專利名稱：：誘導茄子小孢子形成胚狀體的方法及其專用培養基的制作方法
技術領域：
：本發明涉及植物細胞工程領域一種誘導茄子小孢子形成胚狀體的方法及其專用土廿養基。
背景技術：
：單倍體在遺傳育種中有重要的意義。目前獲得單倍體的一種主要手段是離體培養小孢子獲得單倍體植株。小孢子數量大，單個狀態體積小且形態均一，便于在人工控制條件下研究其生長、分化和遺傳轉化過程，如人工誘變花粉、染色體功能鑒定等，因而小孢子是很好的研究材料。離體誘導小孢子使植株隱性性狀容易表現，進而豐富了植株類型，同時還可以得到純合的單倍體和雙倍體，提供了多種遺傳分析材料，加速了育種進程。離體小孢子為單細胞，具有天然的分散性，數量巨大，易于獲得，加上小孢子胚胎發生和植株再生能力強，因而能用于胚胎的克隆和新基因型或突變體的大量快速繁殖。通過此法獲得的單倍體再進行加倍，獲得加倍單倍體群體(DH群體，doubled-haploidprogenies)。DH群體在遺傳上是純合的基因組，所以它是AFLP、RAPD、SSR等分子標記和基因圖譜的理想材料，可避免二倍體由于來自雙親的兩條染色體在DNA堿基分子堿基序列的細微差異，從而大大提高基因定位標圖的準確性。植物游離小孢子有單倍體細胞分裂形成胚狀體或愈傷組織，然后由胚狀體發育成小苗或誘導愈傷組織發育為植株兩種發育途徑。而胚狀體在其發生的最早階段就具有兩極性，即根端(胚根)和莖端(胚芽)，并且與母體細胞或外植體的維管束無直接連系，這與器官發生不同。由此說明胚狀體一開始就是一個完整植物的雛形，可通過根端或類似胚柄結構從外植體或愈傷組織中取得營養。也很容易從愈傷組織的表面脫離下來，在適宜條件下長成一株植物。在植物組織培養中，誘導胚狀體與誘導芽相比較，具有顯著的優點，一是數量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚狀體具有這些優點，所以在育種工作及園藝工作中，可用胚狀體作為特定的優良基因型個體的無性繁殖手段，同時在研究胚胎發育中也有很重要的理論意義。
發明內容本發明的一個目的是提供一種植物組織培養基。本發明所提供的植物組織培養基是在KM培養基中加入KT和葡萄糖，使KT在植物組織培養基中的終濃度為0.1-0.5mg/L、使葡萄糖在植物組織培養基中的終濃度為50-70g/L;所述植物組織培養基的溶劑為水；所述KM培養基中不含葡萄糖；所述植物組織培養基的pH為5.0-6.5。所述KT在植物組織培養基中的終濃度優選為0.5mg/L;所述葡萄糖在植物組織培養基中的終濃度優選為65g/L。本發明的另一個目的是提供一種誘導茄子小孢子形成胚狀體的方法。本發明所提供的誘導茄子小孢子形成胚狀體的方法，是將茄子小孢子接種到上述任一所述植物組織培養基，在25-28'C條件下進行暗培養得到胚狀體。所述小孢子可以是按如下方法得到的將花藥接種到預培養基中，在34-36"C條件下暗培養5-6天，然后從花藥中取出小孢子；所述預培養基的組成可以為在MS培養基中加入2，4-D、KT、維生素C、蔗糖和瓊脂，使其在所述預培養基中的終濃度分別為0.05-0.5mg/L、0.5-2mg/L、6-10mg/L、2-4%、5-10g/L;所述預培養基的pH值為5.5-7;所述MS培養基不含蔗糖和瓊脂；所述百分含量為質量百分含量。所述花藥可以取自花冠低于花萼l-2mm至花冠高于花萼l-2mm時期的花蕾。