專利名稱：一種鐵皮石斛無菌苗的無激素培養及快速繁殖方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體地說涉及一種鐵皮石斛無菌苗的無激素培養及快速 繁殖方法。
背景技術：
石斛是傳統名貴中藥，具有很好的療效，根據《中國藥典》2005版的記載，石斛具有益 胃生津，滋陰清熱的功效，還有利咽明目，調節人體免疫力的作用。可作藥用的石斛屬植物 有30多種，其中鐵皮石斛("e/3rfraW"歷c朋必c/咖Wa11. ex Lindl)最為名貴，它又稱黑節 草，民間稱其為救命仙草，醫學界稱其為藥界大熊貓。由于使用量的增加，以及資源的短缺， 其價格不斷飚升，目前干品的價格己經到了每公斤2萬多元。在利益驅動下，產區藥農對野 生鐵皮石斛資源毀滅性采挖，加之鐵皮石斛繁殖率低，生長緩慢等特點，己經處于極度瀕危 狀態，我國政府已將野生石斛資源列入國家二類保護植物。國家鼓勵開展應用生物技術進行 鐵皮石斛大規模繁殖的研究，以保障其資源的可持續利用。
鐵皮石斛的種子極其細小，在自然界很難萌發，野生苗基本上依靠無性繁殖的方法繁殖 后代。但是種子可以在無菌條件下萌發，經過原球莖階段形成植株。我們使用顯微鏡調查發 現，鐵皮石斛每個蒴果內的種子量非常巨大，為4萬粒左右。使用種子繁殖組培苗較其它方 法具有以下優勢有性繁殖可以保證具有優良性狀，操作簡便，成苗速度快， 一定時間內獲 得優質種苗的數量巨大，能滿足快速繁殖的需要。
關于鐵皮石斛的組織培養和無性繁殖已有相關研究報道，但絕大部分的培養方法都添加 了激素以促進植株的分化和生長，并且研究內容不系統。激素的長期應用，會導致組培苗的 優良性狀發生退化或變異。作為藥用植物來說，外源激素的使用不利于人的健康。此外，報 道中使用的組織培養方法操作復雜，費用昂貴，且需要的人員多，占用空間大。本發明使用 的培養方法操作簡便，費用低廉，不需要對組培苗進行頻繁繼代，較好的解決了以上問題。
發明內容
本發明的目的是提供一種鐵皮石斛無菌苗的無激素培養及快速繁殖的方法。該方法操作 簡便，成本低廉，培養過程中不使用激素，較好地解決了目前普遍存在于鐵皮石斛組織培養 過程中的培養成本高和大量使用激素這兩方面問題。
為了實現上述目的，本發明提供了如下技術方案
1、 種子的無菌萌發
采摘鐵皮石斛的果實，進行表面消毒處理；將種子播種在常規石斛無菌萌發培養基上誘 導種子無菌萌發。
2、 原球莖及種苗的誘導和培養播種后的培養瓶置于原球莖及種苗誘導條件下培養，培養條件為溫度10-27°C，光照 可以為紅光，綠光，無光，黃光，藍光；種子萌發形成原球莖或種苗。
3、 無菌苗的生根
根據需要，將上述條件下培養的種苗轉移到誘導生根的條件下培養，以獲得大量性狀優 良的無菌苗；誘導生根的培養條件為自然光或日光燈，每日光照8-24小時，光照強度 500-6000Lx;培養溫度為10-30°C。
4、 無菌苗的增殖及壯苗培養
生根的無菌苗可以經過增殖、壯苗程序獲得大量無菌苗；也可以直接在壯苗培養基中進 行壯苗；
增殖方法為在以下兩種培養基中交替培養，在每種培養基上的培養周期均為3-6個月，
交替l-2次；兩種培養基的組成分別為①N6培養基，蔗糖，瓊脂；②N6培養基，蔗糖，瓊
脂，天然附加物；
增殖和壯苗培養的培養條件均為自然光或日光燈，每日光照8-16小時，光照強度為
1000-6000Lx，培養溫度為10-3(TC，繼代周期為3-6個月，最終獲得壯苗； 壯苗培養基組成為N6培養基，蔗糖，活性碳，瓊脂，天然附加物。
5、 無菌苗的練苗及移栽
壯苗培養后的無菌苗，經過練苗，即可出瓶移栽；
練苗方法為先將培養瓶從壯苗培養條件轉移到遮蔭和自然變溫的條件下，放置7-14天； 然后打開培養瓶的瓶口，再放置2-4天；
出瓶移栽的方法為無菌苗出瓶后，用自來水洗凈培養基后，栽種到花盆或育苗盤或苗
圃中；栽種基質為碎石塊木塊或樹皮水苔=1-3:卜2: 0. 3-1;栽種后要保持環境通風、 遮陽，濕度60%-90%;按時澆水，待苗成活，長出新根、新葉后即可移栽大田。
