專利名稱：：落羽杉離體快速繁殖方法
技術領域：
：本發明涉及一種植物的組織培養方法，尤其涉及落羽杉(rs;ra力'鵬力;"c力順)成熟胚離體快速繁殖方法，屬于植物組織培養領域。
背景技術：
：落羽杉屬(&;ra力'順yic力.)有三個樹種，S卩落羽杉、池杉和墨西哥落羽杉；其中，落羽杉(rs;ro心"http://7Ai"c力哪)是古老的"孑遺植物"，在晚侏羅世至早白堊紀就已繁盛，第四紀冰川以后在歐亞大陸全部滅絕，僅在北美洲和拉丁美洲部分地區保留并繁衍至今。從樹木形態、生物學特性看，落羽杉是高大喬木，冠形雄偉秀麗，枝葉繁茂，落葉期遲，常年景觀優美，很適合作景觀綠化之用。同時落羽杉主干明顯，從基部到頂部不分叉，圓滿通直，出材率高，材質優良，在美國有"永不腐朽之木"的稱號，為優質的用材造林樹種。落羽杉原分布區在美國東部至東南部，范圍跨度大，氣候從亞熱帶至溫帶，且長期處于沼澤地帶，根系發達，在低、濕地帶干基部形成不規則板根狀，68齡時即會在根部向上長出"根膝"，有呼吸、通氣、固著和貯藏養分等作用，具有很強的耐低溫、耐水淹、耐干旱、耐瘠薄能力，同時具有很強的抗污染和抗病蟲害的能力。落羽杉屬樹種因其適應性強，生長快，樹形美，材質優良，病蟲害少，可在我國(北緯40°)以南廣大地區作生態環境建設、用材綠化造林，江湖灘地，江河上、中游水源涵養等均可采用。目前，對于落羽杉的引種較少，對其種源變異、優良種源及無性系的選育等，尚未見報道(汪企明等，落羽杉屬種源研究種子和苗期變異.江蘇林業科技，1993，(1)，1-4，3)。植物組織培養技術是利用細胞的全能性，采取植物體上的細胞團或一塊組織，通過人為條件的控制，使這些組織形成千百萬植株，并且保存了母本的全部優良性狀，且遺傳性狀穩定。這種方法可在短期內形成大量優良試管苗，進行規模化、工廠化生產。許秀玉等公開了一種墨西哥落羽杉離體培養及再生體系的建立方法，該方法以墨西哥落羽杉的幼苗為外植體，依次經過不定芽的誘導、伸長、增殖培養，壯苗的培養，不定根的誘導培養，再生植株形成和煉苗移栽等步驟，該方法的生根率可達78%，但移栽成活率比較低，約20%左右(許秀玉等，墨西哥落羽杉離體培養及再生體系的建立.林業科學，2007年10月，第43巻第10期)。迄今為止，有關落羽杉的離體快速繁殖方法尚未見報道。建立一種落羽杉的離體快速繁殖方法對于優良種源快速選育、遺傳改良以及工廠化生產優質的無菌苗等方面均具有重要的意義。
發明內容本發明目的在于提供一種落羽杉的離體快速繁殖方法，該方法可以在短期內形成大量優良落羽杉試管苗，可進行規模化、工廠化生產。本發明的技術方案是通過以下技術方案來實現的--種落羽杉的離體快速繁殖方法，包括以下歩驟(1)、將落羽杉的種子消毒后取其成熟胚作為外植體；(2)、將成熟胚接種到不定芽誘導培養基上進行誘導培養；(3)、將巳分化出不定芽的胚外植體完整地繼代于不定芽伸長培養基上進行培養，誘導不定芽伸長；(4)、將步驟(3)所培養的不定芽單個切下后轉入不定芽增殖培養基上進行不定芽增殖培養；(5)、將具有明顯主莖的小芽苗轉移至壯苗培養基中進行壯苗培養；(6)、將經過壯苗培養的芽苗轉至不定根誘導培養基上誘導培養不定根的發生；(7)、將形成不定根后的芽苗轉至再生植株培養基上進行再生培養；(8)、煉苗移栽，即得。其中，上述離體快速繁殖方法中，歩驟(2)中所述的不定芽誘導培養基為SH基本培養基+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;步驟(3)中所述的不定芽伸長培養基為大量元素減半的1/2SH基本培養基+6-芐氨基嘌呤(6-BA)5-6毫克/升+吲哚丁酸(IBA)5-6毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，其pH值為為5.8;歩驟(4)中所述的不定芽增殖培養基為SH基本培養基+6-BA10-20毫克/升+IBA2-5毫克/升+萘乙酸(NAA)2-5毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂3.25_6.5克/升，該培養基為半固態，其PH值為5.8;所述的不定芽增殖培養基優選為SH基本培養基+6-