專利名稱：：枯草芽孢桿菌dcy-1及在生物發酵中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于畜牧養殖
技術領域：
，具體地說本發明涉及一株分離的枯草芽孢桿菌菌株篩選及其在豬糞堆肥生產和發酵床中的應用。該方法適用于規模化養殖豬場畜禽糞污處理，屬于農業微生物應用
技術領域：
。
背景技術：
：由于規模化、集約化養殖業的迅猛發展，畜禽養殖環境污染演化成為嚴重的社會問題，并引起社會的高度重視與關注。堆肥作為一種保持良好環境效應的產物,具有生物處理的可持續性和廢棄資源的循環利用等特征，已被許多國家和地區所接受,成為處理有機固體廢物的有效方法之一。堆肥化的實質是微生物在適宜條件下代謝發酵的作用。堆肥技術可以實現豬場廢棄物的無害化、穩定化、減量化，因而被認為是有機固體廢棄物處理與利用的有效方法，但是傳統的天然堆肥不僅發酵效果不穩定，不徹底，而且有效的營養成分得不到充分發揮。微生態發酵床養豬技術是一種實現養豬生產糞尿的資源化利用和無害化處理的新方法，但是存在著微生物種類復雜，有害微生物難以控制等缺陷。因此尋找促進堆肥高溫高效發酵的微生物具有很重要的現實意義。國內外學者對堆肥微生物學進行了廣泛研究。堆肥微生物學研究對開發堆肥微生物資源，加速堆肥過程，縮短堆肥周期，提高堆肥質量等方面都具有重要意義。傳統培養分離微生物的方法是將定量樣品接種于培養基中,在一定的溫度下培養一定的時間，然后對生長的菌落計數和計算含量，并通過在顯微鏡下觀察其形態構造，結合培養分離過程生理生化特性的觀察鑒定種屬分類特性。馮明謙等(馮明謙,劉德明.滾筒式高溫堆肥中微生物種類數量的研究.中國環境科學.1999，19(6)490-492)研究了滾筒式高溫堆肥過程中微生物種類和數量,分離鑒定了細菌5個屬20株、霉菌8個屬13株、放線菌1個屬3株、酵母菌2個屬2株。結果表明,細菌和霉菌是堆肥過程中的優勢類群,其中芽孢桿菌和曲霉菌是優勢種。迄今為止尚未見到有關耐高溫的枯草芽孢桿菌的篩選及其在豬糞堆肥和發酵床中的應用的報道。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，針對現有豬糞堆肥發酵存在的缺陷和發酵床存在的缺陷，從豬糞堆肥中篩選出生長力旺盛的，耐高溫能夠加速堆肥發酵后熟進程的，縮短堆肥周期的微生物菌種及菌劑，利用該菌劑進行豬糞堆肥發酵生產和發酵床的應用，證明添加本發明的菌劑dcy-l后，豬糞堆肥提前到達髙溫發酵期，其堆制周期也明顯縮短。同時本發明菌劑dcy-l的應用也顯著提高了豬場發酵床的發酵溫度，有效殺死致病微生物，間接降低豬的發病率。本發明采用以下的技術方案實現從發酵堆肥的高溫期采集堆肥樣品，用蒸餾水稀釋，破碎后用不同篩選培養基進行分離培養和鑒定，得到一株耐高溫的枯草芽孢桿菌(6acL^"s幼力"7^J)dcy-1，該菌株已于2008年8月25日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCCNO:M208122。將本發明將分離的菌株dcy-116SrDNA序列用常用的細菌16SrDNA測序檢測(Alfreider，A.,Peters,S.，Tebbe，C.C.,Rangger，A.,Insam,H.，2002.Microbialcommunitydynamicsduringcompostingoforganicmatterasdeterminedby16SribosomalDNAanalysis.Compost.Sci.Util.10,303-312)，并將該dcy-l16SrDNA序列提交給美國生物信息學中心(NCBI)網站，獲得登錄號為FJ169903。經與GenBank已收錄的序列進行核苷酸同源性比對，發現本發明分離的菌株dcy-l16SrDNA序列的與已知序列的同源性達到〉98W,經鑒定，確定本發明分離的菌株為一株枯草芽孢桿菌，分類命名為Bacillussubtilis。本發明的枯草芽孢桿菌菌株dcy-1的菌學特征如下菌體大小為(0.6-1.0)咖x(1.5-2.0)咖，細胞呈桿狀，芽孢中生，革蘭氏染色呈陽性反應，能運動。在LB瓊脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落圓形、邊緣波狀、表面隆起、濕潤、色暗、起皺折。最適生長溫度為28'C，PH6-8均生長良好，最適生長pH為7.0-7.2。還原石蕊牛奶，水解酪素、淀粉，接觸酶陽性，在7")6的NaCl濃度中生長。