一種從酵母細胞制備混合型核苷酸飼料添加劑的方法及應用的制作方法

專利名稱：一種從酵母細胞制備混合型核苷酸飼料添加劑的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以酵母細胞為原料制備出高含量單體核苷酸的飼料添加劑 并應用于動物飼料的方法，屬于酵母制備核苷酸及飼料添加劑技術領域。
背景技術：
酵母菌是一群以圓形或橢圓形的以出芽或分裂為主要繁殖方式的單細胞真 菌，具有典型的細胞結構，包括細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核。酵母細胞
是一個豐富的天然營養寶庫，蛋白質含量高達50%，核酸含量接近8%，此外還 含有大量的葡聚糖、甘露聚糖等免疫多糖和類脂、無機鹽、維生素等，極具開 發價值。
酵母菌作為單細胞微生物，具有繁殖快，易培養，產量大的特性。例如目 前我國的啤酒年產量已超過2300萬噸，現在仍以每年10%左右的速度遞增，啤 酒廢酵母是啤酒生產的副產物，其量約占啤酒產量的0.15% (干重)，據此計算， 我國每年有3.45萬噸(干重)啤酒廢酵母產生，急待開發和綜合利用。
核糖核酸RNA是重要的生物遺傳物質，是指導蛋白質合成的模板物質。核 酸RNA經來自麥芽根的5'-磷酸二酯酶定向酶解，可水解為腺苷酸(AMP)、鳥 苷酸(GMP)、尿苷酸(UMP)和胞苷酸(CMP)四種單體核苷酸。
迄今為止公開的以酵母菌體制取核苷酸的方法有許多種，如CN1370837公 開了用啤酒酵母為原料制取核苷酸的方法；CN1049521公開了利用酒廠廢酵母 生產5'-核苷酸的方法；CN13970779公開了一種從味精廢水中提取核苷酸的方 法，但是這些方法均是從酵母菌體中提取核苷酸精制產品(純度達99%以上)， 生產過程使用了柱吸附、分離等方法，工藝復雜，產品損失大，收率低，生產 成本很高。CN1864516公布了一種簡單且低成本地從酵母中制備核苷酸的方法， 但該專利制備得到的核苷酸制劑四種單體核苷酸的含量很低，僅為8% 24%， 含量很不穩定，且蛋白質含量高達50% 60%，該專利也未對這種制劑在飼料中 的添加方法和添加比例進行說明。
九十年代初，人們開始研究核苷酸在飼料上的應用。雖然大多數的生物體 都能自身從嘌呤和嘧啶合成核苷酸。但由于這種從頭合成和分段合成核苷酸在 代謝上是一個耗費代價的過程，尤其當機體處于特殊生理條件下，例如快速生 長期、肝功能障礙、或處于免疫應激時，內源核苷酸相對合成不足，不能滿足 代謝旺盛的器官和組織的需要，此時就需要來源于日糧的外源核苷酸加以補充。 研究結果表明日糧中額外地添加外源核苷酸，可以優化組織快速分化的功能。
4目前營養專家已將核苷酸稱作半必須營養物質，或條件營養物質。
核苷酸對于動物的生理和營養具有多種生理功效。詞料中添加核苷酸可促 進動物腸道的生長，增加腸道吸收面積，改善腸道功能，促進消化，控制下痢， 使動物能吸收更多的營養物質，提高飼料利用率。詞料中添加核苷酸能刺激動 物的特異性和非特異性免疫反應，通過增強動物的免疫系統而明顯地提高動物 的抗病能力和抗應激能力。由于核苷酸具有促進動物免疫功能的作用，因此目 前專家認為核苷酸是動物的有效免疫增強劑。肝臟是從頭合成核苷酸的主要器 官，添加核苷酸可促進肝臟蛋白質和脂肪的合成，促進肝的再生和受損肝的恢 復，肝損傷時補充核苷酸尤為必要。
