種子收量提高的植物的制作方法

專利名稱：種子收量提高的植物的制作方法
技術領域：
本發明涉及種子收量提高的植物，更詳細的是通過導入植物來源的 Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基因而花數、種子數和種子重量中的至少一個 增加的植物，以及使植物的花數和種子數中的至少一個增加的方法。
背景技術：
以往，植物不僅作為糧食還作為鑒賞用、紙和藥品等工業材料和燃 料，在各種場合，與人類越來越緊密相關。而且，近年來，植物還作為 代替化石燃料的生物質能而備受關注。
對于在這樣多樣的用途中利用的植物的發芽、成長、開花等的機理 大多并不清楚。這是因為，植物主要是根據經驗和直覺進行栽培，其收 成大都受氣候等自然的影響所左右。因此，弄清楚植物的發芽、成長、 開花的機理，對它們進行調整和控制，在鑒賞用草本花以及谷物和野菜 等糧食的產量增加中十分重要，而且對于森林中木材的培育以及生物質 能也極為重要。
迄今為止，作為調整植物的成長的手段，人們逐步進行了通過溫室 等人工氣候環境調整開花時期，使用乙烯等化學藥品促進成長等努力。 然而，以往這些方法中的許多方法通過經驗和直覺調整植物的成長，并 沒有基于可以科學判斷植物的成長過程的材料。
因此，本發明人對于植物的發芽、成長、開花的機理逐步開展研究。 其結果是，并已指出活性氧和谷胱甘肽等氧化還原狀態調節物質在植物
的發育中作為控制因子都是必需的(參照專利文獻l, 2)。
谷胱甘肽(GSH)是經Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶由半胱氨酸和谷氨酸 合成Y-谷氨酰半胱氨酸，再經GSH合成酶添加甘氨酸而合成的多肽。谷 胱甘肽是細胞內的主要抗氧化物質，而且，具有解毒細胞內的異物的功
4據報道在導入了大腸桿菌的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的形質轉
化植物中，谷胱甘肽量有效增加(參照非專利文獻1-3)。但是，有凈艮道指 出這種形質轉化植物存在遇光變弱的情況(參照非專利文獻3)。
另 一方面，據報道在使植物自身具有的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基 因過度表達時，具體在通過在擬南芥中導入擬南芥的Y -谷氨酰半胱氨酸 合成酶基因使之過度表達的形質轉化植物中，Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶 mRNA及其翻譯產物(蛋白質)的表達量大幅增力口，但谷胱甘肽量的增加小
(非專利文獻4)。所以，人們意識到采用植物來源的y-谷氨酰半胱氨酸合 成酶基因作為植物中的谷胱甘肽量增加的方法不理想。
專利文獻1: WO01/080638(
公開日:平成15(2003)年7月22曰)
專利文獻2:日本公開專利公報特開2004-352679(
公開日平成 16(2004)年12月16曰)
非專利文獻1: Noctor G Strohm M， Jouanin L， Kunert KJ， Foyer CH， Rennenberg H. Synthesis of glutathione in leaves of transgenic poplar overexpressing y畫谷氛酰半胱氛酉交 synthetase. Plant Physiol. 1996 Nov;112(3):1071畫1078.
非專利文獻2: Noctor Q Arisi AC， Jouanin L， Foyer CH. Manipulation of glutathione and amino acid biosynthesis in the chloroplast. Plant Physiol.1998 Oct; 118(2):471-482.
非專利文獻3: CreissenG， FirminJ， FryerM, KularB, LeylandN, Reynolds H, PastoriG, WellburnF, Baker N, WellburnA, MullineauxP。 Elevated glutathione biosynthetic capacity in the chloroplasts of transgenic tobacco plants paradoxically causes increased oxidative stress. Plant Cell.1999 Jul; 11(7):1277-1292.
非專利文獻4: Xiang C， Werner BL， Christensen EM， Oliver DJ. The biological functions of glutathione revisited in arabidopsis transgenic plants with altered glutathione levels. Plant Physiol.2001 Jun;126(2):564-574.

發明內容
如上所述，盡管人們嘗試進行了通過在植物中導入y -谷氨酰半胱氨 酸合成酶基因使谷胱甘肽量增加的嘗試(非專利文獻1-4),過去的才艮告中 公開了在植物中導入y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基因時(非專利文獻4),在 非壓力下沒發現對植物的正常生長過程(形態等)有大的影響，但是沒有就 對收獲量會有何種影響作研究。
而且，由于考慮到通過在植物中導入植物來源的y -谷氨酰半胱氨酸 合成酶基因難以使谷胱甘肽量大幅增加，因此本發明人之外基本沒有其 它研究組研究植物來源的y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基因產物與植物生長 之間的關系。
因此認為內源的谷胱甘肽合成系統伴隨植物的生長受到某種控制。科學 把握植物的生長過程，科學預測開花時期并進行調整不僅在鑒賞用草本 花和糧食用植物而且在森林以及生物質能用的植物資源中都極為重要。 因此，為了弄清楚內源谷胱甘肽合成的未知的控制系統，了解與催化該 合成系統的第一階段的y -谷氨酰半胱氨酸合成酶相關的植物來源的基因 產物的功能，弄清楚其與植物的生長的關系意義十分深遠。
該研究的結果是，發現了谷胱甘肽合成的控制與種子收量之間存在 緊密的關系，并且了解了這種控制存在于催化合成的第一階段的y -谷氨 酰半胱氨酸合成酶基因產物中。
本發明的目的在于基于這種發現提供一種制作種子收量提高的植物。
本發明人在研究植物生長中植物來源的y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基 因產物的控制機制的過程中，發現導入了植物來源的y-谷氨酰半胱氨酸 合成酶基因的形質轉化植物中y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的表達量提 高的植物，通過在比使每單位面積的生物量和種子收獲量充分提高的栽 種密度更高的栽種密度下進行栽培，花數和種子數都比親本植物有所增 加，從而完成了本發明。
也就是說，本發明涉及的植物的特征在于具有使y -谷氨酰半胱氨酸
6合成酶活性水平增加的變異，而且通過在比使每單位面積的生物量和種 子收獲量充分提高的栽種密度更高的栽種密度下進行栽培，單位面積的 生物量和種子收獲量比親^^直物進一步增加。而且，本發明涉及的植物的特征在于具有使Y -谷氨酰半胱氨酸合成 酶表達水平增加的變異，而且通過在比使每單位面積的生物量和種子收 獲量充分提高的栽種密度更高的栽種密度下進行栽培，單位面積的生物 量和種子收獲量比野生型植物進一步增加。而且，本發明涉及的形質轉化植物的特征在于導入了編碼植物來源 的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸，而且通過在比4吏每單位面積的 生物量和種子收獲量充分提高的栽種密度更高的栽種密度下栽培，單位 面積的生物量和種子收獲量比親本植物進一步增加。本發明涉及的形質轉化植物中，編碼上述植物來源的Y -谷氨酰半胱 氨酸合成酶的多核苷酸的翻譯產物具有葉綠體移行信號肽是優選的。編碼具有葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多肽優選 選自于以下的(a)-(d):(a) 編碼由序列號1所示的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(b) 編碼序列號1所示的tt酸序列中缺失、取代或添加了一個或多 個氛基酸的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(c) 序列號2所示的石咸基序列構成的多核苷酸(d) 與序列號2所示的石咸基序列構成的多核苷酸在嚴緊條件下雜交的 多核苷酸本發明涉及的形質轉化植物中，優選的是編碼上迷^L物來源的Y -谷 氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的翻譯產物不具有葉綠體移行信號肽， 收獲指凄W是高。