專利名稱：：殺滅芽孢桿菌芽孢的復(fù)合制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種殺滅芽孢桿菌芽孢的復(fù)合制劑。技術(shù)背景芽孢桿菌菌屬為可形成芽孢(內(nèi)生孢子)的桿菌，屬于化能異養(yǎng)菌，具發(fā)酵或呼吸代謝類型。芽孢桿菌菌屬的最大特征是生成芽孢，且絕大多數(shù)是一個(gè)菌體僅形成一個(gè)芽孢。由于芽孢具有厚而含水量低的多層結(jié)構(gòu)，所以對熱、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑和其它理化因素有較強(qiáng)的抵抗力，可能與芽孢獨(dú)具的高含量吡啶二羧酸有關(guān)。該屬細(xì)菌對外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處，與人類關(guān)系密切。如炭疽芽孢桿菌可以引起人、畜的炭疽?。幌灅友挎邨U菌、肉毒梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌引起食物中毒；破傷風(fēng)梭菌引起破傷風(fēng)；韋氏梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌引起氣性壞疽等。芽胞生存力強(qiáng)，在干燥土壤中存活40年以上仍具有感染力，探索有效殺滅芽孢的方法一直是消毒與預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)方向。傳統(tǒng)上，一般使用高溫滅菌法(12rC，30min)達(dá)到徹底消除芽孢的目的，然而這種方法不能用于清除環(huán)境或物體表面的芽孢。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域大多借助一些高效化學(xué)消毒劑的使用殺滅芽孢，包括含氯消毒劑、臭氧、甲基內(nèi)酰脲類化合物、雙鏈季銨鹽、環(huán)氧乙垸等，可是這些化學(xué)類消毒劑在使用時(shí)會對人體構(gòu)成一定的傷害并對環(huán)境造成一定程度的污染。乳酸鏈球菌素(Nisin)，一種新型低聚肽，是從乳酸鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中獲得的多肽抗菌素類物質(zhì)，是世界公認(rèn)的安全的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑。乳酸鏈球菌素的一級結(jié)構(gòu)由34個(gè)氨基酸組成，分子末端分別是氨基和羧基，還有5個(gè)硫橋構(gòu)成內(nèi)環(huán)，其分子式如下C143H228N42037S7，平均分子量為3510Da。Nisin主要抑制大部分革蘭氏陽性菌的生長，包括產(chǎn)芽孢桿菌(如肉毒桿菌)、耐熱腐敗菌(如嗜熱脂肪芽孢桿菌)等。Nisin在食品防腐中的重要價(jià)值在于能抑制芽孢細(xì)菌(包括嗜熱產(chǎn)氣芽孢菌)。關(guān)于Nisin對微生物的作用機(jī)理方面有大量研究，目前普遍認(rèn)為Nisin首先對革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜進(jìn)行吸附，然后在細(xì)胞膜上形成空洞從而使胞內(nèi)物質(zhì)泄露，最后導(dǎo)致細(xì)胞解體死亡。目前國際上關(guān)于Nisin針對芽孢桿菌方面的研究剛剛起步，而國內(nèi)相關(guān)方面的研究還處于一片空白，至今為止PubMed上收錄文章僅有兩篇，最早是由T.Nock等人在2007年9月首次報(bào)道，他們通過與magainins，defensins，cecropins等一系列抗菌肽對比證明Nisin對炭疽芽孢桿菌具有最為顯著的抑制作用，實(shí)驗(yàn)中選取10株不同的炭疽芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)對象，Nisin的最小抑菌濃度為0.70-13.51mg/mL。隨后在2008年3月再次由同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)Nisin可以顯著降低炭疽芽孢對于高壓的耐受性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種殺滅芽孢桿菌芽孢的復(fù)合制劑。本發(fā)明提供的殺滅芽孢桿菌芽孢的復(fù)合制劑，其活性成分是乳酸鏈球菌素和L-丙氨酸。