專利名稱：：轉移酶、差向異構酶、編碼它們的多核苷酸及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及制備植物的組合物和方法。所述植物具有改變GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和/或改變的GDP-D-甘露糖差向異構酶活性和/或改變的抗壞血酸含
背景技術：
：抗壞血酸是植物中最豐富的可溶性抗氧化劑，其對于人和一些其他動物也是首要的營養素。抗壞血酸顯著地有助于人類膳食中"游離自由基清除劑"或"抗氧化代謝產物"的全面攝入。令人信服的證據現在表明，這種代謝產物作為抗癌癥形成劑和預防冠心病單獨或者聯合地有助于健康和身體。人類攝入的幾乎全部的膳食抗壞血酸來源于植物產品。然而，植物組織的抗壞血酸含量顯著不同。同時，草本和木本植物中，葉子的抗壞血酸含量一般很高并相對一致，在非綠色的可食用的植物組織中，發現的抗壞血酸含量有巨大的無法解釋的不同。例如，在果實中，在Mz7r/an'aJW/a的卡姆果rcamucamu)中高達30mggFW-lAsA，而在Afe^//^genwaw/ca的枸禾己(medlar)中低于3|iggFW陽lAsA(Rodriguez等人1992,JChromatogrSci,30:433-437)。已報道獼猴桃中抗壞血酸值變化很大(Ferguson,A.R.，Botanicalnominclature:J"/mW<3c/n'we肌、y4c".mWat/Wc/ay",and」W/<i/fl"toy".kiwifruit:scienceandmanagement,ed.I.J.Warrington禾卩G.C.Weston.1990,PalmerstonNorth;NewZealand:NewZealandSocietyforHorticulturalScience.576.Beever，D.J禾口G.Hopkirk,Fruitdevelopmentandfruitphysiology.Kiwifruit:scienceandmanagement,ed.I.J.WarringtonandG.C.Weston.1990,PalmerstonNorth;NewZealand:NewZealandSocietyforHorticulturalScience.576.)。不同的藤蔓植物水果的抗壞血酸含量，對于美味獼猴桃(A^"c/ora)范圍是30-400mg/100g(Ferguson,A.R.,1991ActaHort.290:p.603-656,Spano,D.,等人，1997ActaHort.,.444:p.501-506.)，而對于栽培品種"Hayward"報道的范圍是80-120mg/100g(Beever，D.J禾口G.Hopkirk,Fruitdevelopmentandfruitphysiology.Kiwifruit:scienceandmanagement,ed.I.J.Warrington禾卩G.C.Weston.1990,PalmerstonNorth;NewZealand:NewZealandSocietyforHorticulturalScience.576.)。據報道，軟棗獼猴桃".wgwto)、中華獼猴桃".cW"e"&)(Muggleston,S.等人，Orchardist,1998.71(8):p.38-40,Chen,Q.和Q.Chen,CropGeneticResources,1998(2):p.3，Coggiatti，S.,1971ItalAgr，Oct,.108(10):p.935-941)、金花獼猴桃".c/7，朋Aa)和葛棗獼猴桃(^po(K^ma)的果實中含有較高濃度的抗壞血酸，在毛花獼猴桃(Aw/fl"決a)和闊葉獼猴桃(A中水平非常高(>1%鮮重)(Ferguson1991ActaHort.290:p.603-656.禾卩Ayto/om汰to(Kola,J.和J.Pavelka,1988Nahrung，.32(5):p.513-515)。已提出植物中生物合成抗壞血酸的三種途徑，一種是通過L-半乳糖(L-Gal)(Wheeler等人1998,淑騰393，365-369)，另一種是由肌醇(myoinositol)合成(Loe雨s和Kelly,1961,爿rc/z.歷oc/e附.5/op/^&95,483-493;Lorence等人，(2004)P/a"f尸/^w'o/.134，1200-1205)，第三種途徑是通過半乳糖醛酸(Agius等人2003，淑萬她c/mo/21，177-81)。L-Gal途徑通過L-半乳糖生成半乳糖酸-l，4-內酯(galactono-l,4-lactone)，并因此形成抗壞血酸(Wheeler等人1998,Atow"393，365-369)。迄今為止，對于L-半乳糖途徑，已經鑒定出來或至少部分鑒定出來編碼這些酶的所有基因和他們相關的酶活性，除了一種將GDP-L-半乳糖轉化成L-半乳糖-l-磷酸的推測的酶。被鑒定的基因和酶活性包括GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(Conklin,1998;Conklin等人，1999;Keller等人，1999)，GDP-D-甘露糖3',5'-差向異構酶(Wolucka等人，2001;Wolucka和VanMontagu,2003;Watanabe等人，2006)，L-半乳糖-l-P磷酸酶(Laing等人，2004;Conklin等人，2006)，L-半乳糖脫氫酶(Wheeler等人，1998;Gatzek等人，2002;Laing等人，2004)和L-半乳糖酸-l,4-內酯脫氫酶(Imai等人,1998;Bartoli等人，2005)。缺失的酶，沒有報道(最大限度地就申請人所知)其作為提取的或純化的酶活性，或者作為表達基因用于分析，其催化抗壞血酸生物合成的第二關鍵步驟(committedstep)。在抗臭氧的篩選中鑒定出擬南芥64ra6/tfo;w&Aa//awaJ游FTC2突變體，其還顯示出特別低的抗壞血酸水平的特征(Conklin等人,2000)。使用基于圖的方法來克隆突變基因Uander等人,2002)，并作為編碼新型蛋白的基因(At4g26850)將其鑒定。然而，據報該基因與擬南芥屬64ra6zWo/w^J的其他基因無同源性，除了同樣未鑒定的At5g55120和其他物種的其他未鑒定基因。據報道編碼的蛋白與擬南芥屬蛋白MC015.7，秀麗隱桿線蟲(Cae"w/wW^e/egara)蛋白C10F3.4和黑腹果蠅(Z)raw;/n7ame/a朋g氾妙)蛋白質CG3552最相似，這些蛋白中無一具有證實的功能。盡管已報道擬南芥屬基因(AtAg26850)與FTC2突變體的四個等位基因互補，然而未提供細節(Jander等人，2002)。另外作者陳述"盡管我們有與VTC2突變相關的表型，然而在這些突變體中還需要發現導致維生素C水平下降的調節途徑或生物合成途徑"。在產生抗壞血酸的生物合成途徑中鑒定編碼酶的基因，給以基于基因的方法操縱植物中抗壞血酸含量提供了機會。然而，盡管對于生物合成抗壞血酸的L-半乳糖途經的許多步驟，已經產生在L-半乳糖途經中不同基因表達改變的轉基因植物或突變體，降低的基因表達(和酶的水平)能導致抗壞血酸降低，過表達不導致葉子中抗壞血酸增加(Ishikawa等人，2006和Conklin等人，2006)。本發明的目標是為調節GDP-L-半乳糖脒基轉移酶(也稱作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)活性；和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶的活性；和/或植物中的抗壞血酸含量提供改進的組合物和方法，或至少為公眾提供有用的選擇。
發明內容第一方面，本發明提供制備具有增加GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性(也稱作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)的植物細胞或植物的方法，所述方法包含用編碼多肽(具有SEQIDNO:1至11中任一氨基酸序列)或該多肽變體的多核苷酸轉化植物細胞或植物，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的活性。在一個具體實施方式中，該變體包含氨基酸序列AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列GYNSLGAFAT腿LHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個具體實施方式中，變體包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:13.序列。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:1至11中任一個的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:1至11中任一個的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:IO的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:10的多肽。在另一方面，本發明提供制備具有增加GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的植物細胞或植物的方法，該方法包含用多核苷酸(包含選自SEQIDNO:14至24之中任一序列的核苷酸序列)或其變體轉化植物細胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的多肽。在一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:14至24之中任一序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14至24之中的任一序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含編碼序列SEQIDNO:14至24之中任一序列的全長。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:14具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:14的全長編碼序列具有至少60%的序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含編碼序列SEQIDNO:14的全長。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:19具有至少60%的序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:19全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:19的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:20具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:20全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:20全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:21具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:21。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:21全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:21的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:22具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:22。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:22全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:22的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:23具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:23的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23的全長編碼序列。優選地，通過本發明所述的方法制備的具有增加GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的植物或植物細胞還具有增加的抗壞血酸含量。在另一方面，本發明提供具有增加抗壞血酸含量的植物或植物細胞的方法，該方法包含用編碼多肽(具有SEQIDNO:l至ll中任一個的氨基酸序列)或多肽變體的多核苷酸轉化植物細胞或植物，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性。在一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列AINVSP正YGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個具體實施方式中，變體包含序列SEQIDNO:12和SEQIDNO:13.13在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll中任一個的多肽具有至少60%序列同一性。在另一個具體實施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll中任一個的多肽。在另一個具體實施方式中少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中的多肽。在另一個具體實施方式中少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中的多肽。在另一個具體實施方式中少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中的多肽。在另一個具體實施方式中少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中的多肽。在另一個具體實施方式中少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中的多肽。在另一個具體實施方式中至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中的多肽。在優選的具體實施方式中，該方法進一步包含用編碼多肽(具有氨基酸序列SEQIDNO:25至35之中任一個)或該多肽變體的多核苷酸轉化植物細胞或植物，其中變體具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性。在一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個具體實施方式中，變體包含SEQIDNO:36和SEQIDNO:37序列。變體與氨基酸序列是SEQIDNO:l的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:1變體與氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:6變體與氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:7變體與氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:8變體與氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽具有至a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:9變體與氨基酸序列是SEQIDNO:10的多肽具有a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:10在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一個的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一個的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽。以轉移酶和差向異構酶轉化可以任一順序連續進行。另外，以差向異構酶和轉移酶轉化可同時發生。當同時發生時，編碼差向異構酶和轉移酶的序列可在同一構建體或載體上或分別在不同構建體或載體上。在另一方面，本發明提供制備具有增加抗壞血酸的植物細胞或植物的方法，該方法包含用多核苷酸(包含選自SEQIDNO:14至24之中任一序列的核苷酸序列)或其變體轉化植物細胞或植物，其中變體編碼具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的多肽。在一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:14至24之中的任一個具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中的任一序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中任一個的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:14具有至少60%的序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:14的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14的全長編碼序列。15在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:19具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:19的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:19的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:20具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:20的全長編碼序列具有至少60%的序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:20的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:21具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:21。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:21全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:21的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:22具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:22。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:22全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:22的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:23具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23。在一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:23的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:23的全長編碼序列。在優選的具體實施方式中，方法進一步包含用多核苷酸(包含選自SEQIDNO:38至48之中任一序列的核苷酸序列)或其變體轉化植物細胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的多肽。在一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:38至48中任一個具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:38至48中的任一個。