專利名稱：：一種甘藍型油菜游離小孢子植株的培育方法
技術領域：
：本發明涉及通過組織培養技術的植物再生，特別是涉及一種甘藍型油菜游離小孢子植株的培育方法。技術背景游離小孢子培養是獲得油菜單倍體的重要途徑。單倍體植株的誘導成功加快了育種親本的純合速度，加速近等基因系培育和育種進程，大大縮短了育種周期，比傳統的雜交選育方法可縮短3-5年的育種時間，創新出更豐富的新材料，提高育種效率；油菜小孢子是導入外源基因的良好受體；通過小孢子培養誘導雙單二倍體(DH)群體是遺傳研究和誘變育種研究的良好體系。小孢子培養技術用于油菜新品種的選育已成為育種手段之一，如被用來篩選高、低芥酸和低硫代葡萄糖苷小孢子胚狀體，再通過單倍體加倍技術結合傳統育種手段獲得高、低芥酸和低硫代葡萄糖苷的品種。研究油菜小孢子離體培養技術，建立高頻率誘導油菜的單倍體植株體系，對于我國油菜生產快速發展加快育種進程具有重要的意義。目前，對油菜小孢子培養技術有較多的報道，但油菜小孢子胚狀體誘導率低一直是限制該技術廣泛應用的一個問題。現有技術普遍采用的方法是將分離得到的所有小孢子進行誘導培養，由于小孢子胚的誘導率低，所以在小孢子誘導培養初期會花費較多的人力、物力和財力，如果能在早期篩選出具有出胚潛力的小孢子進行培養，將大大提高誘導效率，節省時間和資源。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種生長在大田環境下的甘藍型油菜所取材的游離小孢子植株的培育方法，提供一種能在早期有效判斷小孢子胚胎發生的預示指標，從而可以在有效時間內加大出胚基因型小孢子的培育次數，解決現有技術中油菜小孢子胚狀體誘導率低的問題，提高誘導效率，節省誘導時間。為了解決上述技術問題，本發明采用如下的技術方案甘藍型油菜游離小孢子植株的培育方法包括小孢子的分離、小孢子胚狀體的誘導和小孢子植株的培育，其中，小孢子胚狀體的誘導為將制備好的甘藍型油菜游離小孢子加入含4555mg/l秋水仙素的全過濾滅菌的NLN-13無激素液體培養基，在3035。C高溫暗培養2天，選擇小孢子膨大率(小孢子膨大率二膨大的小孢子數/培養的小孢子數X100X)大于50%的材料進行后繼的誘導培養。發明人經實驗研究發現小孢子是否膨大，膨大率是否高(>50%)，是小孢子產生胚的一個基本條件，也是衡量小孢子胚胎能否發生的一個有效指標。進一步的，小孢子胚狀體的誘導為將制備好的甘藍型油菜游離小孢子加入含50mg/l秋水仙素的全過濾滅菌的NLN-13無激素液體培養基，在32。C高溫暗培養2天，選擇小孢子膨大率大于50%的材料，用不含秋水仙素的全過濾滅菌的NLN—13無激素液體培養基清洗、離心去除秋水仙素，然后加入不含秋水仙素的全過濾滅菌的NLN—13無激素液體培養基調節小孢子密度為l2個花蕾/ml，在25。C恒溫靜置暗培養至胚狀體產生。前述甘藍型油菜游離小孢子植株的培育方法中，首先要進行油菜游離小孢子的制備，其具體方法為在大田中選取開花37天的甘藍型油菜花序，選擇3.04.0mm的花蕾，將其放入濾布中，在無菌條件下用7(F。酒精消毒lmin，然后用O.1X升汞消毒10min，無菌水沖洗35次，經清洗和滅菌后的花蕾放入pH為5.86.0、含13。/。蔗糖的B5無激素液體培養基中，輕壓擠出小孢子，經300目尼龍網膜過濾到離心管里，于800rpm離心8min，去掉上清液；再加入相同的B5無激素液體培養基在同樣轉速下離心5min，去掉上清液，即得游離小孢子。選擇合適的小孢子發育期是小孢子培養的關鍵環節，最適合游離小孢子培養的時期是單核靠邊期和二核早期。通過小孢子的鏡檢觀察，甘藍型油菜3.5mm的花蕾有70y。左右的小孢子處于單核靠邊期。當在大田中切取花序時，花序的保存方法為4'C冰箱中插水保存15天，不影響胚的產生。