本發明的培養基成本低、培養效果好，利用本發明培養基進行茄子小孢子誘導的方法具有成胚率高、培養周期短的優點，將本發明培養基及小孢子誘導方法應用于茄子遺傳育種中，大大豐富了茄子的優良基因型個體，也會明顯縮短育種周期，不僅完善了茄子單倍體育種途徑，而且為茄科作物小孢子離體培養提供技術和理論依據，為加快我國茄果類蔬菜作物遺傳育種和遺傳研究提供可靠的技術支持。圖1a為膨大的小孢子。圖1b為小孢子第1次細胞分裂形成兩個均等的子細胞。圖1c為小孢子第1次細胞分裂形成兩個不均等的子細胞。圖1d為小孢子第2次分裂形成對稱的四細胞團。圖1e為小孢子第1次細胞分裂形成兩個不均等的子細胞。圖lf為細胞繼續進行對稱分裂形成多細胞團。.圖1g球型胚。圖1h為心型胚。圖1i魚雷型胚。圖1j子葉型胚。圖1k為子葉型胚。圖11為子葉型胚。具體實施方式本實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。實施例中所用的MS培養基的組成如表1所示表l、MS培養基組成(此培養基中不含瓊脂和蔗糖，使用時再加入)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例中所用的KM培養基的組成如表2所示:表2、KM培養基的組成(此培養基中不含葡萄糖，使用時再加入葡萄糖)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例1、綠抗茄子小孢子的誘導一、綠抗茄子小孢子的誘導(一)小孢子的分離.1、花蕾的選擇和采集采集在自然條件下生長健壯植株上的發育正常、無蟲蛀、無傷痕的綠抗茄子的花蕾，一般選盛花期的花蕾。通過鏡檢觀察小孢子的發育時期，選取單核中期和靠邊期的小孢子，對應的花蕾外部特征為花冠低于花萼1-2mi至花冠高于花萼1-2mm,萼片即將開裂前后，花藥一般為黃綠色。2、花藥的預培養(1)花蕾的消毒①用75%(體積百分含量)的酒精進行花蕾表面消毒，消毒時間為30sec;@用6.5%(質量百分含量)的次氯酸鈉溶液浸泡15min;③用無菌水洗滌3次，每次5min，然后用無菌紙吸干備用。(2)接種在超凈工作臺上，從消好毒的花蕾中輕輕剝取花藥接種于裝有預培養基的培養皿(①60mm)中，每培養皿接2個花蕾的花藥，每培養皿裝有8-10mL培養基。所述預培養基I的組成為在每升MS培養基中加入2,4-D、KT、維生素C、蔗糖和瓊脂，使其終濃度分別為0.2mg'L—'、lmg'L—'、8mgL—\3%(質量百分含量)、7gL—、所述預培養基的pH值為5.8;所述MS培養基不含蔗糖和瓊脂。采用高壓滅菌12rC下滅菌15-20min。(3)熱激處理將接種好的花藥放到暗培養箱內進行熱激處理，熱激溫度為36°C，處理時間為6天。小孢子脫分化發生測定將經過溫度預處理的花藥進行小孢子游離，每12個花藥游離到5mL無菌水中，在倒置顯微鏡下觀察(400X)，每皿選取3個視野，記錄每個視野中的小孢子總數和膨大小孢子的數目，脫分化小孢子發生率(％)=膨大小孢子數目/總的小孢子數目X100%。試驗結果表明，綠抗茄子品種小孢子發生脫分化率為6.39%。3、小孢子的游離和收集用無菌的鑷子從預培養過的花藥中選取無污染、無褐化且膨大的花藥，放到無菌的、裝有洗滌培養基的培養皿中。用無菌的解剖刀將花藥切成兩段，再輕輕擠壓花藥，以使小孢子從花藥中游離到洗滌培養基中。將上述含有小孢子的洗滌培養基經200目尼龍篩網過濾，收集濾液，將濾液于500rpm離心l-10min，去掉上清，沉淀再用洗滌培養基洗滌離心，重復3次，收集沉淀，得到綠抗小孢子，用于進行誘導實驗。