昆蟲組織酶解物及其在昆蟲病原線蟲人工培養上的應用的制作方法

專利名稱：：昆蟲組織酶解物及其在昆蟲病原線蟲人工培養上的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于植物害蟲生物防治領域，具體地說涉及一種昆蟲組織酶解物，以及昆蟲組織酶解物在昆蟲病原線蟲人工培養上的應用，還涉及含有昆蟲組織酶解物的昆蟲病原線蟲培養基。
背景技術：
：昆蟲病原線蟲是一類重要的生物殺蟲劑，它隨寄主昆蟲的食物或從昆蟲自然開口、節間膜進入昆蟲體內，在昆蟲血腔中釋放自身攜帶的共生菌，共生菌分泌的毒性因子造成昆蟲患敗血癥死亡。昆蟲病原線蟲寄主范圍較廣，能主動搜尋寄主，因此對土棲和鉆蛀等隱蔽性害蟲具獨特防治優勢；同時具有可大量人工培養和對人、畜、環境安全等優點。在工業化國家昆蟲病原線蟲制劑占生物農藥巿場銷售額的13%,僅次于蘇云金桿菌產品。澳大利亞、美國、德國、荷蘭、加拿大等國家均有一些昆蟲病原線蟲產品廣泛用于防治農林、牧草、花卉、和衛生等重要害蟲。昆蟲病原線蟲雖然在20多年前就實現了商業化生產，但由于存在線蟲生產成本高和線蟲質量不穩定等問題，限制了其在生產上的應用。線蟲培養技術主要集中于線蟲產量、質量和成本，一般通過優化培養基和培養條件可提高線蟲產量，從而降低生產成本和提高線蟲質量。如專利《酶解培養基培養昆蟲病原線蟲的方法》(專利號為ZL200410096044.5)公開了一種固體培養線蟲的淀粉酶酶解培養基，主要是在以淀粉為主要成分的培養基中加入淀粉酶；此方法使線蟲產量大幅提高、收獲期提前，線蟲的收獲率和清潔度也得到提高。但是仍然存在生產成本高，且所生產的線蟲質量不高等問題。另外，在培養基中加入昆蟲物質或寄主物質可復壯菌株和提高產量(劉石泉等，微生物學通報，2008，35(7):1091-1095。吳友良，江蘇蠶業，2003，3:10-11。常韶華等，中國生物防治，1998，14(3):105-106)。但是在培養基中昆蟲表皮的存在會大大降低線蟲清潔度，增加線蟲收獲時的清洗難度。
發明內容本發明目的在于提供一種昆蟲組織酶解物。本發明另一目的在于提供上述昆蟲組織酶解物在昆蟲病原線蟲人工培養上的應用。本發明還一目的是提供含有上述昆蟲組織酶解物的昆蟲病原線蟲培養基。實現本發明的技術方案如下本發明一種昆蟲組織酶解物，按照如下方法制備將昆蟲組織和水加入到勻漿器中，勻漿，再加入蛋白酶進行水解反應，然后過濾，棄殘渣，所得濾液即為昆蟲組織酶解物。上述昆蟲組織酶解物的制備方法，包括將昆蟲組織和水加入到勻漿器中，勻漿，再加入蛋白酶進行水解反應，然后過濾，棄殘渣，所得濾液即為昆蟲組織酶解物。所述的蛋白酶的添加量因所添加蛋白酶的種類和蛋白酶的活性的不同而不同，一般蛋白酶的添加量占昆蟲組織干物質重的重量百分比為0.520%。所述的昆蟲組織干物質重可以通過計算得到，一般昆蟲組織干物質重為昆蟲鮮重的3040%或昆蟲干粉重的9095%。上述蛋白酶進行水解反應的時間因蛋白酶的種類和蛋白酶活性的不同而不同；通常蛋白酶的水解反應時間為10180min。所述的蛋白酶是指可以催化分解蛋白質肽鍵的蛋白質水解酶，如酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等。所述的酶均可自市場上購買。上述蛋白酶進行水解反應的溫度為所述酶活性最高時的溫度；可按照所購酶說明書上所標明的溫度進行。所述的昆蟲組織可以是昆蟲組織干粉或活體昆蟲。所述的昆蟲干粉是將昆蟲幼蟲干燥，然后粉碎即得。所述的昆蟲病原線蟲是指可進行人工培養的昆蟲病原線蟲，如蕪菁斯氏線蟲(5tez'wewe附a^/"ae)，d、巻娥斯氏線蟲(Stez'wer打emacar/ocajosae)，格氏斯氏線蟲g/osen')，大異刁、桿線蟲(//eferor/^k^Y/s附egzV&)，嗜菌異小桿線蟲(//"efe/wtoW他6""en'o//zora)等。