編碼不具有葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷 酸優選選自于以下的(e)-(h):(e) 編碼序列號3所示的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(f) 編碼由序列號3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或 多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(g) 由序列號4所示的i威基序列構成的多核苷酸(h) 與由序列號4所示的堿基序列構成的多核苷酸在嚴緊條件下雜交 的多核香酸。酶的多核苷酸。本發明涉及的方法是使植物的花數和種子數中的至少任意一個增加 的方法，其特征在于包括在植物中導入編碼Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶 的多核苷酸的工序，以及在比使單位面積的生物量和種子收獲量充分提 高的栽種密度更高的栽種密度下栽培導入了上述多核苷酸的植物的工序。本發明的方法中優選上述編碼Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸 選自于以下的(a)-(h):(a) 編碼序列號1所示的氨基S臾序列構成的多肽的多核苷酸(b) 編碼序列號1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或多 個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(c) 序列號2所示的堿基序列構成的多核苷酸(d) 與序列號2所示的堿基序列構成的多核苷酸在嚴緊條件下雜交的 多核苷酸(e) 編碼序列號3所示的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(f) 編碼由序列號3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或 多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(g) 由序列號4所示的石威基序列構成的多核苷酸(h) 與由序列號4所示的石威基序列構成的多核苷酸在嚴緊條件下雜交 的多核苷酸。本發明的其它目的，特征和優點通過以下所述記載會十分清楚。而 且，本發明的優點參照附圖按照以下說明也是一目了然的。


圖1: A為表示具有葉綠體移行信號肽的GSH1基因和不具有葉綠8體移行信號肽的GSH1基因的克隆中使用的引物和限制性酶位點的圖，B 是表示形質轉化時使用的構建體的圖。圖2:是導入了 35S-Chl.GSHl-pBI121的形質轉化植物(2-16)和作為 親本植物的野生型植物(Col)中GSH1 mRNA的RT-PCR的結果的電泳圖 像。而且，ACT1是被發現在該生長條件下構成性表達的對照基因。圖3:是表示野生型植物，導入了 35S-Chl.GSHl-pBI121的形質轉化 植物和導入了 35S-cyt.GSHl-pBI121的形質轉化植物中具有葉綠體移行 信號肽的GSHlmRNA的定量RT-PCR的結果的圖。圖4:是表示野生型植物，導入了 35S-Chl.GSHl-pBI121的形質轉化 植物和導入了 35S-cyt.GSHl-pBI121的形質轉化植物中所有GSHlmRNA 的定量RT-PCR的結果的圖。圖5:是表示野生型植物，導入了 35S-Chl.GSHl-pBI121的形質轉化 植物和導入了 35S-cyt.GSHl-pBI121的形質轉化才直物中導入的 35S-GSHl-pBI121來源(35S-Chl.GSHl-pBI121或35S畫cyt.GSHl畫pBI121) 的GSHlmRNA的定量RT-PCR的結果的圖。圖6:是表示野生型植物，導入了 35S-Chl.GSHl-pBI121的形質轉化 植物和導入了 35S-cyt.GSHl-pBI121的形質轉化植物中宿主基因組來源 的GSHlmRNA的定量的RT-PCR的結果的圖。圖7:是以野生型植物(Col-O)的基因組來源的GSHlmRNA量為1以 相對值表示導入了 35S-cyt.GSHl-pBI121的形質轉化植物(35S-cyt.GSHl l-l,2-7，3-6)中35S-GSHl-pBI121來源的GSHlmRNA量的圖。圖8:是表示野生型植物和導入了 35S-cyt.GSHl-pBI121的形質轉化 植物中GSH1基因產物的y -谷氨酰半胱氨s殳合成酶活性的圖。圖9:是表示生長的光強度變化時的導入了 35S-Chl.GSHl-pBI121 的形質轉化植物中內源谷胱甘肽量的變化的圖。圖10:是表示導入了35S-cyt.GSHl-pBI121的形質轉化植物中內源谷胱甘肽量的圖。圖11:是擬南芥(Col-0，35S- cyt.GSHl)的植物體的照片。圖12:是對22。C,長日照條件下生長的擬南芥(Col-0，35S-Chl.GSHl 2-16, 35S-cyt.GSHl 1-1,2-7,3-6 )的地上部分生物量(種子以夕卜)(A),種子重 量(B),收獲指數(C)和地上部分生物量(D)進行比較的圖。圖13: A是表示導入了35S-cyt.GSHl-pBI121的形質轉化植物 (35S-cyt.GSHl(2-7))和導入了 35S-5，UTRcyt.GSHl-pBI121的形質4爭化植 物中的來自于35S-GSH1- pBI121(35S-cyt.GSHl-pBI121或 35S-5，UTRcyt.GSHl-pBI121)的GSHlmRNA的定量RT-PCR的結果的圖。 B是表示同植物中宿主基因組來源的GSH1 mRNA的定量RT-PCR的結果 的圖。以35S-cyt.GSHl(2-7)的GSHlmRNA量作為l，用相對值表示。圖14: A是表示大腸桿菌來源GSH1基因的克隆用引物和限制性酶位 點的圖，B是表示用于轉化的構建體的圖。圖15:是表示mRNA的穩定性由于插入GSH1基因的5，非翻譯區域 而提高的植物的生長和生產性比Col有所提高的圖。圖16:是表示使大腸桿菌來源的GSH1在擬南芥中表達，使之局部存 在于葉綠體時的植物的樣子的圖。圖17:是表示使大腸桿菌來源的GSH1在擬南芥中表達，使之局部存 在于細胞質時的植物的樣子的圖。圖18:是表示生長時的光強度設定在200 |u E /m2/s時的植物的生長性 和種子收量的圖。圖19:是表示栽種密度和每個個體的生長性和種子收量之間的關系 的圖(數值是相對值)。圖20:是表示通過GSH1基因導入可以抑制取決于栽種密度的生物 量，種子收量和收獲指數的降低的圖。圖21:是表示表達GSH1的植物的單位面積的收量和種子量的差異的圖。圖22:是表示野生型植物的栽種密度和種子收量的關系的圖。10圖23:是表示提高谷胱甘肽結合型醛縮酶的表達時的GSH1基因的導 入效果的圖。圖24:是表示提高谷胱甘肽結合型醛縮酶的表達時的GSH1基因的導 入效果的圖。圖25:表示導入了35S-cyt.GSHl-pBI121的菊花的每個缽中的總花數。
具體實施方式
本發明提供了具有使Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的變 異，而且通過在比使單位面積的生物量和種子收獲量充分提高的栽種密 度更高的栽種密度下栽培，單位面積的生物量或種子收獲量比親本植物 進一步增加的植物。而且，本發明提供了具有使Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的表達水平增 加的變異，而且通過在比使單位面積的生物量和種子收獲量充分提高的 栽種密度更高的栽種密度下栽培，單位面積的生物量或種子收獲量比親 本植物進一 步增加的植物。本發明涉及的植物通過在比使單位面積的生物量和種子收獲量充分 提高的栽種密度更高的栽種密度下栽培，花數、種子數和種子重量中的 至少一個比親本4直物增加。"栽種密度"是指單位面積中栽種的個體數。通常，培育植物時，按 合適的間隔栽種幼苗和樹苗，間苗。這是因為，個體的栽種密度一旦提 高，則每個個體的生物量生產性降低，每單位面積的生物量生產性達到 頂點。這樣，存在與植物的單位面積的生物量生產性相適應的栽種密度， 以超過該密度的密度栽種導致相對于種子和幼苗的購入費用而收獲物量 降低，因此不優選。本發明中所謂"使單位面積的生物量和種子收獲量 充分提高的栽種密度"是指各品種中最合適的栽種密度(即，單位面積的 生物量生產性達到最大的最合適的栽種密度)。而且，盡管植物的每個品 種所最適的栽種密度并不相同，但本領域技術人員可以容易地了解相應與所使用的植物的最適的栽種密度。本發明涉及的植物在以比使單位面 積的生物量和種子收獲量充分提高的栽種密度更高的栽種密度栽J咅時， 單位面積的生物量或種子收獲量比親本植物/野生型植物進一步增加。但 是，栽培本發明涉及的植物時的栽種密度不需要限于比上述最適栽種密度更高的情況，優選為各品種中最適的栽種密度的30%以上，更優選在 60%以上，更為優選100%以上。本發明中，所謂"Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性"是指催化4吏谷氨 酸與半胱氨酸在Y位形成酰胺鍵的反應的活性。Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平，可以例如，采耳又通過氮取代等 方式進行的氧化防止措施，將破碎的植物體進行離心分離而獲得的上清 作為試樣，在含有半胱氨酸，谷氨酸和ATP的反應液中添加試樣后，作 為一定時間內合成的Y-谷氨酰半胱氨酸量求得。