專利名稱：：一種以橙色大白菜子葉段為外植體的離體組織培養方法
技術領域：
：本發明屬于農業
技術領域：
，是以橙色大白菜子葉段為外植體的不定芽誘導和植株再生的培養方法。
背景技術：
：大白菜起源于我國，南北都有種植，具有悠久的栽培歷史，是人們生活中不可缺少的一種重要蔬菜，味道鮮美，營養豐富，素有"菜中之王"的美稱，為廣大群眾所喜愛。橙色大白菜由西北農林科技大學園藝學院蔬菜花卉研究所白菜課題組提供，中晚熟，結球緊實，粗纖維少，含糖量高，味甜，口感佳，營養豐富，商品性好，高抗病毒病，霜霉病和干燒心。通過基因工程技術創新大白菜種質和新品種具有直接、快速和針對性強的優點。建立高效穩定的再生體系是大白菜遺傳轉化的前提，同蕓苔屬其它作物相比，大白菜屬十字花科AA基因組作物，而A基因組對再生芽的抑制效應較大，主要存在材料特異性強、重復性差、周期長和再生頻率低等問題，制約轉基因技術在大白菜種質和品種改良上的應用。前人報道了大白菜子葉、子葉-子葉柄、真葉、下胚軸、花相關組織、小孢子和原生質體直接分化再生、愈傷組織再生、胚狀體再生和原生質體再生等多種途徑。其中子葉-子葉柄離體繁殖為直接器官分化途徑，可以直接誘導再生芽，明顯縮短培養周期，然而報道中芽誘導培養基添加物種類繁多，一般認為AgN03不可缺少，為提高芽分化率還添加了Co(N03)2、CoCl2、GA3、ABA等物質；而且采用的外植體苗齡大小差異很大，315d不等；外植體切割方式報道很不一致，關于保留兩片子葉，在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)，橫切后去除頂芽,切除兩片子葉頂端的方式尚未報道。
發明內容針對現有技術中存在的問題與缺陷，本發明的目的在于提供一種以子葉段為外植體的橙色大白菜離體組織培養方法，該方法有效的解決了培養周期長和再生頻率低的問題。實現上述發明目的的技術方案是一種以子葉段為外植體的橙色大白菜離體組織培養方法，其特征在于，具體包括下列步驟1)挑選籽粒飽滿的橙色大白菜種子，無菌條件下，先用體積百分比為70%的酒精表面殺菌約lmin，再用10%的NaClO溶液滅菌3035min，然后用無菌水反復沖洗45次，最后將種子平放于MS基本培養基表面，在溫度為25士1"C，光照時間16h/d，光照強度20001x的條件下培養；2)當幼苗直立生長，兩片子葉較大、半直立將展平、呈綠色，第一片真葉未露出(播種56d左右)時，在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點)橫切，后沿子葉柄縱切去除頂芽，并切除此子葉頂端的1/3的單片子葉為外植體；3)先將子葉段以子葉的下端豎直向下插入芽啟動培養基中，培養23d，然后轉入芽誘導培養基中培養10d，當不定芽長到23cm時，最后將誘導的不定芽轉入生根培養基中培養。以上培養條件均為溫度25士1°C，光照時間16h/d，光照強度20001x;4)待幼苗基部形成大量的毛根后，煉苗45d，取出小植株，洗凈根部培養基，移栽到珍珠巖草炭體積比為1:3混合基質中，塑料薄膜保濕7d，逐漸揭膜，1015d即可入土栽培。所述的MS基本培養基由組成母液組成含量(mg/L)NH4N031650KN031900大量元素(20x)CaCl2332MgS04'7H20370KH2P04170鐵鹽(lOOx)Na2EDTA37.25FeS047H2027.85KI0.83H3B036.2MnS04'4H2022.3微量元素(lOOx)ZnS04-7H208.6CuS04'5H200.025CoCI27H200.025肌醇100煙酸0.5有機成分(100x)甘氨酸2.0鹽酸硫胺素0.4鹽酸吡眵醇0.5蔗糖30000其它瓊脂7000PH5.8所述的芽啟動培養基是在MS基本培養基中加入7.0mg丄"6-BA和0.5mg丄"NAA;所述的芽誘導培養基是在MS基本培養基中加入5.5mg丄"6-BA和0.5mg丄"NAA;所述的生根培養基是在1/2MS基本培養基中加入0.5mg丄"NAA。