專利名稱：一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法及其專用試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種水產動物人工授精孵育方法及其專用的孵育試劑，特別涉及一 種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法及其專用試劑。
背景技術：
曼氏無針烏賊曾是我國漁場的四大漁業之一，對溫度的適應性較強，在我國沿 海分布很廣，是一種經濟價值很高的傳統漁業種類。由于過度捕撈和生態惡化，自 20世紀70年代以來，先后出現了衰退現象。上世紀八十年代有報道李星頡等對曼 氏無針烏賊資源及增殖的初步研究，而國外有對商烏賊的生物學及養殖方面的報 道。要進行烏賊人工繁殖與育苗，首先必須進行烏賊的基礎生物學的研究。而對烏 賊的基礎生物學的研究需要有可靠的胚胎發育的研究的支撐。只有在對胚胎發育過 程的充分了解之后，才能進一步開展人工繁育與育苗的研究。而對胚胎發育的研究， 最優途徑就是對其胚胎進行體外培養和觀察。
有關頭足類早期發育階段的基礎研究，國內外報道都很少。對曼氏無針烏賊人 工授精孵育的研究更是沒有先例的。該類研究旨在為頭足類基礎生物學研究積累資 料，為曼氏無針烏賊的苗種生產及存活率的提高提供理論依據。在這一基礎上，可 以進一步對其胚胎進行干預，使實現進一步的生產目的成為可能。
發明內容
本發明的目的是提供一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法及其專用試劑，以此 實現對曼氏無針烏賊的離體胚胎培養的技術問題，并且該操作方法簡單，成本低廉。
本發明是這樣實現的 一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法，其將從曼氏無針 烏賊雌性體內輸卵管中的卵移入裝有營養液的容器中進行在體外授精和離體培養， 并且容器底部與卵之間設有瓊脂糖層；營養液含有新鮮或凍干處理的雌性曼氏無針 烏賊體的輸卵管腺分泌液。
體外授精的精子來源采用雄性曼氏無針烏賊的精莢；精莢放置在瓊脂糖層上， 擠壓以釋放精子；營養液還含有血清。
該方法可按如下步驟操作① 選取曼氏無針烏賊并采集卵和精莢，人工海水清洗待用；在培養容器中放入 混合有輸卵管腺分泌液的人工海水；
② 將片狀瓊脂糖層置于培養容器底部；將步驟①的卵放在瓊脂糖層上，放入精 莢并且擠壓精莢，進行體外授精；培育溫度為26土rC，每隔0.5小時至3小時更 換營養液并且移除廢棄的精莢；
③ 受精1天至2天后，在營養液中加入馬或牛的血清；每隔15小時至30小時 取出受精卵換入新的培養容器；培育期間為受精后12天至14天。
步驟①中人工海水至少暴曬三天，并且人工海水是經過微孔過濾的充氣良好的
海水；人工海水的鹽度為27%。至28%。。
人工海水中還含有EDTA，并且人工海水中EDTA的濃度小于3克/米3。 一種曼氏無針烏賊人工授精孵育專用試劑，其含有培養容器底襯和營養液；培
養容器底襯為0.2%的瓊脂糖；營養液按重量份數含有1份至10份的血清和1000
份的無菌海水。
無菌海水為經過微孔過濾的充氣良好的海水。 無菌海水還含有EDTA，并且EDTA的濃度小于3克/米3。 與現有技術相比，本發明的優點在于
本發明使用了使用瓊脂糖襯底的培養方法，結合血清、輸卵管腺分泌液混合的 人工海水，開拓性的應用于曼氏無針烏賊人工授精孵育。由于傳統無襯底培養方式 由于容器底部質地堅硬，造成卵的變形，并且卵膜與容器底部接觸面不能吸收營養 物質，會導致胚胎發育畸形甚至發育停止，培養成功率極低。本技術方案由于瓊脂 糖分子結構疏松，營養物質能夠自由流動滲透，卵在瓊脂糖襯底上變形較小，而且 不會造成接觸面的營養缺乏。輸卵管腺分泌液或血清單獨使用的情況下，由于關鍵 營養元素的缺失，仍然會出現胚胎發育停止的現象。只有在輸卵管腺分泌液配以低 濃度血清提供營養的條件下，并且保證卵不變形，才能使曼氏無針烏賊體外培養的 胚胎順利完成整個發育過程。