到目前為止，國內對核苷酸用于動物飼料的研究論文很多，但將核苷酸用 作動物飼料添加劑，并明確提出使用方法和使用劑量的國內專利還沒有出現。
國外則早在2006年的美國專利US6987095中就報道，在魚飼料中添加一定濃度 的核苷酸，例如尿苷酸、鳥苷酸、胞苷酸、胸苷酸、腺苷酸或它們的混合物， 能促進腸道的發育，使得小腸絨毛的面積增加，從而有效地提高腸道對飼料和 詞料添加劑的吸收。

發明內容
本發明的目的是提出一種機械破壁與鹽法破壁相結合的方法，對酵母細胞 實現高效破壁，節省了鹽用量，提高了破壁率，提高了核酸提取收率(達到4%)。
本發明的另一目的是提供一種采用分步等電結晶技術從酵母細胞中提取出相 對純度較高的核酸RNA產品(含RNA》70。/c))的方法。
本發明的進一步目的是提出一種核酸RNA高效酶解方法，即在5'-磷酸二酯酶 液的制備過程中以及核酸RNA的7jC解過程中，加入酶激活劑、穩定劑、恢復劑與增 強劑，從而提高酶活力(達550U/mL)和酶解效率(》87%)。
本發明的更進一步目的是提供一種混合型核苷酸飼料添加劑在動物飼料中 的添加方法，包括添加方式、添加劑量、飼喂周期等。
本發明的技術方案 一種從酵母細胞制備混合型核苷酸飼料添加劑的方法， 制備工藝過程如下
(1) 破壁采用均質破壁與鹽法破壁相結合的方法，將酵母混入水中，用高
壓均質機在30 40Mpa壓力下均質破壁2 3次；然后加入固體食鹽，溶解，配 制成含10%干重計酵母細胞、3% 6%NaCl的酵母乳液；
將酵母乳液置于反應釜中，通過蒸汽加熱迅速升溫至95°C 100°C;
在95。C 100。C條件下攪拌保溫2 5小時后，冷卻至室溫；
(2) 分離將上述反應液離心分離(7000轉/分)，固體物為脫核酸酵母，富含
酵母葡聚糖及甘露聚糖的細胞壁和不溶性的蛋白質；
(3) 等電結晶母液用鹽酸調節pH5.0 6.0，室溫結晶后，離心分離(7000轉/分)，固型物為變性后的蛋白質和其他不溶性物質；剩下的母液繼續用鹽酸調 節pH3.0 4.0，室溫結晶，離心分離(7000轉/分)，固型物為變性后的蛋白質和 其他不溶性物質；
最后的母液進一步用鹽酸調節pH1.0 2.5，室溫結晶，離心分離(7000轉/分)， 固型物為核糖核酸RNA濕粗品;將濕粗品9(TC烘干，粉碎，烘干物含70G/。核酸RNA; 相當于國家規定的合格品核酸。
(4) 制酶麥芽根經粉碎、過篩、浸泡、離心，獲得5'-磷酸二酯酶酶液；
(5) 酶解將制備得到的核酸RNA溶于水中，按照每克核酸加入3000 6000U 5'-磷酸二酯酶，進行定向酶解，70'C攪拌1 3小時后，迅速升溫至90'C滅酶；
(6) 干燥將上述酶水解液直接噴霧干燥，粉碎，篩分，獲得含量超過60% 的四種單體核苷酸AMP、 GMP、 CMP、 UMP的混合型核苷酸飼料添加劑。
用所述方法制備的混合型核苷酸飼料添加劑用于動物詞料的添加方法，以 含量超過60%的單體核苷酸的混合型核苷酸為詞料添加劑原料，其添加方法如 下
將所述添加劑與水產飼料相混合，添加比例為占總質量的0.01% 0.05%， 然后經熟化、調質、制粒、干燥，制備成專門的顆粒型水產詞料。在水產動物 早期生長階段使用，或者在水產動物處于應激狀態時使用，也可以作為免疫增 強劑在水產動物的整個生長階段中使用。