其中，洗滌培養基的組成為在MS培養基中加入終濃度為30g/L的蔗糖；洗滌培養基的pH值為5.5-7。采用高壓滅菌115-12rC下滅菌15-20min。(二)用液體培養基i進行小孢子誘導1、小孢子誘導形成胚狀體本實驗中使用的液體培養基i為在KM培養基中加入KT和葡萄糖，得到液體培養基i，使KT在液體培養基i中的終濃度為0.5rag/L，使液體培養基i中的葡萄糖的終濃度為65mg/L;所述液體培養基i的pH為5.5;所述KM培養基的組成如表2所示。液體培養基i用0.22Wn—次性濾器過濾滅菌。將分離得到的小孢子用液體培養基i稀釋至4Xl()5個/mL(用血球計數板計數)，分裝到無菌培養皿(O60mm)中，每個培養皿裝5mL(每皿約2個花蕾的花藥)，用Parafilra膜封口。將培養皿放進培養盒內，在28"C、黑暗條件下進行靜止淺層暗培養，至胚狀體出現，其中每隔15-20天換一次新鮮的液體培養基i。在游離小孢子進行靜止培養時，通過倒置顯微鏡觀察茄子小孢子離體形態發生的過程，并統計胚狀體的數目，計算成胚率。實驗設3次重復，每次接種40個培養皿，共使用了約240個花蕾，結果表明，三次重復共獲得了12個胚，平均成胚率為5.0%±0.5(平均值士標準差)(成胚率=成胚數/總花蕾數)。結果表明茄子小孢子胚狀體的發生過程主要如下小孢子有絲分裂形成兩個均等的細胞而不分化為營養細胞和生殖細胞。這兩個均等的細胞在染色體上是和典型的營養細胞相似，他們繼續分裂，形成胚狀體。通過倒置顯微鏡可以觀察到膨大的小孢子(圖l:a)發生第l次細胞分裂，形成兩個均等的子細胞(圖l:b)，而后觀察到經過第2次分裂形成對稱的四細胞團(圖l:d)，之后細胞繼續進行對稱分裂形成多細胞團(圖1:f)，直至肉眼可見的球型胚、心型胚、魚雷型胚和子葉型胚(圖1:g，h,i，j，k，1)。同時也有個別小孢子的胚胎發生是通過小孢子的不均等分裂產生的(圖版l:C，e)。實驗結果還表明，小孢子胚狀體離體形態發生存在不同步性，即胚狀體形成的時間不一致，在倒置顯微鏡下可以觀察到有的小孢子已剛啟動分裂形成二細胞、有的己形成四細胞或多細胞，有的卻還未啟動分裂仍是一個大圓球細胞；在同一培養皿中肉眼可以觀察到球型胚、心型胚、魚雷型胚和子葉型胚，也說明了胚狀體發育的不同步性。二、綠抗茄子小孢子的誘導(一)小孢子的分離1、花蕾的選擇和采集方法與實驗一中所述相同。2、花藥的預培養(1)花蕾的消毒①用70%(體積百分含量)的酒精進行花蕾表面消毒，消毒時間為lmin;@用5.0%(質量百分含量)的次氯酸鈉溶液浸泡5min;③用無菌水洗滌3次，每次lmin，然后用無菌紙吸干備用。(2)接種在超凈工作臺上，從消好毒的花蕾中輕輕剝取花藥接種于裝有預培養基II的培養皿(O60mm)中，每培養皿接2個花蕾的花藥，每培養皿裝有8-lOmLi肯養基。所述預培養基II的組成為在每升MS培養基中加入2,4-D、KT、維生素C、蔗糖和瓊脂，使其終濃度分別為0.05mg/L、0.5mg/L、6mg/L、2%、5g/L;所述預培養基的pH值為5.5;所述MS培養基不含蔗糖和瓊脂；所述百分含量為質量百分含量。采用高壓滅菌121。C下滅菌15-20min。(3)熱激處理將接種好的花藥放到暗培養箱內進行熱激處理，熱激溫度為34。C,處理時間為5天。