本發明以橙色大白菜子葉段為外植體，從苗態、切割方式和接種方式及添加6-BA與NAA兩個激素組合幾個方面，優化了橙色大白菜離體植株再生體系，為橙色大白菜轉基因研究奠定基礎。本發明的橙色大白菜組織培養方法在傳統橙色大白菜組織培養的基礎上首次采用了芽啟動培養基和對子葉段的不同切割方式，使的培養方法簡單、易操作、成本低；同時，培養出來的不定芽質量好、健壯、沒有畸形，提高了再生頻率，縮短了再生周期，優化了橙色大白菜離體植株再生體系，為獲得大白菜轉基因的受體新材料提供了新的途徑，對利用現代基因工程技術創新大白菜種質和新品種將具有重要的現實意義。圖l06J28幼苗直立生長，兩片子葉較大、半直立將展平，呈綠色，第一片真葉未露出圖。圖206J28在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)先橫切，然后沿子葉柄縱切去除頂芽，并切除此子葉頂端的1/3。圖306J28先經芽啟動培養基MS+7.0mg丄"6-BA和0.5mg丄"NAA培養2-3d，然后轉入芽誘導MS+5.5mg丄"6-BA和0.5mg丄"NAA培養10d的誘導芽。圖406J28經MS+0.5mg丄"NAA生根培養后長成的再生植株。圖506J28再生植株的在MS+0.5mg丄"NAA的生根狀況。圖606J28再生植株的移栽到混合基質中。具體實施方式試驗例11)材料橙色大白菜06J28，2)方法第一步，無菌苗培養挑選籽粒飽滿的橙色大白菜06J28種子，無菌條件下，先用體積百分比為700/。的酒精表面殺菌約lmin，再用l(f/。的NaC10溶液滅菌3035min，然后用無菌水反復沖洗45次，最后將種子平放于MS基本培養基表面。第二步，適宜苗態的篩選為了獲得相同生理狀態的外植體，將不同苗態下的06J28子葉段插入確定的最優芽啟動培養基和芽誘導培養基中培養，20d后統計苗數，據此結果篩選出最優的外植體苗態。苗態劃分為4種，分別是Sl:種子發芽后，種殼剛脫離，子葉發黃(播種23d左右)；S2:幼苗直立生長，兩片子葉完全脫離種殼，子葉較小、完全張開，呈黃綠色，(播種34d左右)；S3:幼苗直立生長，兩片子葉較大、半直立將展平，呈綠色，第一片真葉未露出，(播種56d左右)；S4:第一片真葉剛長出(播種67d以后)。第三步，外植體的切割與接種方式在無菌條件下切取材料06J28處于苗態S3的子葉段，豎直向下插入或平放于選擇的芽啟動培養基和芽誘導培養基中，10d后再轉接到生根培養基中，20d后統計苗數。根據統計結果篩選出最優的子葉段切割方式和接種方式。子葉段的切割方式有以下8種Cl:在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)先橫切，然后沿子葉柄縱切去除頂芽，并切除此子葉頂端的l/3;C2:在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)先橫切，然后沿子葉柄縱切去除頂芽，并切除此子葉頂端的1/2;C3:在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)先橫切，然后沿子葉柄縱切去除頂芽，并切除此子葉頂端的2/3;C4:保留單片子葉，在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)，先橫切，然后縱切去除頂芽，保留此完整子葉；C5:在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)橫切后，去除頂