化和電穿孔。可以提到的優(yōu)選常用方法是磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染法、陽離子脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、轉(zhuǎn)導和感染。此類方法是技術人員已知的并且在例如Davis等人，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)中描述。用于植物和細胞培養(yǎng)物的基因轉(zhuǎn)移方法的綜述，見，F(xiàn)isk等人，(1993)ScientiaHorticulturae55:5_36和Potrykus(1990)CIBAFoundSymp154:198。用于單子葉植物和雙子葉植物中導入和表達異源基因的方法是已知的。見，例如US5，633，446、US5，317，096、US5，689，052、US5，159，135和US5，679，558；Weising等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22:421_477。單子葉植物的轉(zhuǎn)化尤其可以使用多種技術，包括電穿孔法(例如，Shimamoto等人，(1992)Nature338:274-276)；生物射彈法(例如，EP-A1270,356)和農(nóng)桿菌法(例如，Bytebier等人，(1987)ProcNatlAcadSciUSA.84:5345_5349)。特別地，農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化法目前是單子葉植物中高效的轉(zhuǎn)化方法(Hiei等人(1994)PlantJ6:271-282)。可以使用這種方法在禾谷類植物玉米、稻、小麥、燕麥和大麥中實現(xiàn)能育轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生(綜述見ShimamotoK(1994)CurrentOpinioninBiotechnology5158-162；Vasil等人(1992)Bio/Technology10:667_674;Vain等人(1995)BiotechnologyAdvances13(4)653-671；Vasil(1996)NatureBiotechnology14702；Wan禾口Lemaux(1994)PlantPhysio.104:37-48)。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法低效或無效的情況下，可以優(yōu)選其他方法，如微拋射體或粒子轟擊法(US5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)、電穿孔法(EP-A290395、WO87/06614)、微量注射法(WO92/09696、WO94/00583、EP-A331083、EP-A175966、Green等人(1987)PlantTissueandCellCulture,AcademicPress)、直接DNA攝取法(DE4005152，WO90/12096，US4，684，611)、脂質(zhì)體介導的DNA攝取法(例如Freeman等人(1984)PlantCellPhysiol29:1353)或渦旋混合方法(例如，Kindle(1990)ProcNatlAcadSciUSA871228)。特別地，裸子植物如松柏類的轉(zhuǎn)化可以使用粒子轟擊20技術進行(ClaphamD等人，(2000)ScanJForRes15:151-160)。用于轉(zhuǎn)化植物細胞的物理方法在Oard，(1991)Biotech.Adv.91-11中綜述。備選地，可以使用不同技術的組合來增強轉(zhuǎn)化方法的效率，例如用農(nóng)桿菌涂覆的微粒子轟擊(EP-A-486234)或微拋射體轟擊以誘導創(chuàng)傷，隨后與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)(EP-A-486233)。DSBI酶的表達盒優(yōu)選地整合到特定質(zhì)粒，或整合到穿梭載體或中間載體或整合到雙元載體中。例如，若Ti或Ri質(zhì)粒將用于轉(zhuǎn)化，Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA的至少右邊界，不過在大多數(shù)情況下，所述質(zhì)粒的左邊界和右邊界作為側(cè)翼區(qū)域與待導入的表達盒連接。優(yōu)選使用雙元載體。雙元載體能夠在大腸桿菌和在農(nóng)桿菌中復制。它們含有選擇標記基因和在側(cè)翼具有T-DNA右邊界和左邊界側(cè)翼序列的接頭或多接頭?？梢詫⑺鼈冎苯愚D(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中(Holsters(1978)MolGen.Genet163:181-187)。選擇標記基因允許選擇轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌并且例如是賦予卡那霉素抗性的nptll基因。在此情況下充當宿主生物的農(nóng)桿菌應當已經(jīng)含有帶vir區(qū)的質(zhì)粒。對于T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞中需要vir區(qū)。如此轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌可以用于轉(zhuǎn)化植物細胞。根癌農(nóng)桿菌利用組織培養(yǎng)外植體轉(zhuǎn)化植物的用途已經(jīng)由Horsch等人(HorschRB(1986)ProcNatlAcadSciUSA83(8):2571_2575)、Fraley等人(Fraley等人1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，4803-4807)和Bevans等人(Bevans等人1983，Nature304，184-187)描述。許多根癌農(nóng)桿菌菌株能夠轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)，例如菌株[pEHA101]、EHA105[pEHA105]、LBA4404[pAL4404],C58C1[ρΜΡ90]和C58C1[pGV2260]。菌株EHAlOl[ρΕΗΑΙΟΙ]已經(jīng)由Hood等人(HoodEE等人，(1996)JBacteriol168(3)1291-1301)描述，菌株EHA105[pEHA105]已經(jīng)由Hood等人(Hood等人，1993，TransgenicResearch2,208-218),菌株LBA4404[pAL4404]已經(jīng)由Hoekema等人(Hoekema等人，1983，Nature303,179-181)描述，菌株C58C1[pMP90]已經(jīng)由Koncz和Schell等人(Koncz和Schell1986，MolGen.Genet.204,383-396))描述并且菌株C58C1[pGV2260]已經(jīng)由Deblaere等人(Deblaere等人，1985，Nucl.AcidsRes.13,4777-4788)描述。對于農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以與合適的T-DNA側(cè)翼區(qū)組合并導入常規(guī)的根癌農(nóng)桿菌宿主載體中。當根癌農(nóng)細菌感染細胞時，根癌農(nóng)桿菌對宿主的毒力功能將指導轉(zhuǎn)基因和相鄰標記基因(若存在的話)插入植物細胞DNA。根癌農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化技術在科學文獻中描述。見，例如，Horsch等人(1984)Science233:496-498，F(xiàn)raley等人(1983)ProcNatlAcadSciUSA80:4803-4807，Hooykaas(1989)PlantMolBiol13327-336,HorschRB(1986)ProcNatlAcadSciUSA83(8):2571_2575)，Bevans等人(1983)Nature304:184-187，Bechtold等人(1993)ComptesRendusDeLAcademieDesSciencesSeriesIll-SciencesDeLaVie-LifeSciences316:1194-1199,Valvekens等人(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:5536_5540。除了卸甲Ti質(zhì)粒之外，用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株還包含帶有待轉(zhuǎn)移T-DNA的雙元質(zhì)粒，其中所述的雙元質(zhì)粒通常包含用于選擇轉(zhuǎn)化細胞的基因和待轉(zhuǎn)移的基因。兩種基因必須均配備轉(zhuǎn)錄性和翻譯性起始與終止信號。雙元質(zhì)粒可以由例如電穿孔法或其他轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌菌株中(Mozo和Hooykaas1991，PlantMol.Biol.16，917—918)。植物外植體與農(nóng)桿菌菌株的共培養(yǎng)通常進行2至3日?？赡芑蚩梢允褂枚喾N載體。原則上，可以區(qū)分用于農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化法或農(nóng)桿菌感染法的那些載體，即包含表達盒的那些載體，以表達T-DNA中的DSBI酶，這實際上允許T-DNA穩(wěn)定整合到植物基因組中。另外，可以使用無邊界序列的載體，該載體可以例如由粒子轟擊法轉(zhuǎn)化到植物細胞中，在那里它們可以引起瞬時轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定表達。已經(jīng)深入地研究和描述了T-DNA轉(zhuǎn)化植物細胞的用途(EP120516；Hoekema,TheBinaryPlantVectorSystem,OffsetdrukkerijKantersB.V.,Alblasserdam,第V章；Fraley等人，Crit.Crit.Rev.Plant.Sci，41-46和An等人，EMBOJ.4(1985)，277-287)。多種雙元載體是已知的,其中一些是市售的例如pBmi9(ClontechLaboratories,Inc.USA)。為轉(zhuǎn)移DNA至植物細胞，將植物外植體與根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。從感染的植物材料(例如葉、根或莖部分、及植物細胞的原生質(zhì)體或懸液)開始，使用可以含有例如用于選擇轉(zhuǎn)化細胞的抗生素或殺生物劑的適宜培養(yǎng)基，可以再生出完整植物。隨后可以對所得植物篩選導入的DNA(在這種情況下是本發(fā)明的DSBI酶表達盒)的存在性。一旦DNA已經(jīng)整合到宿主基因組中，則所討論的基因型通常是穩(wěn)定的，并且所討論的插入也存在于后續(xù)世代中。通常，整合的表達盒含有向轉(zhuǎn)化植物賦予針對殺生物劑(如除草劑)或抗生素如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或膦絲菌素等抗性的選擇標記。選擇標記允許選擇轉(zhuǎn)化的細胞(McCormick等人(1986)PlantCellR印orts5:81_84)。所得的植物可以用慣常方式培育和雜交。應當培育兩個或更多個世代以確?；蚪M整合是穩(wěn)定的和遺傳性的。以上提及的方法例如在S.D.Kung和R.Wu編輯的TechniquesforGeneTransfer,在TransgenicPlants,第1卷，EngineeringandUtilization,AcademicPresss(1993)，128-143，禾口在Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225)中描述。優(yōu)選地將待表達的構(gòu)建體克隆到適合轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌例如pBinl9(Bevan等人，Nucl.AcidsRes.12(1984)，8711)的載體中。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化最適合于雙子葉植物細胞，并且已經(jīng)成功地對某些單子葉植物細胞進行優(yōu)化，而直接轉(zhuǎn)化技術適用于任何細胞類型。若選擇標記是所導入DNA的部分，則可以從未轉(zhuǎn)化的細胞選出轉(zhuǎn)化的細胞，即包含整合到宿主細胞DNA中的DNA的那些細胞。標記基因可以是例如能夠賦予針對抗生素或除草劑的抗性的任意基因。表達這種標記基因的轉(zhuǎn)化細胞能夠在殺死非轉(zhuǎn)化野生型的適宜抗生素或除草劑的濃度存在下存活。在上文中描述了多種正選擇和負選擇標記。實例是賦予磺酰脲和咪唑啉酮除草劑抗性的ahas(乙酰羥酸合酶)基因、賦予除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(RathoreKS等人，PlantMolBiol.1993年3月；21(5):871_884)、賦予卡那霉素抗性的nptll基因、賦予潮霉素抗性的hpt基因或賦予除草劑草甘膦抗性的EPSP基因。一旦已經(jīng)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細胞，則可以使用技術人員已知的方法獲得完整植物。例如，使用愈傷組織培養(yǎng)物作為起始材料?？梢栽谶@種仍未分化的細胞生物質(zhì)中以已知的方式誘導幼枝和根形成?？梢詫Λ@得的幼枝在合適的條件下誘導根發(fā)育。所獲得的植物可以隨后體外培養(yǎng)，并種植在土壤中。在用編碼DSBI酶的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞后，從轉(zhuǎn)化的植物細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物品系。這種產(chǎn)生根據(jù)本領域技術人員已知的方法進行。通常，本發(fā)明的步驟b)可以如下進行。為產(chǎn)生含有編碼DSBI酶的基因的完整轉(zhuǎn)基因植物，在含有促幼枝的植物激素(例如細胞分裂素)和還含有選擇劑的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)抵抗化學選擇劑的推定的轉(zhuǎn)基因愈傷組織，取決于所用選擇標記基因而使用D-絲氨酸或咪草煙(Pursuit)。形成的幼枝轉(zhuǎn)移至存在選擇劑、但缺少植物激素的生根培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)基因在所產(chǎn)生的推定的轉(zhuǎn)基因植物基因組中的整合由例行分子技術如DNA印跡分析或PCR分析證實。在下文中將描述通過DSBI酶作用待切除核酸序列的特征。術語“待切除的核酸序列”指任意長度的任意核苷酸序列，其切除或缺失可以因任意原因(例如，賦予改善的品質(zhì))由本領域普通技術人員認為是想要的。此類核苷酸序列包括但不限于結(jié)構(gòu)基因(例如報道基因、選擇標記基因、癌基因、藥物耐藥性基因、生長因子等)的編碼序列和不編碼mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的非編碼性調(diào)節(jié)序列(例如啟動子序列、聚腺苷酸化序列、終止序列、增強子序列等)。優(yōu)選地，待切除序列的長度是至少約10或至少約50堿基對、更優(yōu)選至少約100或至少約500堿基對、特別優(yōu)選至少約1000或至少約5000堿基對并且最優(yōu)選至少約10000或至少約50000堿基對。另外，優(yōu)選地，待切除序列的長度是最大約50000或最大約10000堿基對、更優(yōu)選最大約5000或最大約1000堿基對、尤其優(yōu)選至少約500或至少約100堿基對。那些下限值和上限值可以按照任何適當?shù)姆绞浇M合。待切除的核酸可以最初是一種構(gòu)建體、一種所謂“重組構(gòu)建體”的部分，其中所述的重組構(gòu)建體起到例如轉(zhuǎn)化植物細胞或植物的作用，旨在產(chǎn)生含有待切除核酸序列的植物品系(見本發(fā)明方法的步驟d))。待切除的核酸序列(例如T-DNA區(qū)或其部分，或選擇標記如抗生素抗性或除草劑抗性基因)從植物的基因組中以可預測的方式被缺失或切除。待消除的序列包含位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的至少一個識別序列(例如稀有切割的限制性酶的識別序列)并且在兩側(cè)鄰接重復序列(或“同源”序列)。雙鏈斷裂由適合在識別序列處誘導dna雙鏈斷裂的酶(dsbi酶)誘導，這隨后引起同源序列的同源重組并且因而引起位于所述同源序列之間的任意核酸序列缺失。用于位點定向地誘導dna雙鏈斷裂的識別序列同樣地被缺失。術語“識別序列”指由如上所述DSBI識別的DNA序列。用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的識別序列通常指在所用植物細胞或植物中的條件下，能夠被DSBI酶在每種情況下識別并切割的那些序列。識別序列一般將是至少10堿基對長度，更通常是10至30堿基對長度，并自在大多數(shù)實施方案中是小于50堿基對長度。在本領域中描述了用于序列特異性DSBI(例如歸巢核酸內(nèi)切酶)的識別序列。各DSBI酶的識別序列和來源生物可以例如取自WO03/004695ο還包括的是識別序列的少量偏離(簡并)，所述偏離仍能夠由所討論的DSBI酶識別和切割。已經(jīng)描述了此類偏離-還描述了與不同框架條件例如鈣或鎂濃度方面的聯(lián)系(ArgastGM等人，(1998)JMolBiol280:345_353)。還包括的是這些識別序列的核心序列。已知識別序列的內(nèi)側(cè)部分足以誘導雙鏈斷裂并且外側(cè)部分不是絕對相關的，不過可以共同決定切割效力。因此，例如，可以對I-SceI定義一個18bp核心序列。I-SceI的識別序列5‘-agttacgctagggataaλcagggtaatatag(seqidno28)3，-TCAATGCGATCCCΛTATTGTCCCATTATATCI-SceI的核心序列5，-tagggataaacagggtaat(seqidno29)3，-ATCCCΛTATTGTCCCATTA被缺失或切除的序列是位于兩個同源序列(例如稱作“A”和“B”的同源性或重復序列)之間的那些序列。技術人員知道當實施重組時，他不限于特定序列，但是只要存在足夠的長度和同源性，任意序列可以與其他序列發(fā)生同源重組?！巴粗亟M”是在兩個同源(“重復”)dna位點處發(fā)生并因存在所述dna位點而促進的dna重組事件，它通過在相同序列區(qū)范圍內(nèi)雜交而引起dna序列重排或聯(lián)合。提及“同源性”或“重復”序列A和B時，“足夠的長度”優(yōu)選地指具有至少20堿基對、優(yōu)選至少50堿基對、特別優(yōu)選至少100堿基對、非常特別優(yōu)選至少250堿基對、最優(yōu)選至少500堿基對長度的序列。