小孢子脫分化發生測定將經過溫度預處理的花藥進行小孢子游離，每12個花藥游離到5mL無菌水中，在倒置顯微鏡下觀察(400X)，每皿選取3個視野記錄視野中的小孢子總數和膨大小孢子的數，脫分化小孢子發生率(％)=膨大小孢子數/總的小孢子數X100。/0。試驗結果表明茄子品種綠抗小孢子發生脫分化率為6.0%。3、小孢子的游離和收集方法與實驗一中所述方法相同。(二)用液體培養基ii進行小孢子誘導1、小孢子誘導形成胚狀體用液體培養基ii進行小孢子誘導本實驗中使用的液體培養基ii為:在KM培養基中加入KT和葡萄糖，使其終濃度分別為O.1rag/L和50g/L;所述液體培養基i的pH為5.0;所述KM培養基的組成如表2所示。液體培養基ii用0.22Mm—次性濾器過濾滅菌。將分離得到的小孢子用液體培養基ii稀釋至4X105個/mL(用血球計數板計數)，分裝到無菌培養皿(①60mm)中，每個培養皿裝5mL(每皿約2個花蕾的花藥)，用Parafilm膜封口。將培養皿放進培養盒內，在25'C、黑暗條件下進行靜止淺層暗培養，至胚狀體出現，其中每隔15-20天換一次新鮮的液體培養基i。在游離小孢子進行靜止培養時，通過倒置顯微鏡觀察茄子小孢子離體形態發生的過程，統計胚狀體的數目，并統計成胚率。實驗設3次重復，每次接種40個培養皿，共使用了約240個花蕾，結果表明，三次重復共獲得了10個胚，平均成胚率為4.2%±0.5(平均值士標準差)(成胚率=成胚數/總花蕾數)。結果表明茄子小孢子胚狀體的發生過程與實驗一中所述相同，即小孢子有絲分裂形成兩個均等的細胞而不分化為營養細胞和生殖細胞，這兩個均等的細胞在染色體上是和典型的營養細胞相似，它們繼續分裂，形成胚狀體。同時也有個別小孢子的胚胎發生是通過小孢子的不均等分裂產生的。小孢子胚狀體離體形態發生也存在不同步性三、綠抗茄子小孢子的誘導(一)小孢子的分離1、花蕾的選擇和采集、花藥的預培養、小孢子的游離和收集的方法均與實驗一中所述相同。方法與實驗一中所述相同。2、花藥的預培養(1)花蕾的消毒①用75%(體積百分含量)的酒精進行花蕾表面消毒，消毒時間為3rain;用8.0%(質量百分含量)的次氯酸鈉溶液浸泡40min;③用無菌水洗滌3次，每次10min，然后用無菌紙吸干備用。(2)接種在超凈工作臺上，從消好毒的花蕾中輕輕剝取花藥接種于裝有預培養基III的培養皿(①60mm)中，每培養皿接2個花蕾的花藥，每培養皿裝有8-10mL培養基。所述預培養基III的組成為在每升MS培養基中加入2，4-D、KT、維生素C、蔗糖和瓊脂，使其終濃度分別為0.5mg/L、2mg/L、10mg/L、4%、10g/L;所述預培養基的pH值為7;所述MS培養基不含蔗糖和瓊脂；所述百分含量為質量百分含量。采用高壓滅菌12TC下滅菌15-20min。(3)熱激處理將接種好的花藥放到暗培養箱內進行熱激處理，熱激溫度為35°C，處理時間為6天。小孢子脫分化發生測定將經過溫度預處理的花藥進行小孢子游離，每12個花藥游離到5mL無菌水中，在倒置顯微鏡下觀察(400X),每皿選取3個視野記錄視野中的小孢子總數和膨大小孢子的數，脫分化小孢子發生率(％)=膨大小孢子數/總的小孢子數X10(F。。試驗結果表明茄子品種綠抗小孢子發生脫分化率為5.9%。3、小孢子的游離和收集方法與實驗一中所述方法相同。(二)用液體培養基iii進行小孢子誘導1、小孢子誘導形成胚狀體用液體培養基iii進行小孢子誘導本實驗中使用的液體培養基iii為在KM培養基中加入KT和葡萄糖，使其終濃度分別為0.5mg/L和70g/L;所述液體培養基i的pH為6.5;所述詣培養基的組成如表2所示。