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48中任一個的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:38具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:38的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:39序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:39的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:40序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:40的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40的全長編碼序列。以轉移酶和差向異構酶進行轉化可以任一順序連續進行。或者以差向異構酶和轉移酶同時進行轉化。當同時進行轉化時，編碼差向異構酶和轉移酶的序列可在同一構建體或載體上，或分別在不同的構建體或載體上。在另一方面，本發明提供制備具有增加GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的植物細胞或植物的方法，該方法包含用編碼多肽(具有SEQIDNO:25至35之中任一氨基酸序列)或多肽變體的多核苷酸轉化植物細胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性。在一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個具體實施方式中，變體包含SEQIDNO:36和SEQIDNO:37序列。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25至35中任一個的多肽具有至少70%序列同一性。在另一個具體實施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25至35中任一個的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽具有至少70%序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽具有至少70%序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽具有至少70%序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽。在另一方面，本發明提供制備具有增加GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的植物細胞或植物的方法，該方法包含用多核苷酸(包含選自序列SEQIDNO:38至48之中任一個的核苷酸序列)，或其變體轉化植物細胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的多肽。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:38至48之中任一個具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:38至48中的任一個。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48中任一個的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:38序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:38全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:39具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:39。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:39的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與序列SEQIDNO:40具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:40。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:40的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40的全長編碼序列。在第一方面，本發明提供制備具有增加抗壞血酸含量的植物細胞或植物的方法，該方法包含用編碼多肽(具有SEQIDNO:25至35之中任一個氨基酸序列)或多肽變體的多核苷酸轉化植物細胞或植物，其中該變體具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性。在一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列AA固GGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個具體實施方式中，變體包含序列SEQIDNO:36禾卩SEQIDNO:37。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一個的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25至35之中任一個的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:25的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:26的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽具有至少70%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:27的多肽。在一個優選的具體實施方式中，本發明提供制備具有增加抗壞血酸含量的植物細胞或植物的方法，也可用編碼GDP-L-半乳糖-脒基轉移酶的多核苷酸轉化該植物或植物細胞。以差向異構酶和轉移酶進行轉化可以任何順序連續進行。或者可以差向異構酶和轉移酶同時進行轉化。當同時進行轉化時，編碼差向異構酶和轉移酶的序列可在同一構建體或載體上，也可分別在不同構建體或載體上。優選地，GDP-L-半乳糖脒基轉移酶具有SEQIDNO:1至11的氨基酸序列，或該多肽的變體，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性。在一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列A雨SP正YGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個具體實施方式中，變體包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個具體實施方式中，變體包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:13序列。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll之中任一個的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:1至11之中任一個的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:l的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:6的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:7的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:7的20多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:8的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:9的多肽。在另一個具體實施方式中，變體與氨基酸序列是SEQIDNO:IO的多肽具有至少60%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸編碼氨基酸序列是SEQIDNO:10的多肽。在另一方面，本發明提供制備具有增加抗壞血酸含量的植物細胞或植物的方法，該方法包含用多核苷酸(包含選自序列SEQIDNO:38至48之中任一個的核苷酸序列)或其變體轉化植物細胞或植物，其中該變體編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的多肽。在一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:38至48之中的任一序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48之中的任一序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38至48之中任一的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:38的序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:38。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:38的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:38的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:39序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:39。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:39的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:39的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:40的序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:40。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:40的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:40的全長編碼序列。制備具有增加抗壞血酸含量的植物細胞或植物方法的一個優選具體實施方式中，還是以編碼GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的多核苷酸轉化植物或植物細胞。以差向異構酶和轉移酶進行轉化可以任何順序連續進行。或者可以差向異構酶和轉移酶同時進行轉化。當同時進行轉化時，編碼差向異構酶和轉移酶的序列可在同一構建體或載體上，也可分別在不同構建體或載體上。優選地，編碼GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的多核苷酸具有選自SEQIDNO:14至24之中的任一序列或其變體的核苷酸序列，其中該變體編碼具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的多肽。在一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:14至24.之中任一序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中的任一序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14至24之中任一全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:14的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:14全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:14的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:19的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:19的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:19的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:20的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:20的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:20的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:21的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:21。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:21的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:21的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:22的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:22。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:22的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:22的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:23的序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含序列SEQIDNO:23。在另一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:23的全長編碼序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，a)的多核苷酸包含SEQIDNO:23的全長編碼序列。在另一方面，本發明提供制備具有增加抗壞血酸含量的植物細胞或植物的方法，該方法包含以下列成分轉化植物細胞或植物a)編碼GDP-D-甘露糖差向異構酶的多核苷酸；和b)編碼GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的多核苷酸。在一個具體實施方式中，GDP-D-甘露糖差向異構酶包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。23在另一個具體實施方式中，GDP-D-甘露糖差向異構酶包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個具體實施方式中，GDP-D-甘露糖差向異構酶包含與SEQIDNO:25至35之中任一個的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，GDP-D-甘露糖差向異構酶包含SEQIDNO:25至35之中任一個的氨基酸序列。在一個具體實施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉移酶包含氨基酸序列A雨SPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個具體實施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉移酶包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個具體實施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉移酶包含與SEQIDNO:1至11之中任一個的氨基酸序列具有至少60%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉移酶包含氨基酸序列是SEQIDNO:l至ll之中的任一個。在另一方面，本發明提供編碼多肽(包含選自SEQIDNO:1至7之中任一個的序列)或其變體的分離的多核苷酸，其中變體是GDP-L-半乳糖脒基轉移酶。在一個具體實施方式中，變體包含序列AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。在另一個具體實施方式中，變體包含序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。在另一個具體實施方式中，變體包含序列SEQIDNO:12禾BSEQIDNO:13。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:1至7中任一序列具有至少72%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含SEQIDNO:l至7中任一個的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:1的序列具有至少75%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:1。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:2的序列具有至少74%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:2。在另一個具體實施方式中，包含與SEQIDNO:3的序列具有至少75%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:3。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:4的序列具有至少78%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:4。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:5的序列具有至少75%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:5。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:6的序列具有至少72%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:6。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:7的序列具有至少73%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:7。在另一方面，本發明提供分離的多核苷酸(包含SEQIDNO:14至20之中任一個的全長編碼序列)或其變體，其中變體編碼GDP-L-半乳糖脒基轉移酶。在一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:14至20之中任一個的全長編碼序列具有至少68%序列同一性的序列。在一個具體實施方式中多核苷酸包含SEQIDNO:14至20之中任一個的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:14至20之中任一個序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:14的全長編碼序列具有至少68%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:14序列之內的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:14。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:15的全長編碼序列具有至少69%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:15序列內的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:15。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:16的全長編碼序列具有至少66%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:16序列內的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:16。