提及同源序列A和B時，“足夠的同源性”優(yōu)選地指在這些同源序列內(nèi)部，在至少20堿基對、優(yōu)選至少50堿基對、特別優(yōu)選至少100堿基對、非常特別優(yōu)選至少250堿基對、最優(yōu)選至少500堿基對長度范圍內(nèi)具有至少70%、優(yōu)選80%、優(yōu)選至少90%、特別優(yōu)選至少95%、非常特別優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選100%同源性的序列。兩個核酸序列之間的“同源性”理解為意指核酸序列在每種情況下覆蓋完整序列長度范圍內(nèi)的同一性，其中所述同一性通過比對，借助程序算法GAP(WiSCOnSinPackage第10.0版，威斯康辛大學，GeneticsComputerGroup(GCG),Madison，美國)設置如下參數(shù)計算空位權(quán)重12，長度權(quán)重4，平均匹配2.912平均不匹配-2.003。在一個實施方案中，僅一個用于位點定向地誘導dna雙鏈斷裂的識別序列位于同源序列A和B之間，從而待切除的核酸序列(或用于轉(zhuǎn)化靶植物或植物細胞以產(chǎn)生本發(fā)明方法步驟d)的植物品系的重組構(gòu)建體)以5’-至3’-方向構(gòu)建如下23al)第一同源序列A，bl)用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的識別序列，和a2)第二同源序列B，其中同源序列A和B具有足夠的長度和足夠的同源性旨在能夠高效同源重組。在另一個實施方案中，其他核酸序列位于同源序列A與B之間，從而待切除的核酸序列(或用于轉(zhuǎn)化靶植物或植物細胞以產(chǎn)生本發(fā)明方法步驟d)的植物品系的重組構(gòu)建體)以5’-至3’-方向構(gòu)建如下al)第一同源序列A，bl)用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的識別序列，C)其他核酸序列，和a2)第二同源序列B，其中同源序列A和B具有足夠的長度和足夠的同源性旨在能夠高效同源重組。用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的識別序列也可以位于所述其他核酸序列之后或位于其中。在又一個實施方案中，用于位點定向地誘導雙鏈斷裂的第二識別序列存在于所述其他核酸序列之后。該實施方案在同源序列A與B進一步分開的情況下或在其他核酸序列較長的情況下是尤其有利的，因為重組效力提高。在這個實施方案中，待切除的核酸序列(或用于轉(zhuǎn)化靶植物或植物細胞以產(chǎn)生本發(fā)明方法步驟d)的植物品系的重組構(gòu)建體)以5’-至3’-方向構(gòu)建如下al)第一同源序列A，bl)用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的第一識別序列，和C)其他核酸序列，和bl)用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的第二識別序列，和a2)第二同源序列B，其中同源序列A和B具有足夠的長度和足夠的同源性旨在能夠高效同源重組。此外，除用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的第二識別序列之外，其他識別序列也可以存在于同源序列A和B之間。用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的各個識別序列(例如bl或b2)可以是相同的或不同的，即它們可以充當某個酶的識別序列或充當多種酶的識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂。在本上下文中，優(yōu)選這樣的實施方案，其中用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的識別序列充當某個酶的用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂的識別序列。技術人員熟悉多種方式以獲得包含待切除核酸序列的重組構(gòu)建體和獲得含有待切除核酸序列的植物品系。所述構(gòu)建體可以通過例如在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.SambrookjMolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)中、在Τ.J.Silhavy,Μ.L.Berman和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1984)中禾口在Ausube1,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecular.Biology,GreenePublishingAssoc,andWileyInterscience(1987)中描述的慣用重組和克隆技術制備。優(yōu)選地，通過如下方式產(chǎn)生本發(fā)明的重組構(gòu)建體，即使用技術人員熟悉的重組和克隆技術，將上文提及的重組構(gòu)建體的必需組件與上文提及的序列連接起來，并將產(chǎn)物隨后導入宿主植物的基因組。另外，技術人員熟悉可以將本發(fā)明的重組構(gòu)建體導入植物細胞或植物的基因組中的多種方式。在本上下文中，插入可以是定向的(即在定義的插入位點處發(fā)生)或非定向的(即隨機發(fā)生)。適合的技術是技術人員已知的。除了上文就DSBI酶表達盒所述的元件(遺傳控制元件、啟動子、增強子等)外，重組構(gòu)建體(包含待切除的核酸序列)可以包含其他核酸序列。此類核酸序列可以優(yōu)選地構(gòu)成表達盒。可以通過舉例方式、而非限制性方式提到在表達構(gòu)建體中待表達的以下DNA序列i)正選擇標記正選擇標記是這樣的基因，它的存在賦予細胞或植物能夠在否則是有害的處理存在下持續(xù)存在或被鑒定。就植物轉(zhuǎn)化而言，需要選擇標記以選擇已經(jīng)整合并表達任何目的DNA(例如T-DNA)的細胞。連同表達構(gòu)建體一起導入的選擇標記可以向已經(jīng)成功發(fā)生重組或轉(zhuǎn)化的細胞賦予針對殺生物劑(例如除草劑如膦絲菌素、草甘膦或溴苯腈)、代謝抑制物如2-脫氧葡萄糖-6-磷酸(W098/45456)或抗生素(例如四環(huán)素、氨芐青霉素、卡那霉素、G418、新霉素、博來霉素或潮霉素)的抗性。該選擇標記允許從未轉(zhuǎn)化的細胞選出轉(zhuǎn)化的細胞(McCormick等人(1986)PlantCellR印orts5:81_84)。特別優(yōu)選的選擇標記是賦予除草劑抗性的那些選擇標記?？梢蕴岬降倪x擇標記實例是編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的DNA序列，其中膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶使谷氨酰胺合酶抑制劑膦絲菌素(PPT)的游離氨基乙?；⑶乙蚨餚PT解毒(deBlock等人，1987，EMBOJ.6，2513-2518)(也稱作雙丙氨膦RTM抗性基因(bar))，賦予草甘膦RTM(N-(膦酰甲基)甘氨酸)抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS合酶基因)，·編碼草甘膦.RTM.降解酶(草甘膦氧化還原酶)的gox基因，·deh基因(編碼使茅草枯.RTM.失活的脫鹵素酶)，·對磺酰脲和咪唑啉酮不敏感的突變乙酰乳酸合酶，·編碼降解溴苯腈.RTM.的腈水解酶的bxn基因，·卡那霉素或G418抗性基因(NPTII)。NPTII基因編碼因磷酸化反應而降低卡那霉素、新霉素、G418和巴龍霉素抑制作用的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶?！OG.sup.Rl基因。DOG.sup.Rl基因已經(jīng)從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)分離(EPO807836)。該基因編碼賦予2-D0G抗性的6_磷酸_2_脫氧葡萄糖磷酸酶(Randez-Gil等人1995，Yeast11，1233-1240)。ii)負選擇或反選擇標記能夠鑒定缺少指定基因功能的細胞和/或使之存活，例如選擇成功地缺失包括該標記基因在內(nèi)的序列的生物(KoprekT等人，(1999)ThePlantJournal19(6):719_726)。TK胸苷激酶(TK)和白喉毒素A片段(DT-A)、編碼胞嘧啶脫氨酶(GleveAP等人，(1999)PlantMolBiol.40(2)223-35；PereatRI等人，(1993)PlantMol.Biol23(4)793-799；StougaardJ；(1993)PlantJ3:755-761)的codA基因、細胞色素P450基因(Koprek等人，(1999)PlantJ16:719_726)、編碼鹵代烷脫鹵素酶的基因(NaestedH(1999)PlantJ18:571-576)、iaah基因(SundaresanV等人，(1995)Genes&Development91797—1810)或tms2基因(FedoroffNV禾口SmithDL1993，PlantJ3273-289)。iii)編碼輕易可定量的蛋白質(zhì)并且也可以通過固有顏色或酶活性確保評估轉(zhuǎn)化效力或表達定位或時間的報道基因。本文非常特別優(yōu)選編碼報道蛋白的基因(也見SchenbornE,GroskreutzD.MolBiotechnol.1999；13(1):29_44)，所述的報道蛋白例如是“綠色熒光蛋白”(GFP)(ChuiWL等人，CurrBiol1996,6325-330；LeffelSM等人，Biotechniques.23(5):912_8，1997;Sheen等人，(1995)PlantJournal8(5)777-784;Haseloff等人，(1997)ProcNatlAcadSciUSA94(6):2122_2127;Reichel等A,(1996)ProcNatlAcadSciUSA93(12):5888_5893;Tian等人，(1997)PlantCellRep16267-271；W097/41228)。氯霉素轉(zhuǎn)移酶，螢光素酶(Millar等人，PlantMolBiolRep199210:324_414;0w等人，(1986)Science,234:856_859)；允許檢測生物發(fā)光。·β-半乳糖苷酶，編碼可用多種生色底物的酶，·β-葡糖酸酸糖苷酶(GUSJefferson等(1987)EMBOJ6:3901-3907)或uidA基因，編碼具有多種生色底物的酶，·R基因座基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)植物組織中花青苷色素(紅顏色)產(chǎn)生并且因此可以使得直接分析啟動子活性而不添加額外輔助劑或生色底物成為可能的蛋白質(zhì)(Dellaporta等人，在ChromosomeStructureandFunctionImpactofNewConcepts,第18屆Stadler遺傳學研討會，11=263-282,1988)。·β-內(nèi)酰胺酶(Sutcliffe(1978)ProcNatlAcadSciUSA75:3737_3741)，具有多種生色底物的酶(例如PADAC，一種生色的頭孢菌素)。*xylE基因產(chǎn)物(Zukowsky1983,ProcNatlAcadSciUSA801101-1105)，能夠轉(zhuǎn)化生色性兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶，·α-淀粉酶(Ikuta等人(1990)Bio/technol.8:241_242)，酪氨酸酶(Katz等人(1983)JGeneMicrobiol129:2703_2714)，將酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的酶，其中所述的DOPA和多巴醌隨后形成可輕易檢測的黑色素?！に赴l(fā)光蛋白(Prasher等人(1985)BiochemBiophysResCommun126(3)1259-1268)，可以在鈣敏感性生物發(fā)光檢測中使用。上文提及的編碼標記和報道基因的核酸可以包含于本發(fā)明待切除的核酸內(nèi)部。這同樣適用于例如T-DNA區(qū)或其部分。重組構(gòu)建體和從其衍生的任意載體可以包含其他功能性元件。術語“其他功能性元件”將在廣義上理解。它優(yōu)選地指影響本發(fā)明重組系統(tǒng)、本發(fā)明重組構(gòu)建體或包含它們的細胞或生物的產(chǎn)生、增殖、功能、用途或價值的全部那些元件。以下其他功能性元件可以用舉例、但非限制的方式提到?！ご_保本發(fā)明的表達盒或載體在例如大腸桿菌中復制的復制起點?？梢蕴岬降膶嵗荗RI(DNA復制起點、pBR322ori或P15Aori(Sambrook等MolecularCloning.ALaboratoryManual,.ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor,NY,1989)。·能夠并且促進一個或多個核酸序列插入的多克隆位點(MCS)?！な雇粗亟M或插入宿主生物基因組中成為可能的序列?！な怪参锛毎修r(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)移成為可能的用于轉(zhuǎn)移和整合到植物基因組中的元件，例如邊界序列，例如T-DNA的右邊界或左邊界或vir區(qū)。所有上文提及的表達盒或其他功能性元件均可以是位于待切除核酸序列的同源或重復序列A和B之間，如所提到的那樣。然而，它們也可以位于A和B之外。這在邊界序列的情況下是尤其有利的。本發(fā)明的方法用于獲得已經(jīng)從其基因組中切除核酸序列的植物。除了“完整”植物或“成熟”植物之外，本發(fā)明也包括從通過本發(fā)明方法獲得的植物衍生的后代、繁殖材料(如葉、根、種子(包括胚、胚乳和種衣)、籽苗、果實、花粉、幼枝等)、部分(器官、幼枝營養(yǎng)器官/結(jié)構(gòu)(例如葉、莖和塊莖)、根、花、插條和花器官/結(jié)構(gòu)例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花藥和胚珠)、組織(例如維管組織、地下組織等)、細胞(例如保衛(wèi)細胞、卵細胞、香毛簇等)、細胞培養(yǎng)物和收獲材料。“成熟植物”理解為意指除了籽苗之外的處于任意發(fā)育期的植物。“籽苗”理解為意指處于發(fā)育早期的幼齡、非成熟植物?！昂蟠?或下代)尤其包括克隆、種子、果實、自交或雜合后代和后代和這些后代和后代任意者的任意繁殖體，如插條和種子，它們在有性或無性再生或繁殖中使用。本發(fā)明也包括這種植物以有性或無形方式繁殖的子孫、克隆或后代或所述植物、子孫、克隆或后代的任意部分或繁殖體。如本文中所用的單數(shù)術語“細胞”或“植物細胞”指單個細胞。復數(shù)術語“細胞”指細胞群體。該群體可以是包含一種細胞類型的純?nèi)后w。同樣，該群體可以包含多于一種細胞類型。在本發(fā)明中，不限制細胞群體可以包含的細胞類型數(shù)目。細胞可以是同步或不同步的。屬于本發(fā)明含義的植物細胞可以是分離的(例如在懸浮培養(yǎng)物中)或包含于植物組織、植物器官或處于任何發(fā)育期的植物中。就植物而言，術語“組織”(或“植物組織”)意指多個植物細胞的排列，包括分化和未分化的排列。植物組織可以構(gòu)成植物器官的部分(例如，植物葉的表皮)，不過也可以構(gòu)成瘤組織(例如，愈傷組織)和多種類型的培養(yǎng)細胞(例如，單個細胞、原生質(zhì)體、胚、愈傷組織、原胚體樣體等)。植物組織可以在植物原位、在器官培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或細胞培養(yǎng)物中。在本發(fā)明范圍中包括植物界的全部屬和物種的高等和低等植物。可以用在本發(fā)明方法中的植物類別總體上如適用于轉(zhuǎn)化技術的高等和低等植物那么廣泛，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物和多細胞藻類。它包括多個倍性水平的植物，包括非整倍體、多倍體、二倍體、單倍體和半合子。本發(fā)明的方法可以優(yōu)選地用于以下植物科莧科(Amaranthaceae)、蕓胃禾4*(Brassicaceae)Λ5t^f(Caryophyllaceae)Λ藥(Chenopodiaceae)Λ^r(Compositae)、葫戸禾斗(Cucurbitaceae)、唇形禾斗(Labiatae)、豆禾斗(Leguminosae)-^^花亞科(Papilionoideae)、百合科(Linaceae)、錦葵科(Malvaceae)、薔薇科(Rosaceae)、虎耳草禾斗(Saxifragaceae)、玄參禾斗(Scrophulariaceae)、前禾斗(Solanacea)、番杏禾斗(Tetragoniacea)及其轉(zhuǎn)基因組合。一年生、多年生、單子葉和雙子葉植物是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選宿主生物。本發(fā)明方法的用途還在全部觀賞植物、用材樹或觀賞樹、花、切花、灌木或草坪草中更有利。可以用舉例方式、但非限制方式提到的植物是被子植物、苔蘚植物例如獐耳細辛屬(Hepaticae)(h印aticas(獐耳細辛))和蘚綱(Musci)(蘚類植物)；蕨類植物如蕨類、木賊類和石松類；裸子植物如松柏類植物、蘇鐵植物、銀杏(ginkgo)和買麻藤科(Gnetaeae)植物；藻類如綠藻綱(Chlorophyceae)、褐藻綱(Phaeophpyceae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、粘藻綱(Myxophyceae)、黃藻綱(Xanthophyceae)、硅藻綱(Bacillariophyceae)(硅藻類)和裸藻綱(Euglenophyceae)。出于本發(fā)明目的植物以舉例方式但非限制性方式包含薔薇科如玫瑰、杜鵑花科(Ericaceae)如杜_$花(rhododendron)禾口印度杜_$花(azaleas)、大卓戈禾斗(Euphorbiaceae)如一品紅(poinsettias)禾口巴豆(croton)、石竹科(Caryophyllaceae)如石竹(pinks)、爺科如牽?；?petunias)、苦苣苔科(Gesneriaceae)如非洲紫苣苔(Africanviolet)、鳳仙花禾斗(Balsaminaceae)如鳳仙花(touch_me_not)、蘭禾斗(Orchidaceae)如蘭花(orchids)>鳶尾科(Iridaceae)如唐菖蒲(gladioli)、鳶尾花(iris)、小蒼蘭(freesia)和番紅花(crocus)、菊科如萬壽菊、櫳牛兒苗科(Geraniaceae)如geraniums、百合科如龍血樹屬植物(drachaena)、?？?Moraceae)如榕屬(ficus)植物、天南星科(Araceae)如黃蘗(philodendron)和許多其他植物?？