專利名稱：滇重樓快繁技術和煉苗、種植的方法
技術領域：
本發明涉及一種滇重樓快繁技術和煉苗、種植的方法。
背景技術：
重樓是《中國藥典》收錄品種,是云南白藥和中藥配伍中重要的稀缺中藥材，重樓是以地下根為 藥材，重樓主根生長緩慢，周期長，依賴于采挖野生資源來滿足需求，資源日漸枯竭.國內雖有種 植，但播種后1-2年萌發出芽，尚末解決種源，隨著我國制藥企業對重樓原料需求量的迅速增長， 重樓已逐漸成為瀕臨消亡的珍稀瀕危物種。
目前國外無此相關技術的研究報道，我國對于重樓的引種馴化和人工栽培技術的研究從上世紀 80年代就開始了，例如李運昌(1982)對滇重樓的有性繁殖進行了研究。王麗萍，起學偉(2002)也 對滇重樓進行了野生馴化及栽培技術的初步研究。近年來對重樓需求每年以20%幅度遞增，而其野 生資源逐年減少，供需逐年擴大。種植重樓是大勢所趨，綜觀技術有四
1、 假植
在中藥現代法種植中，云南省重樓的大多數種植公司是將甲地的野生重樓挖出，運到乙地種植， 實際上不是種植是假植，假植處理不妥，爛根極多，導致重樓資源短缺，沒有解決從獲得種苗至大 田種植的根本問題。
2、 有性繁殖種苗的種植
從種植方面而言，目前國內常采用的兩種方法(有性種子繁殖和無性切塊繁殖)之一采集野
外和假植重樓的種子進行有性繁植，如澄江正飛藥材種植公司。野生滇重樓的種子采集困難，滇重 樓種子的生物特性決定滇重樓種子的發芽必須經過兩個冬季休眠才會發芽，才能長成幼苗，是典型 的"二年種子"，種植后十年其根可作藥材，十二年種植費用和管理成本很高，周期過長，藥農不能 早見效益，難于推廣。非專業技術人員采集種子的品種難于控制，使種植的重樓有非藥用滇重樓的 情況，品種混亂使藥材質量不易控制。
3、 滇重樓無繁一切塊種植 一
先對滇重樓帶頂芽的塊莖進行切塊，將切塊直接種入苗床，待成芽后再移入大田進行種植。如 云南白藥有限公司和澄江正飛藥材種植公司。非專業技術人員挖來的重樓品種難于控制，使種植的 重樓品種混亂，使種植的重樓有非藥用滇重樓的情況。切塊后品種不保證，藥材質量難控制。切塊 快繁可縮短種植周期，但仍需采集野生重樓為材料，種植中爛根較多尚未完全解決，于資源保護不 利。4、 滇重樓組培苗
云南農業大學，云南大學和云南中醫學院，先后進行了組培實驗。組培生產種苗，可縮短出苗 周期，使品種單一，但組培苗不易生根，種植不易成活的瓶頸難題尚未解決，滇重樓組培苗大田種 植成活率方面沒有突破，雖有人做過試驗，但均未見有成功和較好效果的文獻報道。
5、 滇重樓組培苗存在問題
滇重樓組培苗不易生根，煉苗技術不成熟，種植不易成活是困繞科技工作者多年， 一直沒有解決 的瓶頸難題。
發明內容
本發明的目的是提供一種滇重樓快繁技術和煉苗、種植的方法，該方法利用組織培養的技術原 理，選擇滇重樓根部的頂端為外植體，進行無性繁植；攻克了組培苗不易生根，煉苗技術不成熟、 種植不易成活的瓶頸難題,為滇重樓資源的再生、確保重樓中藥材的市場供應、滿足制藥企業對重樓 原料需求、實現資源的再生和持續利用提供了有效的方法。
本發明的技術方案如下
一、 快繁技術
材料經過對甾體皂甙化學成分含量分析后，選擇高含量植株莖、芽為外植體，建立單株無菌 體系，確保種苗品質的一致性，確保滇重樓中藥材優質種源。
1) 對外植體消毒:取健壯根沖洗1小時——70%乙醇擦洗根部——放到超凈工作臺上按以下步驟 操作用0. 1%升汞液浸泡10—15min，放入裝有無菌水的瓶子搖洗6次，用消毒鑷子取出在用消毒 刀片先切芽頭部分，然后順著芽頭往下在芽眼處斜切，切面成三角形，將切面向下沿瓶邊插入MS培
養基中，每瓶放一塊外植體。蓋緊瓶蓋，用保鮮袋封好瓶口，；
2) 組培
① 培養基配制以MS為基本培養基，附加不同濃度的植物激素(如Naphthalene acetc acid， 6-benzyladenine, kinetin, I油le-3-butyric acid , Indole-3-actic acid, adenine)庶 糖30g/L、瓊脂粉6.5g/ L 、 ^值=5.6—6.4，生根培養基中加入活性炭lg/L。