此外，還可以通過定量 伴隨該反應生成的磷酸量來求得。"Y -谷氨酰半胱氨S臾合成酶活性水平增加"是指活性水平高于同 一種 親本植物的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平。優選與在同一條件下栽 種的同一種親本植物的同一部位的Y -谷氨酰半胱氨S吏合成酶活性水平相 比，活性水平在1.1倍以上時判斷為活性水平增加，更優選通過U企-驗存 在5%水平的顯著差異時判斷為活性水平增加。而且，親本植物的活性水 平必須用相同方法同時測定。本發明中，所謂"Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表達水平"是指Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA的量或Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白質 的量。作為測定Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA水平的方法，如果是可 以測定特定mRNA水平的方法，則無特別限定，可以/人/>知方法中適當 選擇。具體可以例舉例如RT-PCR法，實時RT-PCR法，CompetitivePCR 法，Northern blot法，原位雜交法，原位PCR法，DNA陣列法等。作為測定Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白質水平的方法，如果是可以 測定特定蛋白質水平的方法，則無特別限定，可以從公知方法中適當選 擇。具體可以例舉例如使用與測定對象的Y -谷氨酰半胱氨S臾合成酶蛋白12質特異性結合的抗體。作為使用抗體測定蛋白質水平的公知方法，可以例舉例如radio imuno assay(RIA)法，ELISA法(固相酶免疫測定法)， western blot法，免疫沉淀法，免疫組織化學法，抗體陣列法等。所謂"y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的表達水平增加"是指mRNA或蛋 白質水平高于同 一種親本植物的y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的表達水平。 優選與在同一條件下栽種的同一種親本植物的同一部位的y -谷氨酰半胱 氨酸合成酶表達水平相比，表達水平在1.1倍以上時判斷為表達水平增 加，更優選通過t檢驗存在5%水平的顯著差異時判斷為表達水平增加。 而且，優選親本才直物的表達水平用相同方法同時測定，而且可以4吏用積 累的數據作為背景數據。本發明中所稱"花數"是指1個個體或單位面積中所種植的才直物上 形成的花數。而且，所謂"種子數"是指1個個體或單位面積中所種植的才直物上 形成的種子數。所謂"花數增加"是指與相同栽培條件下栽培的同一種親本植物的 花數相比增加。而且，所謂"種子數增加"是指與相同栽培條件下栽培 的同 一種親本植物的種子數相比增加。如果花數增加，例如，以觀賞花作為目的的觀葉植物的價值則升高。 而且，由于花數增加與果實增加相關，因此利用果實的植物的價值也升 高。而且，如果種子數增加，則利用種子的植物的價值升高。y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的植物可以通過以下方式獲得，例如，在目標植物中用公知的變異導入法隨機導入變異，從中篩選 出y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的個體。同樣，Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶表達水平增加的植物也可以通過以下方式獲得，在從隨機導入了變異的植物組中篩選出y-谷氨酰半胱氨酸 合成酶表達水平增加的個體。在植物中隨機導入變異的方法沒有特別限定，可以適當選擇公知的 方法進行使用。具體可以例舉例如用化學物質(例如，EMS，NTG等)處理 種子的方法，利用》文射線的方法，利用轉座子的方法，利用T-DNA的方法，通過基因槍物理導入的方法等。Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的個體的篩選中，可以使用上述Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平的測定方法。同樣，Y-谷氨酰半 胱氨酸合成酶表達水平增加的個體的篩選中，可以使用上述Y -谷氨酰半 胱氨酸合成酶表達水平的測定方法。此外，如果Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶表達水平增加，則通常，與之 相隨，y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加。因此，可以容易地理解 Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶表達水平增加的植物也相當于Y -谷氨酰半胱 氨酸合成酶活性水平增加的植物。迄今為止，以及就獲得內源性的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性水 平，或者表達水平增加的變異體的方法進行了說明，但Y-谷氨酰半胱氨 酸合成酶的活性水平或表達水平增加的植物可以通過導入編碼植物來源 的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸來獲得。也就是說，本發明提供 了導入了編碼植物來源的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸且花數和 種子數中的至少一個增加的形質轉化植物。以下，就本發明涉及的形質 轉化植物和本發明涉及的使植物的花數和種子數中的至少一個增加的方 法進行說明。此外，在本說明書中使用時，用語"多肽"可以與"肽，，或"蛋白 質，，交換使用。而且，在本說明書中使用時，用語"多核苷酸，，可以與 "基因""核酸"或"核酸分子"交換4吏用，是指核苷酸聚合物。可以在本發明中使用的編碼Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸 (以下記為"GSH1基因"。)如果是植物來源則沒有特別限定。優選為宿 主植物本身具有的GSH1基因，但也可以適當使用來源于與宿主植物不 同的植物的GSH1基因。這里，可以在本發明中使用的植物來源的GSH1基因的翻譯產物在 具有葉綠體移行信號肽時，確認了本發明涉及的形質轉化植物除了花數 和種子數中的至少一個增加之外，生物量和種子收量也增加了。另一方 面，可以在本發明中使用的植物來源的GSH1基因的翻譯產物在不具有 葉綠體移行信號肽時，發現本發明涉及的形質轉化植物除了花數和種子14數中的至少一個增加之外，收獲指數也提高了。這些表現型的特點在下 文進4亍說明。植物來源的GSH1基因編碼的蛋白質通常含有葉綠體移行信號肽。 所以，植物來源的GSH1基因產物，即Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶通常存 在于葉綠體中。另一方面，不具有葉綠體移行信號肽的Y-谷氨酰半胱氨 酸合成酶無法向葉綠體移行。本說明書中所謂"不具有葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半胱氨酸合 成酶"是指不存在正常行使功能的葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半胱氨 酸合成酶，例如，包括原來存在的葉綠體移行信號肽區域全部缺失，一 部分缺失而喪失葉綠體移行功能，由于氨基酸的取代或添加而喪失葉綠 體移行功能，原本不具有葉綠體移行信號肽等。因此，編碼不具有葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的 GSH1基因需要作為例如編碼葉綠體移行信號肽的區域發生缺失的變異 GSH1基因進行人工制備。作為本發明中可以使用的合適的GSH1的基因的1種，可以例舉本 發明人使用的擬南芥的GSH1基因(TAIR登錄基因2127172,名稱 AT4G23100.1)。擬南芥的y -谷氨酰半胱氨酸合成酶由序列號1所示的氨 基酸序列構成，編碼其的基因(全長cDNA)由序列號5所示的堿基序列構 成。序列號5所示的堿基序列中，第172-174位為啟始密碼子，第1738 位-1740位為終止密碼子。也就是說，擬南芥GSH1基因，序列號5所示 的堿基序列中，具有第172-1740位的開放性閱讀框(ORF)。序列號2所 示的堿基序列是擬南芥GSH1基因的ORF的堿基序列。而且，擬南芥的GSH1基因產物(序列號1所示的氨基酸序列構成的 多肽)，如果使其自N末端起的73個氨基酸缺失，本發明人發現Y -谷氨 酰半胱氨酸合成酶不向葉綠體移行而存在于細胞質中。因此，可以例舉 由序列號3所示的tt酸序列構成的多肽作為不具有葉綠體移行信號肽 的擬南芥的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶，編碼其的基因由序列號4所示的 堿基序列構成。