或將所述添加劑與畜禽飼料相混合，添加比例為占總質量的0.02% 0.09%， 混合均勻后，制備成專門的畜禽詞料。在畜禽動物早期生長階段使用，或者在 畜禽動物處于應激狀態時使用，也可以作為免疫增強劑在畜禽動物的整個生長 階段中使用。
所使用的酵母原料選用啤酒廢酵母、面包酵母、產朊假絲酵母、熱帶假絲 酵母、園擬酵母、球擬酵母或釀酒酵母。
所述的制酶步驟麥芽根浸泡液中加入了 MgS04、 NaCL和ZnS04三種無機 鹽，加入濃度分別為0.1M 0.3M、 0.1M 0.3M、和1(T2M 1(T4M,從而獲得酶 活達到550U/mL的高活性5'-磷酸二酯酶液。
在酶解步驟中5'-磷酸二酯酶液酶解核酸RNA時，在反應液中加入了 5'-磷酸二酯酶的激活劑MgS04，添加濃度為0.1M 0.3M，同時加入能提高5'-磷 酸二酯酶熱穩定性和酶活力的ZnS04，添加濃度為l(T2M l(r4M,從而使核酸 RNA的酶解率達到87%以上。
加了添加劑后所制備的水產飼料適用于魚飼料、蝦飼料、蟹飼料及所有類型的 水產飼料。
加了添加劑后所制備的畜禽飼料中的添加比例為0.02% 0.08%，該比例適 用于雞飼料、豬飼料等類型的畜禽動物飼料；對于牛、羊等反臼類動物飼料，
6該比例提高為0.05% 0.09%。
本發明使用的NaCl為普通的食用鹽，使用的鹽酸為食用級鹽酸。 本發明使用的麥芽根可以是啤酒企業的廢棄麥芽根，也可以是麥芽生產企
業生產麥芽過程中的廢棄麥芽根。
本發明使用的MgS04、 NaCL和ZnS04均為分析純級別。 本發明使用的噴霧干燥法，操作工藝參數如下進料物質的干物質含量在
25% 30%左右，進風溫度140°C 150°C，塔體出風溫度控制在95°C以上，干
燥后成品含水量5% 6%，必須用刮板式真空蒸氣機濃縮。
本發明通過分步等電結晶法，盡可能高效率地去除了蛋白質、肽類和其他
雜質，獲得了相對純度較高的核酸產品(含RNA超過70y。)。
在5 '-磷酸二酯酶液制備工藝和核酸RNA酶解工藝中，本發明使用了
MgS04、 NaCl和ZnS04等無機鹽，MgS04是5'-磷酸二酯酶的激活劑；而NaCl
和ZnS04是5'-磷酸二酯酶的熱穩定劑，同時也是酶活力的恢復劑與增強劑。通
過使用這些無機鹽使本發明制備得到的5 '-磷酸二酯酶活力高達550U/mL單位，
對RNA的水解效率達到87%以上，最后獲得的混合型核苷酸產品四種單體核苷
酸含量超過60%。
本發明的混合型核苷酸添加劑因含有較高的四種單體核苷酸(AMP、 GMP、 UMP、 CMP)，總含量達到60%以上，可以作為幼畜、幼禽、奶牛、魚、蟲下、蟹 和其他水產養殖動物的詞料添加劑。起到促進動物腸道發育、促進動物生長、 提高飼料利用率、增強動物免疫功能，提高動物抗病能力、抗應激能力等多種 生理功效。同時本發明產品中含有的單體鳥苷酸(GMP)還具有增強詞料鮮味 的功能，對動物能起到一定的誘食效果。
本發明的創新點
① 本發明以酵母細胞為原料生產核苷酸飼料添加劑，酵母是2003年國家明 文規定的可用作飼料原料的微生物，本發明使用的原料來源廣泛，生產工藝無 毒無污染，所生產的核苷酸產品是一種高效綠色安全的詞料添加劑。
② 本發明采用機械破壁(均質法)和鹽法破壁相結合的方法，與單一的鹽 法破壁相比，減少了鹽用量，提高了破壁率，提高了核酸RNA提取收率(達到 4%左右)。
③ 本發明采用分步等電結晶技術，盡可能分離出變性后不溶于水的蛋白質、 多肽和其他雜質，從而獲得純度較高的核酸產品，產品核酸RNA的純度達70。/。 以上。