圖1是本發明實施例培養的胚胎各發育階段的顯微照片。
具體實施例方式
以下結合附實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例 一種曼氏無針烏賊人工授精孵育專用試劑，其含有培養容器底襯和營 養液；培養容器底襯為0.2%的瓊脂糖；營養液按重量份數含有1份的血清或1份輸 卵管腺分泌液或其組合；營養液按重量份數還含有500份的無菌海水。在受精2天 之前的培養階段，單獨使用1份的曼氏無針烏賊的輸卵管腺分泌液，2天之后則采 用1份血清加1份輸卵管腺分泌液作為提供營養的培養液。試驗表明這樣才能使胚 胎正常完成整個發育過程。
無菌海水為經過微孔過濾的充氣良好的海水，即通過人工充氣，使其含氧量至 少不低于普通的自然海水的含氧量。無菌海水中還含有EDTA，并且EDTA的濃度 小于3克/米3。
一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法，將從曼氏無針烏賊雌性體內輸卵管中的 卵移入裝有營養液的塑料培養皿中進行在體外授精和離體培養，并且塑料培養皿底 部與卵之間設有瓊脂糖層；營養液含有新鮮或凍干處理的雌性曼氏無針烏賊體的輸 卵管腺分泌液。瓊脂糖層在玻璃培養皿中預先制備，使用時移入塑料培養皿中，平 鋪于底部。
體外授精的精子來源采用雄性曼氏無針烏賊的精莢；精莢放置在瓊脂糖層上， 擠壓以釋放精子；營養液還含有血清。 該方法的具體步驟如下
① 準備工作選取曼氏無針烏賊并采集卵和精莢，人工海水清洗待用；在培養 塑料培養皿中放入混合有輸卵管腺分泌液的人工海水。試驗表明此時的營養液可以 支持胚胎的早期發育，然而，后期會出現發育停止和胚胎死亡的現象。烏賊生性兇 猛，在操作時最好先進行麻醉，從其輸卵管或卵巢釆集成熟的色澤光亮的卵。
② 人工授精將片狀瓊脂糖層置于培養塑料培養皿底部；將步驟①的卵放在瓊 脂糖層上，放入精莢并且擠壓精莢，進行體外授精；受精后，在更換營養液的同時 拋棄精莢，每隔半小時更換營養液；培育溫度為26士rC。
③ 受精2天后，在原營養液的基礎上增加馬或牛的血清，以增加胚胎發育所需 要的營養，否則胚胎在后期發育時會出現大量死亡；每隔24小時取出受精卵換入 新的培養塑料培養皿，并且出去死卵;培育期間為受精后12天至14天， 一般情況 下曼氏無針烏賊在經12天至14天發育后破卵，整個培育過程也就隨之完成了。
所有的操作對衛生要求是比較高的，無菌操作可以在一定程度上提高胚胎的成 活率。步驟①中人工海水至少暴曬三天，并且人工海水是經過微孔過濾的充氣良好的 鹽度為27.5%。左右的海水。
人工海水中還含有EDTA，并且人工海水中EDTA的濃度小于3克/米3。在這 里EDTA是離子螯合劑，能夠螯合重金屬離子，防止海水中過多的重金屬離子對胚 胎的毒害。
本發明本發明使用了使用瓊脂糖襯底的培養方法，結合血清、輸卵管腺分泌液 混合的人工海水，開拓性的應用于曼氏無針烏賊人工授精孵育。由于傳統無襯底培 養方式由于容器底部質地堅硬，造成卵的變形，并且卵膜與容器底部接觸面不能吸 收營養物質，會導致胚胎發育畸形甚至發育停止，培養成功率極低。本技術方案由 于瓊脂糖分子結構疏松，營養物質能夠自由流動滲透，卵在瓊脂糖襯底上變形較小， 而且不會造成接觸面的營養缺乏。輸卵管腺分泌液或血清單獨使用的情況下，由于 關鍵營養元素的缺失，仍然會出現胚胎發育停止的現象。只有在輸卵管腺分泌液配 以低濃度血清提供營養的條件下，并且保證卵不變形，才能使曼氏無針烏賊體外培 養的胚胎順利完成整個發育過程。在體外培養能夠方便人工干預胚胎發育，從而實 現進一步的產業化目的。