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:17的全長編碼序列具有至少69%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:17序列內的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:17。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:18的全長編碼序列具有至少69%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:18序列內的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:18。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:19的全長編碼序列具有至少68%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:19序列內的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:20的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:20序列內全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:20。在另一方面，本發明提供包含氨基酸序列是SEQIDNO:1至7的分離的多肽或其變體，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性。在一個具體實施方式中，變體多肽與選自SEQIDNO:1至7之中任一個的氨基酸序列具有至少72%序列同一性，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽與氨基酸序列是SEQIDNO:1的多肽具有至少75%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:1。在另一個具體實施方式中，分離的多肽具有與氨基酸序列SEQIDNO:2具有至少74%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:2。在另一個具體實施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:3具有至少75%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:3。在另一個具體實施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:4的多肽具有至少78%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:4。在另一個具體實施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:5具有至少75%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:5。在另一個具體實施方式中，分離的多肽與氨基酸序列是SEQIDNO:6具有至少72%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:6。在另一個具體實施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:7具有至少73%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:7。在另一方面，本發明提供編碼多肽(包含選自SEQIDNO:25至27之中任一序列)或其變體的分離的多核苷酸，其中變體是GDP-D-甘露糖差向異構酶。在一個具體實施方式中，變體包含序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。在另一個具體實施方式中，變體包含序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。在另一個具體實施方式中，變體包含序列SEQIDNO:36和SEQIDNO:37。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:25至27中任一序列具有至少91%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含選自SEQIDNO:25至27中的任一序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:25序列具有至少91%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:25。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:26序列具有至少91%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:26。在另一個具體實施方式中，多肽包含與SEQIDNO:27中任一序列具有至少91%同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多肽包含序列SEQIDNO:27。在另一方面，本發明提供包含SEQIDNO:38至40中任一全長編碼序列的分離的多核苷酸或其變體，其中變體編碼GDP-D-甘露糖差向異構酶。在一個具體實施方式中，變體包含與SEQIDNO:38至40中任一全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:38至40中任一全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:38至40的任一序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:38的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:38序列內的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含在SEQIDNO:39序列內的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:39。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含與SEQIDNO:40的全長編碼序列具有至少70%序列同一性的序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含SEQIDNO:40序列內的全長編碼序列。在另一個具體實施方式中，多核苷酸包含序列SEQIDNO:40。在另一方面，本發明提供包含氨基酸序列SEQIDNO:25至27或其變體的分離的多肽，其中變體具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性。在一個具體實施方式中，變體多肽與選自SEQIDNO:25至27中任一氨基酸序列具有至少91%的序列同一性，其中變體具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:25具有至少91%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:25。在另一個具體實施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:26具有至少91%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:26。在另一個具體實施方式中，分離的多肽與氨基酸序列SEQIDNO:27具有至少91%的序列同一性。在另一個具體實施方式中，分離多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:27。在另一方面，本發明提供編碼本發明所述多肽的分離的多核苷酸。在另一方面，本發明提供包含下列成分的分離的多核苷酸a)包含本發明所述的多核苷酸的長度至少是15個核苷酸的片段的多核苷酸；b)包含本發明所述的多核苷酸的長度至少是15個核苷酸的互補的多核苷酸；或d)包含能與本發明所述的多核苷酸雜交的長度至少是15個核苷酸的序列的多核苷酸。在另一方面，本發明提供包含至少一個本發明所述的多核苷酸的遺傳構建體。在另一方面，本發明提供包含至少一個本發明所述的多核苷酸的表達構建體。在另一方面，本發明提供包含至少一個本發明所述的多核苷酸的RNAi構建體。在另一方面，本發明提供包含本發明所述的表達構建體、遺傳構建體或RNAi構建體的載體。在另一方面，本發明提供包含至少一個本發明所述的表達構建體或遺傳構建體的宿主細胞。在另一方面，本發明提供遺傳改造的宿主細胞，該細胞表達至少一個本發明所述的多核苷酸，或至少一個本發明所述的多肽。優選地，宿主細胞是遺傳修飾的用于表達編碼GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的多核苷酸；和編碼GDP-D-甘露糖差向異構酶的多核苷酸。在另一方面，本發明提供制備GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的多肽的方法，該方法包含培養包含能表達GDP-L-半乳糖脒基轉移酶多肽的本發明所述表達構建體或本發明所述遺傳構建體的宿主細胞。在另一方面，本發明提供制備GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的酶產物的方法，該方法包含在酶的底物存在條件下，培養包括能表達GDP-L-半乳糖脒基轉移酶多肽的本發明所述表達構建體或本發明所述遺傳構建體的宿主細胞，所述的酶的底物可供應給宿主細胞或在宿主細胞中天然存在。在另一方面，本發明提供制備GDP-D-甘露糖差向異構酶多肽的方法，該方法包括培養包含能表達GDP-D-甘露糖差向異構酶多肽的本發明所述表達構建體或本發明所述遺傳構建體的宿主細胞。在另一方面，本發明提供制備GDP-D-甘露糖差向異構酶的酶產物的方法，該方法包括在酶的底物存在條件下，培養包括能表達GDP-D-甘露糖差向異構酶多肽的本發明所述表達構建體或本發明所述遺傳構建體的宿主細胞，所述的酶的底物可供應給宿主細胞或在宿主細胞中天然存在。在另一方面，本發明提供生物合成抗壞血酸的方法，該方法包含在抗壞血酸前體存在下，培養包含能表達GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的本發明所述表達構建體或本發明所述遺傳構建體的宿主細胞的步驟，所述前體可補充給宿主細胞或在宿主細胞中天然存在。優選地，宿主細胞還包含能表達GDP-D-甘露糖差向異構酶的本發明所述表達構建體。在另一方面，本發明提供生物合成抗壞血酸的方法，該方法包含在抗壞血酸前體存在下，培養包含能表達GDP-D-甘露糖差向異構酶的本發明所述表達構建體或本發明所述遺傳構建體的宿主細胞的步驟，所述前體可補充給宿主細胞或在宿主細胞中天然存在。優選地，宿主細胞還包含能表達GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的本發明所述表達構建體。優選地，宿主細胞是植物細胞。優選地，植物細胞是植物的一部分。在另一方面，本發明提供經遺傳修飾的植物細胞，所述細胞表達至少一種本發明所述的多核苷酸，或至少一種本發明所述的多肽。在另一方面，本發明提供植物細胞，所述細胞包含至少一種本發明所述的表達構建體或至少一種本發明所述的遺傳構建體的。在另一方面，本發明提供包含本發明所述的植物細胞的植物。在另一方面，本發明提供選擇GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性改變的植物的方法，該方法包含試驗用于本發明所述多核苷酸表達改變的植物。在另一方面，本發明提供選擇GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性改變的植物的方法，該方法包含試驗本發明所述多肽表達改變的植物。在另一方面，本發明提供選擇GDP-D-甘露糖差向異構酶活性改變的植物的方法，該方法包含試驗本發明所述多核苷酸表達改變的植物。在另一方面，本發明提供選擇GDP-D-甘露糖差向異構酶活性改變的植物的方法，該方法包含試驗本發明所述多肽表達改變的植物。在另一方面，本發明提供選擇抗壞血酸含量改變的植物的方法，該方法包含試驗本發明所述多核苷酸或多肽的表達改變的植物。在另一方面，本發明提供通過本發明所述的方法制備出來的植物細胞或植物。優選地，植物經遺傳修飾，包括或表達本發明所述的多核苷酸或者多肽。在另一方面，本發明提供經本發明所述的方法選擇出來的植物。在另一方面，本發明提供經本發明所述的方法選擇出來的成組植物。優選地，該組包括至少2個，更優選至少3個，更優選至少4個，更優選至少5個，更優選至少6個，更優選至少7個，更優選至少8個，更優選至少9個，更優選至少10個，更優選至少11個，更優選至少12個，更優選至少13個，更優選至少14個，更優選至少15個，更優選至少16個，更優選至少17個，更優選至少18個，更優選至少19個，更優選至少20個植物。在另一方面，本發明提供制備抗壞血酸的方法，該方法包含從本發明所述的植物細胞或植物中提取抗壞血酸。在另一方面，本發明提供鑒定作為除草劑(herbicide)候選的化合物的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:1至11之中任一個序列或具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的其變體的多肽接觸；并且b)檢測所述化合物與所述多肽之間的結合是存在和/或缺失，其中結合提示所述化合物是除草劑候選。在另一方面，本發明提供鑒定作為候選除草劑的化合物的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:1至11之中任一個序列或具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的其變體的多肽接觸；并且b)評價所述化合物對所述多肽的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的影響；其中活性下降提示所述的化合物是候選除草劑。在另一方面，本發明提供鑒定作為候選除草劑的化合物的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:25至35之中任一個序列或其變體的具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的多肽接觸；并且b)檢測所述化合物與所述多肽之間的結合是存在和/或缺失，其中結合提示所述化合物是候選除草劑。在另一方面，本發明提供鑒定作為候選除草劑的化合物的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:25至35之中任一個的序列或具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的其變體的多肽接觸；并且b)評價所述化合物對所述多肽的GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的影響；其中活性下降提示所述的化合物是候選除草劑。在另一方面，本發明提供經本發明所述的方法鑒定的化合物。在另一方面，本發明提供確定本發明所述的化合物是否具有除草劑活性的方法，其包含使植物或植物細胞與所述的候選除草劑接觸，并檢測所述植物或植物細胞的生長或存活的下降，其中所述下降是該化合物的除草劑活性的指征。在另一方面，本發明提供抗本發明所述多肽的抗體。在另一方面，本發明提供制備L-半乳糖-l-磷酸的方法，所述的方法包含使GDP-L-半乳糖和GDP受體(包括己糖-l-磷酸或磷酸)與包含本發明所述多核苷酸的表達構建體的表達產物接觸以獲得L-半乳糖-l-磷酸。在另一方面，本發明提供制備GDP-半乳糖的方法，所述的方法包含使GDP-甘露糖與包含本發明所述多核苷酸或本發明所述多肽的表達構建體的表達產物接觸以獲得GDP-半乳糖。另外，在本發明所述的所有方面的具體實施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉移酶是GDP-L-半乳糖己糖-l-P-脒基轉移酶。類似地，在本發明所述的所有方面的可選擇的具體實施方式中，GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性是GDP-L-半乳糖己糖-l-P-脒基轉移酶活性。GDP-L-半乳糖己糖-l-P-脒基轉移酶不必須地限于使用己糖-l-P作為GDP受體，還可使用其它GDP受體，如磷酸和焦磷酸。優選地，其它GDP受體是磷酸。本發明所述的多核苷酸和多核苷酸的變體可來源于任何物種。多核苷酸和變體還可重組產生，還可是"基因重組"(geneshuffling)方法的產物。在一個具體實施方式中，多核苷酸或變體來源于植物物種。在另一個具體實施方式中，多核苷酸或變體來源于裸子植物物種。在另一個具體實施方式中，多核苷酸或變體來源于被子植物物種。在另一個具體實施方式中，多核苷酸或變體來源于雙子葉(dicotyledonuous)植物物種。31本發明所述的多肽和多肽的變體可來源于任何物種。多核苷酸和變體還可是重組產生，還可由基因重組方法的產物表達而來。在一個具體實施方式中，本發明所述的多肽或變體可來源于植物物種。在另一個具體實施方式中，本發明所述的多肽或變體來源于裸子植物物種。在另一個具體實施方式中，本發明所述的多肽或變體來源于被子植物物種。在另一個具體實施方式中，本發明所述的多肽或變體來源于雙子葉植物物種。本發明所述的植物細胞和植物，其包括那些其多核苷酸、變體多核苷酸、多肽和變體多肽來自任何物種的植物細胞和植物。在一個具體實施方式中，植物細胞和植物來自裸子植物物種。在另一個具體實施方式中，植物細胞和植物來自被子植物物種。在另一個具體實施方式中，植物細胞和植物來自雙子葉植物物種。在另一個具體實施方式中，植物細胞和植物來自選自下列屬但不限于下列屬的水果物種獼猴桃屬、蘋果屬(Ma/M)、柑橘屬^CzYmy)、草莓屬(Trag"n'a)或越桔屬(Tflcc/"/調)。特別優選的水果植物物種是美味獼猴桃(JC^^7/"cfe//dOM)、中華獼猴桃".c/z/"潔^)、毛花獼猴桃".m'a"翻)、軟麥獼猴桃".a，to)、四種獼猴桃物種的雜交品種、蘋果(似fl/^ifowe幼'ca)和三葉海棠(Ma/ww/e6oW//)。在另一個具體實施方式中，植物細胞和植物來自選自下列屬但不限于下列屬的蔬菜物種芥屬(5mw/ca)、番茄屬(丄戸戸Wco")或茄屬(5W朋,)。特別優選的蔬菜植物物禾中是番茄(Z^copers/co"^a^"ftwz)和土豆(SWamwn赫ems,)。在另一個具體實施方式中，植物細胞和植物來自單子葉植物物種。在另一個具體實施方式中，植物細胞和植物來自選自下列屬但不限于下列屬的農作物物種大豆屬(G(yd"e)，玉蜀黍屬(Zea)，大麥屬(Z/oWe"m)或稻屬特別優選的農作物物種是水稻(Ot加s加/va)，大豆(Gfyc/"ewax)和玉米(Zea附ajKsO。具體實施例方式在本說明書中引用專利說明書、其它外部文件或其它信息來源的地方，這通常是為討論本發明的特征提供上下文的目的。除非是特意聲明，否則對這類外部文件的參考不應解釋為以任何權限承認這類文件，或這類信息來源是現有技術，或形成本領域一般公知常識的一部分。在本說明書中所使用的術語"包含"意味"至少由…部分組成"。當在本說明書中解釋每個包括術語"包含"的陳述時，其他特征或者那些以該術語開始的特征也可出現。相關術語如"包括"和"含有"的解釋方式相同。本文所使用的術語"多核苷酸"意味著任意長度的單或雙鏈的脫氧核糖核酸或核糖核酸多聚體，但是優選至少是15個核苷酸，且以非限制性實施例，包括基因的編碼和非編碼序列、正義和反義序列的互補區、外顯子、內含子、基因組DNA、cDNA、前-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酸酶、重組多肽、分離的和純化的天然存在的DNA或RNA序列、合成性RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。本文所提供的多核苷酸序列的"片段"是連續的核苷酸子序列，其能夠與感興趣的靶向特異地雜交，例如與至少長度為15個核苷酸的序列雜交。本發明所述的片段包含本發明所述的多核苷酸的15個核苷酸，優選至少20個核苷酸，更優選至少30個核苷酸，更優選至少50個核苷酸，更優選至少50核苷酸和最優選至少60個核苷酸的連續的核苷酸。多核苷酸序列片段能在反義、基因沉默，三螺旋或核酶技術中使用，或作為包括在芯片的引物、探針使用，或在本發明所述的基于多核苷酸的選擇方法中使用。術語"引物"是指短的通常有自由的3'0H基團的多核苷酸，其與模板雜交并用于引發與靶向互補的多核苷酸的聚合作用。術語"探針"是指短的多核苷酸，其用于在基于雜交的檢測中，檢測與探針互補的多核苷酸序列。探針可由本文所定義的多核苷酸的"片段"組成。多彥微本文所使用的術語"多肽"包含任意長度的氨基酸鏈，但優選至少5個氨基酸，包括蛋白質全長，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。