但是，缺失的氨基酸不限于自N末端起的73個氨基酸， 只要在葉綠體移行信號肽的功能喪失的前提下，可以進行適當選擇。本15領域技術人員使用公知技術可以容易地確認進行怎樣的改變葉綠體移行 信號肽的功能是否喪失。作為擬南芥以外的植物來源的GSH1基因，已知有例如百曰草 (Genbank登錄號AB158510),稻(Genbank登錄號AJ508915)，煙草 (Genbank登錄號DQ444219)等，這些都可以在本發明中適當使用。這 些基因的翻譯產物與擬南芥一樣，在N末端區域中具有葉綠體移行信號 肽。而且，由在序列號1或3所示的M酸序列中缺失，取代或添加了 1 個或多個氨基酸的氨基酸序列構成，且編碼具有Y -谷氨酰半胱氨酸合成 酶活性的多肽的多核普酸也可以在本發明中適當^f吏用。這其中所謂的"缺失，取代或添加了 l個或多個氨基酸"是指缺失， 取代或添加了通過定點誘變法等公知的變異肽制備法可以缺失，取代或 添加的程度的數目(優選10個以下，更優選7個以下，更優選5個以下) 的氨基酸。這種變異蛋白質不限于具有通過公知的變異多肽制備法人為 導入的變異的蛋白質，還可以是分離純化的天然存在的蛋白質。本領域周知的是，蛋白質的氨基酸序列中的幾個氨基酸可以以對該 蛋白質的結構或功能沒有顯著影響的容易地進行改變。而且，公知的是， 不僅有人為進行改變的變異體，而且還存在天然蛋白質中該蛋白質的結 構或功能不發生顯著變化的變異體。優選的變異體具有保守性或非保守性氨基酸取代，缺失或添加。優 選的是沉默取代，添加和缺失，特別優選的是保守性取代。這些都不會 使本發明涉及的多肽活性發生變化。被認為是代表性的保守性取代的為以下取代脂肪族氨基酸 Ala,Val,Leu和lie中的1個氨基酸向其它氨基酸的取代，羥基殘基Ser和 Thr的交換，酸性殘基Asp和Glu的交換，氨基殘基Asn和Gln之間的 取代，堿性殘基Lys和Arg的交換，以及芳香族殘基Phe, Tyr之間的取 代。而且，本發明中，只要可以編碼具有y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性 的蛋白質，還可以使用在嚴緊條件下與由序列號2或4所示的堿基序列構成的多核苷酸雜交的多核苷酸。這種多核苷酸包括例如由序列號1中 所示的氨基酸中缺失，取代或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列構 成的多肽的多核苷酸。本發明中所謂"嚴緊條件"是指只是在序列之間存在至少90%的同 一性，優選至少95%的同一性，最優選至少97%的同一性時才發生雜交。 具體可以例舉例如在雜交溶液(含50%曱酰胺,5 x SSC(150mM的NaCl, 15mM的檸檬酸三鈉)，50mM的磷酸鈉(pH7.6),5 x Denhert液，10%石克酸 葡聚糖和20 ia g/ml的變性剪切鮭精子DNA)中于42。C溫育過夜后，約65 。C在0.1 x SSC清洗過濾器的條件。雜交可以按Sambrook等人在分子克隆，實驗室手冊第三版，冷泉港 實驗室(2001)中記載的方法進行。通常，溫度越高，鹽濃度越低的嚴緊度 越高(更難雜交)。可以獲得同源性更高的多核苷酸。氨基酸序列和堿基序列的同一性可以用Karlin和Altschul的算法 BLAST(Karlin S, Altschul SF, Proc 。NatLAcad.Sci.USA，87:2264-2268(1990); Karlin S, Altschul SF, Proc 。 Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993))來決定。現已開發了基于BLAST 的算法的稱為BLASTN和BLASTX的程序(Altschul SF等人， J.Mol.Biol. ,215:403 (1990))。可以在本發明中使用的GSH1基因，可以是來源于基因組DNA,也 可以來源于cDNA,也可以是化學合成DNA。而且也可以是RNA。作為獲得可以在本發明中使用的GSH1基因，可以例舉通過乂^知的 技術分離并克隆編碼Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA片段的方法。例 如，可以制備與編碼擬南芥的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA的堿基 序列的一部分特異性雜交的探針，篩選基因組DNA文庫和cDNA文庫。或者，作為或者可以在本發明中使用的GSH1基因，可以例舉使用 PCR等擴增手段的方法。例如，通過從編碼擬南芥的Y-谷氨酰半胱氨酸 合成酶的cDNA中5，側和3'側的序歹'K或者其互補序列)中分別制備引物， 使用這些引物，以基因組DNA(或者cDNA)作為模板進行PCR等，擴增 兩條引物間所夾的DNA區域，可以大量獲得可以在本發明中使用的編碼Y -谷氨酰半胱氨酸的DNA片段(GSH1基因)。可以在本發明中使用的GSH1基因可以以合適的植物的組織或細胞 作為供給源來獲得。由于所有的植物具有GSH1基因，因此可以以所希 望的植物作為供給源來獲得GSH1基因。本發明中，作為在植物中導入GSH1基因的方法，可以適當使用構 建在編碼Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的DNA的上游連結在植物細胞中行 使功能的啟動子，在下游連結在植物細胞中行使功能的終止子的重組表 達載體，再導入于植物中的方法。后述的實施例中，作為在植物細胞中行使功能的啟動子，使用構成 型表達的花椰菜花葉病毒35S啟動子，但不限于此。作為花椰菜花葉病 毒35S啟動子以外的構成型啟動子，可以例舉稻的肌動蛋白啟動子，玉 米的泛素等，這些啟動子也可以在本發明中適當使用。作為構成型啟動子以外的啟動子，可以例舉rbsS啟動子，Cab啟動 子等的綠葉組織特異的啟動子和HSP70啟動子等誘導性啟動子，但不限 于此。而且，在葉綠體的基因組中直接插入時的啟動子，可以例舉rbcL 啟動子等，但如果是在葉綠體中行使功能的啟動子，就不限于此。作為在植物細胞中行使功能的終止子，可以例舉胭脂石咸合成酶(NOS) 基因來源的終止子，花椰菜花葉病毒來源的終止子等。可以在植物的轉化時使用的重組表達載體，如果是可以使插入基因 在植物細胞內表達的表達載體，則沒有特別限定。尤其是，在載體導入 于植物體中的方法為采用農桿菌的方法時，優選使用pBI系統等二元載 體。作為二元載體，可以例舉例如pBIG, pBIN19， pBI101, pB121， pBI221 等。本發明中的轉化的對象植物，也指植物體整體，植物器官(例如，葉， 花瓣，莖，根，種子等)，植物組織(例如表皮，韌皮部，薄壁組織，木質 部，維管束，柵欄組織，海綿狀組織等)或植物培養細胞，或各種形態的 植物細胞(例如，懸浮培養細胞)，原生質體，葉的切片，愈傷組織等中的 任意一種。作為可以在轉化時使用的植物，沒有特別限定，可以適當選 擇可使用的GSH1基因能夠表達的植物。18這其中，使用擬南芥的GSH1基因時，轉化的對象植物為與擬南芥 近緣的油菜科的植物是合適的，但不限于此。例如，據報道煙草，楊樹， 檸檬等可以用擬南芥的基因制作形質轉化植物。我們認為，如果按照 (Franke R,McMichael CM，Meyer K,Shirley AM,Cusumano JC，Chapple C.(2000)Modified lignin in tobacco and poplar plants over-expressing the Arabidopsis gene encoding ferulate 5-hydroxylase.Plant J.22:223-234;Pena L,Martin-Trillo M, Juarez J, Pina JA, Navarro L, Martinez-Zapater JM.(2001)Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 gene in citrus reduces their generation time.Nat Biotechnol. 19:263-267),在上 述植物中導入擬南芥的GSH1基因，則可以制作出花數和種子數中的任 意 一個增加的各種形質轉化植物。在植物細胞中導入重組表達載體時，可以使用本領域公知的轉化方 法(例如，農桿菌法，粒子槍法，聚乙二醇法，電穿孔法等)。例如，在使 用農桿菌法時，在適當的農桿菌(才艮農桿菌(Agrobacterium tumefaciens))中 導入所購建的植物用表達載體，按照葉盤法(內宮博文著，植物基因操作 手冊，1990， 27-31pp，講談社Scientific,東京)等使之感染無菌培養葉片， 可以獲得形質轉化植物。而且，在使用粒子槍法時，可以直接使用植物體，植物器官，植物 組織本身，也可以制備成切片后再使用，也可以是制成原生質體再使用。 可以用基因導入裝置(例如，PDS-1000(BIO-RAD公司)等)處理這樣制備 的試樣。處理條件根據植物或試樣而不同，但通常在450-2000psi左右的 壓力，4-12cm左右的距離進行。導入了目的基因的細胞或植物組織，首先用卡那霉素抗性或潮霉素 抗性等藥物抗性標記進行選擇，然后用常規方法再生成植物體。