BA10毫克/升+IBA2毫克/升+NAA2毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂3.25克/升，該培養基為半固態，其pH值為5.8;步驟(5)中所述的壯苗培養基為SH基本培養基+活性炭l克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;所述的壯苗培養基優選為SH基本培養基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升+硝酸銀8.0毫克/升，pH值為5.8;步驟(6)中所述不定根誘導培養基為大量元素減半的1/2SH基本培養基+IBA20-25毫克/升+活性炭1克/升+蔗糖20克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;步驟(7)中所述再生植株培養基為SH基本培養基+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8。為了達到更好的技術效果，在將成熟胚接種到不定芽的誘導培養基上進行誘導培養之前，可將成熟胚按照以下方法進行預處理，即將成熟胚在附加生長調節劑6-BA8-10毫克/升的SH液體培養基浸泡處理成熟胚8-36小時，優選為24小時；由于胚在萌發初期對營養的吸收是由子葉進行的，而在固體培養基上只有少數子葉接觸到培養基。與直接將成熟胚接種于附加生長調節劑的固體培養基中相比，本發明通過用附加生長調節劑6-BA的SH液體培養基浸泡處理成熟胚有利于胚吸收培養基中的營養物質及生長調節劑，更有利于外植體誘導出更多的不定芽。作為一種更優選的技術方案，步驟(i)中將落羽杉的種子進行消毒之前先將其在0-4'C低溫條件下保存一周，然后再按照以下方法進行消毒處理用紗布包裹種子在自來水中沖洗l-3天，然后在無菌燒杯中用70%酒精浸泡，無菌蒸餾水沖洗2-3次后用0.1%升汞(HgCl2)表面滅菌，最后用無菌水沖洗6-8次；更優選的用70%酒精浸泡種子1分鐘，用0.1%升汞表面滅菌的時間為10分鐘。步驟(2)和步驟(6)中所述的不定芽誘導和不定根誘導的培養優選在以下條件進行首先在溫度為25'C的黑暗條件下培養一周后再轉入光照為2000勒克斯的光照條件下進行誘導培養。步驟(3)、步驟(4)、步驟(5)和歩驟(7)中所述的不定芽伸長、不定芽增殖、壯苗培養和再生植株培養優選在以下條件進行培養溫度為25°C，光照強度為2000勒克斯(lux)，光照時間為10-14小時/天。步驟(8)中所述的煉苗移栽優選為移栽前逐漸打開培養瓶的封口膜在光照培養室內煉苗5-7天，然后將生根的小苗取出，用自來水洗去根部殘留的瓊脂培養基，移栽于裝有蛭石與泥碳土等比例混合的基質的容器內，每周澆一次SH基本培養基。本發明利用落羽杉成熟胚為外植體進行離體快速繁殖，每個培養階段所采用的基本培養基都是SH基本培養基，由于SH培養基降低了NH/的濃度，大大提高了氨基酸和維生素的用量，與常用的MS基本培養基相比，采用SH基本培養基更有利于落羽杉的生長。本發明中涉及的所有培養基中生長調節劑，皆是在各階段采用正交設計實驗后選擇的最適宜的用量及配比，重復驗證性實驗結果一致。在不定芽增殖階段，本發明將不定芽轉入SH半固體培養基，置于70rpm的普通搖床中振蕩培養，可以使不定芽增殖系數擴大10倍，同樣是因為液體、固體混合培養基增大了與外植體的接觸面積，更有利于不定芽吸收培養基中的營養物質及生長調節劑，同時有利于培養瓶與外界環境的通氣狀況。采用植物組織培養的方法繁殖落羽杉，不僅可以節約大量外匯，而且不受外界條件的限制，四季皆可進行，節約育苗占地，降低生產成本。采用本發明培育的落羽杉試管苗生長健壯，繁殖系數高，誘導生根率達到80%，移栽成活率高(達到90%左右)，是工廠化大規模生產落羽杉幼苗的簡便、快捷的技術體系。圖1落羽杉不定芽的分化與伸長。圖2落羽杉不定芽的增殖。圖3落羽杉在附加活性炭的培養基的培養。圖4落羽杉不定根的誘導。圖5落羽杉再生植株的形成。圖6落羽杉試管苗的主根外觀。圖7移栽后的落羽杉。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1一、試驗材料1、成熟落羽杉種子來自于美國路易斯安娜州。