該菌株按照常規甘油管保藏方法保藏。圖l:是本發明的技術流程圖圖2:是本發明的枯草芽孢桿菌菌劑dcy-1應用堆肥試驗中發酵溫度的變化曲線圖。本發明效果是1、本發明的菌劑明顯加快了豬糞堆肥的發酵速度，縮短了堆制周期，節約人力，降低了堆肥的成本。2、本發明菌劑提高了豬場發酵床的發酵溫度，有效殺死致病微生物，間接降低豬的發病率。更詳細的技術步驟見《具體實施方式》。具體實施例方式實施例l1、微生物的分離和培養l.l取樣稱取5g豬糞堆肥樣品(過孔徑lmm，即18號的篩孔)置于50mL燒杯中并加入玻璃珠，用量筒加25mL蒸餾水，置于搖床震蕩20min使樣品充分散開，并使微生物細胞分散，靜置。然后用沸水煮15min左右，以殺死其他微生物，使芽孢桿菌產生芽孢，得到含有芽孢桿菌的稀釋菌液。1.2稀釋菌液制備用1支無菌吸管吸取步驟(1)10—1稀釋菌液lmL移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓稀釋菌液充分混合，即成10—2稀釋菌液；再換用l支無菌吸管吸取10—2稀釋液1mL移入裝有9mL無菌水試管中，即成為10—3稀釋菌液。同理，分別制成10—4、10—5、l(T稀釋菌液，備用。1.3菌種的純化培養通過稀釋平板劃線分離法分離，制備平板(蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaCl5g/L,瓊脂粉15g/L，補充蒸餾水至1L，調pH值至7.0)，將制備好的平板于12rC高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后將步驟1.2所稀釋的菌液接種到滅菌后的平板上劃線培養，培養溫度30。C，培養時間12h。1.4挑選生長旺盛的菌種在牛肉膏蛋白胨培養基(配方同上述步驟1.3，但不加瓊脂)中擴大培養，得到純的芽孢菌液。2、菌株的16sRNA鑒定2.1、芽孢桿菌染色體DNA的提取和純化2.1.1收集菌體取1.5mL上述一中步驟1.4的芽孢菌液，在12000rpm下離心lmin。2.1.2倒出培養液，加入lmLTES溶液(稱取242gTris堿溶于750mL雙蒸水中，加入57.lmLHAC、lOOmLO.5MEDTA(pH8.0)，加水定容至1000mL)洗滌。2.1.312000rpm離心lmin收集菌體，倒出培養液，加入300ulTES并混合均勻。2.1.4加溶菌酶(購自上海生工生物工程技術有限公司)至終濃度為150ug/mL，37。C水浴lh2h。2.1.5加入1/10體積的10%十二烷基磺酸鈉(SDS)(約50ul)，混勻，65。C水浴編n(觀察菌液此時應為透明)。2.1.6加入5MNaCl溶液到終濃度為1M(約100ul)。2.1.7加入等體積的苯酚/氯仿，振蕩，混勻(有些菌較粘稠，此時為鼻涕狀，用槍頭緩慢吸打，直至不粘稠為止)。2.1.812000rpm離心8min，取上清液400ul緩慢轉入另一離心管。2.1.9加200ul氯仿混勻，12000轉離心5min，取上清液300ul轉入另一離心管。2.1.10加入約250ul異丙醇，置倒數次，室溫下放置至少15min。2.1.1112000rpm離心5min(注意離心管在離心機孔中的方向以便知道DNA沉淀在離心管壁內那個部位)。2.1.12小心吸出全部液體，加入500ul70%的乙醇洗滌總DNA(浸泡即可，切勿打散DNA)。2.1.13盡量吸干離心管中管壁的液體，打開管蓋放其自然干燥。2.1.14加入100ul去離子水或低濃度TE(10mmol/LTrisCl(pH8.0)、lmmol/LEDTA(pH8.0))，121'C高壓蒸汽滅菌，溶解總DNA。2.2PCR擴增和瓊脂糖電泳以芽孢桿菌DNA為模版，采用芽孢桿菌16SrRNA基因通用引物，進行PCR擴增。反應體系和程序見表1和表2。表1PCR反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2PCR反應程序<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上游引物5，CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG3，下游引物5，CGACTTCACCCCMTCATCATCTG3，上述引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。