防治棉花黃萎病的菌株b221的制作方法

專利名稱：：防治棉花黃萎病的菌株b221的制作方法
技術領域：
：本發明涉及防治棉花黃萎病的單一菌株，屬于農作物防病治病
技術領域：
，專用于棉花黃萎病的無公害防治。二、
背景技術：
由棉花黃萎病菌大麗輪枝孢(d"W&eKleb.)引起的棉花黃萎病是世界性、毀滅性病害，素有棉花"癌癥"之稱。自1914年首次在美國報道以來，現已遍及世界各大棉區。我國自1935年由美國引進斯字棉時傳入，后隨棉種調運不斷擴大。近年來，棉花黃萎病在國內各棉區連續流行為害，尤其是20022003年，在全國各棉區大面積流行，發病面積高達3xi(^hn^以上，對棉花生產構成極大威脅。由于該病是通過土壤和秸桿傳播的維管束病害，所以防治難度較大。首先，目前對棉花黃萎病的藥劑防治中沒有有效的化學農藥。即使有，使用化學農藥不僅會產生農藥殘留，而且隨著化學農藥的逐年使用也會出現棉花黃萎病菌的抗藥性問題。其次，我國目前對此病害主要是采用選育選用抗病品種為主的綜合治理措施。但目前我國棉花品種的抗病性只能達到耐至抗病水平，致使該病在環境條件合適的情況下仍然連續流行危害。此外，隨著經濟的發展，人們生活水平的提高，人們越來越注重食品安全問題，綠色作物、有機農產品等也越來越受人青睞。社會對安全、健康食品的需求促進了利用無公害方法來控制有害生物的研究。通過幾年的研究實踐，現己開發出一些生物殺菌劑，如農用鏈霉素、井崗霉素，前者可以配成200mg/L液灌根防治蔬菜軟腐病、青枯病，后者配成1000-1500倍液防治蔬菜炭疽病、霜霉病。因為迄今為止尚缺乏理想的高抗豐產品種和有效藥劑，且化學防治對環境污染的問題日益突出，所以在注重發展無公害生產技術的今天，生物防治作為防治棉花黃萎病的一種新思路，將得到進一步的重視與發展。三、
發明內容技術問題針對棉花黃萎病沒有較高防效的生防菌株制劑現狀，提供開發一種防治棉花黃萎病的單一菌株及其菌劑，專用于防治棉花黃萎病，菌株的防效高，并且有增產功能。技術方案防治棉花黃萎病的菌株B221，為球毛殼屬(Oiaeto脂'wwg/o6oswm)，于2008年05月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCN0.2493。用防治棉花黃萎病的菌株B221制備生防菌劑的方法為-將上述防治棉花黃萎病的菌株B221在PDA培養液25°C200rpm振蕩培養7天，用8層滅菌紗布過濾后得到其孢子懸浮液菌劑成品，用血球計數法將菌劑成品中活菌總濃度調節為109個孢子/毫升。其應用方法為，菌株制劑在作物移栽前噴霧使用，也可以做成堆肥使用，或稀釋后在移栽時灌根使用。有益效果本發明與現有棉花黃萎病防治技術相比，其優點和積極效果表現在本發明是專門針對棉花黃萎病開發的生防菌株，因而在防治棉花黃萎病方面與目前其他廣譜生物殺菌劑相比防治效果顯著提高。由于是生物菌株制劑，完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于作物的無公害生產，農民可以不用或減少其他防治棉花黃萎病化學農藥的用量，這不僅可為農民節省開支，而且有利于作物的出口。同時，生防菌株制劑還有增產功能，可為農民增加收入。B221菌株制劑可以在溫室移栽前，噴在肥料中，然后隨肥料在整地過程中埋到土里，也可以在栽苗時灌根使用。栽苗后，菌株通過多種生防機制起作用，從而達到防治棉花黃萎病的效果。試驗表明，在溫室中使用B221菌株制劑對棉花黃萎病有一定程度的防治效果，達到58.96%;B221菌株制劑對棉花還有一定程度的增產效果，達到51.20%。四圖1溫室試驗中B221菌劑在播種55天后對棉花黃萎病的防治效果注.-左一CK，右^B221;防效圖2溫室試驗中B221菌劑在播種55天后對棉花黃萎病的促生效果注左一CK，右^B221;促生圖3溫室試驗中B221菌劑在播種55天后對棉花黃萎病的促生效果(根)注左一CK，右一B221;促生(根)五具體實施方式1菌株的鑒定防治棉花黃萎病菌大麗輪枝孢(FeW/d///w/wdaW&eKleb.)的生防菌株B221，它是由南通市如東縣掘港鎮丁字岸村某棉花黃萎病發生嚴重的田塊中，棉花健株的根部分離得來，發明人對菌株B221的平板拮抗活性、產纖維素酶、蛋白酶、幾丁質酶活性和利用磷和氮元素的測定進行了研究，發現菌株B221對棉花黃萎病菌(Fert/d/"ww^W^e)具有較強的平板拮抗活性，但不具有蛋白酶，纖維素酶和幾丁質酶活性，不能利用磷和氮元素，菌株用PDA培養基培養，于PDA斜面4'C保存。發明人還對其進行了溫室防效和促生實驗研究，發現B221菌株制劑有很好的防病增產效果，防效達到58.96%，生物量的增加達51.20%，有較大的潛力開發成商業化的活菌生防制劑。將待測真菌B221接于PDA培養基，25'C培養5天，用無菌手術刀刮取成熟的菌絲，根據Wang""/.方法(Wang，H.，Qi，M.，andCutler,A丄1993AsimplemethodofpreparingplantsamplesforPCR.NucleicAcidsRes.21，4153-4154.)提取真菌的DNA。利用弓l物ITS!禾口ITS4(ITS!:5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')(生興生物技術有限公司合成)進行PCR擴增待測真菌的ITS區域。