2、培養基的配制(1)、"SH基本培養基"的組成或配制方法；表lSH培養基(SchenkandIIildebrandt，1972)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述S11培養基母液配好后，儲存于4'C冰箱待用。根據配置培養基的數量，稱量所需瓊脂和蔗糖，將其倒入欲配培養基體積3/4的無菌水中，順序加入所需的大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽母液和有機成分母液，每加入一種都充分攪拌，最后加水定容至培養基最終體積，用pH計測試培養基酸堿度，用0.lmolL—1的KOH或0.lmolL—1的HC1將pH值調整至5.8。(2)、成熟胚預處理液體培養基SH基本培養基添加6-BA8-10mg七—'，蔗糖20g七—'，不添加瓊脂，調節pH值為5.8，培養基在121'C下滅菌15rain。(3)、不定芽誘導培養基SH基本培養基添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至6.5克/升，調節pH值為5.8;在121。C下滅菌15min。(4)、不定芽伸長培養基大量元素減半的1/2SH基本培養基中添加6-BA至5-6毫克/升、添加iM至5-6毫克/升、添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至6.5亳克/升，調pH值為5.8;在121'C下滅菌15min。(5)、不定芽增殖培養基SH基本培養基添加6-BA至10毫克/升、添加IBA至2毫克/升、添加NAA至2毫克/升、添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至3.25克/升，該培養基為半固態，調pH值為5.8;在121'C下滅菌15min。(6)、壯苗培養基SH基本培養基，添加活性炭至l克/升，添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至6.5克/升，調pH值為5.8;在12rC下滅菌15min。(7)、不定根誘導培養基大量元素減半的1/2SH固體培養基，添加IBA至20-25毫克/升、添加活性炭至l克/升，添加蔗糖至20克/升、添加瓊脂至6.5克/升，調pH值為5.8;在12rC下滅菌15min。(8)、再生植株培養基SH基本培養基添加蔗糖至30克/升、添加瓊脂至6.5克/升，調pH值為5.8;在121。C下滅菌15min。3.培養條件培養條件采用人工光照，封閉式培養室，光照強度為2000Lux,光照時間10-14htf1，溫度(25士2)。C。其中，不定芽的誘導和不定根的誘導是在25"C的黑暗條件下培養一周后再轉入光照強度為2000Lux的條件下進行誘導培養；不定芽的伸長培養、不定芽的增殖培養、壯苗培養和再生植株培養均在以下條件下培養溫度為25'C、光照強度為2000Lux，光照吋間10-Mhd—'。二、試驗方法將落羽杉成熟種子置于4"C冰箱低溫保存一周，接種前用紗布包裹種子在自來水中沖洗2天，然后在無菌燒杯中用70%酒精浸泡種子lmin，無菌蒸餾水沖洗2-3次，再用0.1%升汞(HgCl2)表面滅菌10min，期間輕輕搖動燒杯使其充分接觸，無菌水沖洗6-8次。將處理好的種子放在無菌干燥的濾紙上吸取表面水分。在超凈工作臺用解剖刀小心剝除堅硬的外種皮，剝除胚乳并去除胚根部分的成熟胚，備用；將所剝離的成熟胚浸泡在成熟胚預處理液體培養基中處理24h，然后用滅菌濾紙吸干表面水分；將預處理后的成熟胚平放于不定芽誘導培養基表面，置于25"C黑暗條件下培養一周再轉入光照強度為2000Lux的條件下進行誘導培養；不定芽誘導20天后，胚外植體子葉、子葉基部、胚軸開始有大量不定芽分化；將已分化出不定芽的胚外植體完整地繼代于不定芽伸長培養基，培養溫度25匸，光照強度2000lux(日光燈照明)，光照時間10-14h.d—1;此階段不定芽在原外植體上伸長，平均一個胚外植體可獲得9-12個長勢旺盛、顏色嫩綠、具有明顯可辨莖段的不定芽(圖l);待不定芽長至1.0-1.5cm長時，將其逐一單個切下，轉入不定芽增殖的半固體培養基中，置于70rpm的普通搖床中處理30d進行不定芽增殖，培養溫度25'C，光照強度2000lux(日光燈照明)，光照時間10-14h.d—1(圖2);待不定芽增殖出的新芽長至1.0-1.5cm長時，反復進行此步驟操作，逐一單個切下1.0-1.5cm長的不定芽，轉入新鮮的SH半固體培養基中振蕩培養。