所述的昆蟲是指可進行人工培養或容易獲得、繁殖成本低的昆蟲，優選可人工飼養且蛋白質含量較高的昆蟲；進一步優選為所培養線蟲的寄主昆蟲；如小木蠹蛾、蠅蛆、蠶蛹、玉米螟、大蠟螟、菜青蟲、米蛾、棉鈴蟲、黃粉蟲、桃小食心蟲等。所述的組織勻漿器是指可以破碎昆蟲組織的工具;勻漿器可自市場上購買。所述的過濾是指用孔徑小于勻漿后昆蟲組織的濾網進行，如尼龍網、綢布或紗布等。上述昆蟲組織酶解物在昆蟲病原線蟲人工培養上的應用。所述的應用是指將昆蟲組織酶解物作為昆蟲病原線蟲培養基的組份。含有昆蟲組織酶解物的昆蟲病原線蟲培養基，按照如下方法制備在昆蟲病原線蟲培養基中加入昆蟲組織酶解物，混勻后高壓滅菌；所添加的昆蟲組織酶解物的數量為勻漿前昆蟲組織干物質重與培養基的質量比為1:2.5250。所述的昆蟲病原線蟲培養基是指可以人工培養線蟲的固體或液體培養基等，如狗飼料培養基(House等.Natrue，1965，206:847)、雞內臟培養基(Bedding等.Ann.appl.Biol.,1984，104:117-120)、鴨腸培養基(楊懷文等.中國生物防治，1991,2:87)、豆粉培養基(韓日疇等.昆蟲天敵，1995，17(4):153-164)、動植物蛋白混合培養基(Yang等.Biologicalcontrol,1997，10,193-198)、蠶蛹培養基(常韶華等.中國生物防治，1998，14(3):105-106)等。本發明具有的優點利用本發明昆蟲組織酶解物配制的培養基培養的線蟲產量高、培養周期短、線蟲毒力強、生產成本低；收獲的線蟲更清潔，簡化了收獲程序，降低了線蟲貯存期污染的幾率；操作簡便易行，適于線蟲的大規模生產。具體實施例方式實施例1芫菁斯氏線蟲(5fez'f2^7zema/eto'ae)培養的對比試驗1、昆蟲大蠟螟組織酶解物的制備(1)選取實驗室培養的營養、生理狀況一致的大蠟螟末齡幼蟲16g，加500g水后用組織勻漿器充分破碎昆蟲組織，使大蠟螟組織內含物完全釋放并均勻懸浮于混合液中；(2)在混合液中加入中性蛋白酶(北京奧博星公司)lg，在45'C下進行水解反應10分鐘；然后用致密綢布濾去大蠟螟組織殘渣，所得濾液即為大蠟螟組織酶解物。2、蕪菁斯氏線蟲培養基的制備(1)向步驟l(2)所得濾液中加入黃豆粉240g、面粉80g、蛋黃粉16g、蛋白胨8g、酵母膏24g、豬油80g、水500g,然后充分攪拌均勻，再用160g海綿吸附；(2)將步驟(1)的培養基以40g/瓶的量裝入250ml三角瓶，在121。C下濕熱滅菌45分鐘后備用。3、蕪菁斯氏線蟲的對比培養試驗(1)培養基為a.本發明的培養基，b.對照為豆粉培養基(組成成份為黃豆粉240g，面粉80g，蛋黃粉16g，蛋白胨8g，酵母膏24g，豬油80g，海綿160g，水1000g)。(2)在上述培養基中分別接種蕪菁斯氏線蟲的共生細菌(&"on^Z^^6oWem7)，于25。C下黑暗培養2天；(3)在步驟(2)培養細菌的培養基中接種蕪菁斯氏線蟲，于25"C下黑暗培養；(4)從第6天開始每2天檢測培養基中昆蟲病原線蟲侵染期線蟲的比例含量直到收獲，每處理重復4次；(5)在侵染期線蟲比例穩定到達95%以上時收獲線蟲，在解剖鏡下對收獲的侵染期昆蟲病原線蟲計數，每處理重復7次，計算得到每克培養基中侵染期線蟲平均產量(IJs/g);以接種線蟲到收獲線蟲所用的天數作為線蟲的培養周期；用"沙柱法"(Yang等.Biologicalcontrol,1997,10，193-198)測定昆蟲病原線蟲對大蠟螟的侵入率，作為線蟲質量檢測標準。