梢酝ㄟ^舉例方式并且不以限制性方式提到的開花植物是以下科的植物豆科如豌豆、苜蓿和大豆；禾本科(Gramineae)如稻、玉米、小麥；茄科如煙草和許多其他植物；傘形科(Umbelliferae)，特別是胡蘿卜屬(Daucus)(更特別是物種胡蘿卜(carota))和芹屬(Apium)(更特別是物種旱芹(graveolensdulce(旱芹)))及許多其它植物；茄科(Solanaceae)，特別是番茄屬(Lycopersicon)，更特別是物種番茄(tomato)和茄屬(Solanum)，更特別是物種馬鈴薯(tomato)和茄子(aubergine)、煙草(tobacco)及許多其它植物；辣椒屬(Capsicum)、更特別是物種辣椒(Capsicumannum(pepper))物種及許多其它植物；豆科(Leguminosae)，特別是大豆屬(Glycine)，更特別是物種大豆(soybean)及許多其它植物；和十字花科(Cruciferae)，特別是蕓苔屬(Brassica)，更特別L禾中(oilseed(beet)>(BrassicaoleraceacvTastie(^心菜))、花椰菜(BrassicaoleraceacvSnowballY(花椰菜))禾口花蓮甘藍(oleraceacvEmperor(broccoli))；和擬南芥屬，更特別是物種擬南芥及許多其它植物；菊科(Compositae)，特別是萵苣屬(Lactuca)，更特別是物種萵苣(lettuce)及許多其它植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物尤其選自單子葉作物植物例如禾谷類植物如小麥、大麥、高粱和谷子、黑麥、黑小麥、玉米、稻或燕麥和甘蔗當中。還優(yōu)選樹，例如蘋果樹、梨樹、木瓜樹(quince)、李樹、櫻桃樹、桃樹、油桃樹(nectarine)、杏樹、番木瓜樹(papaya)、芒果樹和其他木本物種，包括針葉樹和落葉樹，如楊樹(poplar)、松(pine)、紅杉(sequoia)、雪松(cedar)、橡樹(oak)等。特別優(yōu)選的是擬南芥、煙草(Nicotianatabacum)、油籽油菜、大豆、玉蜀黍(玉米(maize))、小麥、亞麻、馬鈴薯和萬壽菊(tagete)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物尤其還選自雙子葉作物植物例如蕓苔科如歐洲油菜、水芹、擬南芥屬植物、卷心菜或卡諾拉油菜，豆科植物如大豆、苜蓿、豌豆、豆類或落花生當中。茄科如馬鈴薯、煙草、番茄、茄子或辣椒、菊科如向日葵、萬壽菊、萵苣或金盞花。葫蘆科如甜瓜、西葫蘆(pumpkin)/南瓜(squash)或小西葫蘆和亞麻子、棉花、大麻、亞麻屬植物、紅椒、胡蘿卜、甜菜和多種樹、堅果與藤本(wine)物種。對于本發(fā)明方法，特別優(yōu)選的是玉米、擬南芥、煙草和油籽油菜和用作食物和飼料的全部屬和物種，如上述的禾谷類物種，或適合產(chǎn)生油的全部屬和物種，如油料作物(例如油籽油菜)、堅果物種、大豆、向日葵、南瓜/西葫蘆和落花生。對于本發(fā)明方法，最優(yōu)選的是玉米、擬南芥屬植物、高粱、稻、油菜籽、煙草、小麥、黑麥、大麥、燕麥、馬鈴薯、番茄、甜菜、豌豆、甘蔗、蘆筍、大豆、苜蓿、落花生、向日葵和南瓜組成的組。在本發(fā)明方法步驟b)中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物品系或該轉(zhuǎn)基因植物品系的細胞或部分用在步驟c)中以實施瞬時測試法。該測定法起到分析DSBI酶功能性的作用。該測定法可以避免費時地評估DSBI酶的活性并且取而代之的是可以允許簡單且迅速地評價DSBI功能性。在一個優(yōu)選的實施方案中，該瞬時測試法是染色體內(nèi)同源重組(ICHR)測定法。這種測定法用來監(jiān)測染色體內(nèi)HR的頻率。優(yōu)選地，本發(fā)明方法步驟C)的瞬時測試法包括報告構(gòu)建體的瞬時轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)化可以通過上述關于轉(zhuǎn)化(編碼DSBI的)構(gòu)建體的任意轉(zhuǎn)化方法進行，優(yōu)選地通過生物射彈轟擊法或PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行。優(yōu)選地，報告構(gòu)建體包含待切除的核酸序列，其中所述核酸序列包含對本發(fā)明方法步驟a)的酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中所述核酸序列在兩個末端鄰接允許同源重組的同源序列。以舉例方式，但非限制性方式，那些報告構(gòu)建體的概念將解釋如下。瞬時測定系統(tǒng)可以使用例如由該報告構(gòu)建體中所包含的重組基因(例如葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因)的重疊部分組成的“重組陷阱”。可以通過HR除去在該基因(例如⑶S基因)的兩個片段之間的重疊部分，導致恢復功能基因。當植物或植物部分或細胞以組織化學方式染色時，可以檢測到此類HR事件，例如在GUS基因的情況下，檢測為藍色斑點或區(qū)域。優(yōu)選地，報告構(gòu)建體選自由GUS構(gòu)建體、綠色熒光蛋白(GFP)構(gòu)建體、氯霉素轉(zhuǎn)移酶構(gòu)建體、螢光素酶構(gòu)建體、β"半乳糖苷酶構(gòu)建體、R-基因座基因產(chǎn)物構(gòu)建體、β"內(nèi)酰胺酶構(gòu)建體、xylE基因產(chǎn)物構(gòu)建體、α淀粉酶構(gòu)建體、酪氨酸酶構(gòu)建體和水母發(fā)光蛋白構(gòu)建體組成的組。檢測這些基因產(chǎn)物的方法是技術人員熟知的，并且在上文引用的文獻中描述。在步驟C)的瞬時測試法之后，本發(fā)明方法步驟b)中產(chǎn)生的植物品系與含有待切除核酸序列的植物品系雜交，其中待切除的核酸序列包含對步驟a)的酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中待切除的核酸序列在兩側(cè)鄰接允許DNA修復機制的重復序列(步驟d)。"DNA修復”是鑒定和校正DNA損傷例如雙鏈斷裂的一個過程。在本發(fā)明中，這種修復機制優(yōu)選地是同源重組(HR)。備選地，修復所導入雙鏈斷裂的機制可以是非同源的末端連接(NHEJ)、精確連接(PL)或其他機制修復，從而完全切除目的序列。非同源的末端連接(NHEJ)是可以用來修復DNA中雙鏈斷裂的一種途徑。NHEJ稱作"非同源的"，原因是直接連接斷裂末端，無需同源模板，與需要同源序列以指導修復的同源重組相反。術語“非同源的末端連接”由MooreJ.K.和HaberJ.E.(MolCellBiol.1996年5月；16(5):2164_73)在1996年創(chuàng)造。NHEJ一般利用名為微型同源物的短同源DNA序列來指導修復。使用往往存在于雙鏈斷裂末端的單鏈突出端中的微型同源物來促進可恢復性修復。當這些突出端是相容的時候，NHEJ幾乎總是精確地修復斷裂，無序列丟失。引起核苷酸丟失的不精確修復也可以發(fā)生，不過比通常少得多。許多蛋白質(zhì)參與NHEJ。由Ku70和KuSO組成的Ku異二聚體與DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs)形成復合體，其在哺乳動物中存在，但在酵母中不存在。由催化亞基DNA連接酶IV及其輔因子XRCC4組成的DNA連接酶IV復合體執(zhí)行修復的連接步驟。NHEJ還需要最近發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)XLF(又稱作Cernunnos)0術語“雜交”意指兩株植物(最終代表兩個植物品系)之間的交配，其中所述的兩個獨立植物具有不相同的遺傳背景。換句話說，兩種親代類型具有不同的遺傳構(gòu)成。對于與包含待切除核酸的植物異花授粉，T0品系和純合的T1品系均可以使用。雜交可以通過授粉進行。通常，授粉是花粉從花的雄性繁殖結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到花的雌性繁殖結(jié)構(gòu)的過程。更精確地，授粉是花粉(雄蕊的)花藥轉(zhuǎn)移到(雌蕊的)柱頭的過程。代表植物中有性繁殖的授粉引起受精，并且通常引起種子產(chǎn)生。通常，授粉可以在單個植物上(自花授粉)或在不同植物或植物品種之間(異花授粉)發(fā)生。在一個優(yōu)選的實施方案中，“待切除的核酸序列”包含T-DNA區(qū)或其部分。另一種可能是待切除的核酸序列編碼選擇標記。這種選擇標記優(yōu)選地選自由負選擇標記、賦予針對殺生物代謝抑制劑、針對抗生素或針對除草劑的抗性的標記、正選擇標記和反選擇標記組成的組。最優(yōu)選地，該選擇標記選自由乙酰羥酸合酶、D-絲氨酸脫氨酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦降解酶、失活茅草枯的脫商素酶、失活磺酰脲和咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶、降解溴苯腈的腈水解酶、卡那霉素_或G418-抗性基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、6-磷酸-2-脫氧葡萄糖磷酸酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶、D-氨基酸代謝酶、D-氨基酸氧化酶、慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷-3-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、博來霉素耐藥性決定子、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶、UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶、胞嘧啶脫氨酶、細胞色素Ρ-450酶、吲哚乙酸水解酶、鹵代烷脫鹵素酶和胸苷激酶組成的組。最后，在雜交步驟d)后，進行未成熟胚轉(zhuǎn)換(步驟e)?！拔闯墒炫咿D(zhuǎn)換”是通過體外轉(zhuǎn)換/萌發(fā)未成熟胚成完整籽苗而從未成熟胚恢復植物或籽苗的過程，無愈傷組織形成。在此過程期間，可以將未成熟胚置于生根培養(yǎng)基上并將未成熟胚轉(zhuǎn)換成籽苗。該過程已經(jīng)在例如GreenC.E.和PhillipsR.X.CropScience，第15卷，1975年5-6月，第417-421頁中描述。所述轉(zhuǎn)換是胚萌發(fā)并且優(yōu)選地隨后發(fā)育成建立的自養(yǎng)型植物的能力。萌發(fā)是胚中生理過程的起始，通常由攝取水和暴露于誘導性環(huán)境信號誘導，導致分生組織生長(細胞分裂和伸長)并且以子葉完全發(fā)育為終結(jié)。術語“未成熟胚”指從種子/谷粒衍生的未充分發(fā)育并成熟至具有適宜大小、重量和含水量的胚。這些正在發(fā)育的胚具有在合適的體外條件下變成植物的能力。本發(fā)明未成熟胚轉(zhuǎn)換方法的其他優(yōu)選實施方案將以舉例方式在下文描述。在成功授粉(自花授粉或異花授粉)后，從授粉后約10-20日的玉米粒中無菌地剝離未成熟胚，置于不補充植物激素的MS瓊脂培養(yǎng)基上并在光照下在20-27°C溫育。幼枝和根在溫育1日后開始變得可見，并且充分完整的籽苗可以在約7日獲得。每個未成熟胚變成一株完整籽苗。備選地對于步驟e)的“未成熟胚轉(zhuǎn)換”-或該步驟后_通過愈傷組織形成進行組織培養(yǎng)再生。該步驟允許恢復含有DNA雙鏈斷裂誘導酶的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法也包括在步驟b)或C)之后鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因品系。優(yōu)選地，單拷貝轉(zhuǎn)基因植物品系用于本發(fā)明方法的其他步驟。在本發(fā)明的上下文中，術語“單拷貝”指雙鏈斷裂誘導酶。鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因品系可以借助本領域技術人員已知的任意標準分子技術進行。優(yōu)選地，單拷貝鑒定通過定量PCR或Southern雜交進行。定量PCR是用來同時定量和擴增給定DNA分子的特定部分的一項技術。使用這項技術來確定某個特定序列是否存在于樣品中，并且若其存在，則確定在樣品中的拷貝數(shù)。該方法遵循聚合酶鏈反應的一般模式，但是在每輪擴增后對DNA定量。兩種常用定量方法是使用嵌入雙鏈DNA的熒光染料和當與互補DNA雜交時發(fā)出熒光的經(jīng)修飾DNA寡核苷酸探針。所述技術包括SYBR綠色定量PCR、基于探針的定量PCR和逆轉(zhuǎn)錄酶定量PCR。關于PCR技術的細節(jié)可以在“PCR-Polymerase-Kettenreaktion.DasMethodenbuch，，(Hans-JoachimMillIer,SpektrumAkademischerVerlag,2001年6月)、"MolekularbiologischeDiagnostik，，(FrankThiemannHoppenstedtPublishing,2002)或"DerExperimentator:Molekularbiologie/Genomics，，(CornelMiilhardt,SpektrumAkademischerVerlag，2006年4月)中找到。"Southern雜交”或“DNA印跡”是通過標記特異性DNA序列來增強瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的方法。作為一般示例，但非限制，所述方法包括以下步驟1.DNA片段在凝膠上電泳以基于大小分離(例如源自PCR的)DNA。2.若DNA大于15kb，在印跡前，凝膠可以用起到使DNA片段脫嘌呤的稀酸(如稀HCl)處理。這使DNA斷裂成能夠比較大片段更高效地完成轉(zhuǎn)移的較小片段。3.來自DNA電泳的凝膠用堿性溶液(一般含有氫氧化鈉)處理，以引起雙鏈DNA變性，使之分離成單鏈。變性是必需的，從而DNA將黏附于膜并被探針雜交(見下文)。4.將一張硝化纖維素膜(或備選地，尼龍膜)置于凝膠的頂部。向凝膠均勻地施加壓力(或使用抽吸，或通過將一疊紙巾和一個重物置于該膜和凝膠的頂部)。這導致在粘附處DNA因毛細管作用從凝膠移動到與此DNA黏附的膜上。5.隨后將膜烘烤(在硝化纖維素膜的情況下)或暴露于紫外輻射(尼龍膜)以將該DNA永久地交聯(lián)于此膜。6.此膜現(xiàn)在用雜交探針_一種具有特定序列的分離的DNA分子-處理，其中所述的特定序列與適宜序列配對(所述的適宜序列是限制性酶識別的序列的互補序列)。標記探針DNA，從而可以例如因摻入放射性或用熒光染料或生色染料標記該分子而檢測到該探針DNA。在一些情況下，雜交探針可以從RNA而非DNA產(chǎn)生。7.在雜交后，從膜上洗去過多的探針，并且雜交模式在X-光膠片上顯像或作為等同技術，在放射性探針或熒光探針的情況下，通過自顯影術，或若使用生色檢測法，通過顏31色在膜上本身顯色而顯像。該方法首先由Ε.M.(1975)“檢測由凝膠電泳分離的DNA片段中的特定序列(DetectionofspecificsequencesamongDNAfragmentsseparatedbygelelectrophoresis)”，JMolBiol，98:503_517描述。技術人員知道如何實施Southern印跡法，例如豐艮據(jù)Τ·Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY(1989)中描述內(nèi)容。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括在步驟b)或C)之后分析轉(zhuǎn)基因表達水平。在本上下文中，術語“轉(zhuǎn)基因”指雙鏈斷裂誘導酶。在本上下文中，術語“表達”包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。優(yōu)選地，將高度或至少中度表達的植物品系用于本發(fā)明方法的進一步的步驟。該步驟替代上文提及的“鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因品系”步驟備選地進行，或優(yōu)選地除了“鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因品系”步驟之外還進行該步驟，最優(yōu)選在“鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因品系”步驟之后進行該步驟。這種分析可以通過本領域技術人員已知的任意標準分子技術進行。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因表達水平的分析通過RT-PCR或Northern雜交進行。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)是用于擴增RNA分子的定義片段的技術。RNA鏈首先逆轉(zhuǎn)錄成其DNA互補物或互補性DNA，隨后使用聚合酶鏈反應擴增所得的DNA。這可以是一個1步驟或2步驟過程。聚合酶鏈反應本身是通過溫度介導的酶即DNA聚合酶用來擴增DNA分子的特定部分的方法。在稱作“第一鏈反應”的RT-PCR第一步驟中，使用dNTP和RNA依賴性DNA聚合酶即逆轉(zhuǎn)錄酶，通過逆轉(zhuǎn)錄過程，從mRNA模板產(chǎn)生互補性DNA。以上成分與DNA引物在逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液中合并，于約37°C持續(xù)1小時。在逆轉(zhuǎn)錄酶反應結(jié)束和已經(jīng)從原始的單鏈mRNA產(chǎn)生互補性DNA后，開始名為“第二鏈反應”的標準聚合酶鏈反應。1.添加熱穩(wěn)定的DNA聚合酶以及上游和下游DNA弓丨物。2.將反應加熱到高于約37°C的溫度以促進DNA引物對cDNA(副本DNA)的序列特異性結(jié)合。3.進一步加熱允許這種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(“轉(zhuǎn)錄酶”)從引物結(jié)合的cDNA產(chǎn)生雙鏈DNA。4.將反應加熱到大約95°C以分開兩條DNA鏈。5.冷卻該反應，從而使引物能夠再次結(jié)合并且重復該循環(huán)。在大約30個循環(huán)后，產(chǎn)生數(shù)百萬個目的序列拷貝。初始RNA模板由RNA酶H降解，留下純的cDNA(外加多余的引物)。通過使用含有該過程第二階段所要求的酶的蠟珠，該過程可以簡化成單步驟過程，其中第二鏈反應中加熱以使引物復性時，所述蠟珠熔化，釋放其內(nèi)容物。RNA印跡法技術可以用來進一步研究RNA基因表達。"RNA印跡法”或“Northern雜交”是用來研究基因表達的技術。該技術因與用來研究DNA的Southern印跡法的相似性得名，關鍵不同之處在于RNA是通過電泳分析并用雜交探針檢測的物質(zhì)，而非DNA。該方法中的明顯不同之處(如與Southern印跡法相比)是在瓊脂糖凝膠中添加充當變性劑的甲醛。如Southern印跡法中那樣，可以從DNA或RNA產(chǎn)生雜交探針。技術人員知道如何實施Nouthern印跡法，例如根據(jù)T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.SambrookjMolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中描述的內(nèi)容。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括在步驟b)或C)之后對轉(zhuǎn)基因植物品系授粉，其中所述授粉是自花授粉或與野生型植物品系異花授粉。優(yōu)選自花授粉。優(yōu)選地，將先前確定具有單拷貝DSBI轉(zhuǎn)基因和/或具有高度或至少中度DSBI表達的品系用于授粉步驟。在所謂"Ttl品系”(由本發(fā)明方法步驟b)產(chǎn)生的品系)自花授粉后，獲得的種子叫做"T1種子”。