平均每30d更換一次新鮮培養基。不定芽轉入增殖培養基30d后，每個伸長的小枝葉腋有6-8個新芽產生，同時小枝基部被切割的部分膨大，有20-30個綠色突起。如此反復2-3個月可將不定芽的繁殖系數擴大到80-IOO倍。為防止芽苗的玻璃化，將具有明顯主莖的小芽苗轉移至壯苗培養基中，培養溫度25°C，光照強度2000lux的日光燈照明，光照時間10-14hd—、此階段芽苗的高生長顯著，主莖平均30d生長4-5cm(圖3);待優質芽苗的主干長至8-10cm左右時，將芽苗轉至不定根誘導培養基，置于25'C黑暗條件下培養一周再轉入正常光照條件，誘導不定根的發生，誘導生根率達80%(圖4)。不定根形成后將芽苗轉至形成再生植株培養基，進行根苗的伸長生長。培養溫度25°C，光照強度2000lux(円光燈照明)，光照時間10-14hd—'。30d后，發達的主根布滿玻璃瓶底部，主根肉質、白色，長達20-25cm，苗高生長達12-18cm(圖5、圖6);將生長健壯的再生植株的培養瓶封口膜在光照培養室內于移栽前逐漸打開，煉苗5-7d，然后將植株取出后，用水洗去根部殘留的瓊脂培養基，移栽于裝有蛭石與泥碳土等比例混合的基質的容器內。每周澆一次SH基本培養基。2個月后移栽成活率為90%左右(圖7)。實施例2除不定芽增殖培養基中所用6-BA至20毫克/升、IBA5毫克/升、添加NAA至5毫克/升，其余均與實施例l相同。實施例3除不定芽增殖培養基中所用瓊脂為6.5克/升，其余均與實施例1相同。實施例4除壯苗培養基中添加防褐劑硝酸銀8.0mg/L，其余均與實施例1相同。試驗例1表2和表3分別給出了實施例1至4中不同培養基對不定芽增殖培養和壯苗培養階段落羽杉生長的影響數據。表2不定芽增殖培養基對落羽杉不定芽增殖培養的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3壯苗培養基中防褐劑的添加對芽苗的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1、落羽杉(Taxodiumdistichum)的離體快速繁殖方法，包括以下步驟(1)、落羽杉的種子消毒后取其成熟胚作為外植體；(2)、將落羽杉的成熟胚接種到不定芽誘導培養基上誘導培養不定芽；(3)、將已分化出不定芽的胚外植體完整地繼代于不定芽伸長培養基上進行培養，誘導不定芽伸長；(4)、將步驟(3)所培養的不定芽切下后轉入到不定芽增殖培養基上進行不定芽增殖培養；(5)、將具有明顯主莖的小芽苗轉移至壯苗培養基中進行壯苗培養；(6)、將經過壯苗培養的芽苗轉至不定根誘導培養基上誘導培養不定根的發生；(7)、將形成不定根后的芽苗轉至再生植株培養基上進行再生培養；(8)、煉苗移栽，即得。2、按照權利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)中所述的不定芽誘導培養基是SH基本培養基+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;步驟(3)中所述的不定芽伸長培養基是大量元素減半的1/2SH基本培養基+6-節氨基嘌呤5-6毫克/升+B引哚丁酸5-6毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，其pH值為5.8。3、按照權利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于，步驟(4)中所述的不定芽增殖培養基是SH基本培養基+6-芐氨基嘌呤10-20毫克/升+吲哚丁酸2-5毫克/升+萘乙酸2-5毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂3.25-6.5克/升，該培養基為半固態，其pH值為5.8;優選的，所述的不定芽增殖培養基是SH基本培養基+6-芐氨基嘌呤10毫克/升+吲哚丁酸2毫克/升+萘乙酸2毫克/升+蔗糖30克/升+瓊脂3.25克/升。