結果(見表l)昆蟲組織培養基線蟲產量為對照豆粉培養基的1.52倍，培養周期由原來的22天縮短為16天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟的侵入率提高5.24%。表l蕪菁斯氏線蟲培養的對比試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2蕪菁斯氏線蟲培養的對比試驗重復實施例l、但進行下述修改將實施例l步驟l(2)中的中性蛋白酶lg改為酸性蛋白酶(北京奧博星公司)lg，酶解反應條件改為在55'C下進行水解反應30分鐘。結果(見表2)昆蟲組織培養線蟲產量為豆粉培養基的1.50倍，培養周期比豆粉培養基縮短了6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟的侵入率提高了6.10%。表2蕪菁斯氏線蟲培養的劉t比試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3蕪菁斯氏線蟲培養的對比試驗重復實施例l，但進行下述修改將實施例l步驟l(2)中的中性蛋白酶改為堿性蛋白酶(北京奧博星公司)0.5g，酶解反應條件為在5(TC下進行水解反應60分鐘；結果(見表3)昆蟲組織培養線蟲產量為對照豆粉培養基的1.58倍，培養周期比對照豆粉培養基縮短了6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟的侵入率提高了4.78%。表3蕪菁斯氏線蟲培養對比試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4小巻蛾斯氏線蟲(Ste&ememacar;7oca戸ae)培養的對比試驗重復實施例l，但進行下述修改將步驟l(1)中的大蠟螟末齡幼蟲質量改為黃粉蟲干粉320g;將步驟l(2)中的酶用量改為5g，酶解反應條件改為在45'C下進行水解反應60分鐘；將步驟3(2)中修改為接種小巻蛾斯氏線蟲(Sfe/"ememacfl^wca/M"e)的共生細菌(^Te"cWzaWw51"謡fl鄉fe7"51)。將步驟3(3)中修改為接種小巻蛾斯氏線蟲5fe/"er"emac^r/oca/wae;結果(見表4)昆蟲組織培養線蟲產量為對照豆粉培養基的2.26倍，培養周期比對照豆粉培養基縮短6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟的侵入率提高了9.78%。表4小巻蛾斯氏線蟲培養對比試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例5小巻蛾斯氏線蟲培養的對比試驗重復實施例4，但進行下述修改將其中的黃粉蟲干粉改為蛆干粉。結果(見表5)昆蟲組織培養線蟲產量為豆粉培養基的2.17倍，培養周期縮短6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟侵入率提高了10.56%。表5/」、巻蛾斯氏線蟲培養的對比試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例6小巻蛾斯氏線蟲5"te/wememaca/poca/waei咅養基的制備重復實施例5，但進行下述修改將其中的中性蛋白酶改為酸性蛋白酶5g(北京奧博星公司)，酶解反應條件改為在55"C下進行水解反應120分鐘。結果(見表6)昆蟲組織培養基線蟲產量為對照豆粉培養基的2.15倍，培養周期縮短6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟侵入率提高了9.50%。