所述復(fù)合制劑中，所述乳酸鏈球菌素(Nisin)和所述L-丙氨酸(L-Ala)的質(zhì)量比可為(9-1000):900。所述的復(fù)合制劑中，所述乳酸鏈球菌素和所述L-丙氨酸的質(zhì)量比優(yōu)選為(2-100):100。所述的復(fù)合制劑中，所述乳酸鏈球菌素和所述L-丙氨酸的質(zhì)量比最優(yōu)選為(3-6):100。本發(fā)明還提供了一種殺滅芽孢桿菌芽孢的方法，是應(yīng)用所述復(fù)合制劑殺滅芽孢。所述復(fù)合制劑具體可為任何劑型，如干粉、片劑、溶液等。當(dāng)所述復(fù)合制劑為溶液形式時(shí)，所述溶液的溶劑為萌發(fā)緩沖液。每升所述萌發(fā)緩沖液具體可含有以下組分lOmmolNaH2P04，lOOmmolNaCl;pH7.2。每升所述復(fù)合制劑溶液中，所述活性成分的量為100-100000ug/mL。每升所述復(fù)合制劑溶液中，所述活性成分的量優(yōu)選為1000-10000yg/mL。所述復(fù)合制劑溶液中，所述活性成分的量最優(yōu)選為9000-10000ng/mL。試驗(yàn)證明，Nisin作用于RSVFl菌株的LD50為672ug/mL。在OD咖"1.0的RSVF1芽孢懸液中加入一定量的萌發(fā)劑L-Ala(溶劑為萌發(fā)緩沖液)使其在整個(gè)體系中終濃度達(dá)100mmol/L，37°C，15min后芽孢萌發(fā)率為97.80%。本發(fā)明通過試驗(yàn)證明在常溫條件下，在15min內(nèi)，L-Ala對RSVFl芽孢的殺滅率為2.4847%;Nisin對RSVFl芽孢的殺滅率為20.28。/。；而復(fù)合制劑對芽孢的殺滅率可達(dá)99.37%，比Nisin提高了約5倍。本發(fā)明提供的復(fù)合制劑在常溫下、短時(shí)間內(nèi)可以殺滅95%以上的芽孢，可應(yīng)用于制備污染環(huán)境的洗消劑及致病性芽孢桿菌治療藥物，具有開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖1為Nisin對RSVF1菌的LD50。圖2為染色法檢測RSVF1菌株芽孢生成率。圖3為復(fù)合制劑對芽孢的殺滅率。tf,t、、-L、-'V具評頭她方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)材料如下"3CJ'"iAscere^菌株RSVF1，即ATCC4342,購自美國ATCC菌種保藏中心。酶緩沖液(EB):5mmol/LKH2P04，lramol/LDTT，1誦1/LEDTA;pH6.1。萌發(fā)緩沖液(pH7.2):10陽1/LNaH2P04，100畫1/LNaCl。LB培養(yǎng)基10gTrypton，5gYeastextract,10gNaCl，900mL去離子水；pH7.0;高壓滅菌。產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基(CCY):MgCl26H2O(0.5mmol/L)，MnCl24H20(0.Olramol/L)，F(xiàn)eCl36H20(0.05ramol/L)，ZnCl2(0.05mmol/L)，CaCl26H20(0.2mmol/L)，KH2P04(13,1/L)，K2HP04(26mmol/L)，谷氨酰胺(20g/L)，酸水解干酪素(lg/L)，酶水解干酪素(lg/L)，酶解酵母浸出物(0.4g/L)和甘油(0.6g/L)配制1L。乳酸鏈球菌素YP-1000Nisin，購自天津澎耀生物技術(shù)有限公司，其效價(jià)》1000IU/mg。實(shí)施例1、Nisin的LD50的測定為了實(shí)驗(yàn)過程方便安全，選取了丑cei^/s菌屬的一株在基因組方面與炭疽芽孢桿菌極其相似的菌株RSVF1作為實(shí)驗(yàn)對象。然后借助OD,值測定了Nisin作用于RSVF1菌株的LD50，目的是檢測Nisin對于RSVFl菌株的殺菌效果并為下一步的功效實(shí)驗(yàn)選擇適宜的蛋白濃度。將Nisin依次倍比稀釋加入96孔板，再各加入100yL菌密度達(dá)到0D65。=0.6的RSVFl菌懸液測定Nisin的LD50。以200uL酶緩沖液(EB)作為空白陰性對照，以100nL0D65。=0.6的RSVF1菌懸液+100ixL酶緩沖液(EB)作為生長對照，將各組溶液混勻后，37。C靜置孵育15min。測各組濃度Nisin作用15min后菌懸液的0D65。，將OD咖最低的Nisin濃度作為其LD50。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。圖l顯示了OD,的測定結(jié)果，X軸取濃度對數(shù)(Lg濃度(ug/mL))，Y軸取各個(gè)濃度下的0D65。。