④ 本發明在5 '-磷酸二酯酶制備工藝和RNA酶解工藝中，加入酶激活劑、 熱穩定劑、恢復劑與增強劑等無機鹽，酶活力高達550U/mL單位，酶解效率高 達87%以上，最后獲得的添加劑產品四種單體核苷酸含量超過60%。⑤ 由于采用了創新技術②、③和④，使本發明產品的生產成本大幅度降低， 從而顯著降低了在飼料中的添加成本。
⑥ 由于采用了創新技術②、③和④，使本發明產品四種單體核苷酸含量較
高(60%以上)，雜質含量較低，從而便于飼料組方的設計，降低綜合成本。
⑦ 本發明在國內首次對核苷酸用作動物飼料添加劑，明確提出使用方法和 使用劑量。
我國是一個農業大國，也是一個養殖業大國。我國的養殖技術經歷了由粗 放型養殖到高密度集約化工廠化養殖的過程。近年來，集約化高密度養殖規模 日益擴大，使得養殖動物產量大幅度提高。但這種養殖方式帶來的弊端是養殖 環境日益惡化，動物免疫力下降、抗病能力下降、抗應激反應能力下降、環境 耐受性降低，為了解決這些問題，人們就大量使用濫用各種抗生素和化學藥物。 為了加速動物的生長，提高飼料報酬，人們在飼料中大量使用各種生長激素。 這樣做的后果是導致這些藥物在動物體內大量殘留和蓄積，不僅嚴重影響了動 物產品的質量和食用安全，危害消費者健康，同時也會污染生態環境。
當前國內外高度重視食品的安全性，人們對環境保護的意識空前加強，因 此研發以養殖生態環境保護、提供食用安全、有營養的綠色食品為前提的高效 安全養殖技術，從養殖源頭上消除動物產品食用安全問題十分必要。尤其是開 發能替代抗菌素、生長激素等影響動物產品安全的物質，具有促進動物生長、 提高動物免疫力、減少環境污染和無殘留作用的新型安全高效和綠色環保的飼 料添加劑，成為當前飼料領域的研究熱點和研究方向。
采用本發明工藝生產出來的混合型核苷酸添加劑屬天然物質，不受動物排 斥，不引起任何毒副作用，是一種綠色安全的產品，具有安全高效的特點。將 其用于動物養殖飼料中，能較好地解決上述國內養殖業面臨的諸多問題。
本發明工藝簡單，原料便宜，酶解效率高，生產成本低，產品純度高，產 品功效顯著，具有實現產業化的條件，市場前景廣闊。
具體實施例方式
實施例1
1、 將啤酒廢酵母用水攪拌均勻，過80目篩，沉降并去除上層清液、沉淀 用水洗滌兩次，離心(7000轉/分)，固型物為純度較高的廢酵母菌體。
2、 纟S1予M理的啤酒廢酵母MA/JC中，用高壓均^m在35Mpa壓力下禾/1^ 2 次，然后加入固體食鹽，溶解，酉己制成含10%酵母細胞(干重)、5%NaCl的酵職浮液。
3、 反應釜中通蒸汽夾套加熱，將酵母乳液迅速升溫至95'C 10(TC。
4、 在95'C 10(TC條件下攪拌保溫4小時后，夾套通冷卻水冷卻至室溫。
5、 將上述反應液離心分離(7000轉/分)，固體物為脫核酸酵母，主要為細胞 壁(富含酵母葡聚糖、甘露聚糖等)和不溶性的蛋白質。
86、 母液用鹽酸調節pH5.0左右，室溫結晶，離心分離(7000轉/分)，固型物 為變性后的蛋白質和其他不溶性物質。
7、 剩下的母液繼續用鹽酸調節pH3.0左右，室溫結晶，離心分離(7000轉/ 分)，固型物為變性后的蛋白質和其他不溶性物質。
8、 最后的母液進一步用鹽酸調節pH2.2左右，室溫結晶，離心分離(7000轉/ 分)，固型物為核糖核酸RNA濕粗品。將濕粗品90'C烘干，粉碎，獲得核酸RNA 產品(含RNA71。/。)，相當于國家規定的合格品核酸。