轉化細 胞向植物體的再生可以按照植物細胞的種類，用本領域技術人員公知的 方法進行。目的基因是否導入于植物的確認，可以通過PCR法，southern雜交 法，Northern雜交法等方式進行。例如，從形質轉化植物制備DNA，設 計特異于導入的DNA的引物，進行PCR。然后，通過對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細管電泳等，用溴化乙錠等染 色，檢測目的擴增產物，可以確認被轉化。如果一旦荻得在基因組中導入了 GSH1基因的形質轉化植物，則可 以通過有性生殖或無性生殖從該植物體獲得其后代。而且，還可以從該 植物體及其后代或克隆中獲得繁殖材料(例如，種子，原生質體等)，基于 這些繁殖材料量產目標植物體。通過以比使每單位面積的生物量和種子收獲量充分提高的栽種密度 更高的栽種密度下栽種如上述方式獲得形質轉化植物(即本發明涉及的形 質轉化植物)，花數和種子數中的至少一個比親本植物(轉化時使用的植物) 相比有所增加。本發明涉及的植物中，確認了具有葉綠體移行信號肽的Y-谷氨酰半 胱氨酸合成酶的表達水平增加，Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增加的植物的花數和種子數中的至少 一者比親本植物有所增加，而且生物量和種子收量也增加了。作為這種植物，相當于具有葉綠體移行信號肽的Y-谷 氨酰半胱氨酸合成酶的表達量由于人工變異誘導，或者天然變異而增加 的植物，以及導入了編碼具有葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半胱氨酸合 成酶的多核苷酸的形質轉化植物。本發明中所謂"生物量"是指植物個體的干燥重量。而且，所謂"種 子收量是指"1個植物個體的所有重子的重量或單位面積的種子收量。由于通過增加生物量，可以固定二氧化碳作為碳水化合物，因此可 以獲得有效減少大氣中的C02量的效果，蔬菜的可使用部分增大的糧食 增產的效果，在為樹木等時紙等原料可以增產的效果等各種好處。而且， 由于種子收量增加，可以實現作為糧食和能源作物的種子收量大幅增產， 可以獲得促進生產成本大幅減少這樣的優點。本發明中涉及的植物中，確認了表達不具有葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的植物，花數和種子數中的至少一者比親本植物 有所增加，而且收獲指數也提高了。作為這種植物，相當于通過人工變 異誘導或者天然變異而表達原本的具有葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半 胱氨酸合成酶以及不具有葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶20的植物，以及導入了編碼不具有葉綠體移行信號肽的Y -谷氨酰半胱氨酸 合成酶的多核苷酸的形質轉化植物。本發明中所謂"收獲指數"是指用(l個植物個體的總種子的重量)/(含 有種子含量的該植物個體的干燥重量)計算得到的值。通過增加收獲指數，單位面積的種子收量增加，可以獲得在營養素 限制的土地等上特別有效地提高收獲量這樣的優點。本發明涉及的形質轉化植物，可以再導入編碼谷胱甘肽結合型醛縮 酶的多核香酸(谷胱甘肽結合型醛縮酶基因)。本發明人已經發現導入了編碼谷胱甘肽結合性醛縮酶的DNA的形質轉化植物的成長性和病蟲害抵 抗性提高(W02007/091634)。導入了谷胱甘肽結合型醛縮酶基因的形質轉 化植物的成長性提高，但其收獲指數未必提高，其依賴于光條件。提高 將GSH1基因與谷胱苷肽結合型醛縮酶基因一起導入，植物的收獲指數 和種子收量的提高效果進一步增強。閱讀本說明書的本領域技術人員可 以容易地理解導入谷胱甘肽結合型醛縮酶基因的方法可以按照上述 GSH1基因的導入手段進行。而且，在用于實施發明的最佳方式中所進行的具體的實施方式和以 下的實施例始終是用于弄清楚本發明的技術內容，不應當只限定于這種 具體例子而狹義地進行解釋，本領域技術人員可以在本發明的精神和附 加的權利要求的范圍內進行變化來實施。而且，本說明書中記載的學術文獻和專利文獻的所有內容都作為參 考引入本說明書中。實施例以下，用實施例對本發明進行更詳細的說明，本發明不限于這些實 施例。(l)使用植物作為用于制備轉化體的親本植物，使用野生型擬南芥的 Columbia(Col-O)。植物播種于在正方形的塑料罐(6.5 x 6.5 x 5cm)中從底 部開始按2:1:1的比例按三層裝入了蛭石(旭工業，岡山)，KUREHA培養 土(夕k" (KUREHA)園藝培土，吳羽化學，東京)，蛭石的土;裏中，在生長溫度22。C，長日條件(16小時明期/8小時暗期)下生長。(2)GSH1基因的克隆，GSH1基因的改變和GSH1轉化體的制作 從3周大的擬南芥的野生型Columbia(Col-O)中分離總RNA，用Prostar first strand RT-PCR試劑盒(Stratagene，La Jolla,CA，USA)合成cDNA。如圖1的A的上部分(Chl.GSHl)所示，使用基于GSH1的cDNA序 列設計的以下特異的引物，全長cDNA作為2個片段通過PCR進行擴增， 將各個片段亞克隆到pGEM-TEasy載體(Promega， Madison, WI， USA) 中。在引物GSHl_5，-3和GSHl_3，-2上分別插入向植物轉化用二元載體 pBI121中導入時所需的Xbal和Sacl切斷部位(以下所示的序列中下劃線 表示取代的堿基)。[化1]GSHl—5'-3:5，畫GCTTTCTTCTAGATTTCGACGG-3，(序列號6) GSHl—3'畫3:5，-CCTGATCATATCAGCTTCTGAGC-3，(序列號7) GSHl—5，-2:5，-ATGCCAAAGGGGAGATACGA-3，(序列號8) GSHl—3，畫2:5，-GGAGACTCGAGCTCTTCAGATAG畫3，(序歹'J號9) 在Kpnl切斷部位融合2個片段，構建出含有全長cDNA的載體 (Chl.GSHl-pGEM)。用限制性酶Xbal和Sacl處理Chl.GSHl-pGEM后， 用該片l殳取代二元載體pBI121的花椰菜花葉病毒的35S啟動子的下游 的編碼P -葡糖苦酸酶(GUS)的區域，制備出用于制作形質轉化植物的構 建體(35S-Chl.GSHl-pBI121)(參照圖1的B)。在擬南芥基因組上只存在1拷貝的GSH1，含有向葉綠體的移行信 號。因此，為了使GSHl基因產物(Y-谷氨酰半胱氨S吏合成酶)在細胞質 中累積，因此制作用于使去掉推定為葉綠體移行信號的N末端73個氨基 酸，將N末端起的第74位的丙氨酸殘基取代為蛋氨酸殘基的蛋白質表達 的構建體(35S-cyt.GSHl-pBI121)。首先，以下所示的N末端起的第74位 的丙氨酸殘基取代為蛋氨酸殘基，其上游插入了 Xbal切斷部位的(堿基取 代部位用下劃線表示)的引物GSHl(cyt.)—5'和上述GSHl_3，-3進行 PCR(參照圖1的A中部)，用限制性酶Xbal和Kpnl處理片段后，亞克隆到pBluescript載體(Stratagene,La Jolla,CA，USA)中(cyt.GSHl-pBS)。 [化2]GSH1 (cyt)—5 ，: 5,-AGGGCATCTAGAGACCATGGCAAGTCC-3,(序列 號10)用限制性酶Xbal和Kpnl處理cyt.GSHl-pBS后，將片段取代 35S-CW.GSHl-pBI121 的 GSH1 的 Xbal-Kpnl 片段，制成 35S-cyt.GSHl-pBI121(參照圖1的B)。此外，為了提高GSH1基因的mRNA的穩定性，制備具有GSH1基 因的64bp的5'非翻譯區的35S-5，UTRcyt.GSHl-pBI121 。首先，將 Chl.GSHl-pGEM上的Xbal-Ncol片段取代cyt.GSHl-pBS上的Xbal-Ncol 片段(5，UTRcyt.GSHl-pBS)。用限制性酶Xbal和Kpnl處理后，將片段取 代35S-Chl.GSHl-pBI121上的Xbal-Kpnl片段，制成35S-5，UTRcyt.GSHl-pBI121(參照圖1的B)。而且，為了制備在植物內過剩積累大腸桿菌來源的Y -谷氨酰半胱氨 酸合成酶的形質轉化植物，從大腸桿菌(DH5oc)克隆GSHl基因，制備轉 化用構建體(35S-EcGSHl-pBI121)。預測這種構建體在細胞質中累積。因 此，為了在葉綠體中累積大腸桿菌來源的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶，還 制作了在大腸桿菌的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的N末端上融合了含有推 定為擬南芥的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的葉綠體移行信號肽的區域的N 末端89個氨基酸的構建體(35S-CW.EcGSHl-pBI121)。首先，以大腸桿菌 (DH5oc)作為模板，如圖14的A的上部分(EcGSHl)所示，分別使用基于 大腸桿菌GSH1的堿基序列(GenBank登錄號X03954)設計的以下特異 的引物EcGSHl_Fl和EcGSHl—Rl以及EcGSHlF2和EcGSHl—R2，全 長GSH1基因作為2個片段通過PCR擴增，用限制性酶Xbal或Sacl處 理片,殳后，亞克隆到pBluescript載體(Stratagene，LA Jolla，CA，USA)中 (EcGSHlFRl畫pBS和EcGSHl—FR2誦pBS)。