當游離小孢子誘導出胚后，小孢子植株的培育方法為將產生的小孢子胚狀體在80rpm的搖床上、25。C條件下暗培養l2周，然后將正常發育的小孢子胚轉入pH為5.86.0、含0.8%瓊脂和5%蔗糖的85固體培養基，置入22。C、16h光周期培養箱內培養，23周轉換一次培養基直到生長成為正常不定芽苗，然后再轉生根培養基獲得小孢子再生植株，盆栽馴化后移栽大田。發明人所進行的具體實驗如下一、膨大率對小孢子胚誘導率的影響發明人在2007年春季油菜開花期前后大田取樣，制備游離小孢子，然后加入含50mg/l秋水仙素的全過濾滅菌的NLN-13無激素液體培養基，在32。C高溫暗培養2天，記錄材料的膨大情況，然后用不含秋水仙素的全過濾滅菌的NLN—13無激素液體培養基清洗、離心去除秋水仙素，然后加入不含秋水仙素的全過濾滅菌的NLN—13無激素液體培養基調節小孢子密度為12個花蕾/ml，在25。C恒溫靜置暗培養，記錄胚產生的情況，具體實驗數據如下表l2007年油菜開花期小孢子培養實驗情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*:32'C高溫培養兩天后小孢子的膨大情況；**:材料胚胎發生率=產生胚的材料數/材料數X1000/o;實驗結果表明(表l)，高溫培養兩天后小孢子沒有膨大的材料就不會產生胚，而產生胚的材料在高溫培養兩天后小孢子都有所膨大。表22007年春季油菜初花期小孢子培養膨大情況(取樣時間3.13.3)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*:表中第6欄資料中，沒有標注的材私P均沒有產生月丕。少是指小孢子膨大率小于20%，中是指小孢子膨大率為2050%，良是指小孢子膨大率大于50%。從表2實驗數據分析可以看出小孢子膨大率在50%以上(良)的材料比較容易產生胚，胚胎發生率也高；而膨大率在50%以下(中，少)的胚發生率較低或難以產生胚；沒有膨大的材料則不能產生胚。因此，在加入秋水仙素高溫培養2天后，小孢子是否膨大和膨大率是否高(>50%)，是小孢子產生胚的一個基本條件，也是衡量小孢子胚胎能否發生的一個有效指標。以小孢子高溫培養兩天后的膨大率為指標進行篩選，有利于早期剔除不能產生胚胎的小孢子，提高誘導效率，避免浪費不必要的時間和資源。二、小孢子胚誘導期培養基的選擇2006年春季的實驗初期，培養基的配制是采用大量元素(含蔗糖13%)高溫滅菌(定容為900ml)，有機物(定容為100ml)過濾滅菌。實驗共做了20多個雜交組合，IOO多個單株，IOOO多個培養皿。在高溫培養2天后用倒置顯微鏡觀察，發現小孢子沒有膨大，培養l月左右均未有變化，也沒有胚狀體產生。其原因可能是含有高糖的NLN大量元素培養基經高溫滅菌產生了一些影響小孢子發育的有毒物質或阻礙物質，致使小孢子不能膨大和進一步發育。2006年夏繁油菜開花期，將培養基全部采用過濾滅菌，高溫培養2天后小孢子有所膨大，最終獲得胚狀體。因此，小孢子是否膨大與能否產生胚有直接相關性，而NLN培養基全部采用過濾滅菌更有利于小孢子產生胚胎。三、小孢子發育期選擇合適的小孢子發育期是小孢子培養的關鍵環節。據報道，最適合游離小孢子培養的時期是單核靠邊期和二核早期。由于本實驗供體植株是種植大田，溫度不能控制，小孢子的最適發育時期難以用一個準確尺度來進行判斷，因此在實驗中采用鏡檢、花蕾長度和開花時期綜合指標進行選擇。首先是鏡檢，起初采用傳統的醋酸洋紅和苯酚染液染色，效果很不理想，看不到細胞核，難以找到最適的單核靠邊期，這主要是由于單核期小孢子的細胞壁開始增厚，用普通顏料染色，多數細胞觀察不到細胞核；而個別能看到細胞核的都在發育早期(1.5mm花蕾)，如四分體時期。在2006年夏繁試驗中，采用Hoechest熒光染色來觀察小孢子的發育情況。結果在以前苯酚染液和醋酸洋紅染色看不到細胞核的材料中都可以觀察到細胞核。