專利名稱：石斛蘭原生種胚培養方法
技術領域：
本發明涉及一種蘭科植物的培養方法，尤其涉及一種石斛蘭原生種胚培養的方法。
技術背景石斛蘭屬(Dendrobium)是蘭科(Orchidaceae)植物中，原生種數量僅次于石豆蘭屬 的第二大屬，目前己發現有81個種(亞種)。全球分布區域北至印度、緬甸、中國以及日 本，南至印度尼西亞、巴布亞新幾內亞、澳大利亞和新西蘭，馬萊群島和菲律賓群島。石 斛屬植物具有較高的藥用價值和觀賞價值。作為藥材的石斛蘭，其藥用價值有生津、止 咳、潤喉等功效。作為觀賞的石斛蘭，既美麗又芳香，是世界著名的花卉。石斛蘭附生于高山巖石和樹上，近年來由于森林的破壞、環境變化及大量毀滅性的采 收，使得野生石斛蘭資源遭到嚴重破壞，種群數量和分布急劇減少。石斛蘭果實為蒴果，冬春季經過授粉，幾個月后果實變為黃綠色，基本成熟。后隨著 成熟度的增加，種子變為淡黃色，后果皮干裂種子散出。每個果實中含種胚上萬至幾十萬 粒，種子胚小，種皮寬大，呈紡錘型。是一團未分化的胚細胞，不含胚乳，只達圓球胚階 段，無子葉、胚根、胚芽，沒有貯藏營養物質的組織，極難萌發。現有技術中主要的石斛蘭繁殖手段集中在利用高芽分株和扦插等無性繁殖上。上述現有技術至少存在以下缺點對母株的依賴性較強，因母株數量和生長量有限， 導致種苗繁殖緩慢、株間差異大、種苗不整齊。發明內容本發明的目的是提供一種繁殖快、株間差異小、種苗整齊的石斛蘭原生種胚培養方法。本發明的目的是通過以下技術方案實現的 本發明的石斛蘭原生種胚培養方法，包括步驟首先，采集種胚已成熟、果莢未開裂的石斛蘭蒴果，進行表面消毒處理； 然后，切開果皮取出種胚；之后，將所述種胚植入已滅菌培養基中培養。由上述本發明提供的技術方案可以看出，本發明所述的石斛蘭原生種胚培養方法，由于首先采集種胚已成熟且果莢未開裂的石斛蘭蒴果，進行表面消毒處理后，切開果皮取出 種胚；之后，直接將種胚植入已滅菌培養基中培養。繁殖快、株間差異小、種苗整齊。
具體實施方式
本發明的石斛蘭原生種胚培養方法，其較佳的具體實施方式
是，首先，采集種胚已成 熟、果莢未開裂的石斛蘭蒴果，進行表面消毒處理；然后，切開果皮取出種胚；之后，將 種胚植入已滅菌培養基中培養。在進行表面消毒處理時，可以先將石斛蘭蒴果用70。/。左右的乙醇擦洗l 2min，再用約 1(m的次氯酸鈣上清液浸泡20min左右，之后用無菌水沖洗2 4次左右。切開果皮取出種胚后，將種胚植入已滅菌培養基中的方法包括兩種-一種是將種胚浸入無菌水中搖勻，用無菌吸管將所述種胚帶水吸出，以微滴形式均勻 的滴入所述培養基中；另一種是將種胚以粉末狀均勻撒在所述培養基表面。種胚植入的培養基可為Ne培養基。當種胚植入已滅菌培養基中培養大約3個月后，可生成種胚苗，然后可將種胚苗移入 繼代培養基中培養。繼代培養基為tl培養基，可在培養基中附加0.2 0.3%的活性炭、 1.5 2.5%的蔗糖、0.6 1.0%的瓊脂等。種胚苗移入繼代培養基中培養8 10周之后，再移入生根壯苗的培養基中培養6 8 周。生根壯苗的培養基為MS+萘乙酸+6-芐基嘌呤0.5mg/L。根據需要也可以選用其它的培養 基。種胚從植入到培養成苗過程中的培養條件為培養溫度25'C 28'C，每日光照10 12 小時，光照強度1600 2000勒克斯。本發明提供的石斛蘭原生種胚的無菌胚培養技術可應用于石斛蘭原生種、雜交種的種 苗生產、保存和育種工作中，下面通過具體實施例對本發明的方法進行詳細描述石斛蘭蒴果在種子成熟未開裂前，蒴果內種子成熟到可相互分離，容易播種，不致播 種成塊狀。另外滅菌容易，只對果實表皮滅菌，萌發也快。蒴果開裂后，粉末狀種子滅菌 較為困難。切取蒴果注意勿切破果實，防止滅菌的液體滲入果實中，導致果實種子連成 塊，給播種增加難度。胚培養以不開裂的果莢進行消毒比較容易。當果實變為黃綠色時，要及時采收，否則易裂果。