9、 麥芽根粉碎、過80目篩、4'C水浸泡一整液(水中預先分別加入0.2M MgS04、 0.2MNaCl、和1(T3M的ZnS04)，離心(4000轉/分)，上清液70。C水浴 5 10分鐘滅雜酶，最后得到的溶液為5'-磷酸二酯酶酶液，測定酶活力達 550U/mL單位。
10、 將制備得到的核酸RNA溶于水中，按照每克核酸RNA加入4000U的 5 '-磷酸二酯酶，再分別補加入MgS04和ZnS04，使其終濃度分別為0.2M和 10—3M，然后70'C水浴攪拌反應2小時，測定酶解率達到87.2%。反應結束后迅 速升溫至9(TC滅酶。
11、 將上述酶水解液直接噴霧干燥，干燥工藝條件為進料固型物濃度25% 30%左右，進風溫度140'C 15(TC，塔體出風溫度控制在95'C以上，干燥后成 品含水量5% 6%，用刮板式真空蒸氣機濃縮。
12、 產品粉碎，過80目篩，獲得含有四種單體核苷酸AMP、 GMP、 CMP、 UMP (含量60.9%)的混合型核苷酸飼料添加劑。
實施例2
1、 將含單體核苷酸60.9%的混合型核苷酸添加劑與水產詞料相混合，添加 比例為0.03% (干重)，然后經熟化、調質、制粒、干燥，制備成專門的顆粒型 水產飼料；在水產動物早期生長階段使用，或者在水產動物處于應激狀態時使 用，也可以作為免疫增強劑在水產動物的整個生長階段中使用。每天分3次投 喂，早、中、晚各一次。對于蝦類投喂時間2個月；對于魚類投喂時間可以從3 周 17周， 一般選擇5周 8周。
2、 將含單體核苷酸60.9%的混合型核苷酸添加劑與畜禽飼料相混合，對于 雞詞料、豬飼料，添加比例為0.02% 0.08% (干重)；對于牛飼料、羊詞料等反 臼類動物詞料，添加比例提高為0.05% 0.09% (干重)。混合均勻后，制備成專 門的畜禽動物飼料。在動物早期生長階段使用，或者在動物處于應激狀態時使 用，也可以作為免疫增強劑在動物的整個生長階段中使用。每天分3次投喂， 早、中、晚各一次。根據動物的生長情況和攝食情況，確定投喂的時間長度。
權利要求
1、一種從酵母細胞制備混合型核苷酸飼料添加劑的方法，其特征是制備工藝過程如下(1)破壁采用均質破壁與鹽法破壁相結合的方法，將酵母混入水中，用高壓均質機在30～40Mpa壓力下均質破壁2～3次；然后加入固體食鹽，溶解，配制成含10％干重計酵母細胞、3％～6％NaCl的酵母乳液；將酵母乳液置于反應釜中，通過蒸汽加熱迅速升溫至95℃～100℃；在95℃～100℃條件下攪拌保溫2～5小時后，冷卻至室溫；(2)分離將上述反應液離心分離，固體物為脫核酸酵母，富含酵母葡聚糖及甘露聚糖的細胞壁和不溶性的蛋白質；(3)等電結晶母液用鹽酸調節pH5.0～6.0，室溫結晶后，離心分離，固型物為變性后的蛋白質和其他不溶性物質；剩下的母液繼續用鹽酸調節pH3.0～4.0，室溫結晶，離心分離，固型物為變性后的蛋白質和其他不溶性物質；最后的母液進一步用鹽酸調節pH1.0～2.5，室溫結晶，離心分離，固型物為核糖核酸RNA濕粗品；將濕粗品烘干，粉碎，烘干物含70％核酸RNA；(4)制酶麥芽根經粉碎、過篩、浸泡、離心，獲得5’-磷酸二酯酶酶液；(5)酶解將制備得到的核酸RNA溶于水中，按照每克核酸加入3000～6000U5’-磷酸二酯酶，進行定向酶解，70℃攪拌1～3小時后，迅速升溫至90℃滅酶；(6)干燥將上述酶水解液直接噴霧干燥，粉碎，篩分，獲得含量超過60％的四種單體核苷酸AMP、GMP、CMP、UMP的混合型核苷酸飼料添加劑。