通過PCR擴增出16SrDNA片段，經測序獲得目的基因序列。用美國生物信息學中心(NCBI)的BLAST程序對所初步獲得的菌種的16SrDNA序列進行登陸，獲得登錄號為FJ169903(GenBank(http:〃麗.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，與已收錄的序列進行核苷酸同源性比較。經過微生物學分類鑒定，確定該分離的菌株為枯草芽孢桿菌(&"W"s犯/7tih's)，我們將該菌株命名為枯草芽孢桿菌(fecL7"s幼6n'h's)dcy-1，該菌株已于2008年8月25日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCCN0:M208122。3、發酵培養將篩選得到的枯草芽孢桿菌株dcy-l接種到發酵培養基上(成分及配比蛋白胨10g/L、麩皮5g/L、NaCl5g/L、酵母提取物lg/L，補充蒸餾水至1L，調pH至7.0左右，于121°C高壓蒸汽滅菌20min)，在160rpm，30-33'C搖床上培養36h，得到生產上可以應用的液體菌劑，申請人將該菌劑命名為枯草芽孢桿菌菌劑dcy-l。顯而易見，申請人或其他本領域的其他人運用農業微生物常規操作方法如固體培養發酵方法制備出本發明所述的的固體菌劑。類似的方法可以參照華中農業大學的授權發明專利(專利號為ZL02147874.0,發明名稱凈化水質的枯草芽孢桿菌、菌劑及固體發酵工藝與應用)所介紹的方法生產出本發明所述的枯草芽孢桿菌固體菌劑dcy-l。4、堆肥發酵試驗按重量計將鮮豬糞300公斤(本身有一定的含水量)，稻殼糠100公斤，將液體菌劑dcy-l按5X。(重量計)的添加量加入到所述的培養物料中(必要時加適量的水)，調節物料的碳、氮比為25:1，調節堆肥的含水率為60%進行堆肥試驗。分別設置試驗組和對照組，實驗組加菌劑dcy-1(添加量為5%。，重量計算)，對照組不加菌劑dcy-1，堆制時間設為19天，按照常規檢驗方法檢測本發明菌劑的應用效果。5、堆肥指標的測定5.1溫度測定在堆肥的過程中，每天上午10時，下午3時左右對堆體溫度測定，記錄。5.2堆肥樣本pH值的測定稱取5g堆肥樣品(過18目篩)置于50mL燒杯中，用量筒加25mL蒸餾水，攪拌lmin(最好用磁力攪拌器)使樣品充分散開，放置lh(此時應避免空氣中有氨及揮發性酸)，然后以pHS—2型pH計測定pH值。5.3堆肥中大腸菌群值測定(參照中華人民共和國衛生部發布，中華人民共和國國家標準糞便無害化衛生標準(GB7959-1987)，北京，中國標準出版社，1988年2月版)5.3.1稱取10g發酵成熟的堆肥樣品，放于無菌的250raL帶玻璃珠的三角瓶內，加無菌水，使其體積為I00mL，即成為1:10的混懸液。5.3.2樣品稀釋用lmL滅菌吸管吸取l:10混懸液lmL，注入10mL滅菌水管內，制成1:100稀釋液，按同法依次稀釋，制成I:IOOO、1:10000稀釋液(每種稀釋液各換一支滅菌吸管)。初發酵試驗無菌操作，用lmL滅菌吸管吸取l:lO(相當O.19份樣品)、1:IOO(相當O.019'份樣品)、1:1000(相當0.0019份樣品)、l:10000(相當0.00019份樣品)稀釋液各lmL，分別接種于乳糖膽鹽發酵管內，每個稀釋液各用l支吸管。置44.5。C培養24土2h。5.3.3平板分離平板培養基使用伊紅美藍瓊脂培養基。伊紅美藍瓊脂平板內含有伊紅和美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發酵乳糖造成酸性環境時，菌體帶H+，故可染上酸性染料伊紅，又因伊紅與美藍結合成復合物，使大腸菌群產生帶核心的，有金屬光澤的深紫色(龍膽紫的紫色)陽性菌落。而產酸弱的菌株的菌落呈棕色。不發酵乳酸的菌落無色透明。5.3.4將產酸產氣或只產酸的發酵管接種于伊紅美藍瓊脂培養基上，然后放入37'C恒溫培養箱內，培養24h，挑選典型菌落(帶金屬光澤菌落)，進行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察。5.3.5復發酵試驗以上革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，需通過此試驗再進一步證實.將平皿中其余的另一半菌落接種于乳糖發酵管內，置44.5'C培養24h,原理與初發酵試驗相同，培養后產酸又產氣的，最后確定為大腸菌群陽性結果。