4、按照權利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于，步驟(5)中所述的壯苗培養基為SH基本培養基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;優選的，所述的壯苗培養基為SH基本培養基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升+硝酸銀8.0毫克/升。5、按照權利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(6)中所述不定根誘導培養基為大量元素減半的1/2SH基本培養基+吲哚丁酸20-25毫克/升+活性炭1克/升+蔗糖20克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8;步驟(7)中所述再生植株培養基為SH基本培養基+蔗糖30克/升+瓊脂6.5克/升，pH值為5.8。6、按照權利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于將落羽杉成熟胚接種到不定芽的誘導培養基上進行誘導培養之前，先將成熟胚按照以下方法進行預處理將成熟胚在液體培養基中浸泡處理8-36小時；所述液體培養基是SH基本培養基+6-芐氨基嘌呤8-10毫克/升+蔗糖20克/升。7、按照權利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(1)中將落羽杉種子進行消毒之前先將種子在0-4'C低溫條件下保存一周，然后再按照以下方法進行消毒處理用紗布包裹種子在自來水中沖洗1-3天，然后在無菌燒杯中用70%酒精浸泡，無菌蒸餾水沖洗2-3次后用0.1%升汞表面滅菌，最后用無菌水沖洗6-8次；優選的，用70%酒精浸泡落羽杉種子的時間為1分鐘，用0.1%升汞表面滅菌的時間為10分鐘。8、按照權利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)和歩驟(6)中所述的不定芽的誘導和不定根的誘導培養條件為在25'C黑暗條件下培養7天后再轉入光照為2000勒克斯的光照條件下培養。9、按照權利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(3)、歩驟(4)、歩驟(5)和步驟(7)中所述的不定芽伸長、不定芽的增殖、壯苗培養和再生植株培養均在以下條件下培養溫度為25"，光照強度為2000勒克斯，光照時間為10-14小時/天。10、按照權利要求1所述的離體快速繁殖方法，其特征在于步驟(8)中所述的煉苗移栽為移栽前打開培養瓶的封口膜在光照培養室內煉苗5-7天，然后將生根的小苗取出，用自來水洗去根部殘留的瓊脂培養基，移栽于裝有基質的容器內，每周澆一次SH基本培養基；所述的基質由蛭石與泥碳土按照1:l的重量比例組成。全文摘要本發明公開了落羽杉(Taxodium.distichum)的離體快速繁殖方法，屬于植物組織培養領域。本發明方法包括以下步驟(1)落羽杉種子消毒后取其成熟胚作為外植體，(2)不定芽的誘導培養，(3)不定芽的伸長培養，(4)不定芽的增殖培養，(5)壯苗的培養，(6)不定根的誘導培養，(7)形成再生植株，(8)煉苗移栽；其中，每個培養階段所采用的基本培養基都是SH培養基，各個培養階段所添加的生長調節劑，皆是采用正交設計實驗后選擇的最適宜的用量及配比。本發明方法所培育的落羽杉試管苗生長健壯，繁殖系數高，誘導生根率達到80％，移栽成活率達到90％左右，可進行規模化、工業化生產。文檔編號A01H4/00GK101347099SQ200810146948公開日2009年1月21日申請日期2008年8月27日優先權日2008年8月27日發明者曹福亮,朱燦燦,楊小虎,汪貴斌申請人:南京林業大學