液體培養基iii用0.22Mm—次性濾器過濾滅菌。將分離得到的小孢子用液體培養基iii稀釋至4X105個/mL(用血球計數板計數)，分裝到無菌培養皿(①60mm)中，每個培養皿裝5mL(每皿約2個花蕾的花藥)，用Parafilm膜封口。將培養皿放進培養盒內，在27'C、黑暗條件下進行靜止淺層暗培養，至胚狀體出現，其中每隔15-20天換一次新鮮的液體培養基iii。在游離小孢子進行靜止培養時，通過倒置顯微鏡觀察茄子小孢子離體形態發生的過程，統計胚狀體的數目，并統計成胚率。實驗設3次重復，每次接種40個培養皿，共使用了約240個花蕾，結果表明，三次重復共獲得了9個胚，平均成胚率為3.8%±0.2(平均值士標準差)(成胚率=成胚數/總花蕾數)。結果表明茄子小孢子胚狀體的發生過程與實驗一中所述相同，即小孢子有絲分裂形成兩個均等的細胞而不分化為營養細胞和生殖細胞，這兩個均等的細胞在染色體上是和典型的營養細胞相似，它們繼續分裂，形成胚狀體。同時也有個別小孢子的胚胎發生是通過小孢子的不均等分裂產生的。小孢子胚狀體離體形態發生也存在不同步性實施例2、歐長箭茄子小孢子的誘導一、歐長箭茄子小孢子的誘導(一)小孢子的分離1、花蕾的選擇和采集采集在自然條件下生長健壯植株上的發育正常、無蟲蛀、無傷痕的歐長箭茄子的花蕾，一般選盛花期的花蕾。通過鏡檢觀察小孢子的發育時期，選取單核中期和靠邊期的小孢子，對應的花蕾外部特征為花冠低于花萼1-2mm至花冠高于花萼l-2iM，萼片即將開裂前后，花藥一般為黃綠色。2、花藥的預培養方法與實施例1中實驗一中所述一致。歐長箭茄子品種小孢子發生脫分化率為6.42%。3、小孢子的游離和收集方法與實施例1中實驗一中所述一致。(二)用液體培養基i進行小孢子誘導1、小孢子誘導形成胚狀體方法與實施例1中實驗一中所述一致。實驗設3次重復，每次接種40個培養皿，共使用了約240個花蕾，結果表明，三次重復共獲得了21個胚，平均成胚率為8.8%±0.5(平均值土標準差)(成胚率=成胚數/總花蕾數)。結果表明歐長箭茄子小孢子胚狀體的發生過程與實施例1中實驗一中所述一致，即小孢子有絲分裂形成兩個均等的細胞而不分化為營養細胞和生殖細胞，這兩個均等的細胞在染色體上是和典型的營養細胞相似，它們繼續分裂，形成胚狀體。同時也有個別小孢子的胚胎發生是通過小孢子的不均等分裂產生的。小孢子胚狀體離體形態發生也存在不同步性。二、歐長箭茄子小孢子的誘導(一)小孢子的分離1、花蕾的選擇和采集方法與實驗一中所述相同。2、花藥的預培養方法與實施例1中實驗二中所述相同。試驗結果表明茄子品種歐長箭小孢子發生脫分化率為6.1%。3、小孢子的游離和收集方法與實驗一中所述方法相同。(二)用液體培養基ii進行小孢子誘導1、小孢子誘導形成胚狀體方法與實施例1中實驗二中所述相同。實驗設3次重復，每次接種40個培養皿，共接種了使用了約240個花蕾，結果表明，三次重復共獲得了19個胚，平均成胚率為7.9%±0.5(平均值士標準差)(成胚率=成胚數/總花蕾數)。結果表明茄子小孢子胚狀體的發生過程與實施例l中實驗二中所述相同，即小孢子有絲分裂形成兩個均等的細胞而不分化為營養細胞和生殖細胞，這兩個均等的細胞在染色體上是和典型的營養細胞相似，它們繼續分裂，形成胚狀體。同時也有個別小孢子的胚胎發生是通過小孢子的不均等分裂產生的。小孢子胚狀體離體形態發生也存在不同步性。