在開花37天的3.5mm的花蕾中，觀察到70%以上的小孢子處于單核靠邊期。據報道，小孢子發育的同一性和單核靠邊期小孢子所占的比例與小孢子的誘導頻率有很大的關系。單核靠邊期小孢子所占比例大，誘導率高。通過熒光染色觀察，對于本試驗所用的甘藍型油菜材料而言，一般1.5mm花蕾的小孢子處于四分體時期和單核早期，23mm的花蕾有部分單核靠邊期出現，3.5mm的有70%左右的小孢子處于單核靠邊期，4.Omm以上的又逐漸減少，5.Omm的出現雙核中期和三核期，因此，取樣最適的花蕾大小為3.5mm。分析實驗結果可以得出當小孢子沒有膨大時，是不會產生胚的，只有膨大的小孢子才能產生胚，而且，從試驗中還發現，小孢子膨大率在50%以上的材料比較容易產生胚，胚胎發生率也高；而膨大率在50%以下的胚發生率較低或難以產生胚。在加入秋水仙素高溫培養2天后，小孢子是否膨大和膨大率是否高(>50%)，是小孢子產生胚的一個基本條件，也是衡量小孢子胚胎能否發生的一個有效指標。以小孢子高溫培養兩天后的膨大率為指標進行篩選，有利于早期剔除不能產生胚胎的小孢子，提高誘導效率，避免浪費時間和資源。與現有技術相比，本發明的關鍵在于在小孢子誘導期早期對小孢子的篩選。發明人在實驗中發現，熱激培養2天后小孢子的膨大率是衡量小孢子胚胎能否發生的一個有效指標。在小孢子的膨大率大于50%時，小孢子的胚胎發生出現質的轉變。這表明，小孢子培養密度和膨大小孢子的密度可能都具有集體效應。這種集體效應促使小孢子偏離配子體發育途徑。由于甘藍型油菜是2年生作物，一年只有一次開花期，一株植株的有效取樣時間只在開花后的310天。以前需要23周以后才能看出小孢子能否產生胚狀體，應用該方法能在培養2天后判斷出所培養的小孢子胚狀體的產生情況，從而可以在有效時間內加大出胚小孢子的培育次數，解決現有技術中油菜小孢子胚狀體誘導率低的問題，提高誘導效率，節省誘導時間，大大減少工作量。具體實施方式實施例l:春季油菜開花初期，在天氣晴朗的早晨(8:0011:00)，于大田中選取開花37天的花序，插水保存在4'C冰箱中(15天都不會影響胚的產生)，然后選取小孢子發育時期在單核期和二核早期的花蕾(花蕾長度在3.5mm左右)，將其放入濾布中，在無菌條件下用70。/。酒精消毒lmin左右，然后在無菌條件下用O.1X升汞消毒10min，無菌水沖洗35次。將已清洗和滅菌的花蕾放入pH為5.86.0、含13。/。蔗糖的B5無激素液體培養基中用玻璃棒輕輕將花粉擠出，經300目尼龍網膜過濾到離心管里，于800rpm離心8min，去掉上清液；再加入相同的B5無激素液體培養基在同樣轉速下離心5min，去掉上清液，即得游離小孢子。在游離小孢子中加入DUCHEFABI0CHEMIE公司生產的含50mg/l秋水仙素的全過濾滅菌的NLN-13液體培養基(蔗糖濃度為13%，pH5.9)，在32。C的溫度下高溫(熱激)暗培養2天，選擇膨大率大于50%的材料，用不含秋水仙素的全過濾滅菌的NLN-13無激素液體培養基(蔗糖濃度為13%，不添加秋水仙素)清洗離心，除去秋水仙素，然后加入相同培養基即不含秋水仙素的全過濾滅菌的NLN—13無激素液體培養基，調節小孢子的密度為l個花蕾/ml，在25'C恒溫靜置暗培養23周至胚狀體產生。將產生胚狀體的小孢子置于80rpm的搖床上、25'C條件下暗培養12周，然后將正常發育的小孢子胚轉入B5固體培養基(0.8%瓊脂，5%蔗糖，pH5.86.0)，置入22。C、16h光周期培養箱內培養，23周轉換一次培養基直到植株生長成為正常不定芽苗，然后再轉生根培養基和盆栽馴化，最后移栽大田。