配制過程按照常規方法，培養瓶為玻璃瓶或透明塑料瓶。滅菌采用121 'C滅菌30分鐘高壓濕熱 滅菌。
② 組培條件:組培室溫度25'C、置于光照培養箱中，在溫度為25'C士2，光照時間為12小時， 光照強度為1000 2000勒可斯，uM m-2 s -1條件下培養。
二、 煉苗
將上面獲得的再生小苗從生根培養基中取出，用無菌水洗去再生小苗的培養基。于大量元素培 養基和微量元素液以及根據目的添加鐵鹽、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、各種維生素、植物激素，煉苗12天，根3—5條，長度3—5cm。
大量元素培養基即MS培養基，其具體配方為硝酸鉀18-49、硫酸鎂.5.1-8.2、硝酸銨11.25、 磷酸二氫鉀1.6-5.3，定溶1升，與用無水氯化鈣6.64克定溶1升的溶液進行混配；
微量元素液具體配方為上述培養基中每升加入硒1. 6—4. 2克，銨1. 8—5.6克，鋅0. 002—0.01 克，磷0.01—0.5克，培養10—15天，增加光照強度， 一般要求為4000 6000勒可斯，而后打開 瓶蓋通風、透氣5—7天，待苗木葉色濃綠、塊莖木質化程度提高，并逐步適應后、再移栽。也可以 將生根瓶移入溫室內培養，而后打開瓶蓋通風、透氣，使苗逐步適應后再移栽。
三、種植
具體方法步驟及條件從微量元素液中取出幼苗，移栽在經消毒的土壤培養袋中，置于背陰、通 風、濕潤的地床上，無需施肥、澆水， 一周后檢査土壤濕潤度以土壤從手指縫中流出，手捏住土 壤時濕潤無滲水為標準；20天后小苗葉片轉為墨綠色，長出新根后，可添加腐熟土更換營養袋中消 毒土壤，待長出的頂芽長成葉片時，即可移栽野外。
蟲害防治重樓的主要蟲害為白螞蟻及老鼠，老鼠喜溫，因此，野外移栽防治鼠害的條件極為 重要首先要選擇西邊背陰1800米海拔以上的寒冷山區為宜；同時，定期滅鼠。
本發明的有益效果
優選重樓的根中"根莖頂端生長優勢"為外植體進行單株組培組培，可確保種苗品質的一致性， 確保重樓中藥材優質種源。誘導出愈傷組織，分化頻率為100%，增殖系數為5—6倍以上。愈傷組織 轉接到不定芽分化和繼代培養，每個芽的年增殖系數理論上為1.0X1010以上。無根不定芽，轉接到 生根培養基中，培養得到不定根生根苗，生根達3—5厘米。煉苗時加入微量元素，可長出新的須根 2—5條，須根長度均超過0. 5CM。煉苗的成活率達80X.主根粗壯，須根增多,種植野外時適應性強，大 田種植成活率達80%以上，解決了組培不易成活的難題。
重樓種子具"二次休眠"的生理特性，用種子有性繁殖出苗需二年以上；利用"根莖頂端生長 優勢"為外植體進行組培，在一年內即可培育三批組培苗，提前二年獲得種苗，縮短了種植周期。 此發明創造技術與現有其他技術相比，具有生長周期短、生產成本低、品質好、可規模化生產種苗 的特點。
具體實施例方式
實施例1:愈傷組織誘導與分化
取甾體皂甙化學成分含量高,健壯的重樓根外殖體，用70%的乙醇表面消毒卜6分鐘，再用0.1% 的升汞消毒5-15分鐘，滅菌蒸餾水洗6次，每次10分鐘。然后，將消毒后的外植體切成小塊接種 在0. 2 mg/L NAA和1. 5 mg/L 6-BA激素，分裂素3%活性炭,添加100ml/L椰汁的MS蔗糖瓊脂培養基 上，配制過程按照常規方法，培養瓶為玻璃瓶，滅菌采用121 'C滅菌30分鐘高壓濕熱滅菌。置于光照培養箱中，在溫度為25'C土2，光照時間為12小時，光照強度為1000 2000勒可斯， yMm-2 s -1條件下培養；經過對外植體誘導后得到愈傷組織，培養4周，其體積可比原愈傷組織 擴大5 6倍。誘導出愈傷組織，增殖系數為5 6倍以上。
按此方法可每月繼代培養，每個芽的年增殖系數理論上為1.0X1010以上。 實施例2:不定芽、不定根誘導