把種胚己成熟還未開裂的石斛蘭蒴 果，去除宿存花被、果柄，進行表面消毒。先用70。/。乙醇擦洗l 2min，再用10%的次氯酸鈣 上清液浸泡20min后，用無菌水沖洗3次。對種皮消毒后，在無菌超凈工作臺上，切開果 皮，用無菌解剖刀將兩端各切lcm，中間段縱向切開。把種子浸入小半瓶無菌水中，搖動使之擴散均勻，用無菌吸管將種子帶水吸出，以微滴形式均勻滴入培養基。或直接把粉末狀 的種子撒入已滅菌培養基，均勻分布于培養基表面。播種胚量不可太多，過多則增加轉瓶 次數，胚萌發后會出現擁擠，影響生長。蒴果內胚的成熟度影響胚萌芽率，胚成熟度高則出苗率也高，當圓球胚沿縱軸細胞有 大小細胞區別后，就可進行培養。當胚齡在3個月內，萌發率極低，萌發時間長，即使萌發 也難形成胚狀體成苗。隨著胚齡增長，其萌發期逐漸縮短，萌發率逐漸升高，成苗率也逐 漸升高。但達一定胚齡后，差異并不明顯。種子成熟時(8 10個月)其胚達到最大萌發 率、最短萌發期和最高成苗率。胚顏色以金黃色者胚培養效果最佳，果莢內種子胚顏色為 金黃色時，播種后發芽率高生長較快。果莢內種子胚顏色為乳黃色和淡黃色的，播種后生 長較慢，部分胚變黑、老化死亡。莢果內種子胚的顏色為乳白色和淡白色，播種后生長很 慢。如種子過熟(ll個月以上)，則消毒滅菌時容易開裂，胚失落，滅菌不徹底，污染率 高。果莢內種子在果莢無蟲孔或未開裂時為無菌狀態，不需消毒。消毒完成前，果莢不可 切破，消毒液進入果莢內，將影響幼嫩種子的發芽率，如用無菌水沖洗則會洗掉種子，種 子粘附在果莢上不容易進入培養基。胚的播種密度影響苗的生長速度。播種以種子相互接觸而又不出現堆積為宜。每瓶胚 量不能太多。種子肝播種的培養基為Ne培養基，不需要添加外源激素。種肝苗生長的繼代 培養基為Ne培養基，需要附加活性炭0.25%，蔗糖2%，瓊脂0.8%，蔗糖濃度均以20g/L最 佳。不需要添加外源激素。無菌播種一周后。胚由金黃色轉為淡黃色。這是由于胚吸水膨 脹，撐破種皮形成淡黃色胚，然后胚由淡黃色轉為綠色，2個月后形成第一個芽鞘。經3個 月后，均能萌發。胚培養的生根壯苗的培養基為MS +萘乙酸lmg/L + 6-芐基嘌呤0. 5mg/L，附加香蕉汁 15%和活性炭0.4%，蔗糖3%，瓊脂10g/L， pH5.4。培養條件溫度不要超過28。C 。各種蔗糖濃 度均以20g/L最佳。繼代培養基可添加10%的香蕉汁，加速幼苗的生長及促進生根。胚培養過程中的溫度可以為25。C 28。C，每日光照10h 12h (小時)，光照強度1600 lx 2000 lx(勒克斯)。轉接2次即可出苗，出苗時間要掌握在春季為好。本發明通過石斛蘭種子胚培養，可在短期內獲得大量幼小植株，可用于雜交育種和原 生種的繁殖。具有萌發率高，苗壯、出苗快，種苗品質好等優勢。進行授粉與種胚培養， 不僅加速種苗的工廠化生產，且可選育出奇特、優質的新品種。胚培養播種過程中消毒滅菌方式、播種方式、播種密度等操作方式和手段，根據條件 和需要可采用不同的手段，皆能獲得一定的胚培養效果。石斛蘭各個階段的培養基配方濃 度的適當增加或減少，以及相同作用效果的激素成分和種類的改變也可達到胚培養目的。本方法采用人工培養基對石斛蘭的胚無菌播種，胚萌發形成莖和芽，再進行繼代、生 根培養形成完整植株，通過煉苗獲得大量的試管苗。本發明提供石斛蘭無菌播種的方法和 需要的培養基，可操作性強，簡單實用。本發明把石斛蘭種子播種于無菌的培養基上，利用培養基中的養分來促進種子的萌 發，解脫了對共生菌的依賴。同時由于石斛蘭每個果莢中種子量非常大，單個果莢可培養 大批量的播種苗，出苗整齊一致，有利于優良品種和雜種苗的培育和生產。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，但本發明的保護范圍并不局限于此，任 何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都 應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1、一種石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，包括步驟首先，采集種胚已成熟、果莢未開裂的石斛蘭蒴果，進行表面消毒處理；然后，切開果皮取出種胚；之后，將所述種胚植入已滅菌培養基中培養。