表6'」、巻蛾斯氏線蟲培養對比試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例7異小桿線蟲(//e/m^/za^/fe^rc&n'o//7ora)培養對比試驗重復實施例5，但進行下述修改將其中的黃粉蟲質量改為1600g;將其中的蛋白酶(北京奧博星公司)用量改為3g;將其中接種的共生細菌修改為接種異小桿線蟲的共生細菌(i^oto^Wc/附/"m/M^"m);將其中接種的線蟲修改為接種異小桿線蟲。結果(見表7)昆蟲組織培養線蟲產量為豆粉培養基的2.15倍，培養周期縮短4天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟侵入率提高了6.42%。表7異小桿線蟲培養對比試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例8異小桿線蟲(//efera^7flZ^to6ac^7'o//zoraJ培養對比試驗重復實施例7，但進行下述修改將其中的酶解反應條件改為在45'C下進行水解反應180分鐘；結果(見表8)昆蟲組織培養線蟲產量為豆粉培養基的2.10倍，培養周期縮短為18天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟侵入率提高了10.57%。表8異小桿線蟲培養對比試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權利要求1、一種昆蟲組織酶解物，其特征在于按照如下方法制備將昆蟲組織和水加入到勻漿器中，勻漿，再加入蛋白酶進行水解反應10～180min，然后過濾，棄殘渣，所得濾液即為昆蟲組織酶解物。2、按照權利要求l所述的昆蟲組織酶解物，其特征在于所添加蛋白酶的數量占昆蟲組織干物質重的重量百分比為0.520%。3、按照權利要求1或2所述的昆蟲組織酶解物，其特征在于所述的蛋白酶是指酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶或胰蛋白酶之一種。4、按照權利要求3所述的昆蟲組織酶解物，其特征在于所述的昆蟲組織是指昆蟲組織干粉或活體昆蟲。5、按照權利要求4所述的昆蟲組織酶解物，其特征在于所述的昆蟲是小木蠹蛾、蠅蛆、蠶蛹、玉米螟、大蠟螟、菜青蟲、米蛾、棉鈴蟲、黃粉蟲或桃小食心蟲之一種。6、權利要求1所述的昆蟲組織酶解物在昆蟲病原線蟲人工培養上的應用。7、按照權利要求6所述的應用，其特征在于所述的應用是指將昆蟲組織酶解物作為昆蟲病原線蟲培養基的組份。8、按照權利要求6所述的應用，其特征在于所述的昆蟲病原線蟲是指蕪菁斯氏線蟲、小巻蛾斯氏線蟲、格氏斯氏線逸、大異小枉線蟲或嗜菌異小桿線蟲。9、含有權利要求15任一所述的昆蟲組織酶解物的昆蟲病原線蟲培養基，按照如下方法制備在昆蟲病原線蟲培養基中加入昆蟲組織酶解物，混勻后高壓滅菌；所添加的昆蟲組織酶解物的數量為勻漿前昆蟲組織干物質重與培養基的質量比為1:2.5250。10、按照權利要求9所述的昆蟲病原線蟲培養基，其特征在于所述的昆蟲病原線蟲培養基是指人工培養線蟲的固體培養基或液體培養基。全文摘要本發明公開了一種昆蟲組織酶解物，主要是利用蛋白酶對昆蟲組織進行水解，然后過濾，所得濾液即為昆蟲組織酶解物。本發明還公開了昆蟲組織酶解物在人工培養病原線蟲上的應用，即將昆蟲酶解物作為組份加入到常規培養基中，混勻滅菌即可。利用本發明昆蟲組織酶解物配制的培養基培養的線蟲產量高、培養周期短、線蟲毒力強、生產成本低；收獲線蟲更清潔，簡化了收獲程序，降低了線蟲貯存期污染的幾率；操作簡便易行，適于線蟲的大規模生產。文檔編號A23K1/18GK101411405SQ20081022728公開日2009年4月22日申請日期2008年11月26日優先權日2008年11月26日發明者倩劉,曹翠玲,王金利,恒簡申請人:中國農業大學