就生物體、多肽或核酸序列而言，術語“野生型”、“天然”或“天然來源”意指所述生物是天然存在的或是在至少一種天然存在生物中可獲得的，其中所述的天然存在生物沒有被改變、突變或沒有被人類操作。優(yōu)選地，分析通過授粉獲得的種子和/或籽苗("T1籽苗”)的接合性。在這種情況下，該分析確定DSBI轉(zhuǎn)基因的存在并且起到鑒定純合植物和半合子植物的作用。術語“純合的”指生物中各自位于相同基因組位置內(nèi)的兩個DNA序列，每個DNA序列存在于一個同源染色體上。“雜合的”或可互換地“半合子的”描述了僅單拷貝的基因(例如轉(zhuǎn)基因)在雙倍體(或多倍體)生物中的單個染色體上存在。接合性分析可以根據(jù)本領域技術人員已知的任意標準分子技術，例如通過定量PCR、Southern雜交和/或熒光原位雜交法進行。將后者定義為使用核酸探針檢測并鑒定染色體中DNA的或真核細胞和組織中RNA的特定互補性序列。檢測借助熒光(例如與熒光染料偶聯(lián)的探針)進行。在又一個優(yōu)選的實施方案中，選擇在接合性分析后鑒定到的純合品系用于本發(fā)明方法步驟d)的雜交。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，分析通過本發(fā)明方法步驟e)所獲得的種子和/或籽苗(稱為“F/’)的DNA雙鏈斷裂介導的同源重組。優(yōu)選地，種子和/或籽苗的這種同源重組分析由包括PCR分析法、比色或生物化學測定法或者DNA測序法在內(nèi)的標準分子技術確定。這種分析可以通過如對本發(fā)明方法步驟c)所描述的方法進行。備選地或額外地，可以進行PCR分析。引物的選擇取決于待切除的核酸序列。技術人員知道如何設計適宜的PCR反應，例如，如在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.SambrookjMolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中描述。如上文所述的方法也可以反向進行，這意味著它涉及互逆方法。在這種情況下，用編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體進行步驟a)的轉(zhuǎn)化，進行步驟c)的瞬時測試法以評估步驟a)的構(gòu)建體的識別序列和重復序列的功能性，以及將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物品系與含有DNA雙鏈斷裂誘導酶的植物品系雜交。因而，本發(fā)明也涉及用于從植物或植物細胞的基因組切除核酸序列的方法，該方法包括a)用編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，其中待切除的核酸序列包含對DNA雙鏈斷裂誘導酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中待切除的核酸序列在兩側(cè)鄰接允許DNA修復機制的重復序列，b)從步驟a)的細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物品系，c)用步驟b)的植物品系或其細胞或部分實施瞬時測試法以分析步驟a)的構(gòu)建體的識別序列和重復序列的功能性，d)將步驟b)的植物品系與含有DNA雙鏈斷裂誘導酶的植物品系雜交，和e)進行未成熟胚轉(zhuǎn)換或通過愈傷組織形成進行組織培養(yǎng)再生。上文定義的全部術語和方法以相同的方式適用于這種逆向方法，例外是瞬時測試法，該測定法優(yōu)選地用編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶的構(gòu)建體進行。作為步驟d)雜交的備選，獲得標記切除事件的另一種方法是用構(gòu)建體“再轉(zhuǎn)化”在步驟b)中產(chǎn)生并在步驟C)中分析的植物品系。在步驟a)的轉(zhuǎn)化過程用編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶的構(gòu)建體進行的情況下，再轉(zhuǎn)化用編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體進行。因而，本發(fā)明涉及用于從如上文定義的植物或植物細胞的基因組中切除核酸序列的方法，其中步驟d)的雜交替換為用編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化步驟b)的植物品系，其中待切除的核酸序列包含對步驟a)的酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中待切除的核酸序列在兩側(cè)鄰接允許DNA修復機制的重復序列，其中待切除的核酸序列包含對步驟a)的酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中待切除的核酸序列在兩側(cè)鄰接允許DNA修復機制的重復序列，在其中步驟a)的轉(zhuǎn)化過程用編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體進行時的“逆向”方法中，再轉(zhuǎn)化用編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶的構(gòu)建體進行。因而，本發(fā)明還涉及用于從如上文定義的植物或植物細胞的基因組中切除核酸序列的方法，其中步驟d)的雜交替換為用編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶的構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化步驟b)的植物品系。用第二構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物品系的方法可以根據(jù)上文描述內(nèi)容，即上文提及的任意轉(zhuǎn)化方法進行。這同樣適用于第二構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)(遺傳控制元件、啟動子、增強子、聚腺苷酸化信號、核糖體結(jié)合位點等)，其可以根據(jù)上文描述內(nèi)容設計。在這種備選方法中，技術人員明白另一種(第二)選擇標記系統(tǒng)應當優(yōu)選用于第二轉(zhuǎn)化過程。例如，若用于第一構(gòu)建體的選擇標記系統(tǒng)基于“ahas”基因，則所述第二選擇標記系統(tǒng)可能是在編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體的表達盒中所包含的“dsdA”基因，或反之亦然。同樣可以使用上文提及的任意選擇標記與技術人員已知的任意選擇標記的任何其他組合。優(yōu)選地，在含有待切除的靶DNA序列的轉(zhuǎn)基因植物上進行再轉(zhuǎn)化，尤其當待切除的靶DNA序列是第一選擇標記基因時。例如，從含有ahas選擇標記基因的第一轉(zhuǎn)基因品系衍生的未成熟胚用含有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株感染并與之共培養(yǎng)，其中所述的ahas選擇標記基因是待切除的靶，所述質(zhì)粒包含攜帶dsdA基因作為選擇標記的第二轉(zhuǎn)化盒。若第一轉(zhuǎn)基因品系相對于第二選擇標記基因是野生型，則遵循相似的轉(zhuǎn)化步驟。例如，若第一轉(zhuǎn)基因品系含有帶ahas基因的第一T-DNA，則僅施加針對dsdA基因的D-絲氨酸就可以進行選擇。對如此產(chǎn)生的植物分析切除事件。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法獲得的植物或從這種植物衍生的后代、繁殖材料、部分、組織、細胞或細胞培養(yǎng)物。最后，本發(fā)明涉及本發(fā)明的植物或后代、繁殖材料、部分、組織、細胞或細胞培養(yǎng)物的用途，用作食物、飼料或種子或用于產(chǎn)生藥物或化學品。本發(fā)明的植物可以被人或動物消費，并且因而還可以例如直接地或在本領域已知的加工法之后用作食物或飼料原料。這里，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物時，缺失例如抗生素抗性和/或除草劑抗性不僅因消費者接受性、還因產(chǎn)品安全性原因，從而是有意義的。本發(fā)明的又一個主題涉及上述植物和從它們衍生的結(jié)構(gòu)物、藥物或化學品、尤其精細化學品的用途。這里再次地說明，缺失例如抗生素抗性和/或除草劑抗性不僅因消費者接受性、還因產(chǎn)品安全性原因而是有利的?！八幬铩崩斫鉃橐庵冈卺t(yī)學治療、預防或接種中使用的藥物(drug)、化學藥或藥品?！熬毣瘜W品”理解為意指可廣泛使用的酶、維生素、氨基酸、糖、脂防酸、天然和合成的香料、芳香物質(zhì)或色料。特別優(yōu)選的是產(chǎn)生生育酚和生育三烯酚和產(chǎn)生類胡蘿卜素。通過技術人員已知的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主生物并從宿主生物或從培養(yǎng)基分離。藥物(例如抗體或疫苗)的產(chǎn)生由HoodEE,JilkaJM.(1999)CurrOpinBiotechnol.10(4):382_386；MaJK和VineND(1999)CurrTopMicrobiolImmunol.236:275_92)描述。本發(fā)明的多種其他方面和實施方案將由于本公開而對本領域技術人員是顯而易見的。在本說明書中提到的全部文件通過引用的方式并入本文。本發(fā)明的某些方面和實施方案現(xiàn)在將以舉例方式說明。應當理解本發(fā)明不限于如描述那樣的具體方法學、方案、細胞系、植物物種或?qū)佟?gòu)建體和試劑。參考文獻NutterRC,ScheetsK,PanganibanLC,LommelSA.玉米褪綠斑駁病毒基因組的完整核苷酸序列(Thecompletenucleotidesequenceofthemaizechloroticmottlevirusgenome).NucleicAcidsRes.1989年4月25日；17(8):3163_77·ScheetsK,Khosravi-FarR,NutterRC.玉米褪綠斑駁病毒cDNA克隆的轉(zhuǎn)錄物在玉米原生質(zhì)體中復制并且感染玉米植物(TranscriptsofamaizechloroticmottleviruscDNAclonereplicateinmaizeprotoplastsandinfectmaizeplants).Virology.1993年4月；193(2)1006-9.ScheetsK.玉米褪綠斑駁病毒和小麥線條花葉病毒的濃度在協(xié)同性疾病玉米致死性壞死中升高(Maizechloroticmottlemachlomovirusandwheatstreakmosaicrymovirusconcentrationsincreaseinthesynergisticdiseasecornlethalnecrosis).Virology.1998年3月1日；242(1):28_38·ScheetsK.玉米褪綠斑駁病毒表達從表達來自1.47_kb亞基因組RNA的衣殼蛋白并且產(chǎn)生0.34_kb亞基因組RNA(Maizechloroticmottlemachlomovirusexpressesitscoatproteinfroma1.47-kbsubgenomicRNAandmakesa0.34-kbsubgenomicRNA).Virology.2000年2月1日；267(1):90_101.CzakoΜ,WenckAR,MartonL(1996)用于植物的負選擇標記，在GresshoffPM(編輯)Technologytransferofplantbiotechnology.CRCpress,BocaRaton,第67-93頁·JeffersonRA(1987)分析植物中的嵌合基因⑶S基因融合系統(tǒng).PlantMolBiolRep5387-405.SchrottM(1995)Selectablemarkerandreportergenes.在PotrukusI(編輯)Genetransfertoplants.Springer,Berlin,Heidelberg,NewYork,第325-336頁·Kozak,M(1987)來自699種脊椎動物信使RNA的5，非編碼序列的分析(Ananalysisof5'-noncodingsequencesfrom699vertebratemessengerRNAs).NucleicAcidsResearch,15:208125-8148.實施例材料和一般方法除非另外說明，實施例中的化學品和試劑從SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)獲得，限制性核酸內(nèi)切酶來自NewEnglandBiolabs(Beverly,ΜΑ)或Roche(Indianapolis,IN)，寡核苷酸由MWGBiotechInc.(HighPoint,NC)合成，并且有關生物化學和分子生物測定法的其他修飾酶或試劑盒來自Clontech(PaIc)Alto,CA)、PharmaciaBiotech(Piscataway，NJ)、PromegaCorporation(Madison,WI)或Stratagene(LaJolla,CA)。用于細胞培養(yǎng)基的材料從Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或DIFCO(Detroit,MI)獲得。為本發(fā)明目的所實施的克隆步驟例如限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、純化DNA片段、轉(zhuǎn)移核酸至硝化纖維素膜和尼龍膜、連接DNA片段、轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞、培育細菌、增殖噬菌體和重組DNA的序列分析，如Sambr00k(1989)所述實施。使用ABI激光熒光DNA序列儀，按照Sanger方法(Sanger1977)實施重組DNA分子的測序。1.崖__斤#(DSB)倘白·原·植物細胞中的歸巢核酸內(nèi)切酶(HEN)表達可以增強染色體內(nèi)同源重組(ICHR)。HEN植物中HEN轉(zhuǎn)基因的表達水平在影響ICHR率中發(fā)揮重要作用。以常規(guī)方式，在衍生自表達HEN的植物與含有靶序列的植物之間雜交的后代植物的組織上實施ICHR測定法(圖9A)。與作為代表體型小的和短產(chǎn)生時間的植物物種的擬南芥屬植物相比，該系統(tǒng)在玉米中的進化需要大量努力、時間和資源，包括溫室空間以及長產(chǎn)生時間。為了克服這些差異并以高效且有效的方式在玉米中實現(xiàn)成功的標記切除，研發(fā)了如下方法(圖9B和9C)。在玉米中，所選擇的Ttl植物(HEN品系以及能夠切除的品系)自交以獲得T1種子。使用TaqMan測定法，檢驗用于接合性試驗的T1籽苗，旨在鑒定純合品系。選擇顯示中度至高度水平的轉(zhuǎn)基因表達的Ttl品系以提高DSB介導的HR的效率并限制待用于雜交的植物數(shù)目(圖8)。首先，使用TaqMan半定量PCR測定法鑒定單拷貝品系。使用TaqMan實時RT-PCR測試這些單拷貝品系，旨在于mRNA水平上確定所導入基因(I-SceI或⑶-US，圖1-4)的中度表達至高度表達。轉(zhuǎn)基因表達水平相對于內(nèi)源基因(優(yōu)選單拷貝基因)的表達水平進行歸一化。通過生物射彈轉(zhuǎn)化法，以編碼GU-US基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化來自某些最強烈表達I-SceI的品系的葉組織，用于瞬時ICHR測定法。在本測定法中的成功ICHR由檢測到受轟擊的葉樣品上的藍色⑶S陽性斑點而指示。該方法也可以通過轉(zhuǎn)移I-SceI構(gòu)建體至轉(zhuǎn)基因⑶-US品系的葉組織中實施。這種瞬時測試法系統(tǒng)便于鑒定這樣的HEN轉(zhuǎn)基因品系，其是DSB介導的成功HR的最佳候選者。選擇的轉(zhuǎn)基因品系用于進一步實驗以獲得DSB介導的HR植物。選擇的HEN純合品系與包含它們的互補構(gòu)建體的植物(圖3和4)異花授粉；即I-SceI品系與攜帶報告構(gòu)建體(GU-US)的品系雜交并且報道品系與攜帶I-SceI構(gòu)建體的品系雜交。作為常規(guī)方法之后的對照，對包含I-SceI和⑶-US構(gòu)建體這兩者的所得后代種子直接分析DSB誘導的HR，并進行栽種以評價完整植物中的重組(圖9A)。在包含I-SceI和報告構(gòu)建體這兩者的后代種子中，在胚乳中強烈地觀察到、在盾片中散在地觀察到、在胚軸中沒有觀察到DSB介導的HR，其中在組成型啟動子(例如與玉米遍在蛋白內(nèi)含子組合的玉米遍在蛋白啟動子)的控制下以表達I-SceI并切除能被切除的基因或表達盒。由于盾片是借助農(nóng)桿菌的玉米轉(zhuǎn)化和再生的靶組織，故Fl植物的未成熟胚用于再生過程以通過胚性愈傷組織培養(yǎng)物恢復DSB介導的HR植物。該方法允許增殖和分化顯示出DSB介導的HR的組織。因而即便DSB介導的HR沒有在胚軸中出現(xiàn)，仍顯著提高了鑒定到DSB介導的HR品系的概率(圖9B)。另外，將I-SceI構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化入純合GU-US品系的未成熟胚以改善DSB介導的HR，因為這個過程將經(jīng)歷再生過程(圖9C)。表1是對這些新方法的基本特征和時間表的概述。表1用于以HENI-SceI基因在玉米中獲得無標記事件的三種方法的概述。1基于圖9的方法。2從最終切除獲得無靶標記的事件中分離I-SceI基因所需要的產(chǎn)生時間。方法1獲得切除的無靶標記事件的時間2本發(fā)明中示例的特征A.最少19個月獲得標記切除事件的機會低，和/或需要大規(guī)模種子篩選(因種子中完全切除的頻率低)B8個月獲得標記切除事件的機會提高(因在單個細胞水平上回收切除事件的潛能所致，并且組織培養(yǎng)過程促進重組活性)。C9個月獲得標記切除事件的機會提高(因基于單個細胞轉(zhuǎn)化而獲得完全切除事件的高度潛能所致)如上所述，使用一個遍在的組成型強啟動子表達HEN基因和⑶-US時，當分析成熟的谷粒時，在玉米的胚軸中檢測不到DSB介導的HR(由藍色斑點顯示)。為在胚中實現(xiàn)DSB介導的HR，選擇超級啟動子，因為在玉米中這種啟動子顯示在萌發(fā)期間的整個胚(盾片和胚軸)中強烈表達、在再生期間的愈傷組織(包括胚性愈傷組織)中強烈表達?？梢酝ㄟ^在超級啟動子與I-SceI基因之間添加賦予內(nèi)含子介導增強作用(IME)的內(nèi)含子而增強在這些組織中的表達水平。優(yōu)化I-SceI歸巢核酸內(nèi)切酶基因序列以改善表達和mRNA穩(wěn)定性。使用50%混合的玉米和大豆優(yōu)選密碼子，優(yōu)化該序列。鑒定并除去RNA不穩(wěn)定性基序、密碼子重復序列、隱伏的剪接位點、不希望的限制性位點和mRNA二級結(jié)構(gòu)以獲得最終的優(yōu)化序列。合成的序列由德國雷根斯堡EntelechonGmbH合成。合成該基因，其具有在_3位(作為翻譯起始密碼子的ATG中的腺嘌呤為+1位核苷酸)為Kozak共有序列中的腺嘌呤(Kozak，1987)、所選的限制性位點和Gateway附著區(qū)(Attachmentregion)(圖22)。SEQIDNO26編碼密碼子優(yōu)化的Ι-Scel的序列，SEQIDNO27編碼帶附著區(qū)的密碼子優(yōu)化的I-SceICDS。