本發明所述的多肽可是純化的天然產物，或可部分或全部用重組或合成技術制備。該術語可指多肽，多肽的聚合物，如二聚體或其它多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽的變體或其衍生物。多肽的"片段"是多肽的子序列，其發揮對于該多肽的生物活性所需的功能和/或形成該多肽的三維結構。該術語可指能發揮上述酶的活性的多肽，多肽的聚合物如二聚體或其它多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽的變體或其衍生物。本文公開的用于多核苷酸或多肽序列的術語"分離的"用于指從他們的天然細胞環境中提取出來的序列。分離的分子可經任何方法或包括生物化學、重組和合成技術方法的聯合使用而獲得。術語"重組"是指在其天然環境(context)中從其周圍的序列中提取出來的多核苷酸序列，和/或與在其天然環境中沒有的序列重組的多核苷酸序列。"重組"多肽序列通過從"重組"的多核苷酸序列翻譯而制備。來源于特定屬或物種的，關于本發明所述的多核苷酸或多肽的術語"來源于"是指與在那個屬或物種中發現的天然的多核苷酸或多肽具有相同序列的多核苷酸或多肽。來源于一個特定屬或物種的多核苷酸或多肽因此可合成或重組制備。,沐如在本文中所使用，術語"變體"是指區別于明確地鑒定過的序列的多核苷酸或多肽序列，其中一個或多個核苷酸或氨基酸殘基被刪除、取代或添加。變體可是天然出現的等位基因變體，或是非天然出現的變體。變體可來自相同的或來自其它物種，且可包含同源物(homologues)，旁系同源物(paralogues)和直系同源物(orthologues)。在某些具體實施方式中，本發明所述多肽變體和多肽變體與本發明所述多肽或多肽具有相同或相似的生物學活性。術語"變體"當指多肽時，該多肽包含所有形式的多肽和本文所定義的多肽。多提辦辦變體多核苷酸序列與本發明所述的序列優選顯示出至少50%，更優選至少51%，更優選至少52%，更優選至少53%，更優選至少54%，更優選至少55%，更優選至少56%，更優選至少57%，更優選至少58%，更優選至少59%，更優選至少60%，更優選至少61%，更優選至少62%，更優選至少63%，更優選至少64%，更優選至少65%，更優選至少66%，更優選至少67%，更優選至少68%，更優選至少69%，更優選至少70%，更優選至少71%，更優選至少72%，更優選至少73%，更優選至少74%，更優選至少75%，更優選至少76%，更優選至少77%，更優選至少78%，更優選至少79%，更優選至少80%，更優選至少81%，更優選至少82%，更優選至少83%，更優選至少84%，更優選至少85%，更優選至少86%，更優選至少87%,更優選至少88%，更優選至少89%，更優選至少卯％，更優選至少91%，更優選至少92%，更優選至少93%，更優選至少94%，更優選至少95%，更優選至少96%，更優選至少97%，更優選至少98%，和最優選至少99%的同一性。在本發明所述多核苷酸的至少20個核苷酸位置，優選至少50個核苷酸位置更優選至少100個核苷酸位置的比較窗口內，和最優選在全長范圍內發現同一性。能以下列方式確定多核苷酸序列同一性。使用BLASTN(來自BLAST程序組，version2.2.5[Nov2002])，將目標多核苷酸序列與候選多核苷酸序列在bl2seq中進行比較(bl2seq:TatianaA.Tatusova,ThomasL.Madden(1999),"Blast2序歹U…一種比較蛋白質和核苷酸序列的新工具"，FEMSMicrobiolLett.174:247-250)，可從NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blastA)公開獲得該軟件。使用bl2seq的缺省參數，除了應關閉過濾低復雜性(lowcomplexity)部分。可使用下列的unix命令行參數檢査多核苷酸序列的同一性bl2seq-i核苷酸seql-j核苷酸seq2-FF-pblastn參數-FF關閉過濾低復雜性部分。參數-p為成對序列選擇合適的算法。bl2seq程序以行"同一性="中相同核苷酸的數目和百分數報告序列同一性。多核苷酸序列同一性還可通過使用全面序列比對程序(globalsequencealignmentprogram)(例如Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)計算候選和目的多核苷酸序列之間重疊部分的全長得出。在EMBOSS軟件包的needle程序中發現Needleman-Wunsch全面比對算法的完全實施(Rice，P.Longden,I.禾卩Bleasby,A.EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,TrendsinGeneticsJune2000,vol16,No6.pp.276-277)，EMBOSS軟件包能從http:〃www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/獲得。歐洲生物信息學研究所服務器也提供在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/上在線進行在兩個序列之間進行EMBOSS-needle全面比對的工具。另夕卜，可使用GAP程序，該程序在無罰分末端空位(penalizingterminalgap)的條件下，計算兩個序列優化的全面比對。下列文章描述了GAP:Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235。計算多核苷酸的％序列同一性的優選方法是基于使用ClustalX對要比較的序列進行比對(Jeanmougin等人，1998,7>e"A說oc/2e附.Sc/.23，403-5.)。本發明所述的多核苷酸變體還包含那些與一個或多個經明確鑒定過的序列表現出相似性的變體，所述的經明確鑒定過的序列可能保存那些序列的功能等價性，和那些不能合理地預測是隨機出現的變體。這種序列相對于多肽的相似性可使用公開可得到的NCBI上的BLAST程序組(version2.2.5[Nov2002])中bl2seq程序確定(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)。多核苷酸序列的相似性可使用下列unix命令行參數檢測bl2seq-i核苷酸seql-j核苷酸seq2-FF-ptblastx參數-FF關閉過濾低復雜性部分。參數-p為成對序列選擇合適的算法。該程序發現序列之間的相似性區域，且對于每個這種區域報告"E值"，其是一個人能在含有隨機序列的固定參考大小的數據庫中偶然地預期見到這種匹配次數(times)的預測數目。這個數據庫的大小在bl2seq程序中缺省設置。對于比1小得多的小E值而言，E值約是這種隨機匹配的概率。當與任何一種經明確鑒定過的序列進行比較時，變體多核苷酸序列優選顯示其E值小于lx10—6，更優選小于lx10—9，更優選小于lxl(T12，更優選小于lx10—15，更優選小于lxl(T18.更優選小于lxl0—21，更優選小于Ixl0—3Q更優選小于lxl0—4().更優選小于lxl0—5Q,更優選小于1x10—6Q更優選小于lxlO—7(),更優選小于lxl(T8Q更優選小于lxl0^且最優選小于Ixl0-1(K)。另外，在嚴緊條件下，本發明所述的變體多核苷酸與特定的多核苷酸序列或其互補序列雜交。術語"在嚴緊條件下雜交"和與其語法意義相同的術語是指在限定溫度和鹽濃度的條件下，多核苷酸分子與靶多核苷酸分子(如固定在DNA或RNA印跡上的靶多核苷酸分子，如Southern印跡或Northern印跡)雜交的能力。在嚴緊雜交條件下雜交的能力能通過最初在缺乏嚴緊性的條件下雜交，然后將嚴緊性增加到所需的嚴緊性而確定。就長度上在約100個堿基以上的多核苷酸分子而言，典型的嚴緊性雜交條件是低于天然雙螺旋的熔解溫度(Tm)，不超過25至30。C(例如10°C)(—般見Sambrook等人Eds,1987，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress;Ausubel等人，1987,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing)。對于約100個堿基以上的多核苷酸分子的Tm能通過公式Tm=81.5+0.41%(G+C-log(Na+)(Sambrook等人，Eds,1987，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress;Bolton禾口McCarthy,1962，PNAS84:1390)計算得出。長度100個堿基以上多核苷酸典型的嚴緊性條件是如下的雜交條件以6XSSC，0.2%SDS溶液預洗；于65°C雜交，6XSSC，0.2%SDS過夜；接著在IXSSC，0.1%SDS于65°C沖洗兩次，每次30分鐘，和在0.2XSSC,0.1%SDS于65。C沖洗兩次，每次30分鐘。就長度在100堿基以下的多核苷酸分子而言，示例性嚴緊性雜交條件是低于Tm5至10°C。平均而言，長度在100bp以下的多核苷酸分子的Tm約下降(500/寡核苷酸長度)。C。就已知是肽核酸(PNA)的DNA擬似體(Nielsen等人，Science.1991Dec6;254(5037):1497-500)而言，其Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA雜交分子的Tm值，且能使用Giesen等人所述的公式來計算(Giesen等人，NucleicAcidsRes.1998Nov1;26(21):5004-6)。長度在100堿基以下的DNA-PNA雜交的示例性嚴緊性雜交條件是低于Tm5至10°C。本發明所述的變體多核苷酸不僅包含區別于本發明所述序列的多核苷酸，還包含作為遺傳密碼的簡并性結果，編碼與本發明所述多核苷酸編碼的多肽具有相似活性的多肽的多核苷酸。不改變多肽氨基酸序列的序列改變是"沉默變異"。除了ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)，可通過本領域公知技術改變對于同一氨基酸的其他密碼子，例如為了在特定宿主生物體中優化表達密碼子。本發明還包括導致在其編碼的多肽序列上一個或幾個氨基酸的保守性取代，而未顯著改變其生物學活性的多核苷酸序列的改變。本領域技術人員應了解形成表型沉默的氨基酸取代的方法(見例如Bowie等人，1990，Science247,1306)。由于在其編碼的多肽序列上的沉默變異和保守性取代而產生的變體多核苷酸可使用從NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公開得到的BLAST的程序組(version2.2.5[Nov2002])中的bl2s叫程序(version2.2.5[Nov2002])經以前描述過的tblastx算法而確定。本發明所述的變體多核苷酸作為GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的功能可通過如在實施例部分所述的例如通過這種序列在細菌中的表達，并檢測其編碼的蛋白質的活性而評價。變體的功能還可通過其改變植物中的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性或抗壞血酸含量的能力而檢測，該方法在本文的實施例部分也做了描述。36本發明所述的變體多核苷酸作為GDP-D-甘露糖差向異構酶的功能可通過如在實施例部分所述的例如通過這種序列在細菌中的表達，并檢測其編碼的蛋白質的活性而評價。變體的功能還可通過其改變植物中的GDP-D-甘露糖差向異構酶活性或抗壞血酸含量的能力而檢測，該方法在本文的實施例部分也做了描述。多厳沐術語"變體"是指包含天然存在的，重組的和合成產生的多肽的多肽。變體多肽的序列與本發明所述序列優選顯示出至少50%，更優選至少51%，更優選至少52%，更優選至少53%，更優選至少54%，更優選至少55%，更優選至少56%，更優選至少57%，更優選至少58%，更優選至少59%，更優選至少60%，更優選至少61%，更優選至少62%，更優選至少63%，更優選至少64%，更優選至少65%，更優選至少66%，更優選至少67%，更優選至少68%，更優選至少69%，更優選至少70%，更優選至少71%，更優選至少72%，更優選至少73%，更優選至少74%，更優選至少75%，更優選至少76%,更優選至少77%，更優選至少78%，更優選至少79%，更優選至少80%，更優選至少81%，更優選至少82%，更優選至少83%，更優選至少84%,更優選至少85%，更優選至少86%，更優選至少87%，更優選至少88%，更優選至少89%，更優選至少90%，更優選至少91%，更優選至少92%，更優選至少93%，更優選至少94%，更優選至少95%，更優選至少96%,更優選至少97%，更優選至少98%，和最優選至少99%的同一性。同一性經本發明所述多肽的至少20個氨基酸位置，優選至少50個氨基酸位置，更優選至少100個氨基酸位置，和最優選經全長的比較窗口而發現。能通過下列方式確定多肽序列的同一性。將目標多肽序列與候選多肽序列使用BLASTP(來自BLAST程序組，version2.2.5[Nov2002])在bl2seq中進行比較，可公開從NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih,gov/blast/)得到bl2seq。除應關閉過濾低復雜性區域外，使用bl2seq的缺省參數。多肽序列同一性還可使用全面序列比對程序計算候選和目標多核苷酸序列之間重疊部分的全長而得出。上文討論過的EMBOSS-needle(從http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/可得到)禾卩GAP(Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235.)也是計算多肽序列同一性合適的全面序列比對程序。計算多肽％序列同一性的優選的方法是基于使用CkistalX將待比較序列進行比對(Jeanmougin等人，1998,7>ew&歷oc/e肌Sd.23，403-5.)。本發明所述的多肽變體還包含那些與一個或多個經明確鑒定過的序列表現出相似性的變體，所述的經明確鑒定過的序列可能保存那些序列的功能等價性，和那些不能合理地預測是隨機出現的變體。這種序列相對于多肽的相似性可使用公開可得到的來自NCBI(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blast/)BLAST程序組(version2.2.5[Nov2002])的bl2seq程序確定。多肽序列的相似性可使用下列unix命令行參數檢測bl2seq—i肽seql-j肽seq2-FF—pblastp當與任何一種經明確鑒定過的序列進行比較時，變體多肽序列優選地顯示出lxlO《以下，更優選lxlO"以下，更優選lxl(T12以下，更優選lxl(T15以下，更優選lx10—18以下，更優選lxl(T21以下，更優選lxlO^以下，更優選lxlO"^以下，更優選1x10—5()以下，更優選lxlO—w以下，更優選lxlO^以下，更優選lx10—8()以下，更優選lxl(T9()以下和最優選1x10—1Qe以下的E值。參數-FF關閉過濾低復雜性部分。參數-p為成對序列選擇合適的算法。該程序發現序列之間的相似性區域，且對于每個這種區域報告"E值"，其是，一個人能在含有隨機序列的固定參考大小的數據庫中偶然地預期見到這種匹配次數(times)的預測數目。對于比1小得多的小E值而言，這約是這種隨機匹配的概率。本發明還包括不顯著改變其生物學活性，保守性取代在所述多肽序列的一個或幾個氨基酸。本領域技術人員應了解形成表型沉默的氨基酸取代的方法(見例如Bowie等人，19卯，Science247,1306)。多肽變體作為GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的功能可通過在本文的實施例部分描述的方法而評價。多肽變體作為GDP-D-甘露糖差向異構酶的功能可通過在本文的實施例部分描述的方法而評價。賴達體、載沐J真成分術語"遺傳構建體"是指一種多核苷酸分子，通常為雙鏈DNA，其有插入其中的另一種多核苷酸分子(插入的多核苷酸分子)，如，但不限于cDNA分子。遺傳構建體可含有必要的元件，該元件使插入的多核苷酸分子轉錄，并且可選地，將轉錄本翻譯成多肽。插入的多核苷酸分子可來源于宿主細胞，或可來源于不同的細胞或生物體和/或可是重組的多核苷酸。一旦進入宿主細胞內，遺傳構建體可整合進入宿主的染色體DNA中。遺傳構建體可連接到載體上。術語"載體"是指一種多核苷酸分子，其通常是雙鏈DNA，其用于將遺傳構建體轉運進入宿主細胞。載體可能夠在至少一個另一種宿主系統(如大腸桿菌(￡.co//.))中復制。術語"表達構建體"是指一種遺傳構建體，其包括使插入的多核苷酸分子轉錄的，并且可選地使轉錄本翻譯成多肽的必要元件。表達構建體典型地在其5'至3'方向包含a)在宿主細胞中有功能的啟動子，在宿主細胞中可以轉化構建體，b)待表達的多核苷酸，和c)在宿主細胞中有功能的終止子，在宿主細胞中可以轉化構建體。術語"編碼區"或"開放閱讀框"(ORF)是指基因組DNA序列或cDNA序列的正義鏈，其能夠在合適的調控序列控制下，產生轉錄產物和/或多肽。通過5'翻譯起始密碼子和3'翻譯終止密碼子的存在來鑒定編碼序列。當插入遺傳構建體中時，當將其與啟動子和終止子序列可操作性地連接時，能表達"編碼序列"。"可操作性地連接"意味著將待表達的序列置于包括啟動子、組織特異性調控元件、瞬時調控元件，增強子，抑制子和終止子的調控元件的控制之下。術語"非編碼區"是指非翻譯序列，其在翻譯起始位點的上游和在翻譯終止位點的下游。這些序列還分別指5'UTR和3'UTR。這些區域包括轉錄起始和終止和翻譯效率調控所需的元件。終止子是終止轉錄的序列，并且發現其在翻譯序列的下游的基因3'非翻譯末端。終止子是mRNA穩定性的重要決定子，且在某些情況中被發現具有空間調控功能。術語"啟動子"是指在編碼區上游的非轉錄的順式調控元件，其調控基因轉錄。啟動子包含順式起始元件，其指明轉錄起始位點和保守盒如TATA盒和與轉錄因子結合的基序。"轉基因"是取自一種生物體，并通過轉化引入不同生物體中的多核苷酸。轉基因可來源于與轉基因被引入的生物體相同的物種或不同的物種。"轉基因植物"是指通過遺傳操作或轉化而含有新的遺傳物質的植物。新的遺傳物質可來源于與所產生的轉基因植物相同的物種或不同的物種。"插入重復"是重復的序列，在該重復序列的第二部分是在互補鏈上，如(5')GATCTA.......TAGATC(3，)(3，)CTAGAT.......ATCTAG(5，)。通讀轉錄將產生轉錄本，其進行互補性堿基配對形成莖環結構，假如在重復區域之間有3-5bp空間的話。術語本發明所述的多核苷酸或多肽的術語"改變表達"和"表達改變"旨在包含這種情況修飾與本發明所述的多核苷酸對應的基因組DNA，以至于改變本發明所述的多核苷酸或多肽的表達。基因組DNA的修飾可通過遺傳轉化或本領域已知引入突變的其他方法。"表達改變"能與信使RNA和/或產生的多肽的量的增加或減少相關，且還可由于多核苷酸和所產生多肽的序列改變而導致多肽活性改變。本申請人己經鑒定出編碼新型多肽(分別是SEQIDNO:l至7)的新型多核苷酸(SEQIDNO:14至20)，該多肽具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶(也稱作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)活性。本申請人還表明另外已知的但是未經鑒定的，具有以前未知活性的序列(分別編碼SEQIDNO:8至11的SEQIDNO:21至24的多核苷酸)，也是GDP-L-半乳糖脒基轉移酶序列。本申請人已表明，所有公開的多肽序列(SEQIDNO:1至11)顯示出顯著的序列保守性，且彼此是變體。本申請人還已經鑒定出兩個共有多肽序列(consensuspolyp印tides叫uence)基序(SEQIDNO:12和13)，這兩種基序在所有的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶序列中都存在。相似地，本申請人已經顯示出所有公開的多核苷酸序列(SEQIDNO:14至24)顯示出顯著的序列保守性，且彼此是變體。本發明提供遺傳構建體、載體和含有該多核苷酸序列的植物。本發明還提供包含本發明所述的遺傳構建體和載體的植物。本發明提供相對于合適的對照植物，其GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性改變的植物，和相對于合適的對照植物，其抗壞血酸含量改變的植物。本發明提供GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性增加和抗壞血酸含量增加的植物。本發明還提供制備這種植物的方法和選擇這種植物的方法。本發明還提供鑒定除草劑化合物的方法，該除草劑化合物抑制本發明所述的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶多肽的活性。合適的對照植物包括相同物種的非轉化植物或變種或以對照構建體轉化的植物。合適的對照植物不包括具有突變的植物，所述突變導致的改變如GDP-L-半乳糖脒基轉移酶含量下降，GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性下降或抗壞血酸含量下降。本申請人還鑒定出編碼具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的新型多肽(分別是SEQIDNO:25至27)的新型多核苷酸(SEQIDNO:38至40)。