實施例2:在油菜的開花初期，早晨8:0010:00切取開花37天的花序，選擇大小為3.5mm的花蕾，置于4%的次氯酸鈉溶液消毒10min，無菌水洗34次，加入B5培養基，用玻棒輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離至培養基中，過篩除花蕾組織殘渣，離心收集小孢子；加入含55mg/l秋水仙素的全過濾滅菌的NLN—13無激素液體培養基(蔗糖濃度為13%，pH5.9)，在32'C高溫暗培養2天，選擇小孢子膨大率大于50%的材料，加入不含秋水仙素的全過濾滅菌NLN—13無激素液體培養基離心清洗兩次去除秋水仙素，然后加入不含秋水仙素的全過濾滅菌NLN—13無激素液體培養基在25。C培養23周即得小孢子胚；將小孢子胚移到MS固體培養基中培養形成植株。權利要求1.一種甘藍型油菜游離小孢子植株的培育方法，包括小孢子的分離、小孢子胚狀體的誘導和小孢子植株的培育，其特征在于所述小孢子胚狀體的誘導為將制備好的甘藍型油菜游離小孢子加入含45～55mg/l秋水仙素的全過濾滅菌的NLN-13無激素液體培養基，在30～35℃高溫暗培養2天，選擇小孢子膨大率大于50％的材料進行后繼的誘導培養。2.按照權利要求l所述甘藍型油菜游離小孢子植株的培育方法，其特征在于所述小孢子胚狀體的誘導為將制備好的甘藍型油菜游離小孢子加入含50mg/l秋水仙素的全過濾滅菌的NLN-13無激素液體培養基，在32。C高溫暗培養2天，選擇小孢子膨大率大于50%的材料，用不含秋水仙素的全過濾滅菌的NLN—13無激素液體培養基清洗、離心去除秋水仙素，然后加入不含秋水仙素的全過濾滅菌的NLN—13無激素液體培養基調節小孢子密度為l2個花蕾/ml，在25'C恒溫靜置暗培養至胚狀體產生。3.按照權利要求1或2所述甘藍型油菜小孢子植株的培育方法，其特征在于所述小孢子的制備為在大田中選取開花37天的甘藍型油菜花序，選擇3.04.0mm的花蕾，將其放入濾布中，在無菌條件下用7(F。酒精消毒lmin，然后用O.1%升汞消毒10min，無菌水沖洗35次，經清洗和滅菌后的花蕾放入pH為5.86.0、含13。/。蔗糖的B5無激素液體培養基中，輕壓擠出小孢子，經300目尼龍網膜過濾到離心管里，于800rpm離心8min，去掉上清液；再加入相同的B5無激素液體培養基在同樣轉速下離心5min，去掉上清液，即得游離小孢子。4.按照權利要求3所述甘藍型油菜游離小孢子植株的培育方法，其特征在于所述甘藍型油菜花蕾為3.5mm。5.按照權利要求3所述甘藍型油菜游離小孢子植株的培育方法，其特征在于所述選取的大田中開花37天的甘藍型油菜花序，其保存方法為4"C冰箱中插水保存15天。6.按照權利要求1或2所述甘藍型油菜游離小孢子植株的培育方法，其特征在于所述小孢子植株的培育為將產生的小孢子胚狀體在80rpm的搖床上、25'C條件下暗培養12周，然后將正常發育的小孢子胚轉入pH為5.86.0、含0.8%瓊脂和5%蔗糖的B5固體培養基，置入22。C、16h光周期培養箱內培養，23周轉換一次培養基直到生長成為正常不定芽苗，然后再轉生根培養基獲得小孢子再生植株，盆栽馴化后移栽大田。全文摘要本發明公開了一種甘藍型油菜游離小孢子的培育方法，以解決現有技術中沒有早期判斷小孢子胚能否產生的指標的缺陷，本發明方法是將制備好的甘藍型油菜游離小孢子加入含45～55mg/了秋水仙素的全過濾滅菌的NLN-13無激素液體培養基，在30～35℃高溫暗培養2天，選擇小孢子膨大率大于50％的材料進行后繼的誘導培養，本發明選擇高溫誘導培養兩天后小孢子膨大率大于50％的小孢子進行后繼的誘導培養，有利于早期剔除不能產生胚胎的小孢子，可以大大減少工作量，提高誘導效率，避免浪費的時間和資源。文檔編號A01H4/00GK101243776SQ20081030045公開日2008年8月20日申請日期2008年3月4日優先權日2008年3月4日發明者劉永翔,涵徐,麗李,毛堂芬,董穎蘋,黃先群申請人:貴州省生物技術研究所