上述方法中，無菌苗增殖所用的兩種培養基的組成，按重量百分比分別為
(1) N6培養基,蔗糖40-60g/L， pH5.5-6.0，瓊脂7-15g/L;
(2) N6培養基，蔗糖40-60g/L， pH5. 5_6. 0，瓊脂7-15g/L，在此培養基上添加天然附 加物，天然附加物可以是椰子汁60-200g/L，香蕉汁60-200g/L， 土豆汁60-200g/L，番茄 汁50-150g/L，綠豆汁50-200g/L;
上述方法中，壯苗培養基的組成，按重量百分比分別為
N6培養基，蔗糖40-60g/L，活性炭0.5-3g/L， pH5. 5-6. 5,瓊脂7-15g/L，天然附加物 可以是椰子汁60-200g/L，香蕉汁60-200g/L， 土豆汁60-200g/L,番茄汁50-150g/L，綠 豆汁50-150g/L;
與以往的鐵皮石斛無菌苗快速繁殖技術相比，本發明采用的技術方法具有以下優點
(1) 操作步驟簡便，節省人力、物力，生產成本低，便于規模化、工業化應用。
(2) 由于種苗能夠周期性提供，可以滿足工業化生產所要求的連續性生產流程。(3)整套技術采用無激素培養，有利于保持種苗的優良形狀，提高其藥用價值，同時， 由于免除了脫激素的生產環節，使操作變得更簡單。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容。但本發明的內容并不僅僅局限于此。 實施例1:
自廣西南寧采集的鐵皮石斛的蒴果，表面消毒后，獲得無菌種子，種子播種在無菌萌發
固體培養基表面，培養基組成為KC培養基，添加蔗糖20g/L、香蕉150g/L，煮20分鐘后 取汁加入培養基中，瓊脂為9.0g/L， pH5.2。培養瓶置于溫度為20-25°C，光照為藍光的原球 莖及種苗誘導條件下培養。
在上述條件下培養5個月后，種子萌發形成幼苗，取出部分已經播種的三角瓶轉移到誘 導生根的條件下培養，培養條件為光照由日光燈產生，每日光照10小時，光照強度為1500Lx， 培養溫度為25土2。C，培養4個月誘導形成有根的健壯無菌苗。
將有根健壯無菌苗采用增殖方法增殖培養，增殖方法為在以下兩種培養基中交替培養， 培養條件為光照由日光燈產生，每日光照10小時，光照強度為1500Lx，培養溫度為20-25 °C，培養周期為4個月，培養基的使用依次為A培養基，B培養基，然后幼苗發生分化和增 殖；兩種培養基組成如下.
A培養基:N6培養基，蔗糖50g/L， pH5.8，瓊脂10. 5g/L;
B培養基N6培養基，蔗糖50g/L，瓊脂9.0g/L， pH5.8，天然附加物為香蕉100g/L, 番茄80g/L，分別煮20分鐘后取汁加入培養基中。
生長出增殖的小苗后進行壯苗培養，壯苗培養的條件為光照由日光燈產生，每日光照 IO小時，光照強度為1500Lx，培養溫度為20-25'C，壯苗培養基為N6培養基，蔗糖50g/L， 活性炭2g/L，瓊脂9.5g/L， pH5.8，香蕉200g/L，綠豆80g/L，煮20分鐘后取汁加入培養基 中，最終獲得壯苗。
無菌苗在自然光及自然變溫條件下練苗10天，然后再打開瓶口練苗3天。無菌苗出瓶后，
用自來水沖洗干凈培養基，栽種到育苗盤中。基質為碎石塊木塊水苔=1: 2: 0.5。栽
后將育苗盤放置在通風、遮陽網遮光的溫室中，濕度控制在75%_85%，溫度為20-25r。每周 澆水一次。待苗成活并長出新根、新葉后即可大田移栽。移栽地為云南西雙版納鐵皮石斛適 生地蓋有遮陽網的簡易溫棚內，移栽成活率達到了 92.3°/。。 實施例2:
自廣西南寧采集的鐵皮石斛的蒴果，表面消毒后，獲得無菌種子，種子播種在盛有無菌 萌發固體培養基的容器中，培養基組成為大量元素減半的MS培養基，添加蔗糖30g/L，肌 醇100mg/L，椰子汁100g/L， pH5.8，瓊脂9.0g/L。培養條件為溫度15-25。C，光照為黃光。