采用本發(fā)明的方法，在T1世代中產(chǎn)生了在95%置信度上分別以1.8-9.6%和5.4-16.4%效率切除完整報道基因盒和重組GU/US報道基因的完全重組的玉米。提供以下流程圖以簡短和簡化地總述下文中描述的實施例。它不應當理解為限制。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化玉米未成熟胚a)用I-SceI構(gòu)建體(選擇標記盒:ahas)b)用GUS假標記切除構(gòu)建體(標記ahas)c)用⑶-US報告構(gòu)建體(標記ahas)A農(nóng)桿菌接種、共培養(yǎng)、選擇和植物再生1.用農(nóng)桿菌細胞懸液接種未成熟胚；2.在無抗生素和選擇劑的培養(yǎng)基上進行未成熟胚和農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)；3.轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至含有抗生素，但無選擇劑的恢復培養(yǎng)基；胚性愈傷組織的產(chǎn)生在這個階段始于盾片。4.在含選擇劑的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)基因的胚性愈傷組織；5.在含選擇劑的再生培養(yǎng)基上恢復小植物；6.轉(zhuǎn)移年幼Ttl籽苗至含選擇劑的生根培養(yǎng)基；7.進行TaqMan拷貝數(shù)分析，并鑒定單拷貝事件；8.轉(zhuǎn)移生根的、TaqMan陽性的單拷貝植物至土壤；9.通過RT-PCR確定轉(zhuǎn)基因表達水平；10.T0品系自花授粉以獲得T1種子(收獲和貯藏)。通過TaqMan測定法對T1籽苗檢驗純合性。B用于證明DSB介導的HR概念的半瞬時測定系統(tǒng)將⑶-US質(zhì)粒導入表達I-SceI的玉米品系a)在葉組織中通過粒子槍導入，或b)在原生質(zhì)體中通過PEG介導的轉(zhuǎn)化法導入確定報道基因的瞬時表達水平=瞬時ICHR測定法(染色體內(nèi)同源重組)檢測到藍色=陽性斑點—鑒定作為最佳候選的HEN轉(zhuǎn)基因Ttl品系C.異花授粉選擇的純合轉(zhuǎn)基因I-SceI品系與含有選擇標記(或具有⑶-US或⑶S構(gòu)建體)的品系異花授粉，其中所述的選擇標記鄰接有切除位點。I-SceIχ⑶-US=獲得Fl后代(胚/種子)D.未成熟胚轉(zhuǎn)換(通過體外轉(zhuǎn)換/萌發(fā)未成熟胚成完整籽苗而從未成熟胚中恢復植物的過程，無愈傷組織形成。將Fl未成熟胚置于不含植物生長素2，4-D的生根培養(yǎng)基上，并且隨后將未成熟胚轉(zhuǎn)換成籽苗)。(以避開耗費時間篩選從成熟種子衍生的Fl植物)將Fl未成熟胚置于含有針對選擇標記的選擇劑的生根培養(yǎng)基上，其中所述的選擇標記與I-SceI基因連接，一恢復籽苗。38E.通過胚件愈傷組織的棺物再牛這是借助愈傷組織形成，通過組織培養(yǎng)法恢復可能的切除標記的植物的方法。Fl未成熟胚在恢復培養(yǎng)基上培養(yǎng)(以促進愈傷組織形成)，選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)(以促進胚性愈傷組織形成和選擇含有整合的T-DNA的細胞)，在再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)(以轉(zhuǎn)換成熟愈傷組織成小植物)并且隨后在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)(以恢復完整的籽苗)。該方法的主要優(yōu)點是從單個細胞恢復Fl植物，從而分離/選擇了切除標記的細胞系。F.轉(zhuǎn)基因品系的再轉(zhuǎn)化這是除了兩種轉(zhuǎn)基因品系(例如切除標記的目標品系和HEN品系)之間的常規(guī)雜交之外的還適用于標記切除的一項技術。為實施再轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)基因品系A(例如具有在T-DNA中的第一選擇標記基因的切除目標品系)的未成熟胚再次用其T-DNA中含有HEN基因的農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化，或轉(zhuǎn)基因品系B(例如HEN品系)的未成熟胚可以再次用含有切除靶T-DNA的農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化(或反之亦然)。切除標記的籽苗可以從所述再轉(zhuǎn)化過程中恢復。G.用于DSB介導的HR或標記切除的棺物分析用于鑒定無標記(=完全切除標記的)植物的分子篩選法a)葉和谷粒的⑶S組織化學染色測定法b)用于標記切除的PCR分析1.1載體構(gòu)津1.1.1歸巢核酸內(nèi)切酶(I-SceI)構(gòu)津體使用引物1和2從載體pCB586-4以PCR擴增I-SceI。SEQIDNO7引物1(AscI-ATG-I-SceI5，)5，-AGGCGCGCCATGAAAAACATCAAAAAAAACCASEQIDNO8引物2(Sbfl-TAA-I-Scel3，)5’-GCTCCTGCAGGTTATTTCAGGAAAGTTTC所得的PCR產(chǎn)物用AscI和Sbfl消化并克隆到經(jīng)AscI和Sbfl消化的載體pLM065中，以產(chǎn)生包含表達盒的載體PJB010，在所述的表達盒中玉米遍在蛋白啟動子驅(qū)動I-SceI表達。載體pCER040b是其中玉米遍在蛋白啟動子驅(qū)動I-SceI表達的雙元表達載體并且通過將T4DNA聚合酶補平的pJBOlO的PmeI-XbaI片段連接到T4DNA聚合酶補平的AscI-PacI消化的pEG085中產(chǎn)生。載體pCER041是其中甘蔗桿狀病毒(ScBV)啟動子驅(qū)動I-SceI表達的雙元表達載體，并且通過將T4DNA聚合酶補平的pJBOlO的PacI-AscI連接到T4DNA聚合酶補平的EcoRV-AscI消化的pEG085中產(chǎn)生。1.1.2GU-US構(gòu)建體載體pCB642-2編碼其中⑶SORF包含610堿基對內(nèi)部重復的、帶有一個位于該重復區(qū)之間的I-SceI識別位點(GU-US)的表達盒。通過HindIII和SpeI消化從pCB642_2分離編碼⑶-US和NOS終止子的片段，并克隆到HindIII和SpeI消化的pBluescript以產(chǎn)生PJB028。雙元⑶/US表達載體pJB034通過將T4DNA聚合酶補平的pJB028的SpeI-XhoI片段連接到EcoRV-AscI消化的T4DNA聚合酶補平的pEG085中產(chǎn)生。1.1.3假標記切除構(gòu)津體載體pJB035通過將包含GUS表達盒的pBPSMM247b(p-ScBV=GUS:t_N0S)的AscI片段連接到AscI-消化的pU⑶01中產(chǎn)生。為了在pJB035中導入分布于⑶S表達盒側(cè)翼的I-SceI位點，產(chǎn)生了編碼識別序列的寡聚物。寡聚物3和4的復性產(chǎn)生在一個末端帶SalI-匹配突出端和在另一個末端帶XbaI-匹配突出端的雙鏈I-SceI識別位點。SEQIDNO9寡聚物3(SailI-SceI):5，-TCGATAGGGATAACAGGGTAATSEQIDNO10寡聚物4(XbaI-1-SceI):5，-CTAGATTACCCTGTTATCCCTA通過用SalI和XbaI消化pJB035并連接復性的寡聚物3和4，在⑶S表達盒下游添加一個I-SceI位點，因而產(chǎn)生pJB036。產(chǎn)生寡聚物5和6旨在產(chǎn)生帶PacI匹配末端的雙鏈I-SceI序列。SEQIDNO11寡聚物5(PacI-1-SceI5，):5，-TAGGGATAACAGGGTAATSEQIDNO12寡聚物6(PacI-I_SceI3，):5，-TACCCTGTTATCCCTAAT將復性的寡聚物5和6連接到PacI消化的pJB036以產(chǎn)生pJB037。最終的假標記切除載體需要分布在I-SceI位點側(cè)翼的重復DNA序列以便充當同源重組的靶序列(HR靶)。為此目的，將玉米AHAS終止子的一部分重復。從載體pEG085通過850bpEcoRI-KpnI片段切除該區(qū)域。將這個EcoRI-KpnI片段克隆到EcoRI和KpnI消化的pJB037以產(chǎn)生PJB038，其中所述的pJB038包含[I-SceI:p_ScBV⑶S:t_N0SI-SceIHR靶]假標記盒。通過連接來自pJB038的5.2KbHpaI-PmeI片段到T4DNA聚合酶補平的PacI-AscI消化的PEG085以產(chǎn)生PJB039，產(chǎn)生了所述假標記雙元載體。1.2農(nóng)桿菌介導的玉米轉(zhuǎn)化和再生1.2.1植物組織培養(yǎng)和細菌培養(yǎng)基除非另外說明，實施例中的化學品和試劑從SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)獲得。細胞培養(yǎng)基的材料從Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或DIFCO(Detroit，MI)獲得。本發(fā)明目的所實施的克隆步驟例如轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞、培育細菌、增殖噬菌體和重組DNA的序列分析，如Sambrook(1989)所述實施。以說明方式且不以限制方式提供以下實施例。培養(yǎng)基配方通過將28.9mgPursuit溶解到IOOmlDMSO(Sigma)中制備咪草煙(Pursuit)貯存液(ImM)并在4°C貯存于黑暗中。將乙酰丁香酮貯存液制備為DMSO中的200mM溶液并貯存在_20°C。D-絲氨酸貯存液在雙蒸水中制備、濾過消毒并貯存在4°C。表2.玉米YP培養(yǎng)基(用于培育農(nóng)桿菌)用IMNaOH調(diào)節(jié)pH至6.8。對于固體培養(yǎng)基，每250mL瓶添加3g瓊脂(EMScience)。等分IOOmL培養(yǎng)基至每個250mL瓶，高壓滅菌、使其冷卻并在瓶內(nèi)固化。為制備平板，將瓶內(nèi)的培養(yǎng)基在微波爐中熔化，并將該瓶置于水浴中并冷卻至55°C。當冷卻時，添加壯觀霉素(SigmaS-4014)至終濃度50mg/L，充分混合并傾倒制備平板。表3玉米LS-inf培養(yǎng)基用IMHCl調(diào)節(jié)pH至5.2，濾過消毒，以IOOmL等分試樣分裝，在用于農(nóng)桿菌感染前即刻添加乙酰丁香酮(100μΜ)至該培養(yǎng)基(將50μL添加至IOOmL培養(yǎng)基_200mM貯存液)。表4.玉米1.5LSAs培養(yǎng)基(用于共培養(yǎng))用IMNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8。每瓶稱取4gSigma純化瓊脂(8g/L)和每瓶分配500mL培養(yǎng)基，高壓滅菌。當冷卻時，添加AgN03(15mM的貯存液)至終濃度15μM并且添加L-半胱氨酸(150mg/ml的貯存液)至終濃度300mg/L。傾倒至IOOx20mm培養(yǎng)皿。含有乙酰丁香酮的培養(yǎng)基應當隨即使用，而不長期貯存。表5.玉米恢復培養(yǎng)基IM培養(yǎng)基量取約四分之三的所需ddH20總體積，添加蔗糖和鹽，并在攪拌下溶解。在全部成分溶解后，用ddH20調(diào)節(jié)至終體積并使用IMKOH調(diào)節(jié)至pH5.8。等分500ml液體培養(yǎng)基至含0.9g脫乙酰吉蘭糖膠的IL瓶中，高壓滅菌20分鐘(液體循環(huán))。高壓滅菌后，將瓶子置于水浴中以冷卻至55C并添加MS維生素(至終濃度1.Omg/mL)、硝酸銀(至終濃度15μΜ)和特美汀(至終濃度150mg/L)。傾倒培養(yǎng)基至IOOX20mm培養(yǎng)皿并使培養(yǎng)基保留在層流柜中過夜以防止過度凝縮。表6a選擇培養(yǎng)基用IMNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8。添加Sigma純化瓊脂(8g/L)，每IL瓶分配500mL培養(yǎng)基，高壓滅菌，當冷卻時添加(表6b)表7a玉米再生培養(yǎng)基用IMNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8。每瓶(8g/L)稱取4gSigma純化瓊脂(SigmaA7921)。每瓶分配500mL培養(yǎng)基，高壓滅菌并使其在瓶內(nèi)固化。對于使用，用微波爐熔化培養(yǎng)基，當冷卻時，添加(表7b)；用IMNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8，每瓶添加Ig脫乙酰吉蘭糖膠(2g/L)，每瓶分配500mL培養(yǎng)基，高壓滅菌，添加選擇劑后，傾倒至一次性植物托盤內(nèi)。1.3制備供體植物用于轉(zhuǎn)化實驗1.3.1在布達佩斯條約下的保藏物在布達佩斯條約下對以下材料進行保藏1.玉米品系BPS553的種子；專利保藏物命名PTA-61702.玉米品系BPS631的種子；專利保藏物命名PTA-6171。于2004年8月26日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Manassas,VA20110-2209USA進行該保藏。1.3.2制備雜合的供體植物以下玉米近交系用于以下步驟1.HiIIA=HiII親代A；保藏號T0940A，玉米遺傳和基因組數(shù)據(jù)庫)，可獲自玉米遺傳公司-種質(zhì)中心(MaizeGeneticsCooperation-StockCenter)USDA/ARS&CropSci/UIUC,S-123TurnerHall,1102S.GoodwinAvenue,UrbanaILUSA61801-4798；http://www.maizegdb.org/stock,php。2.A188:Agronomy&PlantGenetics,411BorlaugHall，明尼蘇達大學，SaintPaulMN55108。3.BPS533(ATCC專利保藏物命名PTA-6170)。4.BPS631(ATCC專利保藏物命名PTA-6171)。玉米基因型HiIIAxA188的Fl種子通過HiIIA(雌性親代)與近交系A188(雄性)雜交來產(chǎn)生，并種植在溫室中作為花粉供體。(HiIIAxA188)的F2種子通過Fl(HiIIAxA188)植物在溫室或大田中自花授粉產(chǎn)生，并種植在溫室中作為花粉供體。使用近交系BPS553(ATCC專利保藏物命名PTA-6170)或BPS631(ATCC專利保藏物命名PTA-6171)作為雌性親代和Fl或F2(HiIIAxA188)植物作為雄性親代在溫室中產(chǎn)生BPS553x(HiIIAxA188)或BPS631x(HiIIAxA188)的雜合未成熟胚。種子在含有Metromix的花缽中播種。一旦種子萌發(fā)和生根，維護一個籽苗/花缽用于產(chǎn)生未成熟胚，并且拋棄第二籽苗；備選地，在4x4英寸花缽中播種種子，并且將籽苗在播種所述種子2周后移植至10英寸花缽。添加大約一湯勺Osmocote14-14-14(—種緩釋肥料)至每個花缽的表面。溫室中的溫度維持在夜間24°C和晝間28°C。自動地進行澆水，不過若需要每日人工補充澆水。每周兩次，用115稀釋的Peters20_20_20肥料給植物澆水。1.3.3制備近交的供體植物在4英寸花缽中直接播種近交系BPS553或BPS631的種子，并且將籽苗在播種所述種子2周后移植至10英寸花缽。備選地，將種子直接播種在10英寸花缽中。進行自花授粉或近緣授粉。培育條件如上文對雜交品系那樣相同。1.3.4手工授粉對每株玉米植物監(jiān)測幼穗，并且當幼穗出現(xiàn)時，用小的白色幼穗袋(Lawson)蓋住它們。一旦幼穗已經(jīng)產(chǎn)生產(chǎn)生玉米須，則切除玉米須并且再次用幼穗袋覆蓋。相同植物的玉米穗狀花序用棕色紙袋包裹(條件是該玉米穗狀花序已經(jīng)進入開花期)。次日早晨，搖動該玉米穗狀花序以將花粉和花藥移至該袋中。隨后將該袋子取下并在幼穗的玉米須上方抖動。授粉在早晨8點和10點之間進行。確保棕色紙袋在幼穗上方和玉米桿周圍。授粉后，從植物中除去玉米穗狀花序以減少溫室中的花粉(其對于許多人是變應原)。為確保對相同基因型的同步授粉并且因此避免周末收獲/轉(zhuǎn)化，再次切短那些開花早的植物的幼穗。隨后在相同日對一組植物例如>5至10株植物授粉。然而，這種操作取決于植物上花粉的品質(zhì)/數(shù)量。近交系需要近緣授粉。例如，BPS553或BPS631可以自花授粉或在相同基因型之間近緣授粉。1.3.5收獲和預處理玉米穗在授粉后(DAP)8至14(平均10)日收獲來自玉米植物的玉米穗(最佳是出現(xiàn)的首個玉米穗)。根據(jù)生長條件和玉米品種，收獲時間不同。未成熟胚的大小是其發(fā)育期的良好指標。用于轉(zhuǎn)化的未成熟胚最佳長度是約1至1.5mm，包括盾片的長度。胚應當是半透明的，并非不透明的。若玉米穗是可用的，但不能用于那一日的轉(zhuǎn)化，則可以收獲玉米穗，放入授粉袋并貯存在4°C冰箱的塑料袋中1至3日。1.4農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化1.4.1農(nóng)桿菌的制備農(nóng)桿菌甘油貯備物貯存在_80°C。來自甘油貯備物的農(nóng)桿菌接種物在含有適宜抗生素(例如50mg/L壯觀霉素和/或10mg/L四環(huán)素或100mg/l卡那霉素)的YP瓊脂培養(yǎng)基(A-I)上劃線。在黑暗中在28°C溫育細菌培養(yǎng)物1至3日，或直至可見到單個菌落。獲得的平板可以在4°C貯存1個月并且用作主平板以劃線得到新鮮細胞。新鮮細胞應當在轉(zhuǎn)化前至少2日，從主平板上的單菌落劃線到含適宜抗生素的YP瓊脂上?？梢栽诤诎抵杏?8°C溫育這些細菌培養(yǎng)物1至3日。備選地，冷凍的農(nóng)桿菌貯存物可以通過來自冷凍貯存物的農(nóng)桿菌細胞對平板B-YP-002(YP+50mg/L壯觀霉素+10mg/L四環(huán)素)劃線并在28°C培育2至3日制備。將它作為主平板保存并貯存在4°C至多1個月。從該主平板中，將一個接種環(huán)的農(nóng)桿菌細胞對含有25mL液體B-YP-OOO培養(yǎng)基的燒瓶劃線，其中所述的培養(yǎng)基補充有50mg/L壯觀霉素+IOmg/1四環(huán)素。在設于300轉(zhuǎn)/分鐘和28°C的搖床上培育2至3日。通過將1份上述農(nóng)桿菌培養(yǎng)物與1份無菌的30%甘油混合，制備冷凍的農(nóng)桿菌貯存物。渦旋混合以充分混勻并且分配10μL農(nóng)桿菌/甘油混合物至50μLEppendorf管。貯存在_80°C。一個滿接種環(huán)(直徑2mm)的細菌培養(yǎng)物懸浮在補充有200nM乙酰丁香酮的1.0至1.8mL的LS-inf培養(yǎng)基中。這產(chǎn)生了光密度(OD6tltl)大約在0.5至2.0之間的細菌懸液。渦旋混合0.5至3小時。通過(例如用膠帶)將微量離心管水平地(而非垂直地)固定在渦旋混合器的平臺上進行渦旋混合，以確保更好地將農(nóng)桿菌細胞分散到該溶液中。在小瓶中將100μL農(nóng)桿菌細胞懸液與900uLLS-inf溶液混合，并且測量0D6(1(1。用LS_inf(具IOOnM乙酰丁香酮)溶液調(diào)節(jié)初始農(nóng)桿菌溶液的OD至0.6至2.0。該農(nóng)桿菌懸液必須在感染之前于LS-inf+乙酰丁香酮培養(yǎng)基中渦旋混合至少0.5至3小時。在開始收獲胚之前制備該懸液。