芽，切除兩片子葉頂端的l/3;C6:在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)橫切后，去除頂芽，切除兩片子葉頂端的1/2;C7:在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)橫切后，去除頂芽，切除兩片子葉頂端的2/3;C8:保留兩片子葉，在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點處)橫切后，去除頂芽，保留完整子葉。子葉段的接種方式有2種，即平放于培養基和以子葉的下端豎直向下插入培養基。第四步，芽啟動培養基的篩選MS基本培養基附加不同濃度的6-BA(0.0，2.0，3.0，5,0，7.0和10.0mg丄")和NAA(0.0，0.5，1.0和2,0mg丄")。每瓶接種8個外植體，每個處理共接15瓶，分3組(重復)。同時添加0.7%的瓊脂，3%的蔗糖，滅菌前調pH5.8，121°C滅菌20min。培養溫度25士1。C,光照時間16h/d，光照強度2000k。無菌條件下切取材料06J28苗態S3的子葉段，在芽啟動培養基上培養23d左右后，再在芽誘導培養基上培養10d，轉入生根培養基。20d后統計苗數，根據統計結果篩選出6-BA和NAA的最佳濃度組合，并確定最優的芽啟動培養基。第五步，芽誘導培養基的篩選MS基本培養基附加不同濃度的6-BA(0.0，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0mg丄")、NAA(O,O，0.5和1.0mg丄")和AgN03(0.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0mg丄")。每瓶接種7個外植體，每個處理共接15瓶，分3組(重復)；同時添加0.7%的瓊脂，3%的蔗糖，滅菌前調pH5.8,121t滅菌20min。培養溫度25士1°C,光照時間16h/d，光照強度20001x。無菌條件下切取材料06J28苗態S3的子葉段，在芽誘導培養基上培養IOd左右后，轉入生根培養基。20d后統計苗數，根據統計結果篩選出6-BA和NAA的最佳濃度組合，并確定最佳的芽誘導培養基。第六步，不定芽生根與植株移栽1/2MS基本培養基附加不同濃度的NAA(O.O，0.5和1.0mg丄'1)，每瓶接種5個再生芽，每個處理共接9瓶，分3組(重復)；同時添加0.7%的瓊脂，3%的蔗糖，滅菌前調pH5.8，121r滅菌20min。培養溫度25土1°C,光照時間16h/d，光照強度20001x。當分化培養基中的不定芽長到23cm時，經切分后轉入1/2MS附加不同NAA(O.O，0.5和1.0mg丄")的生根培養基中，待基部形成大量的毛根后，打開三角瓶口，煉苗45d后。取出小植株，洗凈根部培養基，移栽到混合基質(珍珠巖草炭=1:3)中，塑料薄膜保濕7d，逐漸揭膜，1015d即可入土栽培。3)數據統計再生頻率(％)=再生不定芽的外植體數/接種外植體總數><100%;每塊外植體再生芽數=外植體不定芽總數/再生不定芽的外植體總數。4)結果與分析4.1)不同苗態對橙色大白菜06J28子葉段再生的影響外植體的大小是影響子葉段再生頻率的重要內在因素之一。從表l可見，06J28大白菜外植體苗態過小或過大時的再生頻率及每塊外植體再生芽數均較低，以苗態S3時的再生頻率及每塊外植體再生芽數均最高，達到88.6%和1.14個，顯著高于其它苗態。因此認為苗態S3的子葉段為適宜苗態，即兩片子葉綠色將展平、第一片真葉未露出、小苗直立生長(播種56d左右)。