在引物EcGSHl—FRl中插入 向植物轉化用二元載體pBI121導入時必需的Xbal和葉綠體移行信號插 入所必需的HincII切斷部位。而且，為了將起始密碼子由亮氨酸取代為 蛋氨酸殘基而導入堿基取代。在引物EcGSHl—R2中插入向植物轉化用二元載體pBI121導入時必需的Sacl切斷部位(以下所示的序列中下劃線表 示取代的堿基)。 [化3]EcGSHlFl: 5,扁TTTGACAGICXaGAGrTQAeTATGATCCCG-3，(序 列號25)EcGSH1—Rl: 5'國TTCCGATGGCGTTTTGATTGCC國3，(序列號26) EcGSHl一F2: 5，-TCGTTTGAGCGATCTCGGCTATACC國3，(序列號27) EcGSHl—R2: 5，扁AATTTTGGGAGCTCACGAGTGGCC-3，(序列號28) 在SnaB I切斷部位融合兩個片段，構建出含有全長GSH1的載體 (EcGSHl-pBS)。用限制性酶Xbal和Sacl處理EcGSHl-pBS后，用片段 取代二元載體pBI121的花椰菜花葉病毒的35S啟動子下游的編碼P-葡 糖苷酸酶(GUS)的區域，制備出用于制作形質轉化植物的構建體 (35S-EcGSHl畫pBI121)(圖14的B)。融合了葉綠體移行信號肽的構建體(35S-Chl.EcGSHl-pBI121)是將含 有用限制性酶HincII處理EcGSH1—FRl-pBS而獲得的大腸桿菌GSH1基 因的上游部分的片段與用限制性酶HincII處理含有前述的擬南芥GSH1 基因的全長cDNA的 Chl.GSHl-pGEM的片段相融合(Chl. EcGSH1—FRl-pGEM)。用限制性酶Aval和Sacl對其進行處理，插入 EcGSHl-pBS的Aval和Sacl片段(Chl.EcGSHl-pGEM)。用限制性酶Xbal 和Sacl處理Chi. EcGSHl-pGEM后，將片段取代二元載體pBI121的花 椰菜花葉病毒的35S啟動子下游的編碼P-葡糖苷酸酶(GUS)的區域，制 備出形質轉化植物用的構建體(35S-Chl.EcGSHl-pBI121)(圖14的B)。用農桿菌法(Clough,S丄and SHl-pB Bent,A.F.(1998)Floral dip:A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thali脆Plant J.16:735-743.)在Col-0中導入通過上述方式制備的 35S-Chl.GSm-pBI121， 35S-cyt. GSHl陽pBI121 ,35S-5,UTRcyt.GSHl-pBI121, 35S-EcGSHl-pBI121 和35S-Chl.EcGSHl-pBI121這五種表達載體,制備出形質轉化植物。具體而言，在含有選擇標記卡那霉素的瓊脂糖培養基(1/2倍的濃度的厶，〉y—只夕一夕'培養基)上，反復進行篩選直至所有的種子顯示出卡那霉素抗性的世代(不分離的世代)。而且，在篩選過程中，按3比1分離卡那霉素抗性的性狀，確認表達載體至少導入于單一的染色體上。(3)通過RT-PCR進行的對GSH1基因的表達量的分析在導入了 35S- Chl.GSHl-pBI121的轉化體中，如下述方式進行 RT-PCR,研究GSH1基因的表達量。首先，用RNeasy Plant Mini試劑盒(Qiagen Inc"Valencia,CA，USA)乂人 3周大的轉化擬南芥的地上部分提取總RNA。用DNase I(Invitrogen)處理 1 ja g的總RNA后，用 Prostar first Strand RT-PCR試劑盒 (Stratagene，La,jolla,CA,USA)進行cDNA。以1 |u gcDNA作為模板，在94 。C2分鐘，l個循環，94。C30秒，5(TC30秒，72。C60秒，32個循環，72 。C5分鐘的條件下進行PCR。使用以下的GSH1_F7和GSH1_R2作為引 物。使用被發現結構性表達的ACT1基因作為對照。ACT1的PCR,使用 ACT1F和ACT1R的引物對，反應液與前述一樣，在94。C2分鐘，1個循 環，94。C30秒，55。C30秒，72。C60秒，30個循環，72。C5分鐘的條件下 進行。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物。[化4]GSHlF7:5，-CTTGATATGATGCTCCGAAC-3，(序列號11) GSH1 —R2:5 ， -ATC ATATAATAAACCC ACCC AG AA-3 ，(序列號12) ACTlF:5，-GATGATGCACCTAGAGCTGT-3，(序列號13) ACTlR:5，-CTCCATGTCATCCCAATTGT-3，(序列號14) 結果示于圖2。如圖2清楚所示，確認了 35S-Chl.GSHl 2-16的GSH1 的相對mRNA量比野生型(Col-O)的有所增加。分別對導入了 35S-cyt.GSHl-pBI121的形質轉化植物的GSHl基因表 達量，包括具有葉綠體移行信號的GSHl基因和缺失葉綠體移行信號肽 的GSHl基因的所有GSHl基因，或者作為宿主的野生型基因組來源的 GSHl基因和使用pBI121載體導入的GSHl基因的表達量定量調查，使 用實時RT-PCR法。具體步驟如下。用RNeasy Plant Mini試劑盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)從2周的轉化擬南芥的地上部分中拔取總 RNA 。 用 QuantiTect Reverse Transcription(Qiagen, Valencia,CA,USA)由1 ja g的總RNA進4亍cDNA,用 SYBR GREEN PCR Master Mix(Applied Biosystems,Warrington,WA1 4SR,UK),通過ABI7700進行實時PCR。在1 n 1 cDNA模板，1 |a 1 20 p M正向引物,1 jul20jaM反向引物,9|ulH20, 12 ja 1 Master Mix的反應 液中，在50。C2分鐘，95。C10分鐘，95。C15秒，6(TC60秒，40個循環 的條件下進行。使用被發現構成型表達的18S核糖體RNA作為內部對照。 定量采用從以野生型Col-0分離的基因組DNA或轉化時使用的質粒 35S-CW.GSHl-pBI121作為模板的PCR產物獲得的校正曲線進行計算。
所采用的引物序列和組合以及可以檢測的mRNA的種類如下所示。
cyt.GSHl一7S:5，-AATTGATTGCCGCGGCAAGTCC畫3，(序列號15) chl.GSHl—7S:5,畫CTATATATACCGCGGCGCTCTTGTC-3,(序列號16) AtGSHl—Rl:5，-CCAGAGGCAAGATAGGCAATG-3，(序列號17) AtGSHl—R2:5，-CCTCACGCCACCCGAAACAA-3，(序列號18) AtGSHl一Fl:5，-TGCGGAGAAGCTCTTGGAGATG畫3，(序列號19) AtGSHl一F2:5，-CCGTGTTCGAAGAGCTGCTGTA-3，(序列號20) AtGSHl一R3:5，-TTCCGGAGACTCGAATTCTTCAG-3，(序列號21) Nos term一R2:5，-CCAAATGTTTGAACGATCGGGG-3，(序列號22) 18S—F:5，-TCCTAGTAAGCGCGAGTCATC-3，(序列號23) 18S—R:5，-CGAACACTTCACCGGATCAT國3，(序列號24) chl.GSHl_7S和AtGSHl—R2:含有葉綠體移行信號的GSHlmRNA cyt.GSHl_7S和AtGSHlRl:總GSHlmRNA(包括不含葉綠體移行 信號的GSHlmRNA)
AtGSHl—F2和AtGSHl_R3:宿主基因組來源的GSHlmRNA AtGSHl_Fl和Nos term—R2:導入的表達載體來源的GSHlmRNA。 含葉綠體移行信號肽的GSHlmRNA的表達水平示于圖3，總 GSHlmRNA的表達水平示于圖4,導入的表達載體來源的GSHlmRNA 的表達水平示于圖5,宿主基因組來源的GSHlmRNA的表達水平示于圖6。而且，這些圖中，數值均用按18S核糖體RNA量標準化的相對值表示。
如圖4和圖5清楚所示，35S-CW,GSH1(2-16)的GSH1的相對mRNA 量比野生型(Col-O)增加了。與之相對，35S-cyt.GSHl(l-l, 2-7和3-6)中， 總GSH1的相對mRNA量基本沒有變化(圖4)，如圖3和圖6清楚所示， 宿主基因組來源的GSH1的mRNA也基本沒有變化。但是，如圖5所示， 確認了導入的35S-cyt.GSHl來源的GSHlmRNA只累積了少許，清楚了 收獲指數和種子收量提高(參照圖12的B和C)。
圖7表示以野生型(Col-O)中GSHlmRNA量(基因組GSHlmRNA)作 為1,以相對值表示35S-cyt.GSHl(l-l, 2-7和3-6)中的35S-cyt.GSHl來 源的GSHlmRNA量。這表示通過按基因組來源的GSH1表達量的千分 之一至數十分之一的次序使細胞質型GSHl表達可以提高收獲指數(圖12 的C)。