所有反應采用25-nL體系ITS!0.25pL，ITS40.25|aL，10xPCRbuffer2.5|oL，25mMMgCl21.5(jL，2.5mMdNTP1(jL，5n/mlr-Tagpolymerase(Takara)0.25pL,ddH2018.25pL，DNA1為模板。PCR反應條件為94°C5min，94°C30s，55。C30s，72°C30s，35cycles,with10minextensionat72。Cusedforthefinalcycle(WangWfl/.，1993)。PCR產物用1%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電壓卯V，15min，EB染色30min，找到目標條帶(500-600bp),采用凝膠回收試劑盒(H.Q.&.Q.GelExtractionKitII)對所需條帶進行回收。將目標片段連接至載體pMD18-T，然后轉入￡.co/ZTop-10感受態細胞中，獲得陽性克隆。通過測序獲得ITS區域核酸序歹!j，在因特網中使用BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)于NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)NucleotideSequenceDatabase進4亍比對，獲f尋鑒定結果B221為球毛殼屬(C7w"ow/wwg/o6oww)。2溫室防效試驗將病原菌(Fer"'"7/fwwdaW/aeKleb.)(Li,X丄.，Li，Y.andZhang,T.Y.2003StudiesonCottonVerticilliumWiltControlbyFungalAntagonists.ActaGossypiiSinica15，2628.)接于PDA培養基，25。C恒溫箱培養5天后，挑取菌絲于PDA培養液(Li,X丄.，Li,Y.andZhang,T.Y.2003StudiesonCottonVerticilliumWiltControlbyFungalAntagonists.ActaGossypiiSinica15,2628.)中，200rpm，25'C培養7天，8層滅菌紗布過濾后，利用血球記數法測得孢子懸浮液濃度，接于滅菌土壤中，使得每克土壤含有3.6><107個孢子，病原菌定殖10天后按照上述方法將生防菌B221接于土壤中(濃度為每克土壤約107個孢子)，同時播種品種為魯棉研15的棉花包衣種子，設只接種病原菌的處理為對照。每個處理重復3次，每個重復20株棉花。播種55天后統計結果，計算病情指數和防效。調查結果時發病強度的分級標準(溫室苗期)0級一健苗，子葉、真葉無病狀；I級一l2片子葉發病，真葉未顯病狀；n級一子葉和i片真葉發病；ni級一2片或2片以上真葉發病；IV級一葉片大量脫落或棉花枯死。病情指數和防效計算公式如下-i:(病植株數x病級數)病情指數=-"00%總植株數x最高病級數對照病情指數一生防菌病情指數防效=-x100%對照病情指數苗期盆栽試驗結果表明(表l，圖l)，接種B221的棉花表現出一定程度的防治效果。表l生防菌施用后55天對棉花黃萎病的盆栽防效<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3溫室促生試驗在促生試驗中，處理組植株只接種拮抗菌B221的孢子懸浮液，設清水處理植株為對照。方法同溫室防效試驗。播種55天后測量棉花的株高，根長，鮮重，并計算生物量的增加，用以估計生防菌對植物促生作用的影響。生物量的增加計算公式如下-處理組鮮重一對照組鮮重生物量增加=對照組鮮重xioo%表2生防菌施用后55天對棉花黃萎病的盆栽促生效果菌株編號根長(cm)株高(cm)鮮重(g)生物量的增加(％)B22112.4324.8515.0951.20CK15.4524.679.98/權利要求1.防治棉花黃萎病的菌株B221，其特征在于，該菌株為球毛殼屬(Chaetomiumglobosum)，于2008年05月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNO.2493。2、權利要求1所述防治棉花黃萎病的菌株B221在防治溫室棉花黃萎病方面的應用。3、用權利要求1所述防治棉花黃萎病的菌株B221制備的生防菌劑。4、權利要求3所述B221生防菌劑的制備方法，其特征在于將權利要求1所述防治棉花黃萎病的菌株B221在PDA培養液25。C200rpm振蕩培養7d，用8層滅菌紗布過濾后得到其孢子懸浮液，菌劑成品中活菌總濃度109個孢子/毫升，即為所制備的B221生防菌劑。5、權利要求3或4所述B221生防菌劑在防治棉花黃萎病方面的應用。全文摘要本發明涉及防治棉花黃萎病的生防菌株B221，屬于農作物防病治病
技術領域：
。經鑒定為球毛殼屬(Chaetomiumglobosum)。菌種保藏號為CGMCCNO.2493。菌種在PDA培養液25℃200rpm振蕩培養7d，用8層滅菌紗布過濾后得到其孢子懸浮液，成品中活菌總濃度10⁹個孢子/毫升，獲得生防菌劑。菌株于PDA斜面4℃保存，B221菌株表現出較好的平板拮抗效果、溫室防效和促生效果。試驗表明，菌株B221溫室防效達到58.96％，生物量的增加達51.20％；有較大的潛力開發成商業化的活菌生防制劑。文檔編號A01P3/00GK101280280SQ200810123738公開日2008年10月8日申請日期2008年6月2日優先權日2008年6月2日發明者徐莉莉,郭堅華,莎魯申請人:南京農業大學