2、 根據權利要求1所述的從酵母細胞制備混合型核苷酸飼料添加劑的方法， 其特征在于步驟(l)所使用的酵母原料選用啤酒廢酵母、面包酵母、產朊假絲酵 母、熱帶假絲酵母、園擬酵母、球擬酵母或釀酒酵母。
3、 根據權利要求1所述的從酵母細胞制備混合型核苷酸詞料添加劑的方法， 其特征在于制酶步驟麥芽根浸泡液中加入了MgS04、NaCl和ZnS04三種無機鹽， 加入濃度分別為0.1M 0.3M、 0.1M 0.3M、和1(T2M 10_4M，從而獲得酶活達 到550U/mL的高活性5'-磷酸二酯酶液。
4、 根據權利要求1所述的從酵母細胞制備混合型核苷酸飼料添加劑的方法， 其特征在于酶解步驟中5'-磷酸二酯酶液酶解核酸RNA時，在反應液中加入了 5'-磷酸二酯酶的激活劑MgS04，添加濃度為0.1M 0.3M，同時加入能提高5'-磷酸二酯酶熱穩定性和酶活力的ZnS04，添加濃度為10—2M 10-4M，從而使核 酸RNA的酶解率達到了 87%以上。
5、 用權利要求1所述方法制備的混合型核苷酸飼料添加劑用于動物飼料的 添加方法，其特征是以含量超過60%的單體核苷酸的混合型核苷酸為飼料添加劑原料，其添加方法如下將所述添加劑與水產飼料相混合，添加比例為占總質量的0.01% 0.05%， 然后經熟化、調質、制粒、干燥，制備成專門的顆粒型水產飼料。或將所述添加劑與畜禽飼料相混合，添加比例為占總質量的0.02% 0.09%， 混合均勻后，制備成專門的畜禽詞料。
6、 根據權利要求5所述的將混合型核苷酸詞料添加劑用于動物飼料的添加方 法，其特征在于加了添加劑后所制備的水產飼料適用于魚飼料、蝦飼料、蟹飼料及 所有類型的水產飼料。
7、 根據權利要求5所述的將混合型核苷酸詞料添加劑用于動物飼料的方法， 其特征在于加了添加劑后所制備的畜禽飼料中的添加比例為0.02% 0.08%，該 比例適用于雞飼料、豬飼料等類型的畜禽動物飼料；對于牛、羊等反臼類動物 飼料，該比例提高為0.05% 0.09%。
全文摘要
一種從酵母細胞制備混合型核苷酸飼料添加劑的方法及應用，屬于酵母制備核苷酸及飼料添加劑技術領域。本發明以酵母細胞為原料，采用均質和鹽法相結合的方法對細胞進行高效破壁處理；通過離心、分步等電結晶分離出細胞壁、蛋白質和其他不溶性物質；專門收集特定等電點時的核酸RNA沉淀，獲得70％純度的核酸濕粗品；將該核酸濕粗品溶于水后，用來自麥芽根的高活力磷酸二酯酶進行高效定向酶解反應，酶解結束后直接噴霧干燥、粉碎，獲得含量超過60％的四種單體核苷酸(AMP、GMP、CMP、UMP)、蛋白含量低于10％的混合型核苷酸飼料添加劑產品。將這種飼料添加劑用于動物飼料，能顯著改善動物腸道吸收功能，促進動物生長，提高免疫功能、抗病能力和抗應激能力。
文檔編號A23K1/16GK101480220SQ200810195178
公開日2009年7月15日 申請日期2008年11月7日 優先權日2008年11月7日
發明者進 葉, 張一平, 張南偉, 靖 李, 秦海萍, 諸建國, 駿 謝 申請人:江蘇省蘇微微生物研究有限公司;常州市武進得康生物技術有限公司;中國水產科學研究院淡水漁業研究中心