盡管已結合優選的實施例描述了本發明，然其并非用以限定本發明，任何本領 域技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，能夠對在這里列出的主題實 施各種改變、同等物的置換和修改，因此本發明的保護范圍當視所提出的權利要求 限定的范圍為準。
權利要求
1、一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法，其特征是將從曼氏無針烏賊雌性體內輸卵管中的卵移入裝有營養液的容器中進行在體外授精和離體培養，并且所述的容器底部與卵之間設有瓊脂糖層；所述的營養液含有新鮮或凍干處理的雌性曼氏無針烏賊體的輸卵管腺分泌液。
2、 根據權利要求1所述的一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法，其特征是體外 授精的精子來源采用雄性曼氏無針烏賊的精莢；所述的精莢放置在所述的瓊脂糖層上， 擠壓以釋放精子；所述的營養液還含有血清。
3、 根據權利要求2所述的一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法，其特征是具有如 下步驟①選取曼氏無針烏賊并采集卵和精莢，人工海水清洗待用；在培養容器中放入 混合有輸卵管腺分泌液的人工海水；② 將片狀瓊脂糖層置于所述的培養容器底部；將步驟①的卵放在所述的瓊脂糖層 上，放入精莢并且擠壓精莢，進行體外授精；培育溫度為26土rC，每隔0.5小時至3 小時更換營養液并且移除廢棄的精莢；③ 受精1天至2天后，在營養液中加入馬或牛的血清；每隔15小時至30小時取出 受精卵換入新的培養容器；培育期間為受精后12天至14天。
4、 根據權利要求3所述的一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法，其特征是步驟 ①中所述的人工海水至少暴曬三天，并且所述的人工海水是經過微孔過濾的充氣良好的 海水；所述的人工海水的鹽度為27%。至28%。。
5、 根據權利要求4所述的一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法，其特征是所述 的人工海水中還含有EDTA，并且所述的人工海水中EDTA的濃度小于3克/米3。
6、 一種曼氏無針烏賊人工授精孵育專用試劑，其特征是含有培養容器底襯和營 養液；所述的培養容器底襯為0.2%的瓊脂糖；所述的營養液按重量份數含有1份至10 份的血清或輸卵管腺分泌液或其組合；所述的營養液按重量份數還含有1000份的無菌 海水。
7、 根據權利要求6所述的一種曼氏無針烏賊人工授精孵育專用試劑，其特征是-所述的無菌海水為經過微孔過濾的充氣良好的海水。
8、 根據權利要求6所述的一種曼氏無針烏賊人工授精孵育專用試劑，其特征是.-所述的無菌海水還含有EDTA，并且EDTA的濃度小于3克/米3。
全文摘要
本發明公開了一種曼氏無針烏賊人工授精孵育方法及其專用試劑，該方法將從曼氏無針烏賊雌性體內輸卵管中的卵移入裝有營養液的容器中進行在體外授精和離體培養，并且容器底部與卵之間設有瓊脂糖層；營養液含有新鮮或凍干處理的雌性曼氏無針烏賊體的輸卵管腺分泌液。該專用試劑，其含有培養容器底襯和營養液；培養容器底襯為0.2％的瓊脂糖；營養液按重量份數含有1份至10份的血清和1000份的無菌海水。本發明由于瓊脂糖分子結構疏松，營養物質能夠自由流動滲透，卵在瓊脂糖襯底上變形較小，而且不會造成接觸面的營養缺乏。在輸卵管腺分泌液配以低濃度血清提供營養，并且保證卵不變形，使曼氏無針烏賊體外培養的胚胎順利完成整個發育過程。
文檔編號A01K61/00GK101427658SQ20081012189
公開日2009年5月13日 申請日期2008年10月21日 優先權日2008年10月21日
發明者吳常文, 徐佳晶, 徐梅英, 桂福坤 申請人:浙江海洋學院