在導入了 35S-5，UTRcyt.GSHl-pBI121的形質轉化植物的T2世代中， 為了分別對野生型基因組來源的GSHl基因的表達量和使用pBI121載體 導入的GSHl基因的表達量定量調查，使用實時RT-PCR法。將T2世代 的種子播種于含有選擇標記卡那霉素的瓊脂培養基(1/2倍的濃度的厶， y—x夕一夕、'培養基)上，將呈現卡那霉素抗性的植物體移植到土壤中， 生長1周后采集葉，才是取總RNA。由1 |a g的總RNA合成cDNA,用SYBR GREEN PCR Master Mix(Applied Biosystems,Warrington,WA1 4SR,UK)，通 過ABI7500進行實時PCR。具體的步驟與上述35S-cyt.GSHl-pBI121 — 樣。
導入的表達載體來源的GSHlmRNA的表達水平和宿主基因組來源 的GSHlmRNA的表達水平示于圖13。數值用18S核糖體RNA量標準化， 用以35S-cyt.GSHl(2-7)中的GSHlmRNA量作為1的相對值來表示。如 圖13所示，發現宿主基因組來源的GSHl的mRNA量幾乎沒有變化(圖 13的B)，而導入的35S-5，UTRcyt.GSHl來源的GSHl比35S-cyt.GSHl(2-7) 的GSHlmRNA的累積量顯著增力口(圖13的A)。這樣就清楚了，通過插 入GSHl基因的5'非翻譯區域，植物體內的mRNA的穩定性提高了 。而且，這些植物的生長和生產性比Col高(圖15)。另一方面，可以使大腸桿 菌來源的EcGSHl在葉綠體中表達(圖16)，也可以使之在細胞質中表達 (圖17)，莢比野生型的短，或者變得不稔，發現了明顯的種子收量的降低。
圖18表示每罐中栽種3個個體，測量以22。C,長日(16小時明期/8 小時暗期)，200 m E/m2/s的光強度生長時的每個個體的地上部分生物量和 種子收量，再計算出收獲指數的結果。如圖清楚所示，表明為了提高收 獲指數，重要的是適當選擇GSH1的表達量根據生長時的光強度而變化 的轉化體，GSH1的表達量高的在生長時的光強度下種子收量高。
圖19表示植物在22°C ,長日(16小時明期/8小時暗期)，100 p E/m2/s 的光強度下生長時的栽種密度與每個個體的生長性和種子收量的關系。A 表示每個植物個體的種子收量。B表示使單位區劃(47.25cm,的播種種子 粒數發生變化而產生的地上部分生物量的狀態差異。C表示使播種種子 粒數發生變化時的地上部分生物量和種子收量的變化。C的左圖表示每 個植物個體的地上部分生物量和種子收量的變化，右圖表示單位區劃的 地上部分生物量和種子收量的變化。如圖所示，通常的植物其個體的栽 種密度如果提高，每個個體的生物量降低，每單位面積的生物量生產性 達到頂點。這種條件下導入了植物來源的GSH1的植物與野生型植物的 生物量和種子收量的比較結果示于圖20。 A和B表示栽種密度分別在低 時(每個單位區劃(47.25cm2)0.5個個體)和高時(每個單位區劃(47.25cm2) 5 個個體)的結果，每個單位區劃的地上部分生物量(左圖上部分)，種子收 量(右圖上部分)，收獲指凄t(左圖下部分)的相對于野生型Col的增加率。 其表示由于導入植物來源的GSH1而導致的生物量和種子收量的增加， 栽種密度越高越有效增加。即使是栽種密度提高使得每單位面積的收獲 量達到最大的作物，通過這樣導入植物來源的GSH1基因可以有效增加 其收獲量。
圖21中表示導入了植物來源的GSH1基因的植物中每單位面積的種 子收量(A)，每單位面積的總生物量(B)的相對于野生型Col的增加率，C 表示收獲指數(種子收量/總生物量)。還清楚了在使GSH1在細胞質中表達時，種子數增加(圖21)。而且，各個個體中獲得的平均種子數與野生
型1482個相對,35S-chl.GSHl 2-16為1486個,35S-chl.GSHl 2-7-1為 2317個,35S-chl.GSHl 3-6-1為1815個,相對于野生型的增加率分別為 0.3%, 56.3%, 22.5%。
圖22表示在長日(16小時明期/8小時暗期)，100jaE/m2/s或200 p E/m2/s下生長時的野生型植物的栽種密度與種子收量的關系。還清楚了 在野生型植物中，每單位面積(47.25cm"的栽種數為2-3時種子收量達到 最大，以各個密度獲得的種子收量用以最大值作為1的相對值來表示。 圖23和24所示的結果是以圖22所示的栽種密度獲得的結果，清楚了通 過導入植物來源的GSH1基因，種子收獲量的最大值上升。而且，該效 果表示在導入了谷胱甘肽結合型醛縮酶(gFBA)的植物中效果進一步提 高。圖23和24的植物分別在100 p E/m2/s和200 ja E/m2/s的光強度下生 長。A表示每單位面積的種子收量，B表示每單位面積的總生物量，C表 示收獲指數。而且，gFBA的過剩表達體的制備按照WO2007/091634中 記載的步驟。
圖25中表示導入了 35S-cyt.GSHl-pBI121的菊的每個缽中的總花數。 100mL的KUREHA園藝培養土中的轉化體移植到裝滿了 2L的培養土(1L 下層蛭石，0.5L中層園藝培養土， 0.5上層蛭石)的缽中，每隔34周追肥 3g的S604號。在溫室中加溫，設定在最低27。C,在自然日長下開花。 按盆栽移植時期和苗的批次設計四個實驗區。A和B在6月末移植，C 和D表示在7月末移植時每個缽的總花數。自然日長下開花的菊，其開 花數對應于移植時期，開花數有所不同，如圖25所示，清楚了 35S-cyt.GSHl植物的花數增加，本發明的效果不依賴于移植的時期。而 且，對于35S-cyt.GSHl-pBI121的菊的轉化體的制備，按照 http :〃www.affrc. go. ip/j a/db/seika/data—flower/h 13/flower01004.html中i己載 的步驟。
(4) y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(y -ecs)活性的測定 在含有0.2mM EDTA,10。/。丙三醇，10mM MgCl2的50mM Tris-HCl 緩沖液(pH8.0)中破碎3周大的擬南芥(Col-0,35S-Chl.GSHl 2-16)的植物
29體，用Microcon YM-10(Amicon， Inc., Beverly，MA,USA)乂人通過離心分 離獲得的上清中除去低分子，從而制成酶液。在反應液[120mM HEPES(pH8.0)，60mM MgC12，6mM ATP,6mM PEP，6單位的丙酮酸激酶， 5mM DTE，48mM L-谷氨酸鹽，40 mM L-半胱氨酸]中添加酶液，使之于 30。C反應。反應通過添加L-半胱氨酸開始，通過添加三氯乙酸而停止。 使用Microcon YM-3(Amicon, Inc.,Beverly,MA,USA)除去反應液的高分子 后，用采用逆相C18柱的HPLC(Shiseido， Tokyo, Japan)分離,用model 5200A Coulochem II electrochemical detector(ESA，Inc.,Chelmsford, MA,USA)測定y -EC 。移動相的組成為50mM磷酸鈉monobasic monohydrate(pH2.7), l.OmM octanesulfonic acid, 2.7%甲醇。
結果示于圖8。清楚了， 35S-Chl.GSHl(2-16)中，GSHl基因產物y -ECS活性大概為野生型的2倍。
(5)谷胱甘肽(GSH)定量
5-1方法1
在5%的三氯乙酸中破碎在25, 50, 100, 200, 500 |J E/m2/s的光條 件下生長的3周大的擬南芥(Col-0，35S-Chl.GSHl 2-16)的地上部分，在通 過離心分離獲得的上清中添加等量的二乙醚，進行懸浮，再去除乙醚層 除去三氯乙酸。重復3次這樣的才乘作后，通過離心蒸發器完全除去乙醚， 再用于測定中。測定通過Ellman的方法(Ellman,G丄.(1959)Tissue sulfhydryl groups.Arch.Biochem.Biophys.82:70-77)通過谷月光甘肽還原酶 畫DTNB(5,5,-Dithiobis 2-nitrobenzonic acid)再循環法進行。在反應液[含有 5mM EDTA,0.25mM NADPH，0.75單位谷胱甘肽還原酶的10mM磷酸鈉 緩沖液(pH7.5)]中添加提取液，添加5mM DTNB開始反應。根據412nm 的吸光度增加的初速求出2-硝基-5-硫代苯甲酸的生成。總GSH量用標準 物質根據制作的校正曲線進行計算。
結果示于圖9。清楚了 35S-Chl.GSHl形質轉化植物無論在哪一種光 強度下，內源谷胱甘肽量都高于野生型。
5-2方法2
在液氮中將2周大的擬南芥(Col-0,35S-cyt.GSHl l-l,2-7，3-6)的地上部分粉碎成粉末狀后，添加10倍量的提取緩沖液(0.1M HC1: (0.1M NaClO4，0.1%H3PO4)=l:l)，在冰中融解，混合，離心分離。用Microcon YM-3(Amicon, Inc.，Beverly，MA，USA)除去反應液的高分子后，用采用逆 相C18柱的HPLC(Shiseido, Tokyo, Japan)分離，用LaChrom UV-VIS Detector L-7420(Hitachi,Japan)檢測還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱 甘肽(GSSG)。移動相的組成為0.1M NaC104， 0.1%H3PO4， 1%乙腈。谷 胱甘肽量使用標準物質根據制作的校正曲線進行計算。