選取愈傷組織轉接到不定芽分化和繼代培養基中，置于溫度為10 °C±2，光照時間為4小時，光 照強度為1000 2000勒可斯，yM nr2 s -1條件下培養得到不定芽。按此方法45天為一周期繼代 培養。
選取生長健壯、高度為1.5-3.0 cm的無根不定芽，轉接到生根培養基中，置于溫度為2(TC土2， 光照時間為10小時，光照強度2000~4000勒可斯，u M m-2 s -1條件下培養得到不定根生根苗， 生根達3—5厘米。 實施例3:煉苗
采用微量元素配方將獲得的生根苗從生根培養基中取出，用無菌水洗去培養基。將生根苗置
于微量元素液，每升加入硒4.2克，銨5.6克，鋅0.01克，磷0.5克，培養15天，保持光照強度 為4000 6000勒可斯，iiMnr2s-l，氣溫為20-25°C，相對濕度為70-100%。待長出木質化新根3 一5條，再將其移栽到大棚進行煉苗30—50天，可長出新的須根2—5條，須根長度均超過0. 5CM。 實施例4:種植
經大棚煉苗長出新的須根2—5條，須根長度均超過0.5cm時，木質化新根粗壯，原地上部分枯 萎，變黃逐漸倒苗，新生苗芽頂出現，此時適應性強，在11月，4月和8月份分批將大棚中的幼苗 整株移栽于野外，并fe持水分。種植成活率達到80%以上，突破了我國重樓組培苗煉苗技術及難以種 植成活的瓶徑難題。
權利要求
1、一種滇重樓快繁技術，其特征是包括組培選擇高含量植株莖、芽為外植體，建立單株無菌體系，對外植體消毒后插入生根培養基中進行組培；生根培養基配制以MS為基本培養基，附加植物激素，蔗糖30g/L、瓊脂粉6.5g/L、PH值＝5.6--6.4，培養基中加入活性炭1g/L；組培條件在溫度為25℃±2，光照時間為12小時，光照強度為1000～2000勒可斯、μMm-2s-1條件下培養；
2、 一種滇重樓煉苗方法，其特征為步驟如下將獲得的再生小苗從生根培養基中取出用無菌水洗凈，于MS培養基中添加鐵鹽、肌醇、 甘氨酸、脯氨酸各種維生素及植物激素煉苗12天，根5—10條，長度3—5cm;再加入微量元素， 每升加入硒1.6—4.2克，銨1.8—5.6克，鋅0.002—0.01克，磷0.01—0.5克，培養10— 15天，增加光照強度至4000 6000勒可斯，而后打開瓶蓋通風、透氣5—7天，待苗木葉色 濃綠、塊莖木質化程度提高，并逐步適應后、再移栽；
3、 一種滇重樓種植方法，其特征為具體方法是從上述微量元素液中取出幼苗，移栽在經消毒的土壤培養袋中，置于背陰、通風、濕潤的 地床上，無需施肥、澆水， 一周后檢査土壤濕潤度以土壤從手指縫中流出、手捏住土壤時濕 潤無滲水為標準；20天后小苗葉片轉為墨綠色，長出新根后，可添加腐熟土更換營養袋中消 毒土壤，待長出的頂芽長成葉片時，即可移栽野外并進行蟲害防治。
全文摘要
本發明涉及一種滇重樓快繁技術和煉苗、種植的方法，其快繁技術包括篩選優質單株體系、消毒、組培煉苗是關系組培苗種植成活率高低的關鍵，本發明首次利用微量元素進行滇重樓煉苗，使煉苗成活率達80％，從而確保種植成活率達80％；煉苗是將再生小苗先置于添加維生素及植物激素的培養基中培養后，再加入微量元素進行培養再移栽；種植方法是將經過煉苗的幼苗移栽在經消毒的配方土壤培養袋中，待新長出的頂芽長成葉片時，即可移栽野外并進行蟲害防治。本發明的技術及方法可確保種苗品質的一致性，確保重樓中藥材優質種源。煉苗的成活率達80％。主根粗壯，須根增多，種植野外時適應性強，大田種植成活率達80％以上，解決了組培不易生根、煉苗技術不成熟，種植不易成活的瓶頸難題。具有生長周期短、生產成本低、品質好、可規模化生產種苗的特點。
文檔編號A01H4/00GK101461327SQ200810233480
公開日2009年6月24日 申請日期2008年10月24日 優先權日2008年10月24日
發明者艷 張, 張抱瓊, 喆 楊, 熊云昆, 勇 石, 陳昌祥 申請人:昆明優利豐園科技開發有限公司