備選地，用于玉米轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌懸液可以制備如下轉(zhuǎn)化前2日，從-80°C貯存物中，來自一只管的農(nóng)桿菌對含有B-YP-002(固化的YP+50mg/L壯觀霉素+10mg/l四環(huán)素)的平板劃線，并且在28°C于黑暗中生長2日。轉(zhuǎn)化前約1至4小時，將一勺細菌細胞置于一只2mLEppendorf管中的1.5mLM-LS-002培養(yǎng)基(LS-inf+200μM乙酰丁香酮)中。渦旋混合該管以將細菌細胞分散到溶液，并且以1000轉(zhuǎn)/分鐘振搖該管1至4小時。0D_應當是0.6至1.0范圍或約108cfu/mL。出于以下實施例的目的，使用以雙元載體質(zhì)粒PBPSMM232轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404或卸甲農(nóng)桿菌菌株K599(NCPPB2659))。pBPSMM232含有ahas基因(作為選擇標記)和gus報道基因。1.4.2玉米穗的表面消毒和未成熟胚的分離在授粉后8至12日從溫室收獲玉米穗。除去全部外殼和玉米須并將玉米穗在棕色授粉袋中運回組織培養(yǎng)實驗室。將穗軸移到無菌柜中。將一對大鑷子插入玉米穗的基部端并且使用鑷子作為操作穗軸的手柄。任選地，當玉米穗上存在昆蟲/真菌時，應當首先用20%商業(yè)漂白劑對玉米穗消毒10分鐘(備選地用30%Clorox溶液消毒15分鐘)，并且隨后用滅菌水漂洗3次。通過鑷子握緊該穗軸，同時用70%乙醇徹底噴淋玉米穗并且隨后用無菌ddH20漂洗。1.4.3接種方法-I改良“管”法將帶鑷子手柄的穗軸置于一只大培養(yǎng)皿中?？梢允褂靡粋€解剖級培養(yǎng)皿。用10#解剖刀切下并移去谷粒的頂部分(2/3)(出于安全考慮，通過遠離持握鑷子手柄的手而切割，產(chǎn)生谷粒上的切口)。隨后用解剖刀(#11解剖刀)從穗軸上的谷粒切下未成熟胚解剖刀片以一個角度插入谷粒的一端。向上撬起胚乳，胚位于胚乳下面。在大約含有LS-inf液體培養(yǎng)基(見上文；A-2)中的1.5至1.SmL農(nóng)桿菌懸液的微量離心管(或小培養(yǎng)皿)中收集切下的胚，其中所述的LS-inf液體培養(yǎng)基含有乙酰丁香酮。每個管可以含有至多到100個胚。手動混合含有胚的管數(shù)次，并使管/平皿在室溫(20至25°C)靜置30分鐘。用吸管從管/平皿除去過多的細菌懸液。轉(zhuǎn)移殘余LS-inf培養(yǎng)基中的未成熟胚和細菌至含有共培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。通過滅菌接種環(huán)轉(zhuǎn)移仍留在微量離心管中的任何胚。用吸管除去過多的細菌懸液。平皿中必須留下少量液體以避免涂布時胚干透。將未成熟胚置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，平側(cè)面向下(盾片向上)。不要將胚埋入培養(yǎng)基。在無菌柜中使平板蓋開啟約15分鐘以蒸發(fā)籠罩未成熟胚的過多潮氣。用3M微孔膠帶密封培養(yǎng)皿。約100個胚可以置于培養(yǎng)皿上共培養(yǎng)。密封平板并用一張鋁箔包裹。將平板在在黑暗中于22°C溫育2至3日。若使用⑶S構(gòu)建體來評估瞬時⑶S表達，則取3至5個未成熟胚用于⑶S染色。1.4.4方法2“滴注”法直接將切下的未成熟胚放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(附錄A-3)上，平側(cè)面向下(盾片向上)。每只平板(20x100mm平板)可以容納至多100個未成熟胚。用復式移液器向每個未成熟胚施加5μL稀釋的農(nóng)桿菌細胞懸液。通過在無菌柜中使平板蓋開啟約15分鐘，除去籠罩未成熟胚的過多潮氣。用3Μ微孔膠帶密封該平板并用鋁箔包裹。將平板在黑暗中于22°C溫育2至3日。若使用⑶S構(gòu)建體來評估瞬時⑶S表達，則取3-5個未成熟胚用于⑶S染色。1.4.5恢復在共培養(yǎng)后，將胚轉(zhuǎn)移至恢復培養(yǎng)基(A-4)并且將平板在黑暗中于27°C溫育約5至10日。保持盾片側(cè)向上并且不得埋入培養(yǎng)基。1.4.6選擇轉(zhuǎn)移未成熟胚至第一選擇培養(yǎng)基(A-6)?？梢栽诿總€平板上安置大約25至50個未成熟胚。小心保持所述胚處于相同方向(盾片向上)。不得將胚埋入培養(yǎng)基。用白色膠帶密封培養(yǎng)平板。在黑暗中于27°C溫育10至14日(第一輪選擇)繼代培養(yǎng)產(chǎn)生不定愈傷組織的全部未成熟胚至第二選擇培養(yǎng)基(A-6)。盡量避免轉(zhuǎn)移粘質(zhì)或柔軟的愈傷組織。在此階段，使用剪子除去已經(jīng)形成的任何幼枝(若可能，盡量從盾片中取出完整胚并棄之)。將愈傷組織穩(wěn)固地安置在培養(yǎng)基上-勿埋入培養(yǎng)基。用3M微孔膠帶包裹平板并置于黑暗中27°C。在與第一輪選擇相同的條件溫育2周(第二輪選擇)。使用2副細鑷子，在立體顯微鏡下從盾片中切下可再生的愈傷組織。這種可再生的愈傷組織呈發(fā)白/淡黃色，緊湊，不呈粘質(zhì)并且可以具有一些胚樣結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)移愈傷組織至新鮮的第2選擇培養(yǎng)基(A-6)，用3M微孔膠帶包裹并在黑暗中于27°C溫育2周。將愈傷組織穩(wěn)固地安置在培養(yǎng)基上-勿埋入培養(yǎng)基。小心分組和標記來自相同胚的愈傷組織片。1.4.7再生和移植轉(zhuǎn)化的植物以與第二輪選擇下相同的方式切下增殖的愈傷組織(稍白色，形成胚結(jié)構(gòu))并轉(zhuǎn)移至25x100mm平板中的再生培養(yǎng)基(A-7)上。將愈傷組織穩(wěn)固地安置在培養(yǎng)基上-勿埋入培養(yǎng)基。用3M微孔膠帶包裹平板并置于25或27°C的光照下。小心分組和標記來自相同胚的愈傷組織片并且通過胚對它們編號。在光照(大約2，OOOlux；14/10小時光照/黑暗)下于25或27°C溫育2至3周，或直至可見到幼枝樣結(jié)構(gòu)。若需要，轉(zhuǎn)移至新鮮再生培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)移帶再生幼枝或幼枝樣結(jié)構(gòu)的愈傷組織部分至含有生根培養(yǎng)基(A-8)的Phytatray盒或深紅色盒并在與上述步驟相同的條件下溫育2周，或直至生根的小植物已經(jīng)發(fā)育。在生根培養(yǎng)基上2至4周后，轉(zhuǎn)移仍具有綠色區(qū)域(但無再生籽苗)的愈傷組織至新鮮的生根Phytatray。取籽苗樣品用于TaqMan分析以確定T-DNA插入數(shù)目。轉(zhuǎn)移生根的籽苗至溫室中的Metromix土壤并且用塑料罩蓋住每株籽苗至少1周，直至籽苗已經(jīng)建立。每日澆水維持所述植物，并且一周補充液體肥料兩次。當植物長到3葉至4葉期時，對它們施Osmocote肥料。根據(jù)需要，含有ahas基因的推定的轉(zhuǎn)基因植物由持證人員用70至IOOg/公頃Pursuit噴灑，并在溫室中培育另外2周。非轉(zhuǎn)基因植物應當產(chǎn)生除草劑癥狀或此時死亡。將存活的植物移植到具MetroMix和1茶匙Osmocote的10英寸花缽中。在開花期，將轉(zhuǎn)基因植物的玉米穗狀花序用棕色紙袋包裝以防止花粉逸出，并且還用玉米穗袋蓋住幼穗以防止花粉混雜。在所述轉(zhuǎn)基因植物上進行授粉。最好使轉(zhuǎn)基因植物自花授粉。若玉米出須和開花期不同步，與轉(zhuǎn)基因Ttl植物具有相同遺傳背景的野生型花粉供體或受體植物應當可用于進行異花授粉。收獲T1種子、干燥并正確地貯存，同時在種子袋上加上適當標簽。在收獲轉(zhuǎn)基因T1種子后，包含Ttl植物的土壤和花缽應當裝入高壓滅菌袋中并高壓滅菌(雙重袋裝)。1.5鑒定顯示高轉(zhuǎn)基因表達的單拷貝轉(zhuǎn)基因品系(Ttl)1.5.1鑒定單拷貝品系使用TaqMan拷貝測定法(AppliedBiosystems目錄號#4326270)鑒定單拷貝品系。1.5.2鑒定對于轉(zhuǎn)基因在mRNA水平高表達的品系。1.5.2.1采樣將用來確定拷貝數(shù)的核酸樣品(見上文的實施例1.5.1)用于測試轉(zhuǎn)基因(pCER040b和pCER041J-SceI,pJB034=GU-US和JB039:GUS)的mRNA表達水平。使用來自Ambion的無DNA試劑盒(目錄號1906)，以DNA酶處理用于拷貝數(shù)分析的Ttl葉核酸樣品，如制造商所述進行。1.5.2表達分析反應的建立一旦樣品已經(jīng)用DNA酶處理，則進行表達分析。為分析每個樣品，進行兩個反應，一個反應針對目的基因(N0S終止子、⑶S報道基因或I-SceI基因)并且一個反應針對用來定量該反應中RNA濃度的內(nèi)源基因?qū)φ?。?nèi)源基因的表達應當在整個測試條件期間保持穩(wěn)定，從而精確地反應目的基因的相對濃度。對于這些實驗，鑒定到一個在正常溫室生長條件下顯示穩(wěn)定表達水平的玉米基因(BPS-NC克隆ID62054718)。引物12和13用來分析這個基因的表達水平。SEQIDNO:13引物12(正向引物Endo)5，-TCTGCCTTGCCCTTGCTT-3，SEQIDNO:14引物13(反向引物Endo)5’-CAATTGCTTGGCAGGTCTTATTT-3‘NOS終止子引物在該終止子中轉(zhuǎn)錄停止之前復性。所述引物的序列如下。SEQIDNO:15引物14(正向引物N0S)5’-TCCCCGATCGTTCAAACATT-3’SEQIDNO:16引物15(反向引物N0S)5’-CCATCTCATAAATAACGTCATGCAT-3‘GUS報道基因引物在該基因序列的中央復性。所述引物的序列如下。SEQIDNO:17引物16(正向引物GUS)5，-TTACGTGGCAAAGGATTCGAT-3，SEQIDNO:18引物17(反向引物GUS)5’-GCCCCAATCCAGTCCATTAA-3‘I-SceI基因引物在可讀框內(nèi)復性。所述引物的序列如下。SEQIDNO:19引物18(正向引物I-Scel)5’-GACCAGGTATGTCTGCTGTACGA-3’SEQIDNO:20引物19(反向引物I-Scel)5，-CAGGTGGTTAACACGTTCTTTTTT-3，反應在帶內(nèi)源對照的96孔光學平板(AppliedBiosystems，4314320)中進行，并且目的基因反應在相同的平板中同時進行。使用本領域已知的標準流程，使用SYBRGreen(Eurogentec#RTSNRT032X-l)，對樣品進行半定量RT-PCR。在PerkinElmerGeneAmp5700(系列號100001042)上進行反應，如制造商所述。所用的熱循環(huán)儀參數(shù)如下階段1在48°C，30分鐘(運行1次)階段2在％°C，10分鐘(運行1次)階段3在95°C，15秒和在60°C，1分鐘(運行40次)使用默認的解離方案在％°C，I5秒在60°C，20秒在35°C，20分鐘，緩慢上升(60-95°C)1.5.2.3在GeneAmp5700上對轉(zhuǎn)基因的數(shù)據(jù)分析結(jié)果內(nèi)源對照反應的結(jié)果用來證實mRNA樣品的質(zhì)量和完整性。基于GeneAmp5700產(chǎn)生的Ct值，將Ttl世代玉米植物中的轉(zhuǎn)基因表達劃分為高度、中度或低度。將高水平視為18至23范圍內(nèi)的Ct值，中度水平(Ct值24至26)，低水平(Ct值26至30)。產(chǎn)生高于30的Ct值的樣品視為不顯示轉(zhuǎn)基因表達。表9顯示了每個構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因品系數(shù)的概要，其中通過實驗確定的mRNA表達水平進行分組。表9，對于每種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的每個表達水平類別中的Ttl植物數(shù)目1.6通過半瞬時測定系統(tǒng)證實雙鏈斷裂(DSB)介導的同源重組概念1.6.1用于證實DSB介導的重組概念的瞬時表達測定法使用瞬時表達測定法提供證明植物細胞中DSB介導同源重組系統(tǒng)的概念數(shù)據(jù)。分別通過生物射彈轟擊或PEG介導的轉(zhuǎn)化，將⑶-US報告構(gòu)建體(例如PJB034)導入玉米葉組織或原生質(zhì)體。有功能的⑶S可讀框僅可以在⑶-US基因座同源重組后從pJB034產(chǎn)生。來自這些實驗的結(jié)果概述于表10和圖4中。與不表達I-SceI的玉米葉相比，來自表達I-SceI的玉米植物的葉組織以PJB034轟擊時，檢測到顯著較高水平的⑶S染色。表10.來自瞬時轟擊測定法的⑶S染色結(jié)果1.6.2生物射彈轉(zhuǎn)化使用Qiagen質(zhì)粒試劑盒(目錄號12143)分離質(zhì)粒構(gòu)建體。根據(jù)Sanford等人(1993)描述的方案，將DNA沉淀在0.6μM金粒子(Bio-Rad目錄號165-2262)上，并利用PDS-1000/He系統(tǒng)裝置(Bio-Rad)加速到靶組織(例如2周齡玉米葉，BMS培養(yǎng)的細胞等)上。全部DNA沉淀步驟和轟擊步驟在無菌條件下于室溫進行。2mg金粒子(2mg/3次射擊)重懸于100%乙醇中，隨后在貝克曼微量離心機(BeckmanMicrofuge)18Centrifuge以2，000轉(zhuǎn)/分鐘于Eppendorf管中離心。沉淀物用無菌蒸餾水漂洗1次、離心并重懸于25μL的1μg/μL總DNA中。向該管添加以下試劑220μLH2O,250μL2.5ΜCaCl2,50μLO.IM亞精胺游離堿。將該DNA溶液短暫渦旋混合并置于冰上5分鐘，隨后以500轉(zhuǎn)/分鐘在貝克曼微量離心機18Centrifuge中離心5分鐘。去掉上清液。沉淀物重懸于600μL乙醇中，隨后以14，000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘。終末沉淀物重懸于36μL乙醇中并且立即使用或在轟擊前貯存在冰上至多4小時。對于轟擊，將2周齡的玉米葉切成大約Icm長度并置于直徑2英寸的消毒W(wǎng)hatman濾紙上。在BMS培養(yǎng)的細胞的情形時，將5mL的1周齡混懸細胞真空緩慢地在置于濾器裝置上的直徑2英寸濾紙上真空抽濾以除去多余液體。將截留植物材料的濾紙安置在滲透誘導培養(yǎng)基(N61-100-25，0.2M甘露醇，0.2M山梨醇)上，在轟擊前于27°C黑暗中持續(xù)2-3小時。射擊前幾分鐘，從該培養(yǎng)基上取下濾紙并置于無菌的開口培養(yǎng)皿上，以使得愈傷組織表面部分地干燥。為保持植物材料的位置，將一張消毒的金屬篩網(wǎng)鋪在樣品的頂部。對于葉材料，每個平板用IOyL金-DNA溶液以2，200psi射擊1次，并且對于BMS培養(yǎng)的細胞，以1，IOOpsi射擊2次。轟擊后，將容留樣品的濾紙轉(zhuǎn)移到MS基礎培養(yǎng)基上并在瞬時測試法之前于27°C在黑暗中溫育2日。按照如上所述的本領域方案，確定報道基因的瞬時表達水平。1.6.3原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染通過遵循Sheen(1990)開發(fā)的方案，實施原生質(zhì)體分離。玉米籽苗在黑暗中于25°C保持10日并且在原生質(zhì)體制備前光照20小時。將葉的中間部分切成0.5mm的條(長度約6cm)并在含有(w/v)纖維素RS、0.(w/v)離析酶RlO(兩者均來自日本西宮YakultHonsha)、0.6M甘露醇、IOmMMes(pH5.7)UmMCaCl2UmMMgCl2UOmMβ-巰基乙醇和0.1%BSA(w/v)的酶溶液中，在23°C溫育3小時，隨后以80轉(zhuǎn)/分鐘輕柔振搖10分鐘以釋放原生質(zhì)體。通過IOOxg離心2分鐘收集原生質(zhì)體，在冷的0.6M甘露醇溶液中洗滌1次，離心并重懸于冷的0.6M甘露醇(2xl06個/mL)中。將總體積100μL無菌水中的總計50μg質(zhì)粒DNA添加到0.5ml的玉米原生質(zhì)體(IxlO6個細胞/mL)懸液中并輕柔混合。添加0.5mLPEG溶液(40%PEG4000,IOOmMCaNO3,0.5甘露醇)并在70°C預溫，同時輕柔振搖，隨后添加4.5mL匪溶液(0.6M甘露醇，15mMMgCl2和0.1%MES)。該混合物在室溫孵育15分鐘。通過在600轉(zhuǎn)/分鐘沉淀5分鐘并重懸于1.OmL的MMB溶液，將原生質(zhì)洗滌2次，并在25°C于黑暗中溫育48小時。在終末洗滌步驟后，將原生質(zhì)體收集在3mLMMB培養(yǎng)基中，并在25°C于黑暗中溫育48小時。按照本領域方案，確定報道基因的瞬時表達水平。1.7通過直接轉(zhuǎn)換和通過Fl雜合未成熟胚的愈傷組織培養(yǎng)恢復無標記的轉(zhuǎn)基因植物在含有鄰接切除位點的選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物與含有I-SceI基因的第二轉(zhuǎn)基因植物雜交后，每一個Fl后代(胚/種子)可以具有(1)具有完整GOI和選擇標記的在胚中的全部細胞(具有完整選擇標記的細胞)；(2)具GOI而無選擇標記的全部細胞(完全標記切除發(fā)生)；和(3)—些細胞使得選擇標記切除，導致混合的基因型。根據(jù)切除在授粉期間或之后發(fā)生的階段，在胚/種子中可能存在不同基因型。若選擇標記切除正好在授粉的單個細胞階段發(fā)生，則預期有完全切除的植物。然而，若標記切除事件在胚發(fā)育期間晚期多細胞階段發(fā)生，則一個合子/胚可以含有混合的細胞類型，即帶有和不帶選擇標記的細胞。常規(guī)地收獲Fl后代的成熟種子并種植在土壤中，以獲得各單株籽苗用于將來篩選。分子技術如PCR分析和DNA印跡分析用來鑒定完全切除的植物。1.7.1基于Fl未成熟胚轉(zhuǎn)換的篩選法與通過篩選成熟種子的常規(guī)方法相比，為了節(jié)省時間，使用在含有選擇劑的生根培養(yǎng)基(A-8)上轉(zhuǎn)換Fl未成熟胚的方法，其中所述的選擇劑針對與I-Sce-I基因連接的選擇標記。例如若dsdA選擇標記用于產(chǎn)生I-Sce-I植物，則在生根培養(yǎng)基中使用D-絲氨酸。剖分未成熟胚并置于生根培養(yǎng)基(A-8)上，并且隨后以16小時光周期在27°C培養(yǎng)箱中溫育?；謴偷淖衙珉S后進行分子篩選以鑒定完全切除標記的植物。就常規(guī)方法與未成熟胚轉(zhuǎn)換方法之間比較而言，采用未成熟胚轉(zhuǎn)換方法節(jié)省約80日，假定兩種方法具有相同的完全切除事件獲得率(表11)。1.7.2基于愈傷組織培養(yǎng)Fl未成熟胚的篩選法為提高獲得完全切除事件的機會，在本發(fā)明中使用培養(yǎng)Fl未成熟胚的方法。與篩選從成熟種子和從未成熟胚衍生的Fl植物的方法相比，我們假定與未成熟胚的胚性愈傷組織培養(yǎng)相關的細胞分裂因胚性愈傷組織起始過程中活躍的DNA增殖和修復活性而促進標記切除活性。由于通過玉米胚性愈傷組織培養(yǎng)的再生是基于單個細胞的過程，因而再生的籽苗含有單一細胞類型，例如完全切除的基因型或不切除的基因型。例如，若切除僅在Fl未成熟胚/種子的盾片中發(fā)生，則不可能通過篩選從成熟種子或已轉(zhuǎn)換的未成熟胚衍生的植物而恢復完全切除植物。相反，嵌合的未成熟胚的愈傷組織培養(yǎng)物可以導致恢復完全切除植物。表11.常規(guī)方法和組織培養(yǎng)再生方法在獲得完全標記切除植物中所需要時間的比較。將1至1.8mm長度的Fl未成熟胚剖分到恢復培養(yǎng)基(A_4，IM培養(yǎng)基)并在27°C于黑暗中溫育約5至10日，并且隨后將衍生的愈傷組織轉(zhuǎn)移到并在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)約14日，其中所述的選擇培養(yǎng)基含有針對與Sce-I基因連接的第二選擇標記基因的選擇劑。