本申請人已表明所有多肽序列(SEQIDNO:25至35)公開的差向異構酶顯示出顯著的序列保守性，且彼此是變體。本申請人還已經鑒定出兩個共有多肽序列基序(SEQIDNO:36和37)，這兩種基序在所有的GDP-D-甘露糖差向異構酶序列中都存在。相似地，本申請人已表明所有公開的差向異構酶的多核苷酸序列(SEQIDNO:38至48)顯示出顯著的序列保守性，且彼此是變體。本發明提供含有新型多核苷酸序列(SEQIDNO:38至40)或編碼新型多肽序列(SEQIDNO:25至27)的序列的遺傳構建體、載體和植物。本發明還提供包含本發明所述的遺傳構建體和載體的植物。本發明提供相對于合適的對照植物，其GDP-D-甘露糖差向異構酶活性改變的植物，和相對于合適的對照植物，其抗壞血酸含量改變的植物。本發明提供GDP-D-甘露糖差向異構酶活性增加和抗壞血酸含量增加的植物。本發明還提供制備這種植物的方法和選擇這種植物的方法。本發明還提供鑒定除草劑化合物的方法，該除草劑化合物抑制本發明所述的GDP-D-甘露糖差向異構酶多肽的活性。合適的對照植物包括相同物種的非轉化植物或變種或以對照構建體轉化的植物。此外，本申請人已表明GDP-D-甘露糖差向異構酶和GDP-L-半乳糖脒基轉移酶在植物中的聯合表達導致植物中抗壞血酸含量增加，其大于任一種酶單獨表達時的量。此外，本申請人已表明當植物細胞或植物中這兩種酶過表達時，存在協同作用。當這兩種酶一同在植物中過表達時，抗壞血酸的增加程度大于過表達一種酶所導致的抗壞血酸的增加程度加上過表達另一種酶所導致的抗壞血酸的增加程度之和。本發明提供制備基于這種聯合表達的，相對于對照植物，抗壞血酸增加的植物的方法。本發明提供通過這種方法制備的植物。本發明還提供轉化差向異構酶和轉移酶序列的植物。分麟縱錄微游膽本發明所述的多核苷酸分子能通過使用本領域普通技術人員已知的各種技術來分離。通過舉例的方式，這種多肽能通過使用多聚酶鏈式反應(PCR)分離(見Mullis等人，Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser,作為參考并入本文)。本發明所述的多肽能使用引物進行擴增，該引物如本文所限定，其來源于本發明所述的多核苷酸序列。分離本發明所述的多核苷酸的另外方法包括使用全部或部分的具有文中作為雜交探針使用的序列的多肽。能使用標記的多核苷酸探針與固定在固相支持物(如硝酸纖維素膜或尼龍膜)上的多核苷酸雜交的技術來篩選基因組文庫或cDNA文庫。示例性雜交和洗膜條件是于65。C在5.0XSSC，0.5%十二烷基磺酸鈉，IXDenhardt氏溶液中雜交20小時；在1.0XSSC，P/。(w/v)十二烷基磺酸鈉洗膜(于55°C，洗三次，每次20分鐘)，且可選地在0.5XSSC，l%(w/v)十二烷基磺酸鈉于60°C洗膜一次(20分鐘)。可選的進一步洗膜(20分鐘)的方法能在0.1XSSC，l%(w/v)十二烷基磺酸鈉于60°C條件下進行。本發明所述的多核苷酸片段可通過本領域熟知的技術制備，這些技術如限制性核酸內切酶消化、寡核苷酸合成和PCR擴增。在本領域所熟知的方法中可使用部分多核苷酸序列來鑒定相應的全長多核苷酸序列。這種方法包括基于PCR的方法、5'RACE(FrohmanMA，1993,MethodsEnzymol.218:340-56)和基于雜交的方法、基于計算機/數據庫的方法。另外，通過示例性方式，反向PCR可獲得本文公開的多核苷酸序列側翼的未知序列，該序列起始于基于已知區域的引物(Triglia等人，1998,M/c/e/c爿c/Aie;y16,8186，通過引用并入本文)。該方法用幾種限制性酶在基因的已知區域內產生合適的片段。然后將片段通過分子內連接環形化，并作為PCR模板。從已知區域設計分枝引物(Divergentprimer)。為了物理性裝配全長的克隆，能使用標準的分子生物學方法(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。當從特定物種制備轉基因植物時，以序列或來源于該物種的序列轉化這種植物可以是有益的。這種益處可緩解關于物種間交叉轉化產生轉基因生物體的公眾的擔心。此外，當基因的下調是所期望的結果時，有必要利用與植物中序列相同(或至少高度相似)的序列，對于該植物，減少表達是期望的。為了其他原因中的這些原因，期望能在不同的植物物種中鑒定和分離特定基因的直系同源物。可通過所述的方法鑒定變體(包括直系同源物)。鑒定鄉游方法激潘方茲可使用基于PCR的方法鑒定變體多肽((Mullis等人，Eds.1994ThePolymeraseChainReaction,Birkhauser)。通常，引物的多核苷酸序列可以基于編碼相應氨基酸序列的保守區序列，所述的引物用于通過PCR擴增本發明所述多核苷酸分子的變體。另外，可使用本領域技術人員所熟知的文庫篩選方法(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。當鑒定探針序列的變體時，雜交和/或洗的嚴緊性通常相對于當尋找完全序列匹配(exactsequencematch)的嚴緊性下降。也可通過物理方法鑒定多肽變體，例如，通過使用抗本發明所述多肽的抗體篩選表達文庫(Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd-ColdSpringHarborPress,1987)或在這種抗體的幫助下從天然來源中鑒定該多肽。基晉,赫灘本發明所述的變體序列，包括多核苷酸和多肽變體，還可通過基于計算機的方法進行鑒定，所述的方法是本領域技術人員所熟知的，該方法使用公共結構域比對算法和序列相似性査找工具查找序列數據庫(公共結構域數據庫包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它)(見例如NucleicAcidsRes.29:1-10和11-16,2001)，其是在線資源的例子。相似性查找尋回(retrieve)和比對靶序列以與待分析的序列(即查詢序列(querysequence))進行比較。序列比較算法使用分值矩陣(scoringmatrix)賦予每次比對一個全面的分值。用于在序列數據庫中鑒定變體的示例性程序族是BLAST程序組(version2.2.5[Nov2002])，其包括BLASTN,BLASTP，BLASTX，tBLASTN和tBLASTX，這些軟件是公眾可從(ftp:〃ftp.ncbi.nih.gov/blastA)或從生物技術信息國家中心(NCBI)，國家醫學圖書館(Building38A,Room8N805,Bethesda,MD20894USA.)得到。NCBI服務器還提供使用這些程序篩選大量公眾可得到的序列數據庫的工具。BLASTN將核苷酸查尋序列與核苷酸序列數據庫進行比較。BLASTP將氨基酸查詢序列與蛋白質序列數據庫進行比較。BLASTX將以所有閱讀框翻譯的核苷酸查詢序列與蛋白質序列數據庫進行比較。tBLASTN將蛋白質查詢序列與以所有閱讀框動態翻譯的核苷酸序列數據庫進行比較。tBLASTX將核苷酸查詢序列的六種框翻譯產物與核苷酸序列數據庫的六種框翻譯產物進行比較。BLAST程序可使用缺省參數或可因需要而改變參數來改進篩選。出版物(Altschul等人，NucleicAcidsRes.25:3389-3402，1997)描述了包括BLASTN，BLASTP和BLASTX的BLAST家族算法的使用。當通過BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似的算法產生的查尋序列，通過該査詢序列"命中"(hit)—個或多個數據庫序列時，對命中序列的相似部分進行比對和鑒定。以相似程度和序列重疊的長度的順序排列命中序列。數據庫序列的命中序列一般代表與僅僅一部分查尋序列的序列長度的重疊部分。對于比對，BLASTN，BLASTP，BLASTX，tBLASTN和tBLASTX算法還產生"預期"值。預期值(E)提示，當查找含有隨機連續序列的相同大小的數據庫時，一個人能"預期"偶然發現的命中序列的數目。預期值用作顯著性的閾值以確定對于數據庫的命中序列是否提示真實的相似性。例如，指定多核苷酸的E值是O.l，命中解釋為在被篩選數據庫大小的數據庫中，在具有相似分值的序列的比對部分，一個人可預期只經偶然發現O.l匹配。對于在比對和匹配部分，E值是0.01或更低的序列，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法在那個數據庫中偶然發現匹配的可能性是1%或更低。成組相關序列的多重序列比對能用CLUSTALW進行(Thompson,J.D.,Higgins:D.G.和Gibson,T丄(1994)CLUSTALW:通過序列加權(sequenceweighting),位置特異性空位罰分和加權矩陣選擇改進進展性多重序列比對的敏感性。NucleicAcidsResearch,22:4673-4680,http:〃www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(CedricNotredame,DesmondG.Higgins，JaapHeringa，T-Coffee:Anovelmethodforfast禾卩accuratemultiple序歹llalignment,J.Mol.Biol.(2000)302:205-217)或PILEUP，其使用進展性成對比對(FengandDoolittle,1987,J.Mol.Evol.25,351)。模式識別應用軟件可用于發現基序或特征序列。例如，MEME(基序引出的多重Em)在成組序列中發現的基序或特征序列，且MAST(基序比對和查尋工具)使用這些基序鑒定查尋序列上的相似或相同基序。MAST結果以具有合適統計學數據的一系列比對和被發現基序的可視概況提供。MEME和MAST是在加利福尼亞大學(圣迭哥)開發出來。PROSITE(Bairoch和Bucher，1994,NucleicAcidsRes.22,3583;Hofmann等人,1999,NucleicAcidsRes.27，215)是一種鑒定從基因組或cDNA序列翻譯過來的未鑒定蛋白質功能的方法。PROSITE數據庫(www.expasy.org/prosite)含有生物學重要模式和圖譜，且其設計成能以合適的計算機工具將新序列分配到已知蛋白質家族中或確定序列中存在哪個已知結構域(Falquet等人，2002，NucleicAcidsRes.30,235)。Proseaxch是能以給定的序列模式或特征來査找SWISS-PROT和EMBL數據庫的工具。分庸多詹減本發明所述的多肽，包括變體多肽，可使用本領域所熟知的肽合成方法制備，如使用固相技術的直接肽合成(例如Stewart等人，1969,inSolid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo,SanFranciscoCalifornia,orautomatedsynthesis,forexamplesusinganAppliedBiosystems431APeptideSynthesizer(FosterCity,California)。多肽的突變形式也可在這種合成過程中制備。本發明所述多肽和變體多肽也可從天然來源中使用各種本領域所熟知的各種技術純化而來(例如Deutscher,1990,Ed，MethodsinEnzymology,Vol.182,Gw/tfeto另外，本發明所述的多肽和變體多肽可在合適的宿主細胞中重組表達并從以下將討論的細胞中分離出來。劍備/爐沐織沐游膽本發明所述的遺傳構建體包含一條或多條本發明所述的多核苷酸序列和/或編碼本發明所述多肽的多核苷酸，且可用于轉化例如細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物體。本發明所述的遺傳構建體旨在包括本文所定義的表達構建體。制備和使用遺傳構建體和載體的方法是本領域所熟知的(且一般見Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,1987所述)。縱船多提艦辦銀纖沐游存主銀蕭膽本發明提供包含本發明所述的遺傳構建體或載體的宿主細胞。宿主細胞可來源于例如細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物體。在本領域所熟知的方法中，本發明所述的包含遺傳構建體如表達構建體的宿主細胞，對于重組制備本發明所述的多肽是有用的(例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987;Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishing,1987)。這些方、法可包含將宿主細胞在合適的培養基中在適于或有益于表達本發明所述多肽的條件下培養。表達的重組多肽，其可選的可分泌至培養物中，然后可將其從培養基、宿主細胞或培養的培養基中采用本領域所熟知的方法分離(例如Deutscher，Ed，19卯,MethodsinEnzymology,Vol182,GuidetoProteinPurification)。劍備包舒鍵沐滅伴爐激細維赫膽本發明進一步提供包含本發明所述的遺傳構建體的植物細胞和經修飾改變本發明所述多核苷酸或多肽表達的植物細胞。包含這種細胞的植物還形成本發明的一個方面。GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶和/或抗壞血酸含量的改變也可在植物中通過本發明所述的方法來改變。這些方法可包含本發明所述的構建體轉化植物細胞和植物，該構建體被設計成用于在這種植物細胞或植物中改變調節GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶活性和/或抗壞血酸含量的多核苷酸或多肽的表達。這種方法還包括以本發明所述的構建體和一種或多種其它構建體聯合轉化植物細胞和植物，所述其它構建體被設計用于在這種植物細胞和植物中改變調節GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶活性和/或抗壞血酸含量的一種或多種多核苷酸或多肽的表達。以多肽轉化植物細胞、植物及其各部分的方法如文獻所述(Draper等人，1988,PlantGeneticTransformationandGeneExpression.ALaboratoryManual.BlackwellSci.Pub.Oxford,p.365;Potrykus禾口Spangenburg,1995,GeneTransfertoPlants.Springer陽Verlag，Berlin.;禾口Gelvin等人,1993,PlantMolecularBiol.Manual.Kl麗erAcad.Pub.Dordrecht.Areviewoftransgenicplants,includingtransformationtechniques,isprovidedinGalun禾口Breiman,1997,TransgenicPlants.ImperialCollegePress,London.)。潛激遺傳鮮游減可得到多種植物轉化策略(例如Birch,1997,AnnRevPlantPhysPlantMolBiol,48，297，HellensRP等人(2000)PlantMolBiol42:819-32,HellensR等人PlantMethl:13)。例如，策略可設計成在植物細胞、器官中和/或在多核苷酸/多肽在是正常表達的特定發育階段增加其表達，或設計成在細胞、組織、器官中和/或在其是不正常表達的特定發育階段異位表達所述多核苷酸/多肽。表達的多核苷酸/多肽可來源于被轉化的植物物種，或可來源于不同的植物物種。轉化策略可設計成在植物細胞、器官中或在多核苷酸/多肽是正常表達的特定的發育階段減少其表達。這些策略稱為基因沉默策略。用于在轉基因植物中表達基因的遺傳構建體通常包括驅動一個或多個克隆的多核苷酸表達的啟動子，終止子和可選擇的用于檢測在轉基因植物中遺傳構建體存在的標記序列。適合用于本發明所述的構建體的啟動子在單子葉植物或雙子葉植物的細胞、組織或器官中是功能性的，且其包括細胞特異性、組織特異性或器官特異性的啟動子，細胞周期特異性啟動子，瞬時啟動子，可誘導啟動子，在大多數植物組織中有活性的組成性啟動子和重組啟動子。啟動子的選擇取決于所期望的克隆的多核苷酸的時間和空間表達。啟動子可是那些正常情況下與目的轉基因相關的啟動子，或是來源于其它植物、病毒和植物致病性細菌和真菌的基因的啟動子。本領域技術人員不需額外的實驗就能選擇適于在使用遺傳構建體來修飾和調節植物性狀中使用的啟動子，所述的遺傳構建體包含本發明所述的多核苷酸序列。組成性植物啟動子的例子包括CaMV35S啟動子，膽脂堿合酶(nopalinesynthase)啟動子和章魚(肉)堿合酶(octopinesynthase)啟動子和玉米的Ubi1啟動子。在特定組織中具有活性的響應于內部的發育信號或外部的非生物的或生物的應激的植物啟動子見科學文獻所描述，例如，WO02/00894描述了示例性的啟動子，通過參考并入本文。在轉化遺傳因構建體的植物中普遍使用的示例性的終止子包括，例如，花椰菜嵌合體(cauliflowermosaic)病毒(CaMV)35S終止子，根瘤病土壤桿菌"gra&"en'ww,w附e/ac/era)膽脂堿合酶或章魚(肉)堿合酶終止子，玉米玉蜀黍蛋白(Zeawqyszein)基因終止子水稻(Oyzas加Va)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶終止子和土豆(5Wa"wm^6eroswm)PI-II終止子。在植物轉化中普遍使用的選擇性的標記包括新霉素磷酸轉移酶II基因(NPT11)，其賦予植物卡那霉素抗性，aadA基因，其賦予植物大觀霉素(spectinomycin)和鏈霉素抗性，膦絲菌素(phosphinothricin)乙酰基轉移酶(6argene)賦予Ignite(AgrEvo)和巴斯塔(Basta)(煙酸己可堿(Hoechst))抗性，以及潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)賦予潮霉素抗性。還注意到包含報告基因的遺傳構建體的用途，遺傳構建體包含的報告基因編碼表達對于宿主是外源活性，通常是酶活性，和/或可見信號(例如熒光素酶、GUS、GFP)的序列，所述的報告基因可用作在植物和植物組織中進行啟動子表達分析。報告基因的文獻綜述見于Herrera-Estrella等人，1993,Nature303，209，和Schrott，1995,In:GeneTransfertoPlants(Potrykus，T.，Spangenberg.Eds)SpringerVerlag.Berline,pp.325-336。關于基因沉默策略，人們關注基因本身或影響編碼多肽表達的調節元件。"調節元件"是在最廣泛的可能的意義上使用，并包括與目的基因接觸的其它基因。設計減少或沉默本發明所述的多核苷酸/多肽表達的遺傳構建體可包括本發明所述多核苷酸的反義拷貝。在這種構建體內，多核苷酸被置于與啟動子和終止子反義的方向上。"反義"多核苷酸通過使多核苷酸或多核苷酸的片段倒置而獲得，以使產生的轉錄本與該基因的mRNA轉錄本互補，例如，5'GATCTA3，(編碼鏈)3'CTAGAT5，(反義鏈)3'CUAGAU5，mRNA5'GAUCUCG3，反義RNA設計用于基因沉默的遺傳構建體還包括倒置重復序列。"倒置重復序列"是其中重復的第二半部分是在互補鏈上的重復序列，例如5，-GATCTA.........TAGATC-3'3，-CTAGAT.........ATCTAG-5，形成的轉錄本可進行互補性堿基配對以形成莖環結構。通常，需要重復區域間至少3-5bp的空間來形成莖環構型。另一種沉默方法包括使用靶向等同于miRNA的轉錄本的小反義RNA(Llave等人，2002,Science297,2053)。使用這種與本發明所述多核苷酸對應的小反義RNA是受關注的。本文所使用的術語"遺傳構建體"還包括小的反義RNA和影響基因沉默的其它這種多肽。以本文所定義的表達構建體進行轉化也可通過稱之為正義抑制的過程導致基因沉默(例如Napoli等人,1990,PlantCell2,279;deCarvalhoNiebel等人，1995，PlantCell,7,347)。在某些情況下，正義抑制可包括全部或部分編碼序列過表達，還可包括基因的非編碼區的表達，基因的非編碼區有如內含子或5'或3'非翻譯區(UTR)。嵌合的部分正義構建體能用于協調地使多個基因沉默(Abbott等人,2002,PlantPhysiol.128(3):844-53;Jones等人，1998,Planta204:499-505)。使用這種正義抑制策略來使本發明所述多核苷酸的表達沉默也是受到關注的。插在設計用于基因沉默的遺傳構建體中的多核苷酸可對應于編碼序列和/或非編碼序列，如啟動子和/或內含子和/或5'或3'UTR序列或對應的基因。其它基因沉默的策略包括顯性抑制(dominantnegative)方法和使用核酶構建體(Mclntyre,1996，TransgenicRes,5,257)。轉錄前沉默可通過基因本身或其調節元件的突變而產生。這種突變可包括點突變，移碼，插入，缺失和取代。