5.3.6根據發酵管的陽性管數査表，即為糞大腸菌群菌值(參照中華人民共和國衛生部發布，中華人民共和國國家標準糞便無害化衛生標準，GB7959-1987;北京，中國標準出版社，1988年2月版)。5.4堆肥中蛔蟲卵死亡率測定取待檢樣品2g放入乳缽中，先加水10mL攪勻，再加飽和食鹽水50mL混勻后，吸取浸出液，注入改良McMaster'S計數板的計數室，置顯微鏡臺上，靜置lmin-2min，由于飽和食鹽水的比重大于蛔蟲卵的比重，當堆料與飽和食鹽水混合后，靜止，可使蛔蟲卵漂浮在溶液的表面，便于在顯微鏡下觀察。在顯微鏡下計數兩個刻度室中的蟲卵總數和活蟲卵數，兩個計數室蟲卵數的平均值A乘200，即為每g待檢樣品中的蟲卵數。6、生物發酵床試驗6.1生物發酵床的設計為了驗證本發明的枯草芽孢桿菌菌劑dcy-l在集約化(規模化)養豬豬舍生物發酵床(又稱欄圈墊料)中的應用效果，本實施例設計了如下的生物發酵床，所用材料及其配比如表3所示。表3、生物發酵床墊料材料選泰降及其配比(重量)原料谷殼鋸末鮮豬糞米糠本發明的菌劑dcy-l比例50%40%10%2kg/m3100g/m36.2采用逐級混合的方法，將所需的米糠與本發明的菌劑dcy-l混合拌勻。6.3按表3給出的量，將谷殼、鋸末、鮮豬糞、米糠與菌劑dcy-l混合物由下到上順序倒入發酵坑，用鏟車或人工將其反復翻堆充分混合攪拌均勻。邊翻堆攪拌邊噴灑水，調節水分，使墊料水分達到45%-50%(以外觀顯示濕潤但手握疏松不成團為度，注意水分不要過量)。6.4將攪拌混合均勻后的墊料堆積起來發酵。堆積好后表面鋪平，適當按壓，再用包裝袋覆蓋周圍保溫。墊料堆積發酵共10天，中間翻堆一次，以將表層墊料翻埋到深部發酵。6.5從第二天起，選擇墊料不同部位監測30cm處的溫度的變化。當溫度逐漸上升，第二天便可達到40。C，以后最高可達到7(TC左右，一周后又緩慢下降到40-45'C，溫度趨于穩定。實施結果8試驗組在堆制剛開始時，豬糞成褐色團塊，有很濃的臭味和蛆的存在，并吸引了大量的蚊蠅。24h后，堆體即發出一股強烈刺鼻刺眼的氨味。從第5天開始，氨味大大減弱，堆體僅有很淡的臭味。但取樣時，對堆體的翻動還是會引發很濃的氨味，此外，白色菌團已在堆體周邊范圍生長。至第9天時，蠅蛆完全消失，室內己完全聞不出氨味，揭開薄膜可見豬糞己成松散狀。第11天時，試驗的兩堆體四周最下部表面有蘑菇狀的菌絲生長。到第14天左右時，已變得疏松的豬糞有森林腐殖土的芳香味。而對照組與實驗組相比，直到第19天才達到腐熟標準。兩個堆體在堆制過程中，都經歷了升溫期、高溫期、降溫期三階段，它們的的高溫期分別維持在一周以上，但是達到高溫期的堆肥堆的時間有先有后，加有菌劑dcy-l的實驗堆在試驗的15天的發酵期中，第三天堆肥堆的溫度即上升到40°C以上，比對照組提前兩天，高溫期55。C以上維持12天，比對照組(不加菌劑dcy-1)提前5天。分析表明大腸桿菌和蛔蟲卵的殺滅率分別為0.58%、100%;0.63%、100%，達到了國家糞便無害化衛生標準。權利要求1、一株分離的適用于豬糞堆肥生產和生態發酵床的微生物菌株，其特征在于，該菌株為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dcy-1，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNOM208122。2、包含權利要求1所述的菌株的微生物菌劑。3、權利要求1所述的菌株在豬糞堆肥生產或生物發酵床中的應用。4、權利要求2所述的微生物菌劑在豬糞堆肥生產或生物發酵床中的應用。全文摘要本發明屬于畜牧養殖
技術領域：
，具體涉及一株分離的枯草芽孢桿菌菌株篩選及其在豬糞堆肥生產和生物發酵床中的應用。本發明也屬于農業微生物應用
技術領域：
和堆肥的制備
技術領域：
。通過分離、篩選和鑒定，獲得一株適用于豬糞堆肥生產和生態發酵床的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)dcy-1，該菌株保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNOM208122。將所述的菌株制成微生物菌劑，并成功地應用在豬糞堆肥生產和規模化養殖的生物發酵床中。本發明適用于規模化養殖豬場的畜禽糞污處理。文檔編號C05F17/00GK101525583SQ20081019701公開日2009年9月9日申請日期2008年9月18日優先權日2008年9月18日發明者方莉玉,亮武,石太莉,燕程,鄧昌彥,玲郭申請人:華中農業大學