愈傷組織進一步在該選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)另外14日，并且隨后轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(A-7)并在組織培養(yǎng)室中16小時/天的光周期下孵育約7至14日。再生的植物隨后在如再生步驟那樣的相同條件下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(A-8)。籽苗隨后進行分子篩選以鑒定完全切除標記的植物。1.7.3對于DSB介導的同源重組或標記切除的植物分析1.7.3.IOTS組織化學測試法用來監(jiān)測重組事件的一種方法是在來自含PJB034的植物的葉和谷粒組織中的GUS組織化學染色法。PJB034構(gòu)建體包含了含有內(nèi)部部分序列重復的被打斷的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)報道基因，從而有功能的可讀框僅可以借助所述重復序列之間的同源重組而重構(gòu)。使用本領域技術人員已知的方法，可以通過生色底物如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸用肉眼看到植物組織中功能性⑶S蛋白的表達。通過組織化學染色法對于來自[JB034xI-SceI]和[JB034xI-SceINull]植物的植物組織分析⑶S表達。結(jié)果概述于表12和圖11中。來自JB034xI-SceI雜交而產(chǎn)生的植物的組織比來自JB034χNull雜交而產(chǎn)生的植物的組織顯示在葉和谷粒中顯著更多的⑶S表達。與零植物(nullplant)(即不表達I-SceI的植物)的雜交不顯示可檢測到的GUS染色。對于全部組合，就I-SceI和JB034構(gòu)建體的母性或父性傳遞進行互交，檢測不到母性方式或父性方式提供的轉(zhuǎn)基因之間GUS表達的定量或定性差異。與CER041(ScBVI-SceI)植物相比，通常在從與CER040b(pUbiI-SceI)的雜交所衍生的植物中觀察到更大量的GUS染色。表12.來自JB034XI-SceI植物的組織的⑶S染色結(jié)果來自不同JB034χI-SceI植物的葉組織在⑶S染色的量方面不同，即可看到代表在葉發(fā)育中相對晚發(fā)生的重組事件的點狀⑶S染色、代表從先前已經(jīng)發(fā)生重組的細胞中發(fā)育的組織的線狀GUS染色，至代表在葉形成之前的發(fā)育期中發(fā)生的重組事件的完全藍色葉。由于重組在細胞水平發(fā)生，有可能的是來自相同植物的不同葉會產(chǎn)生不同的GUS染色模式。1.7.3.2用于標記切除的PCR分析使用PCR來提供對來自包含PJB034或pJB039報告構(gòu)建體的植物的重組事件的分子表征。使用引物7和8，通過PCR分析來自JB034雜交的植物，其中所述的引物分別基于ScBV啟動子和⑶SORF中在重復區(qū)下游的區(qū)域。SEQIDNO21引物7(ScBVfwd)5’-GATCGCAGTGCGTGTGTGACACC-3’SEQIDNO22引物8(GUSAS879rev)5，-GTCCGCATCTTCATGACGACC-3，為了使分析通量最大化，將基因組DNA分組合并用于PCR分析。從天然JB034構(gòu)建體用引物7和8的PCR擴增產(chǎn)生1.7kb產(chǎn)物，而從重組JB034的擴增產(chǎn)生1.OKbPCR產(chǎn)物。圖12顯示了用來自[JB034χI-SceI]植物的基因組DNA進行的PCR產(chǎn)生1.7kb和l.Okb產(chǎn)物，當模板是來自自交的JB034的基因組DNA時，導致僅產(chǎn)生自未重組的JB034基因座中所預期的1.7kb產(chǎn)物。隨后單獨地分析產(chǎn)生切除特異性PCR產(chǎn)物的來自基因組DNA合并物的各株植物。使用分別基于AHAS可讀框和與T-DNA右邊界毗鄰的區(qū)域的引物9和10，通過PCR分析來自JB039雜交的植物。用引物9和10的PCR應當從天然JB039模板產(chǎn)生6.7kb產(chǎn)物，并且從提出的重組JB039中產(chǎn)生0.9kb產(chǎn)物。PCR在不允許高效擴增6.7kb天然產(chǎn)物的條件下實施，從而旨在證實基因組DNA對于全部樣品是完整的，進行一個額外的PCR，旨在提供從包含天然JB039構(gòu)建體的基因組DNA中可輕易擴增的產(chǎn)物。這種使用引物9和11的證實性PCR從天然JB039中產(chǎn)生1.2kb產(chǎn)物，并且從重組的JB039中不產(chǎn)生產(chǎn)物，原因是引物11同源序列丟失。SEQIDNO23引物9(AHASORFfwd)5，-CTAATGGTGGGGCTTTCAAGGSEQIDNO:24引物10(RB近端rev)5，-CCTTAAGGCGATCGCGCTGAGGCSEQIDNO:25引物11(遠側(cè)AHASRB末端rev)5，-AGTGTACGGAATAAAAGTCC為了高效地分析來自盡可能多的植物的基因組DNA，合并來自[JB039xI-SceI]或[JB039χNull]植物的植物基因組DNA并初始地進行分析。圖13顯示這些PCR分析的常見結(jié)果。隨后單獨地分析產(chǎn)生切除特異性PCR產(chǎn)物的來自基因組DNA合并物的各株植物。1.7.3.3用于標記切除的植物分析產(chǎn)生針對⑶-US報告構(gòu)建體(JB034)的一系列17個雜交。用遍在蛋白I-SceI構(gòu)建體(CER40b:Zm.遍在蛋白啟動子:Zm.遍在蛋白內(nèi)含子I-SceI:N0S終止子)從8個雜交獲得總計369個事件并且用ScBVI-SceI構(gòu)建體(CER41=ScBV啟動子I-SceINOS終止子)從9個雜交獲得總計520個事件。對遍在蛋白I-SceI雜交的組織化學篩選產(chǎn)生了由藍色條紋和斑點顯示的118個陽性重組事件，每個雜交平均15個重組事件。對354個這些事件的PCR分析產(chǎn)生58個陽性PCR產(chǎn)物，每個雜交平均7個重組事件。當使用ScBVI-SceI進行所述雜交時，從520個事件中獲得14個組織化學陽性事件，每個雜交平均2個重組事件。PCR分析從516個事件中鑒定出28個陽性PCR產(chǎn)物，每個雜交平均4個重組事件(表3)。較弱的ScBV啟動子產(chǎn)生源自組織化學和PCR篩選方法的較少重組事件。JB034與I-SceI零植物品系的雜交產(chǎn)生93個事件，其中之一呈組織化學和PCR陽性。陽性事件可能是自發(fā)重組事件或誤差的結(jié)果。對于JB039品系和所述兩個I-SceI構(gòu)建體進行類似的系列雜交。4個假⑶Sχ遍在蛋白I-SceI雜交產(chǎn)生188個事件，其中18個事件產(chǎn)生陽性PCR產(chǎn)物，每個雜交平均5個陽性事件。使用ScBV-I-SceI構(gòu)建體，其余7個雜交產(chǎn)生434個事件，其中僅8個事件為PCR陽性，每個雜交平均1個重組事件(表13)。對所述事件的亞組進行組織化學染色，然而在強烈藍色背景中不能辨出白色條紋和斑點，從而放棄了進一步染色。就被打斷的GUS構(gòu)建體而言，使用較弱的ScBV啟動子產(chǎn)生約低4倍的重組事件。表13.來自全部再生植物的分子篩選結(jié)果。陽性1重組由藍色斑點或條紋顯示并且陽性PCR事件由適宜大小的條帶顯示。全部結(jié)果是嵌合的，這在本質(zhì)上因為合并了來自相同事件的組織和/或在任意單株植物中所得到的不完全切除。平均數(shù)2表述為事件數(shù)/雜交含有⑶-US報告構(gòu)建體JB034的834個再生事件中總計132個再生事件對于重組為染色陽性，而870事件中的86事件產(chǎn)生了指示重組基因的PCR條帶。這些陽性事件中50個重組事件對兩項標準均為陽性(表14)。在缺I-SceI的雜交中獲得的一個陽性事件是自發(fā)事件或誤差。表14.用再生和篩選結(jié)果獲得的事件的概述。從每個類型雜交獲得的經(jīng)組織化學法或用PCR分析的事件概述。所篩選GU-US事件對于每個試驗是不同的，因為在事件采樣時間上，每個植物的組織對于組織化學分析而言并非總是可獲得的。對切除事件的組織化學分析是不連續(xù)的并且專門進行PCR分析。1.7.4用于產(chǎn)生具有I-SceI和靶切除這兩者的植物的再轉(zhuǎn)化策略我們還評估了獲得推定的標記切除事件的另一種方法用含有I-SceI基因的構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化靶切除的植物，其中所述的構(gòu)建體具有第二選擇標記。既然組織培養(yǎng)方法可以促進切除活性(假設)，用幾個試驗性構(gòu)建體(HEN構(gòu)建體JB084、LM319或M320)實施再轉(zhuǎn)化實驗。為進行再轉(zhuǎn)化實驗，我們遵循上文所述的轉(zhuǎn)化方法，使用切除靶的植物(帶有AHAS作為選擇標記)作為轉(zhuǎn)化供體材料并使用針對用于第二轉(zhuǎn)化構(gòu)建體的選擇盒的選擇劑(例如dsdA基因的D-Ser)。當使用遍在的組成型強啟動子表達HEN基因和⑶-US時，分析成熟的谷粒后，在玉米的胚軸中檢測不到DSB介導的HR(由藍色斑點顯示)。為在胚中實現(xiàn)DSB介導的HR，選擇超級啟動子，因為在玉米中這種啟動子顯示在萌發(fā)期間的整個胚(盾片和胚軸)中強烈表達、在再生期間的愈傷組織(包括胚性愈傷組織)中強烈表達?？梢酝ㄟ^在超級啟動子與I-SceI基因之間添加賦予內(nèi)含子介導增強作用(IME)的內(nèi)含子來增強在這些組織中的表達水平。1.7.4.1胚特異的啟動子為了使正在發(fā)育的玉米谷粒的胚中的I-SceI表達最大化，產(chǎn)生了這樣的載體，其包含其中I-SceI基因受超級啟動子(一種已經(jīng)被描述成驅(qū)動這些組織中高水平表達的啟動子)驅(qū)動的表達盒。載體pJB082是包含p-Super:I-SceIt_Nos表達盒的基于pUC的載體，并且通過3重連接T4DNA聚合酶補平的來自pLM266的HindIII-BglII超級啟動子片段、T4DNA聚合酶補平的PJBOlO的Ascl-SbfI片段和T4DNA聚合酶補平的pCER039的Ascl片段產(chǎn)生。最終如何裝配JB084？雙元載體pLM319包含p-Super::I_SceI::t_Nos盒，并且通過將T4DNA聚合酶補平的PJB082的PacI-PmeI片段連接到T4DNA聚合酶補平的AscI消化的pLM151中產(chǎn)生。在pUC載體骨架中通過將T4DNA聚合酶補平的來自pLM303的BglII-AscI遍在蛋白內(nèi)含子片段連接到T4DNA聚合酶補平的SphI消化的PJB082產(chǎn)生了包含p-Super::I-Ubi:I-SceI:t-Nos的表達盒，從而產(chǎn)生pJB083。雙元載體pLM320通過將T4DNA聚合酶補平的來自pJB083的PacI-PmeIp-Super:I-UbiI-SceIt_Nos片段連接到T4DNA聚合酶補平的AscI消化的pLM151中產(chǎn)生。1.7.4.2報道基因事件的再轉(zhuǎn)化每種報告構(gòu)建體JB034和JB039的純合事件進行胚拯救并用具有受超級啟動子驅(qū)動的I-SceI基因的JB084再轉(zhuǎn)化。據(jù)信這種啟動子在正在萌發(fā)的胚和盾片層中產(chǎn)生較高的表達，這可以改善重組植物的恢復。使用來自JB034純合事件的胚，以RLM319和RLM320進行相似的再轉(zhuǎn)化設置?？傆?12個胚用RLM319轉(zhuǎn)化并且100個胚用RLM320轉(zhuǎn)化。1.7.4.3用于標記切除的植物分析含有具假標記基因的JB039的總計16個品系從采用JB084的再轉(zhuǎn)化實驗中恢復。對9個品系在五葉期染色并檢驗白色斑塊。3個品系顯示一半白色一半藍色樣式的葉。其余顯示完全藍色的葉。來自6個品系的葉在授粉時染色并且均顯示完全藍色的葉，其中所述的6個品系包括先前顯示一半白色模式的一個品系。含有間斷的GUS的基因JB034的總計11個品系從采用JB084的再轉(zhuǎn)化實驗中恢復。全部品系均對重組進行染色，但均不顯示任何藍色著染。含有間斷的⑶S基因的JB034的總計20個品系從采用LM319的2個再轉(zhuǎn)化實驗中恢復。含有間斷的GUS基因的JB034的總計28個品系從采用LM320的2個再轉(zhuǎn)化實驗中恢復。對這些再轉(zhuǎn)化的植物篩選選擇標記的存在并進行GUS染色以篩選重組。對9株LM319和15株LM320植物進行GUS染色以篩選重組。沒有同源重組陽性事件從使用具無內(nèi)含子的超級啟動子的JB084或RLM319所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體中恢復。從利用帶內(nèi)含子的超級啟動子的RLM320的轉(zhuǎn)化中鑒定到11個陽性事件，其中3個在組織培養(yǎng)中是完全藍色的(表15，圖5和6)。用所述超級啟動子構(gòu)建體產(chǎn)生的再轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)表明與內(nèi)含子(即LM320中的玉米遍在蛋白內(nèi)含子)組合的超級啟動子高效地驅(qū)動I-SceI基因的表達到有功能的水平。無這種內(nèi)含子時(LM319)，該超級啟動子無效。表15.用于每個轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體和證實的品系數(shù)。⑶S染色顯示使用與遍在蛋白內(nèi)含子偶聯(lián)的超級啟動子發(fā)生重組，而使用無該內(nèi)含子的超級啟動時，沒有獲得重組。第一構(gòu)建體第二構(gòu)建體感染的胚證實的事件數(shù)重組事件/#事件完全重組的事件JB039JB084123/90JB034JB084110/110JB034LM31911270/90JB034轉(zhuǎn)基因植物用RLM320或JB084再轉(zhuǎn)化，隨后自交以結(jié)出種子。含有JB084的后代均不顯示同源重組。對來自含有RLM320的總計15個Ttl事件的葉檢驗同源重組。借助⑶S組織化學分析和PCR，15個事件中的11個顯示同源重組。11個事件中的3個是完全重組的。11個事件中的5個在T1世代中進行檢驗。每個事件分析3至4株植物。總計12個T1植物中的2株植物是完全重組的。2.使用微型玉米作為用于確定玉米中標記切除頻率的高效工具為了減少獲得無標記轉(zhuǎn)基因植物的時間，可以使用一種迅速循環(huán)的矮化玉米品系。這種可轉(zhuǎn)化的矮化品系提供勝過常規(guī)玉米品系的優(yōu)勢，原因在于它體型小和短生活周期-它在約60日內(nèi)完成從種子到種子的生活周期，相對于常規(guī)玉米品系的120日。該品系在確定玉米中HEN的標記切除效率中極有用。轉(zhuǎn)化實驗主要基于采用實施例3中所述農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法的方案實施。另一方面，轉(zhuǎn)化實驗也可以基于DNA直接遞送方法如生物射彈轉(zhuǎn)化法，例如本領域技術人員已知的粒子轟擊法實施。轉(zhuǎn)化供體材料的制備也遵循上文所述的方法。附圖簡述圖1.載體pCER040b。包含驅(qū)動I-SceI表達的玉米遍在蛋白啟動子/內(nèi)含子盒的雙元I-SceI表達載體。圖2.載體pCER041。包含驅(qū)動I-SceI表達的ScBV啟動子的雙元I-SceI表達載體。圖3.載體pJB034。包含⑶-US報道基因盒的雙元報道基因載體。圖4.載體pJB039。包含假標記切除盒的雙元報道基因載體。圖5.載體pLM319。包含驅(qū)動I-SceI表達的超級啟動子的雙元I-SceI表達載體。圖6.載體pLM320。包含由聯(lián)合Zm遍在蛋白內(nèi)含子的超級啟動子所驅(qū)動的I-SceI表達的雙元I-SceI表達載體。圖7.用于DSB誘導的同源重組的構(gòu)建體的簡圖。(A)⑶-US構(gòu)建體編碼其中⑶SORF包含內(nèi)部重復(即650bp的GUS編碼序列加陰影的條)的表達盒，具有位于重復區(qū)(⑶-US)之間的一個I-SceI識別位點。加陰影的短線)，帶一個位于重復區(qū)(⑶-US)之間的I-SceI識別位點。(B)假標記切除載體包含在I-SceI位點側(cè)翼分布的重復DNA序列(即，選擇標記盒的850bpAHAS終止子區(qū)域灰色條)，旨在充當同源重組的靶序列(HR靶)。(C)I-SceI構(gòu)建體包含I-SceI表達盒。除了上述元件之外，全部這些載體的T-DNA區(qū)還包含選擇標記盒(SMS)。圖8.使用瞬時測試法鑒定顯示潛在DSB介導的HR的Ttl品系的選擇過程。包含I-SceI(或⑶-US)的中度至高度表達品系用⑶-US(或I-SceI)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。選擇到顯示GUS組織化學陽性表達(藍色斑點)的品系。Ttl植物中的幼胚用于未成熟胚轉(zhuǎn)換以鑒定純61合品系，這與常規(guī)玉米育種時間表相比，加快至少1.5個月，因為省略了種子發(fā)育和成熟、種子干燥時間。這種包括未成熟胚轉(zhuǎn)換的瞬時測定方法不僅引起所需的總時間減少，還引起鑒定候選品系的頻率提高，其中所述的候選品系顯出顯示高比率同源重組的潛能。圖9.用于鑒定轉(zhuǎn)基因玉米品系中出現(xiàn)的DSB誘導的HR的方法。每種方法需要多種時間范圍以獲得顯示DSB介導的HR的轉(zhuǎn)基因品系使用雜交(A)的常規(guī)方法需要最少19個月。再生(B)和再轉(zhuǎn)化(C)方法需要大約8-9個月。μ*提示圖8和10中描述的瞬時測試法系統(tǒng)。圖10.在玉米葉組織中對DSB誘導的同源重組進行瞬時測試法。(A)用包含功能性⑶SORF(左側(cè))或⑶-USORF(右側(cè))的表達盒的載體轟擊野生型玉米葉組織，證實⑶-US的表達沒有導致通過組織化學染色法檢測到有功能的GUS。(B)用GU-US表達盒轟擊來自表達I-SceI的植物的葉組織，導致通過組織化學染色法產(chǎn)生可檢測的⑶S。該結(jié)果在使用遍在蛋白啟動子(左側(cè))和ScBV啟動子(右側(cè))來驅(qū)動I-SceI表達的玉米植物中見到。圖11.[JB034XI-SceI]植物谷粒的組織化學分析。(A)對通過雜交攜帶⑶-US表達盒的玉米品系與表達I-SceI的玉米品系產(chǎn)生的谷粒進行組織化學染色，顯示產(chǎn)生有功能的GUS。當分析來自表達I-SceI的純合植物(在左側(cè)平板底部右孔)的種子時，無GUS染色。B)純合⑶-US谷粒的組織化學染色顯示在I-SceI表達缺乏時，不產(chǎn)生有功能的⑶S蛋白。圖12.[JB034XI-SceI]植物(匯集樣品)的基因組PCR。(A)制備來自[GU-USXI-SceI]植物的基因組DNA樣品并匯集。相似的基因組DNA匯集物從自花授粉的⑶-US植物制備。如實施例中所述進行基因組PCR。使用純化的PJB034載體的陽性對照反應產(chǎn)生從原有構(gòu)建體中預期的1.7Kb產(chǎn)物；該反應也產(chǎn)生顯示重組基因座的1.OKb產(chǎn)物，表明細菌傳代期間的低水平載體重組。在⑶-US基因座處同源重組后，載體PCER044等同于載體PJB034，并且產(chǎn)生預期的1.0KbPCR產(chǎn)物。