下列是能用于遺傳轉化下列植物物種的公開遺傳轉化規程的代表性出版物Rice(Alam等人，1999,PlantCellRep.18，572);apple(Yao等人，1995，PlantCellReports14,407-412);maize(USPatentSerialNos.5,177,010和5,981,840);wheat(Ortiz等人，1996，PlantCellRep.15,1996,877);tomato(USPatentSerialNo.5,159,135);potato(Kumar等人，1996PlantJ.9,:821);cassava(Li等人，1996NatBiotechnology14,736);lettuce(Michelmore等人，1987，PlantCellRep.6,439);tobacco(Horsch等人，1985,Science227,1229);cotton(USPatentSerialNos.5,846,797and5,004,863);grasses(USPatentNos.5,187，073and6.020，539);peppermint(Niu等人，1998，PlantCellRep.17,165);citrusplants(Pena等人，1995,PlantSci.104,183);caraway(Krens等人，1997，PlantCellRep,17，39);banana(USPatentSerialNo.5，792,935);soybean(USPatentNos.5，416,011;5，569,834;5,824，877;5,563,04455and5,968，830);pineapple(USPatentSerialNo.5,952,543);poplar(USPatentNo.4，795，855);monocotsingeneral(USPatentNos.5，591,616and6,037，522);brassica(USPatentNos.5,188，958;5,463，174and5,750，871);cereals(USPatentNo.6,074,877);pear(Matsuda等人，2005,PlantCellRep.24(1):45-51);Prunus(Ramesh等人，2006PlantCellRep.25(8):821-8;Song和Sink2005PlantCellRep.2006;25(2):117-23;GonzalezPadilla等人，2003PlantCellRep.22(1):38-45);strawberry(Oosumi等人，2006Planta.223(6):1219-30;Folta等人，2006PlantaApr14;PMID:16614818),rose(Li等人，2003),Rubus(Graham等人，1995MethodsMolBiol.1995;44:129-33),tomato(Dan等人，2006,PlantCellReportsV25:432-441),apple(Yao等人，1995，戶/朋fCe〃14,407~412)和Actinidiaeriantha(Wang等人，2006，PlantCellRep.25,5:425-31)。其它物種的轉化也受本發明的關注。可在科學文獻上得到合適的方法和規程。可使用本領域已知的幾種進一步方法來改變本發明所述的核苷酸和/或多肽的表達。這些方法包括但不限于Tilling(Till等人，2003,MethodsMolBiol,2%,205)，所謂的"Deleta基因"技術(Li等人，2001，PlantJournal27(3),235)和使用人工轉錄因子，如合成鋅指轉錄因子(例如Jouvenot等人，2003，GeneTherapy10,513)。此外，靶向特定多肽的抗體或其片段也可在植物中表達來調節那種多肽的活性(Jobling等人，2003,Nat.Biotechnol.,21(1)，35)。還可使用轉座子示蹤方法。此夕卜，與本發明所述多肽相互作用的肽可通過如相顯示(phase-display)(Dyax公司)的技術來鑒定。這種相互作用的肽可在植物中表達或應用于植物以影響本發明所述多肽的活性。改變本發明所述核苷酸和/或多肽表達的上述方法中每一種方法的使用受到特別關注。遂激雄減還提供用于選擇GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶活性和/或抗壞血酸含量改變的植物的方法。這些方法包括測試用于改變本發明所述多核苷酸或多肽、植物表達的植物。這些方法可用在年幼或早期發育階段，此時GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶活性和/或抗壞血酸含量的改變可無需容易地檢測到。多核苷酸的表達，如信使RNA，經常用作相應的多肽表達的提示。檢測多核苷酸表達的示例性方法包括但不限于Northern分析，RT-PCR和斑點印跡分析(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.ColdSpringHarborPress,1987)。本發明所述的多核苷酸或部分多核苷酸因此在鑒定植物的方法中用作如本文所定義的探針或引物，所述植物具有改變的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性水平、GDP-D-甘露糖差向異構酶活性水平或抗壞血酸的水平。本發明所述的多核苷酸可用作設計用于鑒定這種植物的雜交實驗中的探針，或基于PCR的實驗中的引物。另外，可制備抗本發明所述多肽的抗體。制備和使用抗體的方法是本領域的標準方法(見例如Antibodies,ALaboratoryManual,HarlowALane,Eds,ColdSpringHarbourLaboratory,1998)。這種抗體可在檢測調節植物花朵大小的多肽表達改變的方法中使用。這些方法可包括ELISA(Kemeny,1991,APracticalGuidetoELISA,NYPergamonPress)和Western分析(Towbin&Gordon,1994,JImmunolMethods,72,313)。這些分析多核苷酸或多肽的表達和選擇GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性、GDP-D-甘露糖差向異構酶活性或抗壞血酸含量改變的植物的方法，在傳統的育種程序中是有用的，所述程序是設計用來產生GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性、GDP-D-甘露糖差向異構酶活性或抗壞血酸含量改變的變種的。潛激術語"植物"旨在包括整個植物，植物的任一部分，植物的繁殖體和后代。術語"繁殖體"意味可用在生殖或繁殖的(有性生殖或無性生殖的)植物的任一部分，包括種子和插條(cutting)。本發明所述的植物可是種植的，且是自體受精或與不同植物品系交叉受精，且所產生的具有所期望的表型特征的雜交體可被鑒定。可種植兩代或更多代以確保目標表型特征穩定維持和繼承。由這些標準育種方法得到的植物也形成本發明的一方面。植物中GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性，和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶活性，和/或抗壞血酸含量的改變也可通過本發明所述的方法來改變。這些方法可包括以本發明所述的構建體轉化植物細胞和植物，所述構建體被設計成用于改變在這種植物細胞和植物中調節GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶活性和/或抗壞血酸含量的多核苷酸或多肽的表達。這些方法還包括以本發明所述的構建體和其他構建體聯合轉化植物細胞和植物，所述其他構建體被設計成用于改變在這些植物細胞和植物中調節GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶活性和/或抗壞血酸含量的一種或多種多核苷酸或多肽的表達。孺腫微蕭就輛湖膽還提供通過從本發明所述的植物中提取抗壞血酸，制備抗壞血酸的方法。可如下從植物中提取抗壞血酸將冰凍組織樣品在Cryomill中在液氮溫度下研碎成精細的粉末。然后將約200mg冰凍粉末組織用4倍體積的含4mMTCEP(Pierce)的0.5NHC1懸浮，震蕩混合20秒，并在40°C在加熱塊中孵育2小時。在提取溶液中使用TCEP，因其在酸性條件下是比DTT更有效的還原試劑，確保所有維生素C是抗壞血酸的還原形式。提取物在4。C離心，且將20|aL上清液注射進入一個7.8x300mmAminexHPX-87HHPLC柱(BioRad)內。該柱以2.8mMH2S04,0.6mL/min的流速運行，且根據在245nm(滯留時間9.6min)處的吸收來計算抗壞血酸的量，將抗壞血酸(SigmaStLouis)用作標準。通過顯示峰在pH5.5被抗壞血酸氧化酶完全降解，驗證其為抗壞血酸。該方法可使用本領域技術人員所熟知的方法為了大規模抗壞血酸提取擴大規模。餘輔,遂膽使用本發明所述的方法，可篩選作為候選除草劑的任何化合物。可能被篩選的化合物的例子包括無機的和有機的化合物，如，但不限于氨基酸、肽、蛋白質、核苷酸、核酸、糖軛合物、低聚糖、月旨、醇、硫醇、醛、烷基化物(alkylator)、碳醚、酰肼、肼、酮、腈、胺類、(烴基)磺酰氯、三嗪、哌嗪(piperizine)、磺胺等。優選地，在本發明所述的方法中篩選化合物庫。合成和篩選化合物庫的方法是本領域技術人員所知的，見例如U.S.專利No.5,463，564;5,574，656;5,684,711;和5,901,069，其內容通過參考被并入。鑒定與這種多肽結合的化合物的方法是已知的，并例如在WO03/077648中有描述。檢測本發明所述多肽活性的方法在本文提供的實施例中有描述。廣義上講，本發明還在于在本申請說明書中分別或一起提及或所提示的各部分、原理和特征，和任意兩個或多個所述部分、原理或特征的任一種或所有組合，以及在本文提及特定整體的地方，所述整體已知是本發明相關的本領域內的等同物，這種巳知的等同物被認為是作為單獨列出弓I入本文。參考下列所附附圖可更好地理解本發明，其中圖1顯示擬南芥序列VTC2與中華獼猴桃"c"m^/a'Hortl6A，序列319998和第二擬南芥U.序列At5g55120的比對。還比對了擬南芥屬(Arabidopsis)酶At5gl8200(編碼推定的UDP-葡萄糖-己糖-l-磷酸尿苷轉移酶(EC-編號2.7.7.12))和未命名的小鼠蛋白質Mm—74150758(該號碼是GenBank登錄號)。在所有五個序列中相同的比對殘基用深灰色顯示，相似的殘基用淺灰顯示。用ClustalX(Jeanmougin等人，1998)伴一些人工調整比對序列。在約250氨基酸殘基處鑒定HIT三聯序列。圖2顯示獼猴桃GDP-甘露糖-l-P脒基轉移酶、EST319998(SEQIDNO:1/14)對GDP-L-半乳糖的反應。使用在方法中所述的差向異構酶從GDP-D-甘露糖制備GDP-L-半乳糖，且混合物GDP-L-半乳糖的濃度通過HPLC確定。使用連續的成對的分析進行分析，每次分析使用0.029ug酶。甘露糖-l-P濃度是0.93mM和1.87mMMgCl2。其他條件如文中所述。正方形代表反應減去無甘露糖-1-P時的運行背景。三角形代表使用HisTrap純化表達空PET30a載體的Ecoli提取物(0.006ug)的背景值(時程319998111006.xls)。圖3顯示酶EST319998(SEQIDNO:1/14)對于潛在的脒基受體的反應。使用連續的成對檢測，以不同的脒基受體的無機磷酸(正方形)，無機焦磷酸(圓形)或D-甘露糖-l-P(三角形)濃度進行檢測。對于底物磷酸、焦磷酸和D-甘露糖-l隱P，vamax值分別是0.12±0.03，0.032±0.002和0.17±0.009nmolsec"ug-1蛋白質。KM值分別是4.4士2,0.16士0.05和0.11士0.03mM。檢測進行三次，具有相似的結果。圖4顯示瞬時表達的獼猴桃EST319998(SEQIDNO:1)對煙草葉中抗壞血酸含量和酶活性的影響。詳見方法部分。白色柱代表葉子中的抗壞血酸濃度(以新鮮重量基礎表示)，黑色柱代表GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性(以g蛋白質基礎表示)。Ll，L2和L3代表三個被注射的頂端的葉子。標準棒(Errorbar)是均值的標準誤差(n-3至6)。圖5顯示將D-甘露糖-l-磷酸轉化為L-半乳糖-l-磷酸的反應。圖6顯示與At4g26850具有顯著相似性的一系列序列的比對。比對使用ClustalX(/)進行。244893_Ac和319998_Ac是中華獼猴桃的EST,24547_Ae和276582_Ae是毛花獼猴桃的EST,82552_Md是蘋果的EST,315905—Ms是天女花OfWe6oW/〃(野生酸蘋果)的EST,At4g26850是擬南芥的VTC2，和At5g55120也是來自擬南芥的同源物。BT013858—Le是自番茄ayco/7e"/cow^cw/ew加w)進入的GenbankDNA的翻譯產物，Osl2g0190000是水稻(水稻)序列。Contig_St是疊連序列(contig)，其由在Genbank中鑒定的95%相同的重疊土豆(So/朋wwft/6emsMWy>(土豆)EST組裝而來。圖7顯示圖6中比對的序列之間的同一性％。圖8顯示上述比對的顯示不同物種序列的叢集的無根的序列樹。圖9顯示的多核苷酸編碼序列的比對(使用ClustalX)，該多核苷酸編碼序列編碼圖6中比對的多肽序列。圖10顯示圖9中比對的多核苷酸編碼序列之間的同一性百分數。圖11顯示SEQIDNO:25至35的GDP-D-甘露糖差向異構酶游多肽序列的比對。所有四條序列中的相同的比對殘基用深灰顯示，相似的殘基用淺灰顯示。序列用ClustalX(Jeanmougin等人，1998)進行比對。圖12顯示圖1中比對的序列之間的序列同一性％。圖13顯示SEQIDNO:5至8的差向異構酶多核苷酸序列的比對(使用ClustalX)。圖14顯示SEQIDNO:25至28的差向異構酶的多核苷酸序列之間的同一性%。圖15顯示煙草葉子中的抗壞血酸作為注射入葉子中的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶(319998)和差向異構酶(169164)量的函數。煙草被瞬時轉化含有任一個這兩種基因的土壤桿菌屬Ugra6a"e^附入注射前將不同量混合，加入恒定量的含有P19的土壤桿菌屬(jgrak^^^w)，且所有混合物的體積達到恒定的水平。約8天后檢測抗壞血酸。差向異構酶(A)和轉移酶(B)的滴定顯示另一種基因的不同水平。圖16顯示瞬時轉化一系列的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶和差向異構酶構建體的煙草葉子中抗壞血酸水平。圖17顯示瞬時轉化特定的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的煙草葉子中抗壞血酸水平。圖18顯示在GDP-L-半乳糖脒基轉移酶319998轉化擬南芥屬64ra6/tto戸/W品系中卡那霉素抗性的分離(segregations種子種植在卡那霉素平板上，且計算綠色和死亡發芽種子的數目。正確=多拷貝，錯誤=單拷貝。以粗體書寫的數值繼續至第二代(表3)。圖19顯示轉化GDP-L-半乳糖脒基轉移酶319998的擬南芥屬的第二代品系，其在葉子中顯示高抗壞血酸的發生率。所有植物經選擇均有卡那霉素抗性。在括51號中的數目是均值的標準誤差，抗壞血酸(ASC)為mg/100g。圖20顯示轉化GDP-L-半乳糖脒基轉移酶319998的擬南芥屬64ra6/tfo;w/W的第三代品系，其葉子中顯示高抗壞血酸的發生率。所有植物經選擇均有卡那霉素抗性。在括號中的數目是均值的標準誤差，抗壞血酸(ASC)為mg/100g。圖21顯示在選擇的轉化GDP-L-半乳糖脒基轉移酶319998的擬南芥屬"raWtfo^&J品系中的基因表達和葉子的抗壞血酸濃度。選定品系中的基因表達通過qPCR檢測。圖22顯示穩定轉化GDP-L-半乳糖脒基轉移酶319998的煙草的抗壞血酸水平和基因表達。使用定性技術進行PCR。圖23顯示￡co/f中表達的酶的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性。于20°C，在舊的Victor平板讀出器(reader)("舊的"使用0.000254517nmol/F的校正因子將熒光單位轉換為納摩爾)中或在新的Victor3("新的"校正因子是2.6565E-05nmol/F)中進行檢測。實施例現在參考下列非限制性實施例，解釋本發明。實施例l:一種來自獼猴桃水果的推定的擬南芥(4mW^/w/sAfl//fl"fl)同源物At4g26850的鑒定使用紐西蘭園藝和食物研究所所有的獼猴桃(J^m'&fl)EST數據庫的At4g26850進行Blast查找，揭示出在超過132,000個EST之中與AT4g26850同源的120個EST。這些EST來源于一系列包括翼瓣、果實、芽和分生組織和葉子的組織。申請人從中華獼猴桃的幼小果實文庫中選定EST319998。這兩種擬南芥屬(Jra^Wo/w^)蛋白質和獼猴桃蛋白質顯示出彼此的71%至75%同一性。序列使用ClustalX(ClustalX(Jeanmougin等人，1998)進行比對，如圖1所示。實施例2:使用生物信息學分析揭示At4g26850作為GDP-L-半乳糖-脒基轉移酶的推定功能微餘基艘拔重復運行PSIBlast(Altschul等人，1997;Schaffer等人，2001)6+次，進一步檢測被鑒定基因的注解(annotation)。基序查找用MEME(Bailey和Elkan,1994)用一套基因作為選定輸入(At4g26850和HIT成員，包括GalT)進行。通過BLASTp査找編碼與未鑒定的擬南芥屬基因At4g26850的預期蛋白質序列相似的蛋白質的基因，申請人最初僅發現了也被注解為與At4g26850相似的其他植物基因。然而，進一步在匹配基因列表中的是蛋白質的InterproHIT家族(IPR001310)成員，該蛋白被鑒定為核苷酸結合蛋白質和水解酶。該家族包括二腺苷四磷酸(Ap4A)水解酶和GalT(I類D-半乳糖-l-磷酸尿苷轉移酶)(Brenner,2002)。例如，屬于這個GalT家族的大鼠基因顯示出1E-37的預期值，其與At4g26850的超過364個殘基具有30%的同一性和48%的相似性。盡管GalT亞群(也稱作interproIPR001937)具有相關基序HXHXQ，然而這些HIT蛋白質通常以基序HXHXH為特征(其中X是疏水氨基酸)。根據結構分析，已經顯示出GalT是HIT蛋白家族成員(Brenner等人，1997)。申請人使用PSI-BLAST(Altschul等人，1997;Schaffer等人，2001)細化該査找，且被比對的主要類別是HIT家族成員。例如，重復6次后，第一個非植物的比對序列是人的基因(Genbank34527348)，其具有28%的同一性和47%的相似性(在373個殘基中)并且預期值為2E-99。從一系列來自哺乳動物物種的基因中發現相似的比對，所有這些具有<2E-93的E值，描述二腺苷四磷酸(Ap4A)水解酶和其它HIT家族水解酶。在較低的相似性上，申請人觀察到一組的ATP腺苷酰轉移酶樣蛋白(預期〉E-70)。在較高的預期值O1E-10)上，申請人然后發現具有HIT注解的其它基因。申請人然后使用了一個選定的HIT組的interproIPR001310成員組，加AT4g26850、At4g26850禾卩EST319998(見表1)，并使用MEME網站httu:〃meme.sdsc.edu(Bailev和Elkan,1994)查找基序。申請人鑒定出六個顯著的基序，這六個顯著的基序出現在所有五種植物序列中。出現在四種動物序列中的五種這樣的基序和剩余的動物序列具有四種基序(見表1)。這顯示這些蛋白質是明確相關的，并屬于HIT超家族。表l.在選定范圍的獼猴桃est319998的同源物中出現的基序<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>基序1包括診斷模式HxHxQ(HxHxH的)(見圖1)。令人感興趣的是，HIT家族的GaIT亞家族也共有這個HxHxQ模式，盡管不能用這個序列發現共同基序。根據這些生物信息學分析，似乎可能的是負責抗壞血酸突變體FTC2(At4g26850)及其獼猴桃的同源物編碼脒基轉移酶。實施例3:獼猴桃GDP-L-半乳糖脒基轉移酶EST319998和擬南芥At4g26850在大腸桿菌(E"http://)中的表達及鑒定酶活性基像,_^厲好,^游袤這將來自中華獼猴桃幼小果實的EST319998和At4g26850中的每個克隆進入pET30A(Novagene,USA)中，檢査其在大腸桿菌中的序列和在大腸桿菌中的表達。N-末端His6標簽用于純化該蛋白。平行表達和純化空載體對照。這些技術基本上是以前已有描述的(Laing等人，2004)。在這項工作的大部分內容中，在5mLHiTrapQFF柱(GEHealthcare)上進一步純化組氨酸(His)蛋白，兩種制備物獲得相同的結果。結合酶從來源于美味獼猴桃的枝芽(shootbud)文庫的EST中，帶有麥芽糖結合蛋白前序列，克隆L-半乳糖脫氫酶(GenBank登錄號AAOl8639(EST56121),1.5ug/次分析)，并如前所述進行分析(Laing等人，2004)。從擬南芥"raWtto戸^(At3g02870,3.1ug/次檢測)中克隆L-半乳糖-l-磷酸磷酸酶，并如前所述進行分析(Laing等人，2004)。在用氰胺(hydrogencyanamide)處理3天后，從休眠的獼猴桃(Ue//c/0M)芽中克隆GDP-D-甘露糖3'，5'-差向異構酶(198296)，并如所述進行分析(Wolucka等人，2001)。前兩種酶就其底物是高度特異性的(Laing等人，2004;Laing等人，2004)。GDP-L-半乳糖(~50%純，如HPLC和LCMS所顯示，其污染有分解產物GDP和L-半乳糖-l-磷酸)和L-半乳糖-l-磷酸購自Glycoteam公司(Hamburg,Germany)。申請人:發現，GDP-L-半乳糖是極其酸性不穩定的，且申請人未試圖將其進一步純化。其他生化試劑購自Sigma公司。體艦.GDP-L-半乳糖-l-磷酸脒基轉移酶的檢測在20mMTrisCl,pH8.0,GDP-L-半乳糖中，和lmMD-甘露糖-l-磷酸進行的。