2、 根據權利要求l所述的石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，所述的表面消毒處 理包括，先將所述石斛蘭蒴果用70。/。的乙醇擦洗l 2min，再用10%的次氯酸鈣上清液浸泡 20min，之后用無菌水沖洗2 4次。
3、 根據權利要求l所述的石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，將所述種胚植入己 滅菌培養基中的步驟包括，將所述種胚浸入無菌水中搖勻，用無菌吸管將所述種胚帶水吸 出，以微滴形式均勻滴入所述培養基中。
4、 根據權利要求l所述的石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，將所述種胚植入己 滅菌培養基中的步驟包括，將所述種胚以粉末狀均勻撒在所述培養基表面。
5、 根據權利要求l、 3或4所述的石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，所述種胚植入的培養基為Ne培養基。
6、 根據權利要求l所述的石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，將所述種胚植入已 滅菌培養基中培養3個月后生成種胚苗，然后將所述種胚苗移入繼代培養基中培養8 10 周。
7、 根據權利要求6所述的石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，所述的繼代培養基 為Ne培養基，所述繼代培養基中附加0.2 0.3%的活性炭、1.5 2.5%的蔗糖、0.6 1.0%的瓊脂。
8、 根據權利要求6所述的石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，所述種胚苗移入繼 代培養基中培養之后，移入生根壯苗的培養基中培養6 8周。
9、 根據權利要求7所述的石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，所述生根壯苗的培 養基為MS+萘乙酸lmg/L +6-芐基嘌呤0. 5mg/L。
10、 根據權利要求l、 6或8所述的石斛蘭原生種胚培養方法，其特征在于，所述培養 包括以下條件培養溫度25。C 28。C，每日光照10 12小時，光照強度1600 2000勒克斯。
全文摘要
本發明公開了一種石斛蘭原生種胚培養方法，首先采集種胚已成熟、果莢未開裂的石斛蘭蒴果，用70％的乙醇清洗1min～2min，再用10％的次氯酸鈣上清液浸泡20min，之后用無菌水沖洗2～4次；然后切開果皮取出種胚；之后將種胚植入已滅菌培養基中培養。可以將種胚浸入無菌水中搖勻，用無菌吸管將所述種胚帶水吸出，以微滴形式均勻滴入培養基中，也可以將種胚以粉末狀均勻撒在培養基表面。采用無菌培養基對石斛蘭的胚無菌播種，胚萌發形成莖和芽，再進行增殖、生根培養最后形成完整植株。本發明操作性強，簡單實用，繁殖快、株間差異小、種苗整齊。
文檔編號A01H4/00GK101268759SQ200810104220
公開日2008年9月24日 申請日期2008年4月16日 優先權日2008年4月16日
發明者李振堅, 雁 王, 崑 繆 申請人:中國林業科學研究院林業研究所