用來自野生型玉米植物的基因組DNA進行的PCR擴增沒有導致任何PCR產(chǎn)物產(chǎn)生，表明在這些反應中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物是對JB034基因座特異的。分析基因組DNA匯集物表明用[JB034XI-SceI]和純合JB034匯集物產(chǎn)生了1.7Kb的未重組產(chǎn)物，但是重組的1.0Kb產(chǎn)物僅在使用[JB034XI-SceI]基因組DNA作為模板時產(chǎn)生。(B)來自純合JB034植物(左側(cè))和[JB034XI-SceI]植物(右側(cè))的谷粒和葉樣品的組織化學染色，顯示⑶S基因座的同源重組僅在表達I-SceI的植物中可檢測到。圖13.[JB039XI-SceI]植物(匯集樣品)的基因組PCR。產(chǎn)生[JB034XI-SceI](藍色)和[JB034CNull](紅色)植物的基因組DNA匯集物。使用證實JB039模板存在的引物9和10并用檢測植物的引物9和11進行PCR，其中所述的植物包含在該基因座已經(jīng)發(fā)生同源重組的細胞(左側(cè))。用引物9和10的PCR從全部樣品產(chǎn)生預期的1.2Kb產(chǎn)物，表明全部基因組DNA匯集物包含天然JB039基因座(上部右側(cè))。用引物9和11的PCR僅在基因組DNA匯集物A2和A4中產(chǎn)生0.9Kb產(chǎn)物，其中所述的A2和A4分別從[JB039XI-SceI]雜交(底部右側(cè))集成而來。圖14.分別的[JB039XI-SceI]植物的基因組PCR。使用如實施例中描述的引物組合9:10(上部)和9:11(底部)，通過PCR分析來自各[JB039xl-Scel]植物的基因組DNA。對照反應(無DNA、載體對照pJB039和野生型玉米基因組DNA)均從兩種引物組中產(chǎn)生預期產(chǎn)物。對基因組DNA匯集物A2的分析鑒定到包含重組的JB039基因座的兩株分別的植物，即植物8a和％。分析形成基因組DNA匯集物A4的植物，表明僅植物17b包含重組的基因座。標為15a和109的泳道代表來自不包括于前述基因組DNA匯集物當中的各[JB039XI-SceI]植物的基因組DNA樣品。圖15.合成的歸巢核酸內(nèi)切酶I-SceI基因序列的圖示。Gateway附著區(qū)Att-Ll和Att-L2由斜線框顯示。Kozak共有序列由垂直箭頭指示并且可讀框由實心箭頭指示。顯示了所選限制性位點的位置。權(quán)利要求用于從植物或植物細胞的基因組切除核酸序列的方法，所述方法包括a)用編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，b)從步驟a)的細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物品系，c)用步驟b)的植物品系或其細胞或部分實施瞬時測試法以分析該轉(zhuǎn)基因DNA雙鏈斷裂誘導酶的功能性，d)將步驟b)的植物品系與含有待切除核酸序列的植物品系雜交，其中待切除的核酸序列包含對步驟a)的酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中待切除的核酸序列在兩側(cè)鄰接允許DNA修復機制的重復序列，和e)進行未成熟胚轉(zhuǎn)換或通過愈傷組織形成進行組織培養(yǎng)再生。2.用于從植物或植物細胞的基因組切除核酸序列的方法，所述方法包括a)用編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，其中待切除的核酸序列包含對DNA雙鏈斷裂誘導酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中待切除的核酸序列在兩側(cè)鄰接允許DNA修復機制的重復序列，b)從步驟a)的細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物品系，c)用步驟b)的植物品系或其細胞或部分實施瞬時測試法以分析步驟a)的構(gòu)建體的識別序列和重復序列的功能性，d)將步驟b)的植物品系與含有DNA雙鏈斷裂誘導酶的植物品系雜交，和e)進行未成熟胚轉(zhuǎn)換或通過愈傷組織形成進行組織培養(yǎng)再生。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中DNA修復機制是同源重組。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，所述方法還包括在步驟b)或c)之后鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因品系。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中單拷貝轉(zhuǎn)基因品系的鑒定通過包括定量PCR或Southern雜交在內(nèi)的分子技術進行。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，所述方法還包括在步驟b)或c)之后分析轉(zhuǎn)基因表達水平。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中轉(zhuǎn)基因表達水平的分析通過包括RT-PCR或Northern雜交在內(nèi)的分子技術進行。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，所述方法還包括在步驟b)或c)之后對轉(zhuǎn)基因植物品系授粉，其中所述授粉是自花授粉或與野生型品系異花授粉。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中對通過授粉所獲得的種子和/或籽苗分析它們的接合性。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中選擇在接合性分析后鑒定的純合品系用于步驟d)的雜交。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中步驟a)的轉(zhuǎn)化選自農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、生物射彈轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、聚乙二醇轉(zhuǎn)化、電穿孔、超聲處理、微量注射、大量注射、真空抽濾、感染和在含DNA的溶液中孵育干燥胚。12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中步驟c)的瞬時測試法是染色體內(nèi)同源重組測定法。13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中步驟c)的瞬時測試法包括報告構(gòu)建體的瞬時轉(zhuǎn)化。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，直到它引用權(quán)利要求1或從屬權(quán)利要求為止，其中報告構(gòu)建體選自GUS構(gòu)建體、綠色熒光蛋白構(gòu)建體、氯霉素轉(zhuǎn)移酶構(gòu)建體、螢光素酶構(gòu)建體、0-半乳糖苷酶構(gòu)建體、R-基因座基因產(chǎn)物構(gòu)建體、內(nèi)酰胺酶構(gòu)建體、xylE基因產(chǎn)物構(gòu)建體和a淀粉酶構(gòu)建體、酪氨酸酶構(gòu)建體和水母發(fā)光蛋白構(gòu)建體。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，直到它們引用權(quán)利要求1或從屬權(quán)利要求為止，其中報告構(gòu)建體包含待切除的核酸序列，其中該核酸序列包含對步驟a)的酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中該核酸序列在兩個末端鄰接允許DNA修復機制的重復序列，所述的DNA修復機制包括同源重組。16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中對通過步驟e)所獲得的種子和/或籽苗分析包括同源重組在內(nèi)的DNA雙鏈斷裂介導的修復機制。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中分析種子和/或籽苗中包括同源重組在內(nèi)的DNA修復機制是通過包括PCR分析法、比色或生物化學測定法或者DNA測序法在內(nèi)的分子技術確定的。18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中DNA雙鏈斷裂誘導酶選自歸巢核酸內(nèi)切酶、限制性核酸內(nèi)切酶、II類核酸內(nèi)切酶、重組酶、轉(zhuǎn)座酶和嵌合核酸內(nèi)切酶。19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中DNA雙鏈斷裂誘導酶選自I-Scel、F-Scel、F-SceII、F_SuvI、F_TevI、F_TevII、I_AmaI、I_AniI、I_CeuI、I_CeuAIIP、I一Chul、I-Cmoel>I一Cpal、I一Cpall、I一Crel、I一CrepsblP、I一CrepsbllP、I一CrepsblllP、I-CrepsbIVP、I-Csml、I-Cvul、I-CvuAIP、I-Ddil、I-Ddill、I-Dirl、I-Dmol、I-Hmul、I-HmuII、I-HspNIP、I-Llal、I-Msol、I-Naal、I-NanI,I-NclIP、1-NgrIP、I-Nitl、I-Njal、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、1-PgrIP、1-PobIP、I-Porl、I-PorIIP、I-PpbIP、I-Ppol、I-SPBetaIP、I-Scal、I-Scell、1-SceIII、1-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-SexIP、1-SneIP、I-SpomCP、1-SpomIP、1-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I_SthPhiST3P、I_SthPhiS3bP、1-TdeIP、I-TevI、RTII-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAlP、I_UarHGPA13P、1-VinIP、1-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI_Rma43812IP、PI-SPBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI和PI-Tlill。20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中DNA雙鏈斷裂誘導酶選自具有SEQIDNOs26或27中所示氨基酸序列的酶或其基本的同源物。21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中步驟a)的構(gòu)建體選自載體、質(zhì)粒、粘粒、細菌構(gòu)建體或病毒構(gòu)建體。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中載體選自pCB系列、pLM系列、pJB系列、pCER系列、PEG系列、pBR系列、pUC系列、M13mp系列和pACYC系列。23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中步驟a)的構(gòu)建體分別包含用于表達DNA雙鏈斷裂誘導酶或用于表達待切除核酸序列的啟動子。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中啟動子選自組成型啟動子、發(fā)育依賴的啟動子、植物病毒衍生的啟動子、誘導型啟動子、化學誘導型啟動子、生物脅迫或非生物脅迫誘導型啟動子、病原體誘導型啟動子、組織特異的啟動子、對胚、盾片、胚乳、胚軸、花藥、子房、花粉、分生組織、花、葉、莖、根、種子、果實和/或塊莖具有特異性的啟動子、能夠在包括玉米、大麥、小麥、黑麥和稻在內(nèi)的單子葉植物中種子特異性表達的啟動子、超級啟動子和此類啟動子的功能性組合。25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，其中啟動子選自遍在蛋白啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、菜豆蛋白啟動子、35SCaMV啟動子、19SCaMV啟動子、短或長USB啟動子、Rubisco小亞基啟動子、豆球蛋白B啟動子、胭脂堿合酶啟動子、TR雙重啟動子、章魚堿合酶啟動子、液泡ATP酶亞基啟動子、富含脯氨酸的蛋白啟動子、PRP1啟動子、苯磺酰胺誘導型啟動子、四環(huán)素誘導型啟動子、脫落酸誘導型啟動子、水楊酸誘導型啟動子、乙醇誘導型啟動子、環(huán)己酮誘導型啟動子、熱誘導型hsp80啟動子、寒冷誘導型a-淀粉酶啟動子、創(chuàng)傷誘導的pinll啟動子、2S白蛋白啟動子、豆球蛋白啟動子、未知種子蛋白啟動子、油菜籽蛋白啟動子、蔗糖結(jié)合蛋白啟動子、豆球蛋白B4啟動子、油質(zhì)蛋白啟動子、Bce4啟動子、高分子量麥谷蛋白啟動子、麥醇溶蛋白啟動子、分支酶啟動子、ADP-葡萄糖焦磷酸酶啟動子、合酶啟動子、bgpl啟動子、lpt2或lptl啟動子、大麥醇溶蛋白啟動子、谷蛋白啟動子、水稻素啟動子、谷醇溶蛋白啟動子、麥醇溶蛋白啟動子、谷蛋白啟動子、玉米醇溶蛋白啟動子、kasirin啟動子、黑麥堿啟動子、orysi啟動子、ZM13啟動子、BplO啟動子、Lcgl啟動子、AtDMCl啟動子、I類patatin啟動子、B33啟動子、組織蛋白酶D抑制劑啟動子、淀粉合酶啟動子、GBSS1啟動子、甘薯塊根特異蛋白啟動子、番茄果實特異性啟動子、胞質(zhì)FBP酶的啟動子、ST-LSI啟動子、CP12啟動子、CcoMTl啟動子、HRGP啟動子、超級啟動子、與賦予內(nèi)含子介導增強作用的內(nèi)含子組合的啟動子和此類啟動子的功能性組合。26.根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項所述的方法，其中所述啟動子包含SEQIDN0:6第1至1112位核苷酸中描述的核酸序列。27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中待切除的核酸包含T-DNA區(qū)或其部分的序列或編碼選擇標記或其部分。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中選擇標記選自負選擇標記、賦予針對殺生物代謝抑制劑、針對抗生素或針對除草劑的抗性的標記、正選擇標記和反選擇標記。29.根據(jù)權(quán)利要求27或28的方法，其中選擇標記選自乙酰羥酸合酶、D-絲氨酸脫氨酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦降解酶、失活茅草枯的脫鹵素酶、失活磺酰脲和咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶、降解溴苯腈的腈水解酶、卡那霉素-或G418-抗性基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、6-磷酸-2-脫氧葡萄糖磷酸酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶、D-氨基酸代謝酶、D-氨基酸氧化酶、慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷-3-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、博來霉素耐藥性決定子、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶、3_葡糖醛酸糖苷酶、甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶、UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶、胞嘧啶脫氨酶、細胞色素P-450酶、吲哚乙酸水解酶、鹵代烷脫鹵素酶和胸苷激酶。30.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中植物選自玉米、擬南芥屬(Arabidopsis)植物、高粱、稻、油菜籽、煙草、小麥、黑麥、大麥、燕麥、馬鈴薯、番茄、甜菜、豌豆、甘蔗、蘆筍、大豆、苜蓿、落花生、向日葵和西葫蘆。31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，直到它們涉及權(quán)利要求1或從屬權(quán)利要求為止，其中用編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化步驟b)的植物品系來替換步驟d)的雜交，其中待切除的核酸序列包含對步驟a)的酶為特異的至少一個識別序列，用于位點定向地誘導DNA雙鏈斷裂，并且其中待切除的核酸序列在兩側(cè)鄰接允許DNA修復機制的重復序列。32.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，直到它們涉及權(quán)利要求2或從屬權(quán)利要求為止，其中用編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶的構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化步驟b)的植物品系來替換步驟d)的雜交。33.通過前述權(quán)利要求中任一項所述的方法獲得的植物，或從這種植物衍生的后代、繁殖材料、部分、組織、細胞或細胞培養(yǎng)物。34.根據(jù)權(quán)利要求33的植物或后代、繁殖材料、部分、組織、細胞或細胞培養(yǎng)物的用途，用作食物、飼料或種子或用于產(chǎn)生藥物或化學品。全文摘要本發(fā)明涉及用于從植物或植物細胞的基因組切除核酸序列的方法。該方法基于以下步驟用編碼DNA雙鏈斷裂誘導酶(DSBI)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物品系，實施瞬時測試法以分析該轉(zhuǎn)基因酶的功能性，將該植物品系與含有待切除核酸序列的品系雜交并且進行未成熟胚轉(zhuǎn)換或通過愈傷組織形成進行組織培養(yǎng)再生。該方法也可以反向進行，這意指用編碼待切除核酸序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，并且與含有DSBI的植物品系進行雜交。作為此雜交步驟的備選，也可以進行用第二構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物品系。本發(fā)明也涉及通過這種方法獲得的植物或從這種植物衍生的后代、繁殖材料、部分、組織、細胞或細胞培養(yǎng)物。最后，本發(fā)明涉及從這種方法衍生的植物或后代、繁殖材料、部分、組織、細胞或細胞培養(yǎng)物的用途，用作食物、飼料或種子或用于產(chǎn)生藥物或化學品。文檔編號A01H5/00GK101889088SQ200880017983公開日2010年11月17日申請日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日發(fā)明者C·E·羅切,F-M·賴,H-S·宋,J·A·布朗申請人:巴斯夫植物科學有限公司