表l06J28不同苗態對白菜子葉段再生的影響苗態類型外植體數再生頻率/%每塊外植體再生芽數513531.9c1.05b523573.4b1.02c533588.6a1.14a543510.0d1.00d注:同列數據后標不同小寫字母者表示在5%水平上差異顯著，下同。4.2外植體的切割方式及接種方式對06J28橙色大白菜子葉段再生的影響由表2得出，不同切割方式中，外植體在兩種接種方式下的再生頻率趨勢基本相同，而且豎直向下插入方式的再生頻率均顯著高于平放方式，故"豎直向下插入"為適宜的接種方式。在豎直向下插入方式條件下，不同外植體的再生頻率大小為Cl>C3>C2>C4>C7>C6>C5>C8,CI切割方式的再生頻率和每塊外植體再生芽數達到最好，分別為90.0%和1.14個，與其它處理之間差異顯著。結合圖l可以看出，不同基因型的子葉段處于同一苗態，在同一切割方式中，再生頻率趨勢是一致的，因此，Cl切割方式是最佳的切割方式。表2外植體的切割方式和接種方式對06J28大白菜子葉段再生的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.3)芽啟動培養基的篩選子葉段經芽啟動培養基23d后，轉接至芽誘導培養基后可觀察到，再生芽生長較快，芽點也較多。由表3可見，在不同激素配比的培養基中，以附加7.0mg丄"6-BA和0.5mg丄"NAA的培養基啟動培養的子葉段再生頻率和每塊外植體再生芽數最高，分別為90.4%和1.14，且與其它處理之間差異顯著，較沒有啟動培養的分別提高4.9%和3.5%。故認為附加7.0mg丄"6-BA和0.5mg丄—AA的培養基為最優啟動培養基。表3不同啟動培養基對06J28大白菜再生的影響處理6-BA/(mg丄-')NAA/(mg丄1)外植體數No.of再生頻率/%每塊外植體再生芽數10.00.5400.0g0.00d22.00.54029.0e1.00c3.00.54033.2e1.01c45.00.54072.9b1.02be7.00.54090.4aU4a610.00.54045.1d1.00c5.01.04040.2d1.00c87.01.04056.9c1.03b910.01.04043.1d1.01c.io5.02.0400.0g0.00d117.02.04017.4f1.00c1210.02.04020.1f1.00c4.4)芽誘導培養基篩選從表4可知，在單獨添加6-BA的MS基本培養基上不能誘導再生芽。同時添加6-BA和NAA可以誘導再生芽；在相同6-BA濃度下，低濃度的NAA利于再生芽萌發；在低濃度NAA下，再生芽萌發與6-BA濃度呈現單峰變化，當6-BA為5.5mg丄"，NAA為0.5mg丄"時再生頻率和每塊外植體再生芽數都達到最大，分別為86.0%和1.10個，并與其它處理之間的差異達到顯著水平。在NAA和6-BA濃度一定的條件下，當添加AgN03的量超過8mg丄'1時再生頻率和每塊外植體再生芽數降低；當添加AgN03的量少于6mg丄"時的再生頻率和每塊外植體再生芽數都有所提高，其再生頻率與不添加AgN03的處理之間差異并不顯著，實驗中觀察到，添加AgN03后，再生芽數雖有增加，但是芽質量差，有玻璃化和畸形現象，可見添加AgNCb對再生芽的促進作用不明顯。因此認為附加5.5mg丄"6-BA和0.5mg丄"NAA的MS培養基為最佳芽誘導培養基。表4不同芽誘導培養基對06J28大白菜再生的影響處理6-BA/(mg丄-')NAA/(mg丄-')AgN03/(mg丄-')外植體數再生頻率/%每塊外植體再生芽數10.00.00.0350.0h0.00e25.00.00.0350,0h0.00e35.50.00.0350.0h0.00e46.00.00.0350.0h0.00e6.50.00.0350.0h0.00e67.00.00.0350.0h0.00e0.00.50.0350.0h0.00e85.00.50.0358.0a