直接使用來自Glycoteam產品的GDP-L陽半乳糖(在該情況下，由于L-半乳糖-l-磷酸的污染而觀察到高背景)，或者使用利用差向異構酶產生的GDP-L-半乳糖。在后一種情況下，0.21mg差向異構酶與GDP-D-甘露糖在20mMTrisClpH8，總體積是400uL(見Wolucka等人，2001)條件下于2(TC孵育30分鐘，然后在分析中以1至20稀釋直接使用。加熱至100'C持續3分鐘10分鐘后終止該分析，或直接與磷酸酶和L-半乳糖脫氫酶結合以測定分析期間產物的形成。將加熱終止的檢測物在冰上冷卻，離心去除沉淀的蛋白質和使用上述的結合酶檢測的L-半乳糖(也可見(Laing等人,2004))。L-半乳糖的分析與加入的L-半乳糖-l-磷酸在檢測范圍內是線性的。使用空載體對照進行背景分析，其產生與煮沸的酶的對照相同的結果。作為另外的檢測，用LCMS鑒定上述正向反應，以及檢測反向的焦磷酸化酶反應，其中GTP(1mM)和L-半乳糖-l-磷酸按照上述方法孵育，且形成隨后的GDP-L-半乳糖。在MS之前，通過HPLC分離GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖。LC-MS使用結合至EttanTMMDLC(GEHealthcareBio-Sciences)上的適合ESI界面的LTQ線性離子阱質譜儀(lineariontrapmassspectrometer)(ThermoQuest,Fi皿igan，SanJose,CA,USA)。使用維持在40°C的100x2.1mm的Hypercarb柱(ThermoElectron,USA)達到GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的分離。溶劑是(A)50mM乙酸銨和(B)乙腈，流速是200uL/min。最初的流動相，5。/。B持續3分鐘，然后于11分鐘時線性傾斜至20%B，持續5分鐘，然后于19分鐘時傾斜至70%B，并持續5分鐘，然后恢復至最初的條件。GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的截留時間分別是16.8分鐘和17.5分鐘。在負性模式下，使用選擇性的反應監測(SRM)方法SRMm/z604〉m/z344，362,424,442和選定的離子監測(SIM)方法SIMm/z604獲得MS數據。該SIM方法僅檢測GDP-D-甘露糖和GDP-L-半乳糖的(M-H)-離子，同時SRM方法監測通過將這兩種化合物的前體離子(M-H)-片段化而形成的特別的子系離子。這兩種方法通過從其他存在的化合物中過濾掉任何化學噪音把敏感度增加到最大限度。將ESI電壓、毛細管溫度、外殼氣體壓力(sheathgaspressure),掃描氣體和輔助氣體分別設置在-10V、350°C、25psi、3psi和3psi。使用100x2.1mm維持在40°C的Hypercarb柱(ThermoElectron,USA),平等地達到D-甘露糖-l-磷酸和L-半乳糖-l-磷酸的分離。溶劑是(A)20mM乙酸銨和(B)甲醇，且流速是200uL/min。使用2。/。B的流動相，D-甘露糖-l-磷酸和L-半乳糖-l-磷酸的截留時間分別是4.3min和4.9min。在負性模式下，使用選擇性反應檢測(SRM)方法SRMm/z259〉m/z79,97和選定的離子監測(SIM)方法SIMm/z259獲得MS數據。煙草葉中轉移酶的活性通過下列步驟來測定:在約5倍的體積的TrisClpH8.0,2mMDTT和1mMEDTA中提取液氮研碎的葉子，離心，使用以同樣緩沖液平衡的NAP脫鹽柱使上清脫鹽，并使用上述的結合檢測分析該酶。提取物中的蛋白質使用BioradBradfordCoumassie分析(Bradford,1976)測定，BSA用作標準。茲菜申請人將這些基因在pET30載體上在大腸桿菌中表達，并使用His標簽和Ni螯合柱純化蛋白質。該蛋白質在SDS凝膠上為55KD，且構成約90%的分離蛋白質。含有空pET30載體的對照也以同樣的方式處理。申請人使用兩種檢測來鑒定該酶，使用兩種來源的底物GDP-L-半乳糖。第一種檢測使用大腸桿菌表達的結合酶L-半乳糖-l-磷酸磷酸酶和L-半乳糖脫氫酶。該磷酸酶對于L-半乳糖-l-磷酸是高度特異性的，否則僅顯著地將肌醇-l-P脫磷酸(Laing等人，2004)。該脫氫酶對于L-半乳糖是特異性的，不與D-甘露糖或D-半乳糖或一系列其它糖發生反應(Gatzek等人2002;Laing等人，2004)，除了L-Gulose(古洛糖)。就這后一種底物而言，L-半乳糖脫氫酶表現出約2.5倍高的最大速率和30倍的Km(底物)，導致在有限的底物濃度下，L-古洛糖與L-半乳糖相比約8%的活性。結果是，我們的結合檢測基本上測定L-半乳糖，且也測定L-古洛糖。申請人檢測通過在檢測中加入結合酶形成的產物，或者檢測NADH形成的時程，或者通過10分鐘后煮沸3分鐘和離心終止該反應。在這后一種時間固定的檢測中，申請人然后加入結合酶檢測L-半乳糖的產生或者使用LCMS檢測產物。使用LCMS僅用于確認結合酶反應的結果并檢測反向反應。使用LCMS和結合反應檢測產物，清楚的是大腸桿菌表達的猴桃EST319998和At4g26能催化GDP-L-半乳糖轉變為L-半乳糖-l-P。取決于酶的濃度，時程是線性的，持續近10分鐘，且反應速率與加入的酶在檢測范圍內是線性的(數據未顯示)。在煮沸的酶或空載體存在條件下，沒有反應出現(圖2)。D-甘露糖-l-P對于脒基部分比對于磷酸或焦磷酸是更好的受體，但是在這些底物是生理濃度時，發現與這后兩種化合物的反應(圖3)。在有GDP-D-甘露糖，無差向異構酶時，或者有兩種底物中一種底物，且無結合酶時，未發現NAD還原活性(數據未顯示)。使用從商家購買的GDP-L-半乳糖-l-磷酸進行的反應具有很高的背景，這是因為L-半乳糖-l-磷酸的污染，且是在固定的時程內進行檢測。這一底物顯示出比用差向異構酶產生的底物進行反應時的速率稍高。測定了其它脒基受體，且發現該酶接受廣范的己糖-l-P底物，盡管D-葡萄糖-6-P僅以最佳受體速率的約25%進行反應(表2)。反應不需要Mg(數據未顯示)，盡管由于磷酸酶需要Mg而在結合檢測中包括Mg。使用表達擬南芥屬"ra6Wo^^J序列(At4g26850)的結合檢測也顯示出與獼猴桃EST319998具有相似的特性的轉移酶活性(數據未顯示)。表2.不同糖的磷酸作為脒基受體對于轉移酶活性的影響。使用差向異構酶產生的底物進行酶的檢測，且在其它條件下連續進行結合檢測如在方法中描述。N=6.(時程319998111006.xls)。底物速率nmol/sec/ug蛋白質標準誤差%D-甘露糖-lPD-葡萄糖-l-P0.350.036106D-葡萄糖-6-P0.080.00224D-葡萄糖-l-P0.240.0574L-肌醇-l-P0.420.07126D-半乳糖-l-PD-甘露糖-l-P0.380.011130.330.07100使用LC質譜確認反應產物是L-半乳糖-l-磷酸(表3)。這包括使用液相層析法分離反應產物，該方法從D-甘露糖中分離L-半乳糖，并從GDP-D-甘露糖中分離GDP-L-半乳糖，且產物的同一性通過其分子量確認。檢測到的逆反應是極少至無。表3.通過LCMS檢測轉移酶活性。使用固定時間檢測，于高或低蛋白質濃度和不同受體和底物的組合進行活性的檢測(如表所示)。檢測通過煮沸終止，且等份使用結合酶或者通過LCMS測定。未檢測nm。底物受體ug蛋白nmol/sec/ug蛋白質質結合檢測LCMSGDPMan/epim甘露糖-l-P0.0570.0120.0094GDPMan/epim無1.140扁380扁31GDPMan/epim無0.0570扁120GDPGal甘露糖-l-P0.0570.017高BGGDPMan/epimPPi1.140細950細3GDPMan/印imPPi0.0570.00260.0031GDPManGallP1.14nm0GDPManGallP0.057nm0GTPGallP1.14nm0GTPGallP0.057nm057苷酸，增加植物中產生的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和抗壞血酸膨靴僻含有克隆在pGreen(Hellens等人2000)上的獼猴桃GDP-L-半乳糖脒基轉移酶(EST319998)基因的土壤桿菌與含有以前描述的(Hellens等人,2005)沉默抑制子P19基因的土壤桿菌"grak"m'謂)混合，瞬時轉化煙草本塞姆氏(iV/cW/a"a6e"Aa冊'a"a)。使用在pGreen上僅含有的P19的土壤桿菌(^gra^c^7'MW)進行對照。轉化后9天收獲煙葉，并將其凍在液氮中。在無還原劑條件下在偏磷酸中如前所述提取抗壞血酸(Davey等人，2003;RassamandLaing,2005)。當以與作為沉默的抑制子P19混合的含有位于載體pGreen上的獼猴桃EST319998的土壤桿菌Ugra6a"ehww)克隆瞬時轉化煙葉時，能檢測葉子提取物中的可檢測活性(圖4A)。發現在僅單獨轉化P19的煙葉中有極低的活性(是轉化的~2%)(圖4)。對照組中低的酶水平是在抗壞血酸生物合成的L-半乳糖途徑中典型的其它酶的水平(WLaing，未發表的觀察結果)。注射土壤桿菌(^ro6""m'讓)的不同年齡的一系列葉子中出現該活性。與對照葉子相比，同樣轉化319998的葉子顯示出抗壞血酸有非常顯著的3倍增加(圖4)。實施例5:獼猴桃的抗壞血酸途徑基因的基因表達分析顯示，GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的高表達與抗壞血酸產生的增加相關。使用qPCR檢測獼猴桃的兩個物種的發育中果實的抗壞血酸生物合成的L-半乳糖途徑中的關鍵步驟基因的基因表達。美味獼猴桃含IOOmg/100gFW抗壞血酸，且毛花獼猴桃含多IO倍的抗壞血酸。顯示基因表達顯著增加的唯一步驟，與抗壞血酸的增加平行，該步驟是GDP-L-半乳糖-l-磷酸轉移酶的基因(表ls)。這支持了在煙葉中這同一基因的過表達導致抗壞血酸水平增加3倍的觀察結果。表ls:與看家基因((PPPRSA;表達設置到l)相比，開花后4周的Hayward和毛花獼猴桃果實中的L-半乳糖抗壞血酸的生物合成途徑成員表達的相對水平。毛花獼猴美味獼猴桃桃變化倍數酶底物(Hajwflr力(XZ-^^flJGDP-甘露糖-3'，5'-差向異構GDP-甘露糖1.82.41.3酶GDP-L-半乳糖脒基轉移酶L-半乳糖-卜磷GDP-L-半乳糖L-半乳糖-l-磷酸L-半乳糖L-半乳糖酸-l,4-內L-半乳糖脫氫酶L-半乳糖酸-l,4-內酯脫氫酶L-抗壞血酸開花后4周果實中的L-抗壞血酸(mg/100mg鮮重)脂4.10.7未檢測10031.2*1.8*1.2*未檢測10857.62.60.810.9*顯著地區別于Hayward(p^.05)實施例6:GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的獼猴桃EST的變體公開的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的獼猴桃EST的幾種變體序列經鑒定基本上如實施例2中所述，其來自Genbank或來自擁有所有權的HortResearchdeEST數據庫獼猴桃和蘋果序列。所有11條蛋白質序列通過ClustalX(Jeanmougin等人,1998,r固A5/oc/z泄Sc/.23，403-5.)進行比對，如圖6所示。這些序列都顯示顯著同源的區域，且包括兩個完全保守的基序AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)和GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)，這兩條基序經比對序列的視覺檢查而鑒定。當序列SEQIDNO:12或13中的任一條序列在blastp(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman，D.J.(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool."J.Mol.Biol.215:403-410)中用于查找GenBank的翻譯蛋白質數據庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb=protein)(3rdMarch2007)時，除了夷卩些在本發明序列列表中公開的序列，沒有其它含有完全保守基序的植物序列鑒定出來。因此，這兩條序列基序中任一個似乎可用于判斷本發明所述的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶，或者在本發明所述的方法中使用。所有多肽序列之間的同一性％顯示在圖7中。圖8顯示蘋果和獼猴桃序列叢集在一起，以及水稻和番茄序列是更加分離的無根的樹。序列使用Blastp査找Genbank和HortResearch數據庫鑒定，并用ClustalX進行比對，用Treeview進行可視化。如圖9所示，每條多核苷酸序列編碼區的DNA序列也用ClustalX進行比對。所有多核苷酸編碼序列之間的％序列同一性如圖10所示。實施例7:從獼猴桃和蘋果中鑒定GDP-D-甘露糖差向異構酶序列申請人在紐西蘭園藝和食品研究所擁有所有權的獼猴桃和蘋果EST數據庫中進行Blast查找，以鑒定與At5g28840同源的EST。申請人選定三個序列作為潛在的GDP-D-甘露糖差向異構酶的編碼序列，兩個來自獼猴桃(169164—KUFA:SEQIDNO:38和1998296—KALA:SEQIDNO:39),且一個來自蘋果(108403—AAOA:SEQIDNO:40)。相應的多肽序列分別顯示于SEQIDNO:25、26和27。申請人從公共數據庫中還鑒定出其它的GDP-D-甘露糖差向異構酶序列，其具有SEQIDNO:42至48的多核苷酸序列，編碼多肽序列SEQIDNO:29至35。多肽序列使用ClustalX(ClustalX(Jeanmougin等人，1998))比對，如圖11所示。序列之間的%序列同一性水平見圖12。申請人還鑒定出兩條序列基序(SEQIDNO:36和37)，其在所有經比對的序列中完全保守。實施例8:獼猴桃的GDP-D-甘露糖差向異構酶序列在大腸桿菌中的表達和酶活性的鑒定使用標準技術將美味獼猴桃的198296—KALA序列(SEQIDNO:39)克隆進pET30A(Novagene,USA)，并使其在大腸桿菌中表達。用N末端Hiss標簽純化蛋白質。平行表達和純化空載體對照。這些技術基本上如前所述(Laing等人,2004)。His-蛋白質在5mLHiTrapQFF柱(GEHealthcare)上脫鹽。方法如實施例3中所述。酶活性檢測如文獻所述(Wolucka等人,2001)。0.21mg差向異構酶與GDP-D-甘露糖于20。C—同在總體積是400uL的20mMTrisCl，pH8(見Wolucka等人，2001)中孵育30分鐘。通過HPLC分離反應產物以鑒定該反應產物新合成的GDP-L-半乳糖。通常使用反相柱。碧菜該蛋白質在SDS凝膠上出現在50KD位置并組成分離出來的蛋白質的約90%。含有空pET30載體的對照也以同樣方法進行處理。實施例9:通過表達本發明所述差向異構酶的多核苷酸，增加植物中產生的GDP-D-甘露糖差向異構酶活性和抗壞血酸淑印層好靴含有克隆在pGreen(Hellens等人，2000)上的GDP-D-甘露糖差向異構酶(169164—KUFA:SEQIDNO:38)和/或GDP-L-半乳糖脒基轉移酶(EST319998—AcSEQIDNO:14)獼猴桃基因的分離的土壤桿菌培養物與含有以前描述的(Hellens等人,2005)沉默抑制子P19基因的土壤桿菌混合，瞬時轉化煙草。使用在pGreen上僅含P19的土壤桿菌進行對照。轉化后9天收獲煙葉，并將其凍在液氮中。在無還原劑條件下，在偏磷酸中如前所述提取抗壞血酸(Davey等人，2003;Rassam禾口Laing，2005)。當以混合了作為沉默抑制子P19的含有載體pGreen上的獼猴桃EST319998的土壤桿菌(^gra^"eWww)克隆瞬時轉化煙葉時，能檢測葉子提取物中的可檢測活性。在僅轉化P19的煙葉中發現極低的活性(是轉化的2%)。以含有攜帶差向異構酶或P19的pGreen載體的土壤桿菌浸潤葉子，或者以僅含有aceto-syringinone的水注射葉子，對葉子的抗壞血酸水平沒有影響。以攜帶轉移酶基因的土壤桿菌浸潤煙葉，導致煙葉中抗壞血酸水平升高3倍，如前所示(Laing等人,2007)。然而，以差向異構酶和轉移酶的混合物注射葉子可使抗壞血酸水平另外升高2倍(表2)，共達到6倍，如下表2所示。表2.分別或一同瞬時表達GDP-L-半乳糖脒基轉移酶(319998)或GDP-D-甘露糖差向異構酶(169164)的基因后，葉子的抗壞血酸水平。在每一種情況下，病毒抑制子蛋白基因P19也與另兩種基因一同表達。對照或者單獨用P19，或者單獨用乙酰丁香酮(aceto-syringone)土壤桿菌感染試劑(同樣的結果)。數據代表三個植物的均值，每株植物取三個葉子(9次檢測，除了對照，其中數據代表18次檢測)。平均數SE抗壞血酸的相對量34.22.71.0處理對照差向異構酶轉移酶差向異構酶+轉33.32.31.0102.07.43.0194.222.65.7這些實驗表明本發明所述差向異構酶序列的過表達能增加植物中抗壞血酸的產生。這一點通過下列結果證實由于GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的過表達，植物中抗壞血酸己經增加3倍的抗壞血酸水平再增加2倍。實施例10:通過改變植物中表達的本發明所述轉移酶和差向異構酶序列的比例操作抗壞血酸的產生雄享銜好過教通過注射懸浮的含有目的基因的土壤桿菌培養物，使用瞬時表達系統((Hellens等人，2005))轉化煙草。GDP-甘露糖差向異構酶是來自毛花獼猴桃的EST169164，轉移酶是來自中華獼猴桃的EST319998。然后收獲葉子，并檢測抗壞血酸水平。此外，在一些情況下，還檢測酶的活性。所用的方法如實施例9中所述。研究本發明所述的差向異構酶和轉移酶序列之間的相互作用和協同作用是通過滴定這兩個基因，所述基因作為混合物注射進入煙草中。在所有的一種與另一種酶的組合中，含有土壤桿菌"grak/"m'ww)懸浮物的轉移酶(EST319998)和差向異構酶(169164)的體積不等，其從0加0.01、O.l和lmL。在所有情況中還加入P19以避免基因沉默。結果(圖15)顯示，在缺乏轉移酶的條件下，增加差向異構酶的水平對葉子中的抗壞血酸沒有影響。然而，在轉移酶存在條件下，抗壞血酸以飽和曲線響應差向異構酶的增加。在另一方面，由于在存在不同量的差向異構酶的條件下轉移酶是增加的，不能達到飽和。該數據表明，這兩個基因協同作用，但是，相對于差向異構酶，需要更大體積的轉移酶來使葉子的抗壞血酸達到最大濃度。在該實驗中，申請人觀察到在所用的兩種酶達到最大量時葉子的抗壞血酸增加7.5倍。將一個簡單的雙曲線模型擬合到這些數據上，預測在轉移酶和差向異構酶達到飽和時葉子的抗壞血酸增加9倍。實施例11:聯合表達本發明所述的差向異構酶序列和本發明所述的各種轉移酶序列使植物中的抗壞血酸的產生增加檢測在獼猴桃差向異構酶(169164)存在條件下，以獼猴桃(319998一Ac)、番茄(BT013858_Lc)和蘋果(82552—Md)的GDP-L-半乳糖轉移酶基因瞬時轉化(通過實施例8所述的方法)的煙葉中的抗壞血酸的產生。獼猴桃319998的轉化也在三種不同的載體構建體/土壤桿菌菌株結合體(combination)中進行。結果如圖16所示。對于所有顯示的物種，轉移酶增加葉子中的抗壞血酸水平，且加入差向異構酶以協同方式進一步增加抗壞血酸。EST319998通常是達到上述作用的最有效的基因。所有三種不同的載體和土壤桿菌克隆相似地起作用。申請人:還檢測了319998的兩種專門的構建體。第一種是克隆進入提供雙丙氨膦(bialaphos)抗性的pGreenII022962-SK中的319998轉移酶(HellensRP，EdwardsEA,LeylandNR,BeanS,MullineauxPM(2000)pGreen:aversatileandflexiblebinaryTivectorforAgrobacterium-mediatedplanttransformation.PlantMol.Biol.42:819-32)。這個構建體能用于在同一植物中產生轉移酶和差向異構酶雙轉化的植物，但是具有兩種不同的選擇標記，其用于選擇這兩種基因。圖17的結果顯示，該構建體是完全功能性的。該實驗還比較了獼猴桃(169164)和蘋果(108403)的差向異構酶，表明這兩種酶可有效地與轉移酶協同地增加抗壞血酸。為了使植物來源的蛋白質純化更容易，第二種構建體包括在pGreen的31998轉移酶序列基因前部的His標簽。當瞬時轉化進入煙葉中時，該構建體對于增加葉子中的抗壞血酸是有活性的(圖17)。實施例12:在轉基因植物中表達本發明所述的轉移酶序列，增加抗壞血酸的產生。申請人產生用含有pGreen中的轉移酶319998(CloughSJ和BentAF，1998.62Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana)的土壤桿菌用floraldipping方法轉化的擬南芥屬植物(PlantJ16:735-7430)。收集種子并選擇卡那霉素抗性品系。回收44個卡那霉素抗性品系，其中19個試驗了卡那霉素抗性分離比率。該數據見圖18。在該數據的基礎上，選擇下列品系進行進一步研究2、6、8、16、21、34、37、40、41、43、44，其中3種僅含有一個插入片段。在第二代，每種品系有多達12株植物從卡那霉素平板上挑選出來，使其在溫室中生長至標準大小的完整葉瓣，并進行抗壞血酸檢測(圖19)。在卡那霉素抗性基礎上挑選的11個品系中的9個表現出顯著的抗壞血酸增加。增加的抗壞血酸達到超過4倍于擬南芥葉子中正常的抗壞血酸水平。一些植物相對于對照植物(例如品系8和16)顯示出減少的抗壞血酸，這提示出現基因沉默。