結果示于圖10。 35S-cyt.GSHl形質轉化植物內的內源谷胱甘肽量與 野生型相比幾乎沒有變化。
(6)種子收量，生物量的測定以及花數和種子數
擬南芥(Col-0， 35S國Chl.GSHl 2-16, 35S-cyt.GSHl l畫l,2-7,3畫6)播種于 罐中，于22。C長日條件下使之生長。圖11中表示播種后第33天的Col-0 以及35S-cyt.GSHl 2-7和3-6的植物體的照片。根據圖11清楚所示， 35S-cyt.GSHl 2-7和3-6已經開花，而Col-0未開花。也就是說，清楚了 35S-cyt.GSHl形質轉化植物比親本植物(Col-0)的成長速度快。
植物體抽薹,開花，在形成有限花序的前端部分形成種子，而在地上 部分掛上果嚢，回收種子和地上部分。干燥后，測定每個個體的種子和 地上部分的重量(地上部分生物量)。
結果示于圖12的A-D。圖中的星號表示與Col野生型(親本植物)相 比，在統計學上存在顯著差異。具體表示實施t4全測的結果為p〈0.05, 顯著。
圖12的A是比較種子之外的地上部分生物量的圖。發現 35S-Chl.GSHl 2-16與Col野生型(親本植物)相比有增加傾向，但沒有顯 著差異。但是，如圖12的D所示，包括35S-Chl.GSHl 2-16的種子的地 上部分的生物量與Col野生型(親本植物)相比顯著增加。另一方面， 35S-cyt.GSHl形質轉化植物的生物量均與Col野生型(親本植物)程度相 同。圖12的B是比較種子重量的圖。35S-CW.GSH1 2隱16和35S-cyt.GSHl 1-1與Col野生型(親本植物)相比顯著增力口。圖12的C是比較收獲指數的 圖。收獲指數用種子質量/地上部分生物量(種子之外)進行計算。收獲指
31數與Col野生型(親^t物)相比，35S-Chl.GSHl 2-16， 35S-cyt.GSHl l隱l, 2-7顯著增加，35S-cyt.GSHl 3-6也呈現增加傾向。
種子大小的平均值，與Col野生型(親本植物)相比，按35S-CW.GSH1 2-16, 35S-cyt.GSHl 3-6, 2-7, 1-1的順序依次變小。因此，根據與收獲 指數的關系，各形質轉化植物的每個個體的種子數與Col野生型(親本植 物)相比都出現大幅增加。
而且，由于擬南芥是無限花序，只要生長延續，就在莖頂分生組織 中繼續形成花芽。如上所述，35S-cyt.GSHl形質轉化植物比親本植物 (Col-0)的生長速度快，由此表明同一時期獲得的花數比親本植物多。而 且，還確認了 35S-Chl.GSHl形質轉化植物與35S-cyt.GSHl —樣，比親 本植物(Col-0)的生長速度快。
根據以上結果，表明35S-Chl.GSHl形質轉化植物的花數，種子數， 生物量和種子質量均增加，其結果是收獲指數增加。另一方面，還清楚 了 35S-cyt.GSHl形質轉化植物的生物量沒有大幅增加，花數，種子數和 種子重量增加，其結果是收獲指數增加。
根據本發明，可以使花數和種子數增加。其結果是起到了可以提供 種子收量和收獲指數提高的生產性高的植物這樣的效果。
了弄清楚本發明的技術內容，不應當狹義地解釋為只限于這種具體例子， 在本發明的精神和如下記載的權利要求的范圍內，可以進行各種改變后 來實施。
工業上利用的可能性
如果根據本發明，可以使植物的花數和種子數增加。因此，可以使 鑒賞用草本花和糧食作物，以及森林和生物質能用植物資源中的花數和 收量增加。因此，不僅在農林業，還可以在食品產業，能源產業等廣泛 的產業中利用。
權利要求
1、一種植物，其特征在于具有使γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性水平增加的變異，而且通過在比使每單位面積的生物量和種子收獲量充分提高的栽種密度更高的栽種密度下進行栽培，每單位面積的生物量或種子收獲量相比于親本植物進一步增加。
2、 一種植物，其特征在于具有使y-谷氨酰半胱氨酸合成酶表達水平 增加的變異，而且通過在比使每單位面積的生物量和種子收獲量充分提 高的栽種密度更高的栽種密度下進行栽培，每單位面積的生物量或種子 收獲量相比于野生型植物進一步增加。
3、 一種形質轉化植物，其特征在于導入了編碼植物來源的Y-谷氨酰 半胱氨酸合成酶的多核苷酸，而且通過在比使每單位面積的生物量和種 子收獲量充分提高的栽種密度更高的栽種密度下進行栽培，每單位面積 的生物量或種子收獲量相比于親本植物進一 步增加。
4、 根據權利要求3所述的形質轉化植物，其特征在于所述編碼植物 來源的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的翻"^產物具有葉綠體移行 信號肽。
5、 根據權利要求4所述的形質轉化植物，其特征在于所述編碼植物 來源的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸選自于以下(a)-(d):(a) 編碼由序列號1所示的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(b) 編碼序列號1所示的氨基S復序列中缺失、取代或添加了一個或多 個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(c) 序列號2所示的石咸基序列構成的多核苷酸(d) 與序列號2所示的堿基序列構成的多核苷酸在嚴緊條件下雜交的 多核苦酸。
6、 根據權利要求3所述的形質轉化植物，其特征在于所述編碼植物 來源的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的翻譯產物不具有葉綠體移 行信號肽，收獲指數提高。
7、 根據權利要求6所述的形質轉化植物，其特征在于所述編碼植物 來源的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸選自于以下(e)-(h):(e) 編碼序列號3所示的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(f) 編碼由序列號3所示的氨基S臾序列中缺失、取代或添加了一個或 多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(g) 由序列號4所示的^威基序列構成的多核苷酸(h) 與由序列號4所示的石威基序列構成的多核苷酸在嚴緊條件下雜交 的多核苷酸。
8、 權利要求3所述的形質轉化植物，其特征在于其還導入了編碼谷 胱甘肽結合型醛縮酶的多核苷酸。
9、 一種使植物的花數和種子數中的至少一者增加的方法，其特征在 于包括在植物中導入編碼Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸的工序， 和在比使每單位面積的生物量和種子收獲量充分提高的栽種密度更高的栽種密度下栽培導入了所述多核苷酸的植物的工序。
10、 根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述編碼y-谷氨酰半 胱氨酸合成酶的多核苷酸選自于以下的(a)-(h):(a) 編碼序列號1所示的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(b) 編碼序列號1所示的tt酸序列中缺失、取代或添加了一個或多 個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(c) 序列號2所示的堿基序列構成的多核苷酸(d) 與序列號2所示的堿基序列構成的多核苷酸在嚴緊條件下雜交的 多核苷酸(e) 編碼序列號3所示的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(f) 編碼由序列號3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了一個或 多個氨基酸的氨基酸序列構成的多肽的多核苷酸(g) 由序列號4所示的堿基序列構成的多核普酸(h) 與由序列號4所示的磁基序列構成的多核苷酸在嚴緊條件下雜交 的多核苷酸。
全文摘要
導入了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的形質轉化植物相比于野生型植物，其花數和種子數中的至少一個均增加，種子收量提高。由此，清楚了植物來源的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因產物的功能，并且提供了做出種子收量提高的植物的技術。
文檔編號A01G7/00GK101583713SQ200880002259
公開日2009年11月18日 申請日期2008年1月15日 優先權日2007年1月16日
發明者小川健一, 巖崎郁 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構