1.04c9"0.50.03586.0aU0a106.00.50.03533.3d1.02cd116.50.50.03520.9e1.03cd127.00.50.03535.2d1.01d130.01.00.0350.0h0.00e145.01.00.0353.8gh1.00d155.51.00.0356,6fg1.00d166.01.00.0359.5f1.00d17,6.51.00.03510.0f1.00d187.01.00.03516.1d1.00d<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.6)不同基因型對大白菜子葉段再生的影響按照06J28的具體操作方法，選用06J26、06J31、06J36、01S671m、秋早55(說明06J26、06J31、06J363個基因型為橙色大白菜；01S671m為自交系；秋早55為普通大白菜)幾個基因型對上述方法驗證，從表6看出，基因型秋早55再生頻率最大，達到85%，與06J28的再生頻率88.9X之間差異不顯著，基因型06J26、06J31、06J36、和01S671m的再生頻率依次下降，分別為75.0%、56.1%，40.0%和10.0%，之間差異性顯著；相比較每塊外植體再生芽數變化較小，以基因型秋早55最高，達到1.18個，顯著高于其它基因型。說明本發明的方法適用橙色大白菜再生體系研究，對其它種類大白菜再生方法也具有一定參考價值。表6基因型對白菜子葉段再生的影響基因型外植體數再生頻率/%每塊外植體再生芽數06J283075.0b1.01b06J263088.9a1.05b06J313056.1c1.02b06J363040.0d1.00b01S67卜m3010.0e1.00b秋早553085.0a1.18a實施例ll)挑選籽粒飽滿的橙色大白菜種子，無菌條件下，先用體積百分比為70%的酒精表面殺菌約lmin，再用10%的NaClO溶液滅菌30min，然后用無菌水反復沖洗4次，最后將種子平放于MS基本培養基表面，在溫度為25"，光照時間16h/d，光照強度20001x的條件下培養；2)當幼苗直立生長，兩片子葉較大、半直立將展平、呈綠色，第一片真葉未露出(播種5d左右)時，在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點)橫切，后沿子葉柄縱切去除頂芽，并切除此子葉頂端的1/3的單片子葉為外植體；3)先將子葉段以子葉的下端豎直向下插入芽啟動培養基中，培養2d，然后轉入芽誘導培養基中培養10d，當不定芽長到3cm時，最后將誘導的不定芽轉入生根培養基中培養，以上培養條件均為溫度25°C，光照時間16h/d，光照強度2000be;4)待幼苗基部形成大量的毛根后，煉苗4d，取出小植株，洗凈根部培養基，移栽到珍珠巖草炭體積比為i:3混合基質中，塑料薄膜保濕7d，逐漸揭膜，iod即可入土栽培。實施例2l)挑選籽粒飽滿的橙色大白菜種子，無菌條件下，先用體積百分比為70%的酒精表面殺菌約lmin，再用10%的NaClO溶液滅菌33min，然后用無菌水反復沖洗5次，最后將種子平放于MS基本培養基表面，在溫度為25'C，光照時間16h/d，光照強度20001x的條件下培養；2)當幼苗直立生長，兩片子葉較大、半直立將展平、呈綠色，第一片真葉未露出(播種6d左右)時，在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點)橫切，后沿子葉柄縱切去除頂芽，并切除此子葉頂端的1/3的單片子葉為外植體；3)先將子葉段以子葉的下端豎直向下插入芽啟動培養基中，培養3d，然后轉入芽誘導培養基中培養10d，當不定芽長到2cm時，最后將誘導的不定芽轉入生根培養基中培養，以上培養條件均為溫度26。