如圖1所示，RSVF1菌懸液生長對照組的OD防。為0.3774。最低OD刷所對應(yīng)的Nisin濃度的對數(shù)值為2.8，故Nisin的LD50為672ug/mL。實(shí)施例2、復(fù)合制劑對芽孢的抑制作用一、芽孢的制備將RSVF1菌株接種于LB培養(yǎng)基中，30°C，200rpm活化過夜。將活化后的菌液1%接種于CCY培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)60h，鏡檢至體系中孢子率大于99%為止。檢測RSVF1菌株芽孢生成率的具體步驟如下(1)取待檢菌芽孢體較多的培養(yǎng)物，涂片、干燥及加熱固定后，滴滿石炭酸復(fù)紅液于涂片上，并以弱火加熱，使染液冒蒸汽約5min。冷后水洗，并用95%乙醇脫色2min。水洗，加堿性美蘭液復(fù)染半分鐘。水洗，干后鏡檢。(2)染色結(jié)果，芽孢呈紅色，菌體為藍(lán)色。結(jié)果見圖2，圖2中，A為RSVF1菌在進(jìn)行芽孢培養(yǎng)之前的切片；B為RSVF1菌在進(jìn)行芽孢培養(yǎng)之后的切片。由圖可見，培養(yǎng)前，視野范圍內(nèi)全部呈現(xiàn)藍(lán)色的菌體(圖2A);培養(yǎng)后，視野范圍內(nèi)極大部分呈現(xiàn)紅色的芽孢以及極少數(shù)藍(lán)色的菌體(圖2B)。如圖所示，RSVFl菌經(jīng)培養(yǎng)后芽孢的生成率達(dá)99。/。以上。收集芽孢液用滅菌棉片過濾后，65"C水浴30min殺滅繁殖體，并激活芽孢，用滅菌水室溫洗滌和離心10次；最后用萌發(fā)緩沖液懸浮芽孢至0D65。^1.0(《4.0X108個(gè)芽孢/raL)。放置于4'C保存，每周用緩沖液洗滌l次。二、L-Ala對芽孢萌發(fā)的促進(jìn)作用向芽孢萌發(fā)體系中添加萌發(fā)劑后，芽孢開始萌發(fā)，體系在650nm的光密度隨著萌發(fā)率的增大而減小(芽孢折光性高，而萌發(fā)后吸光性增強(qiáng))，當(dāng)萌發(fā)率達(dá)到100%時(shí)，光密度降低到初始值的50%60%，并且在此范圍內(nèi)光密度的減小量與芽孢萌發(fā)率的增加量成反比，即芽孢的萌發(fā)率是光密度降低率的2倍。通過測量芽孢體系在650mn光密度的降低率可以計(jì)算芽孢的萌發(fā)率。首先將步驟一制備的芽孢離心收集，并用滅菌水將芽孢懸浮至OD,al.O，用滅菌水離心洗滌芽孢3次，再用萌發(fā)緩沖液懸浮芽孢至初始濃度，然后將芽孢懸浮液等量分布于滅菌試管中，分別加入一定量的萌發(fā)劑L-Ala(溶劑為萌發(fā)緩沖液)使其在整個(gè)體系中終濃度達(dá)100mmol/L，37°C，作用時(shí)間分別為0min，5min，10min，15min，20min，檢測不同時(shí)間點(diǎn)試管中芽孢懸液在650nm的光密度。同時(shí)設(shè)置不加萌發(fā)劑L-Ala的生長對照。檢測前將試管搖動至少30s，使芽孢均勻分布。測定結(jié)果如表1所示。表1通過OD,的降低檢測RSVF1的芽孢生成率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加入萌發(fā)劑L-Ala(100mmol/L)15min左右，就可以促使95%以上的RSVF1芽孢萌發(fā)。三、復(fù)合制劑對芽孢的抑制作用1、配制復(fù)合制劑配制復(fù)合制劑I:將乳酸鏈球菌素和L-丙氨酸混合，乳酸鏈球菌素和L-丙氨酸的質(zhì)量比為1:100，得到復(fù)合制劑I。配制復(fù)合制劑II:將乳酸鏈球菌素和L-丙氨酸混合，乳酸鏈球菌素和L-丙氨酸的質(zhì)量比為io:9，得到復(fù)合制劑n。配制復(fù)合制劑III:將乳酸鏈球菌素和L-丙氨酸混合，乳酸鏈球菌素和L-丙氨酸的質(zhì)量比為5:ioo，得到復(fù)合制劑m。2、復(fù)合制劑對芽孢的抑制作用實(shí)驗(yàn)分組如下所示(每組設(shè)3組平行，設(shè)空白對照組)第一組(空白對照組)接種菌密度為1.0X106cfu/raL的步驟一制備的RSVFl芽孢懸液300叱于210014萌發(fā)緩沖液中；第二組(L-Ala組)接種菌密度為1.0X106cfu/mL的步驟一制備的RSVFl芽孢懸液300叱于2100叱L-Ala溶液中(L-Ala溶液的溶劑為萌發(fā)緩沖液)，使L-Ala的終濃度為8900yg/mL;第三組(Nisin組)接種菌密度為1.0Xl()Scfu/mL的步驟一制備的RSVFl芽孢懸液300化于2100PLNisin溶液中(Nisin溶液的溶劑為萌發(fā)緩沖液)，使Nisin的終濃度為420ug/mL;第四組(復(fù)合制劑組I):接種菌密度為1.0X106cfu/mL的步驟一制備的RSVFl芽孢懸液300ktL于2100叱復(fù)合制劑I溶液中，使復(fù)合制劑I的終濃度為lOOwg/mL。