在該品系內，這些品系具有高和低的抗壞血酸植物的混合物。將從第二代中選擇的植物進行下一代培養。在存在選擇標記的條件下，通過將其培養在卡那霉素平板上對這些植物進行檢査，其顯示是卡那霉素抗性的。申請人還觀察到了其葉子中抗壞血酸是對照水平的4倍以上的植物(圖20)，但是還觀察到在有高抗壞血酸子代的品系之中，總有一些植物具有高和低的抗壞血酸，盡管所有植物來源于高抗壞血酸的卡那霉素抗性親本。再之，這提示基因沉默的出現。當抗壞血酸水平下降到未轉化植物葉子的抗壞血酸以下的時候，這尤其是這種情況，也提示了內源性基因也被沉默了。當319998與擬南芥64ra6Wo;^;^序列進行比對時，發現完全序列同一性的區域(數據未顯示)。這可能是見到的明顯基因沉默的原因。申請人檢查了第三代植物的319998基因表達(圖21)。在每一種情況下，相對對照具有高抗壞血酸的植物也顯示出319998表達增強。在一種情況下，具有低抗壞血酸的植物(在這個品系中沒有植物具有高抗壞血酸)也顯示出319998高表達。這可解釋為意味著在這個品系的基因沉默期間，出現一些基因的表達，如經我們的qPCR方法檢測的那樣。實施例13:轉基因煙草中本發明所述的轉移酶基因的表達導致抗壞血酸含量增加以319998轉化煙草，并選擇卡那霉素抗性品系。這些植物被轉移到土壤中生長直至長出幾片葉子。檢測這些葉子中的抗壞血酸和基因表達(圖22)許多品系顯示基因表達，且兩個品系還顯示出葉子中抗壞血酸顯著增加60%。煙草(Nicotianatabacum)"Samsun"用攜帶含有EST319998的pHex載體的根癌土壤桿菌"gra6a"e〃'wmftwje/ade朋)株GV101轉化。所用的方法如Guerineau等人(1990)所述，除了用卡那霉素取代比率為100mg丄-l的磺酰胺選擇性試劑。實施例14:本發明所述的轉移酶和差向異構酶序列在大腸桿菌中的表達和酶活性的驗證。各種轉移酶基因被克隆進入pET30載體中，并轉化大腸桿菌。帶有His-Trap標簽的蛋白質被表達、提取，通過金屬離子層析法純化，用G25柱脫鹽。用結合檢測進行活性檢測，其中使用GDP-D-甘露糖/GDP-L-半乳糖混合物(通過將EST198296表達的GDP-甘露糖差向異構酶蛋白質與GDP-甘露糖混合產生)作為底物進行檢測。該底物混合物與要檢測的轉移酶孵育，伴有過量的結合酶(更多的差向異構酶，L-半乳糖磷酸酶，L-半乳糖脫氫酶)和50mM雙丙烯酰胺三羥甲基氨基甲烷丙垸(Bistrispropane)pH7.5,0.5mMNAD和2.5mMMgCl2。檢測隨時間和加入轉移酶的量呈線性。檢測活性是在0.1至0.7nmol/mg蛋白質/sec范圍內(圖23)。檢測的所有表達的基因顯示轉移酶活性。此外，表達EST198296和108403的大腸桿菌也顯示差向異構酶活性(數據未顯示)，如通過HPLC和直接結合檢測所檢測到的。不能將本發明的范圍限于上述實施例。如本領域技術人員所理解，許多變化是可能的，其沒有脫離本發明的范圍。參考文獻AgiusF,Gonzalez-LamotheR，CaballeroJL,Munoz-BlancoJ，BotellaMA,ValpuestaV(2003)EngineeringincreasedvitaminClevelsinplantsbyoverexpressionofaD-galacturonicacidreductase.NatBiotechnol21:177-181.AltschulSF,MaddenTL,SchafferAA,ZhangJ,ZhangZ，MillerW,LipmanDJ(1997)GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes25:3389-3402.BaileyTL，ElkanC(1994)Fittingamixturemodelbyexpectationmaximizationtodiscovermotifsinbiopolymers.InProceedingsoftheSecondInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology.AAAIPress,MenloPark,California,pp28-36.BartoliCGGuiametJJ,KiddleG,PastoriGM,DiCagnoR，TheodoulouFL，FoyerCH(2005)Ascorbatecontentofwheatleavesisnotdeterminedbymaximall-galactono-l,4-lactonedehydrogenase(GalLDH)activityunderdroughtstress.Plant,CellandEnvironment28:1073-1081.BradfordM(1976)Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipalofprotein-dyebinding.AnalyticalBiochemistry72:248-254.BrennerC(2002)Hint,Fhit,andGalT:Function,Structure,Evolution,andMechanismofThreeBranchesoftheHistidineTriadSuperfamilyofNucleotideHydrolasesandTransferases.Biochemistry41:9003-9014.BrennerC，GarrisonP,GilmourJ,PeisachD，RingeD，PetskoGA,LowensteinJM(1997)CrystalstructuresofHINTdemonstratethathistidinetriadproteinsareGalT-relatednucleotide-bindingproteins.NatStructBiol4:231-238.ChenZ,YoungTE，LingJ,ChangSC,GallieDR(2003)IncreasingvitaminCcontentofplantsthroughenhancedascorbaterecycling.ProcNatlAcadSci100:3525-3530.ConklinPL(1998)VitaminC:anewpathwayforanoldantioxidant.TrendsPlantSci3:329-330.ConklinPL,GatzekS,WheelerGL，DowdleJ，RaymondMJ,RolinskiS,IsupovM,LittlechildJA，SmirnoffN(2006)ArabidopsisthalianaVTC4EncodesL-Galactose-l-PPhosphatase,aPlantAscorbicAcidBiosyntheticEnzyme.J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47483-47490.序列匯總轉移酶=GDP-L-半乳糖脒基轉移酶差向異構酶=GDP-D-甘露糖差向異構酶SEQIDNO.內容分子類型物種索弓l(Reference)1轉移酶多肽中華獼猴桃"WmWaEST319998—Ac2轉移酶多肽蘋果fMa/wsxEST82552—Md3轉移酶多肽中華獼猴桃EST244893—Ac4轉移酶多肽毛花獼猴桃(勿磁aEST24547—Ae67<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>權利要求1、一種制備具有增加抗壞血酸的植物細胞或植物的方法，該方法包括以編碼多肽或該多肽變體的多核苷酸轉化植物細胞或植物，所述多肽具有SEQIDNO1至11中任一個的氨基酸序列，其中該變體具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性。2、根據權利要求1所述的方法，其中變體包含氨基酸序列A匿SPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。3、根據權利要求1或2所述的方法，其中變體包含氨基酸序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。4、根據權利要求1至3中任一項的方法，其中多肽的變體與氨基酸序列SEQIDNO:1至11中任一個的多肽具有至少60%的序列同一性。5、根據權利要求1至4中任一項的方法，其中以編碼氨基酸序列SEQIDNO:1至11中任一個的多肽的多核苷酸轉化植物細胞或植物。6、根據權利要求1至5中任一項的方法，其中也以編碼GDP-D-甘露糖差向異構酶的多核苷酸轉化植物細胞或植物。7、一種制備具有增加抗壞血酸含量的植物細胞或植物的方法，其包括以編碼多肽或該多肽變體的多核苷酸轉化植物細胞或植物，所述多肽具有SEQIDNO:25至35中任一個的氨基酸序列，其中該變體具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性。8、根據權利要求7所述的方法，其中變體包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。9、根據權利要求7或8所述的方法，其中變體包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。10、根據權利要求7至9中任一項所述的方法，其中變體與氨基酸序列是SEQIDNO:25至35中任一個的多肽具有至少70%的序列同一性。11、根據權利要求7至10中任一項所述的方法，其中以編碼氨基酸序列SEQIDNO:25至35中任一個的多肽的多核苷酸轉化植物細胞或植物。12、根據權利要求7至11中任一項所述的方法，其中也以編碼GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的多核苷酸轉化植物細胞或植物。13、一種制備具有增加抗壞血酸含量的植物細胞或植物的方法，其包括以下列物質轉化植物細胞或植物.-a)編碼GDP-D-甘露糖差向異構酶的多核苷酸；和b)編碼GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的多核苷酸。14、根據權利要求13所述的方法，其中GDP-D-甘露糖差向異構酶包含氨基酸序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。15、根據權利要求13或14所述的方法，其中GDP-D-甘露糖差向異構酶包含氨基酸序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。16、根據權利要求13至15中任一項所述的方法，其中GDP-D-甘露糖差向異構酶包含與SEQIDNO:25至35中任一個的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的序列。17、根據權利要求13至16中任一項所述的方法，其中GDP-D-甘露糖差向異構酶包含SEQIDNO:25至35中任一個的氨基酸序列。18、根據權利要求13所述的方法，其中GDP-L-半乳糖脒基轉移酶包含氨基酸序列AINVSPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。19、根據權利要求13或18所述的方法，其中GDP-L-半乳糖脒基轉移酶包含氨基酸序列GYNSLGAFAT腿LHFQAY(SEQIDNO:13)。20、根據權利要求13、18和19中任一項所述的方法，其中GDP-L-半乳糖脒基轉移酶包含與SEQIDNO:1至11中任一個氨基酸序列的多肽具有至少60%序列同一性的序列。21、根據權利要求13和18至20中任一項所述的方法，其中GDP-L-半乳糖脒基轉移酶包含SEQIDNO:1至11中任一個的氨基酸序列。22、一種分離的多核苷酸，其編碼包含選自SEQIDNO:1至7中任一個的序列的多肽或其變體，其中該變體是GDP-L-半乳糖脒基轉移酶。23、根據權利要求22所述的分離的多核苷酸或變體，其中該變體包含序列A譜SPIEYGHVLLIP(SEQIDNO:12)。24、根據權利要求22或23所述的分離的多核苷酸或變體，其中該變體包含序列GYNSLGAFATINHLHFQAY(SEQIDNO:13)。25、根據權利要求22至24中任一項所述的分離的多核苷酸或變體，其中該變體包含與SEQIDNO:1至7中的任一序列具有至少72%同一性的序列。26、一種分離的多核苷酸，其編碼包含選自SEQIDNO:1至7中任一序列的多肽。27、一種具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的分離的多肽，其包含與選自SEQIDNO:1至7中任一個的氨基酸具有至少72%序列同一性的序列。28、根據權利要求27所述的分離的多肽，其包含選自SEQIDNO:l至7中任一個的氨基酸序列。29、一種分離的多核苷酸，其編碼包含選自SEQIDNO:25至27中任一個序列的多肽或其變體，其中該變體是GDP-D-甘露糖差向異構酶。30、根據權利要求29所述的分離的多核苷酸或其變體，其中該變體包含序列AADMGGMGFIQSNHSVI(SEQIDNO:36)。31、根據權利要求29或30所述的分離的多核苷酸或其變體，其中該變體包含序列GTWKGGREKAPAAFCRK(SEQIDNO:37)。32、根據權利要求29至31所述的分離的多核苷酸或其變體，其中該變體包含與SEQIDNO:25至27中任一序列具有至少91%同一性的序列。33、一種分離的多核苷酸，其編碼包含選自SEQIDNO:25至27中任一序列的多肽。34、一種具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的分離的多肽，其包含與SEQIDNO:25至27的氨基酸序列具有至少91%同一性的序列。35、根據權利要求34所述的分離的多肽，其包含選自SEQIDNO:25至27中任一個的氨基酸序列。36、一種分離的多核苷酸，其包含a)—種多核苷酸，其包含權利要求22至26、29至33和36中任一項所述的多核苷酸的長度至少為15個核苷酸的片段；b)—種多核苷酸，其包含本發明所述多核苷酸的長度至少為15個核苷酸的互補鏈；或者d)—種多核苷酸，其包含能與本發明所述多核苷酸雜交的長度至少為15個核苷酸的序列。37、一種遺傳構建體，其包含權利要求22至26、29至33和36中任一項所述的至少一種多核苷酸。38、一種表達構建體，其包含權利要求22至26、29至33和36中任一項所述的至少一種多核苷酸。39、一種RNAi構建體，其包含權利要求22至26、29至33和36中任一項所述的至少一種多核苷酸。40、一種宿主細胞，其包含權利要求37至39中任一項所述的至少一種構建體。41、一種遺傳修飾的宿主細胞，其表達權利要求22至26、29至33和36中任一項所述的至少一種多核苷酸，或權利要求27、28、34和35中任一項所述的至少一種多肽。42、根據權利要求41所述的遺傳修飾的宿主細胞，其表達編碼GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的多核苷酸；和編碼GDP-D-甘露糖差向異構酶的多核苷酸。43、一種制備GDP-L-半乳糖脒基轉移酶多肽的方法，該方法包含培養能表達GDP-L-半乳糖脒基轉移酶多肽的宿主細胞，所述細胞包含權利要求38所述的表達構建體或權利要求37所述的遺傳構建體。44、一種制備GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的酶產物的方法，其包括在酶的底物存在條件下培養宿主細胞，所述細胞包括權利要求38所述的表達構建體或權利要求37所述的遺傳構建體，能表達GDP-L-半乳糖脒基轉移酶多肽，酶的底物可以補充至宿主細胞中或天然存在于宿主細胞內。45、一種制備GDP-D-甘露糖差向異構酶多肽的方法，其包括培養宿主細胞，所述細胞包含權利要求38所述的表達構建體或權利要求37所述的遺傳構建體，能表達GDP-D-甘露糖差向異構酶多肽。46、一種制備GDP-D-甘露糖差向異構酶的酶產物的方法，其包括在酶的底物存在條件下培養宿主細胞，所述細胞包括權利要求38所述的表達構建體或權利要求37所述的遺傳構建體，能表達GDP-D-甘露糖差向異構酶多肽，酶的底物可以補充至宿主細胞中或天然存在于宿主細胞內。47、一種生物合成抗壞血酸的方法，其包括在抗壞血酸前體存在條件下，培養宿主細胞的步驟，所述細胞包含權利要求38所述的表達構建體或權利要求37所述的遺傳構建體，能表達GDP-L-半乳糖脒基轉移酶，抗壞血酸前體可補充至宿主細胞中或天然存在于宿主細胞內。48、根據權利47所述的方法，其中能表達GDP-D-甘露糖差向異構酶的宿主細胞還包含權利要求38所述的表達構建體或權利要求37所述的遺傳構建體。49、一種生物合成抗壞血酸的方法，其包括以下步驟在抗壞血酸前體存在條件下，培養宿主細胞，所述細胞包含能表達GDP-D-甘露糖差向異構酶的權利要求38所述的表達構建體或權利要求37所述的遺傳構建體，抗壞血酸前體可以補充至宿主細胞中或天然存在于宿主細胞內。50、根據權利要求49所述的方法，其中能表達GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的宿主細胞還包含權利要求38所述的表達構建體或權利要求37所述的遺傳構建體。51、一種遺傳修飾的植物細胞，其表達權利要求22至26、29至33和36中任一項所述的至少一種多核苷酸，或權利要求27、28、34和35中任一項所述的至少一種多肽。52、一種植物細胞，其包含至少一種權利要求38所述的表達構建體，或至少一種權利要求37所述的遺傳構建體。53、在另一個方面，本發明提供一種包含權利要求51或52所述的植物細胞的植物。54、一種選擇GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性或者抗壞血酸含量改變的植物的方法，其包括檢測植物的權利要求22至26和36中任一項所述多核苷酸表達的改變，或權利要求27或28所述的多肽表達的改變。55、一種選擇GDP-D-甘露糖差向異構酶活性或者抗壞血酸含量改變的植物的方法，其包含檢測植物的權利要求29至33中任一項所述的多核苷酸表達的改變或權利要求34或35所述的多肽表達的改變。56、一種通過權利要求1至21中任一項所述的方法制備的植物細胞或植物。57、一種或一組通過權利要求54或55所述的方法選擇的植物。58、一種制備抗壞血酸的方法，其包括從權利要求51、52、56或者57中任一項所述的植物細胞或植物中提取抗壞血酸。59、一種鑒定化合物為候選除草劑的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:1至11中任一個序列的多肽或其具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的變體接觸，且b)檢測所述化合物與所述多肽之間結合的存在和/或缺失；其中結合提示所述的化合物是候選除草劑。60、一種鑒定化合物為候選除草劑的方法，其包含a)將所述化合物與包含選自SEQIDNO:1至11中任一個序列的多肽或其具有GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的變體接觸，且b)評價該化合物對多肽的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性的影響；其中活性下降提示所述的化合物是候選除草劑。61、一種鑒定化合物為候選除草劑的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:25至35中任一個序列的多肽或其具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的變體接觸，且b)檢測所述化合物與所述多肽之間結合的存在和/或缺失；其中結合提示所述的化合物是候選除草劑。62、一種鑒定化合物為候選除草劑的方法，其包含a)將所述的化合物與包含選自SEQIDNO:25至35中任一個序列的多肽或其具有GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的變體接觸，且b)評價該化合物對多肽的GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的影響；其中活性下降提示所述的化合物是候選除草劑。63、一種抗權利要求27、28、34和35中任一項所述的多肽的抗體。64、一種制備L-半乳糖-l-磷酸的方法，其包含將GDP-L-半乳糖和GDP受體與包含本發明所述多核苷酸的表達構建體的表達產物接觸獲得L-半乳糖-l-磷酸，其中所述GDP受體包括己糖-l-磷酸或磷酸。65、一種制備GDP-半乳糖的方法，包括將GDP-甘露糖與包含本發明所述多核苷酸的表達構建體的表達產物接觸或與本發明所述的多肽接觸獲得GDP-半乳糖。全文摘要本發明提供調節植物中的GDP-L-半乳糖脒基轉移酶(也稱作GDP-L-半乳糖磷酸化酶)活性；和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶活性；和/或抗壞血酸含量的組合物和方法。本發明提供具有增加GDP-L-半乳糖脒基轉移酶活性和/或GDP-D-甘露糖差向異構酶活性的植物和植物細胞。本發明提供具有增加抗壞血酸含量的植物和植物細胞，這種增加是由于GDP-L-半乳糖脒基轉移酶的過表達；GDP-D-甘露糖差向異構酶的過表達；或特別是GDP-L-半乳糖脒基轉移酶和GDP-D-甘露糖差向異構酶的組合過表達。文檔編號A01N61/00GK101687907SQ200880011227公開日2010年3月31日申請日期2008年3月7日優先權日2007年3月8日發明者S·M·W·布利,W·A·萊恩申請人:新西蘭植物和食品研究院有限公司