C，光照時間16h/d，光照強度2000lx;4)待幼苗基部形成大量的毛根后，煉苗5d，取出小植株，洗凈根部培養基，移栽到珍珠巖草炭體積比為l:3混合基質中，塑料薄膜保濕7d，逐漸揭膜，15d即可入土栽培。實施例3l)挑選籽粒飽滿的橙色大白菜種子，無菌條件下，先用體積百分比為70%的酒精表面殺菌約lmin，再用10y。的NaClO溶液滅菌35tnin，然后用無菌水反復沖洗4次，最后將種子平放于MS基本培養基表面，在溫度為24t:，光照時間16h/d，光照強度20001x的條件下培養；2)當幼苗直立生長，兩片子葉較大、半直立將展平、呈綠色，第一片真葉未露出(播種5d左右)時，在子葉柄基部和下胚軸交接處(即生長點)橫切，后沿子葉柄縱切去除頂芽，并切除此子葉頂端的1/3的單片子葉為外植體；3)先將子葉段以子葉的下端豎直向下插入芽啟動培養基中，培養2d，然后轉入芽誘導培養基中培養10d,當不定芽長到3cm時，最后將誘導的不定芽轉入生根培養基中培養，以上培養條件均為溫度24'C，光照時間16h/d，光照強度2000lx;4)待幼苗基部形成大量的毛根后，煉苗4d，取出小植株，洗凈根部培養基，移栽到珍珠巖草炭體積比為1:3混合基質中，塑料薄膜保濕7d，逐漸揭膜，12d即可入土栽培。權利要求1.一種以橙色大白菜子葉段為外植體的離體組織培養方法，其特征在于，包括下列步驟1)挑選籽粒飽滿的橙色大白菜種子，無菌條件下，先用體積百分比為70％的酒精表面殺菌約1min，再用10％的NaClO溶液滅菌30～35min，然后用無菌水反復沖洗4～5次，最后將種子平放于MS基本培養基表面，在溫度為25±1℃，光照時間16h/d，光照強度2000lx的條件下培養；2)當幼苗直立生長，兩片子葉較大、半直立將展平、呈綠色，第一片真葉未露出時，在子葉柄基部和下胚軸交接處橫切，后沿子葉柄縱切去除頂芽，并切除此子葉頂端的1/3的單片子葉為外植體；3)先將子葉段以子葉的下端豎直向下插入芽啟動培養基中，培養2～3d，然后轉入芽誘導培養基中培養10d，當不定芽長到2～3cm時，最后將誘導的不定芽轉入生根培養基中培養，以上培養條件均為溫度25±1℃，光照時間16h/d，光照強度2000lx；4)待幼苗基部形成大量的毛根后，煉苗4～5d，取出小植株，洗凈根部培養基，移栽到珍珠巖∶草炭體積比為1∶3混合基質中，塑料薄膜保濕7d，逐漸揭膜，10～15d即可入土栽培。2.根據權利要求1所述的以橙色大白菜子葉段為外植體的離體組織培養方法，其特征在于，所述的芽啟動培養基是在MS基本培養基中加入7.0mg丄"6-BA和0.5mg丄"NAA。3.根據權利要求1所述的以橙色大白菜子葉段為外植體的離體組織培養方法，其特征在于，所述的芽誘導培養基是在MS基本培養基中加入\5.5mg丄"6-BA和0.5mg丄"NAA;4.根據權利要求1所述的以橙色大白菜子葉段為外植體的離體組織培養方法，其特征在于，所述的生根培養基是在1/2MS基本培養基中加入0.5mg丄"NAA。全文摘要本發明公開了一種以橙色大白菜子葉段為外植體的離體組織培養方法。該方法在傳統大白菜組織培養的基礎上首次采用了芽啟動培養基和對子葉段末端的切割措施，優化了橙色大白菜離體植株再生體系。該培養方法不需要添加AgNO<sub>3</sub>、簡單、易操作、成本低；同時，培養出來的不定芽質量好、健壯、沒有畸形，提高了再生頻率，縮短了再生周期。為獲得大白菜轉基因的受體新材料提供了新的途徑，對利用現代基因工程技術創新大白菜種質和新品種將具有重要的現實意義。文檔編號A01G31/00GK101530062SQ20081023206公開日2009年9月16日申請日期2009年1月7日優先權日2009年1月7日發明者屈會玲,張明科,張魯剛,惠麥俠,武云霞,范愛麗申請人:西北農林科技大學