第五組(復(fù)合制劑組II):接種菌密度為1.0X106cfu/mL的步驟一制備的RSVF1芽孢懸液300A于2100A復(fù)合制劑II溶液中(復(fù)合制劑II溶液的溶劑為萌發(fā)緩沖液)，使復(fù)合制劑II的終濃度為100000ug/mL。第六組(復(fù)合制劑組III):接種菌密度為1.0X106cfu/mL的步驟一制備的RSVF1芽孢懸液300A于2100A復(fù)合制劑溶液III中(復(fù)合制劑III溶液的溶劑為萌發(fā)緩沖液)，使復(fù)合制劑III的終濃度為9450pg/mL。以上6組，室溫靜置培養(yǎng)15rain后混勻再分別取lmL在8000rpm下離心3min去除上清，用萌發(fā)緩沖液反復(fù)吹洗3-4次后同樣條件下離心徹底清除殘留蛋白，再用萌發(fā)緩沖液lmL將其重懸，取IOO叱涂布肉湯平板，3(TC孵育18-24h，計(jì)數(shù)法檢測對萌發(fā)芽孢的殺滅率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3和表2。表2平板計(jì)數(shù)法定量測定Nisin與PlyG對芽孢的殺滅率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在常溫條件下，在15rain內(nèi)，L-Ala對RSVFl芽孢的殺滅率為2.4847%;Nisin對RSVF1芽孢的殺滅率為20.28%;而復(fù)合制劑III對芽孢的殺滅率為99.37%，比Nisin提高了約5倍。權(quán)利要求1、一種殺滅芽孢桿菌芽孢的復(fù)合制劑，其活性成分是乳酸鏈球菌素和L-丙氨酸。2、如權(quán)利要求l所述的復(fù)合制劑，其特征在于所述乳酸鏈球菌素和所述L-丙氨酸質(zhì)量比為(9-1000):900。3、如權(quán)利要求2所述的復(fù)合制劑，其特征在于所述乳酸鏈球菌素和所述L-丙氨酸質(zhì)量比為(2-100):100。4、如權(quán)利要求3所述的復(fù)合制劑，其特征在于所述乳酸鏈球菌素和所述L-丙氨酸質(zhì)量比為(3-6):100。5、一種殺滅芽孢桿菌芽孢的方法，是應(yīng)用權(quán)利要求1至4中任一所述的復(fù)合制劑殺滅芽孢。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于將所述復(fù)合制劑為溶液；所述溶液的溶劑為萌發(fā)緩沖液。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于每升所述萌發(fā)緩沖液含有以下組分lOmmolNaH2P04，lOOmmolNaCl。8、如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于每升所述復(fù)合制劑溶液中，所述活性成分的量為100-100000ug/mL。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于每升所述復(fù)合制劑溶液中，所述活性成分的量為1000-10000ug/mL。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述復(fù)合制劑溶液中，所述活性成分的量為9000-10000ug/mL。全文摘要本發(fā)明公開了一種殺滅芽孢桿菌芽孢的復(fù)合制劑。本發(fā)明提供的復(fù)合制劑，其活性成分是乳酸鏈球菌素和L-丙氨酸。應(yīng)用本發(fā)明的復(fù)合制劑，在常溫條件下，在15min內(nèi)，對芽孢的殺滅率可達(dá)99.37％，比常規(guī)試劑乳酸鏈球菌素提高了約5倍。本發(fā)明提供的復(fù)合制劑可應(yīng)用于制備洗消劑及致病性芽孢桿菌治療藥物，具有很大的開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。文檔編號A01N63/02GK101297655SQ20081011546公開日2008年11月5日申請日期2008年6月24日優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日發(fā)明者玲付,侯利華,宋小紅,張曉鵬,曹曉梅,曼李,李建民,董大勇,薇陳申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所