三、歐長箭茄子小孢子的誘導(一)小孢子的分離1、花蕾的選擇和采集方法與實施例1中實驗三中所述相同。2、花藥的預培養方法與實施例1中實驗三中所述相同。試驗結果表明茄子品種歐長箭小孢子發生脫分化率為6.0%。3、小孢子的游離和收集^方法與實施例1中實驗三中所述相同。(二)用液體培養基iii進行小孢子誘導方法與實施例1中實驗三中所述相同。實驗設3次重復，每次接種40個培養皿，共使用了約240個花蕾，結果表明，三次重復共獲得了17個胚，平均成胚率為7.1%±0.2(平均值土標準差)(成胚率=成胚數/總花蕾數)。結果表明茄子小孢子胚狀體的發生過程與實施例1中實驗三中所述相同，即小孢子有絲分裂形成兩個均等的細胞而不分化為營養細胞和生殖細胞，這兩個均等的細胞在染色體上是和典型的營養細胞相似，它們繼續分裂，形成胚狀體。同時也有個別小孢子的胚胎發生是通過小孢子的不均等分裂產生的。小孢子胚狀體離體形態發生也存在不同步性。權利要求1、一種植物組織培養基，在KM培養基中加入KT和葡萄糖，使KT在植物組織培養基中的終濃度為0.1-0.5mg/L、使葡萄糖在植物組織培養基中的終濃度為50-70g/L；所述植物組織培養基的溶劑為水；所述KM培養基中不含葡萄糖；所述植物組織培養基的pH為5.0-6.5。2、根據權利要求1所述的植物組織培養基，其特征在于所述KT在植物組織培養基中的終濃度為0.5mg/L;所述葡萄糖在植物組織培養基中的終濃度為65g/L。3、一種誘導茄子小孢子形成胚狀體的方法，是將茄子小孢子接種到權利要求1或2中所述植物組織培養基，在25-28'C條件下進行暗培養得到胚狀體。4、根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述小孢子是按如下方法得到的將花藥接種到預培養基中，在34-36'C條件下暗培養5-6天，然后從花藥中取出小孢子；所述預培養基的組成為在MS培養基中加入2，4-D、KT、維生素C、蔗糖和瓊脂，使其在所述預培養基中的終濃度分別為0.05-0.5mg/L、0.5-2mg/L、6-10mg/L、2-4%、5-10g/L;所述預培養基的pH值為5.5-7;所述MS培養基不含蔗糖和瓊脂；所述百分含量為質量百分含量。5、根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述花藥取自花冠低于花萼l-2mm至花冠高于花萼卜2ram時期的花蕾。全文摘要本發明涉及植物細胞工程領域一種誘導茄子小孢子形成胚狀體的方法及其專用培養基。本發明所提供的誘導茄子小孢子形成胚狀體的方法，是將茄子小孢子接種到本發明培養基，在25-28℃條件下進行暗培養得到胚狀體。本發明的培養基成本低、培養效果好，利用本發明培養基進行茄子小孢子誘導的方法具有成胚率高、培養周期短的優點，將本發明培養基及小孢子誘導方法應用于茄子遺傳育種中，大大豐富了茄子的優良基因型個體，也會明顯縮短育種周期，不僅完善了茄子單倍體育種途徑，而且為茄科作物小孢子離體培養提供技術和理論依據，為加快我國茄果類蔬菜作物遺傳育種和遺傳研究提供可靠的技術支持。文檔編號A01H1/00GK101401550SQ20081022701公開日2009年4月8日申請日期2008年11月18日優先權日2008年11月18日發明者劉富中,孫振英,勇連,陳鈺輝申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所