在上述條件下培養IO個月后，種子萌發形成具有3片葉的幼苗，取出部分培養容器轉移 到誘導生根的條件下培養，培養條件為自然光照，每日光照8-10小時，光照強度為2000-2500Lx，培養溫度為20_25°C，培養3個月誘導形成有根無菌苗。
將誘導得到的有根無菌苗轉接到壯苗培養基中壯苗培養，壯苗培養基為N6培養基，蔗 糖50g/L， 土豆150g/L，番茄80g/L，煮20分鐘后取汁加入培養基中，活性炭2g/L，瓊脂 9.5g/L， pH5.8。得到粗壯種苗后即可進行練苗移栽，練苗移栽方法同實施例l。 實施例3: '
自貴州赤水采集的經人工授粉后生長的鐵皮石斛的蒴果，表面消毒后，獲得無菌種子， 種子播種在盛有無菌萌發固體培養基的容器中，培養基組成為B5培養基，添加50g/L的蔗 糖，瓊脂9.0g/L， pH5.8;培養條件為溫度15-25°C，無光照培養。培養2個月后，種子萌 發形成原球莖，然后把培養容器轉移到綠光環境中繼續培養，溫度為20-25'C。
培養5個月后，取出部分培養容器轉移到誘導生根的條件下培養自然光照，每日光照 8-10小時，光照強度為2000-2500Lx，培養溫度為20-25°C，培養4個月誘導形成有根無菌 苗。
將上述有根無菌苗繼代到壯苗培養基中N6培養基，添加蔗糖50g/L，活性炭2g/L，瓊 脂9.5g/L， 土豆150g/L，綠豆100g/L，煮20分鐘后取汁加入培養基中，pH5.8。形成壯苗 后進行練苗移栽，練苗移栽方法如下
無菌苗在自然光及自然變溫條件下練苗12天，然后再打開瓶口練苗1天。無菌苗出瓶后，
用自來水沖洗干凈培養基，栽種到花盆中。基質為碎石塊樹皮水苔=2: 2: 0.5。栽后
將花盆放置在通風、遮陽網遮光的溫室中，濕度控制在70%-80%,溫度為20-25'C。每周澆水 一次。待苗成活并長出新根、新葉后即可大田移栽。移栽地為云南西雙版納鐵皮石斛適生地 蓋有遮陽網的簡易溫棚內，移栽成活率達到了90.6%。 實施例4:
自廣西南寧采集的經人工授粉后生長的鐵皮石斛的蒴果，表面消毒后，獲得無菌種子， 種子播種在無菌萌發固體培養基表面，培養基組成為N6培養基，添加50g/L的蔗糖，瓊脂 9.0g/L， pH5.8。培養瓶置于溫度為15-20°C，光照為紅光的條件下培養。
在上述條件下培養12個月，種子萌發形成幼苗，取出部分培養瓶轉移到誘導生根的條件 下培養光照培養，光照由日光燈產生，每日光照10小時，光照強度為1500Lx，培養溫度 為20-25'C，培養2個月誘導形成有根的無菌苗。
將誘導得到的有根無菌苗采用增殖方法增殖培養在以下兩種培養基中交替培養，培養
周期為4個月，培養基的使用依次為A培養基，B培養基，然后幼苗發生分化和增殖；兩種 培養基組成如下
A培養基:N6培養基，蔗糖50g/L， pH5.8，瓊脂10.5g/L;
B培養基N6培養基，蔗糖50g/L，瓊脂9. 0g/L，天然附加物為土豆150g/L，番茄80g/L， 分別煮20分鐘后取汁加入培養基中，pH5.8。
生長出增殖的小苗后進行壯苗培養，壯苗培養基為N6培養基，添加蔗糖50g/L，活性炭2g/L，瓊脂9.5g/L,香蕉200g/L，綠豆80g/L，煮20分鐘后取汁加入培養基中，pH5. 8。
獲得壯苗后進行練苗移栽，練苗移栽方法如下
無菌苗在自然光及自然變溫條件下練苗7天，然后再打開瓶口練苗2天。無菌苗出瓶后， 用自來水沖洗干凈培養基，栽種到苗床上。基質為碎石塊樹皮水苔=2: 2: 0.5。栽后
注意通風，用單層遮陽網遮光，濕度控制在75%-85%，溫度為18-26°C。每周澆水一次。待苗 成活并長出新根、新葉后即可大田移栽。移栽地為云南西雙版納鐵皮石斛適生地蓋有遮陽網 的簡易溫棚內，移栽成活率達到了92.5%。
權利要求
1.一種鐵皮石斛無菌苗的無激素培養及快速繁殖方法，包括步驟(1)種子的無菌萌發采摘鐵皮石斛的果實，進行表面消毒處理；將種子播種在常規石斛無菌萌發培養基上誘導種子無菌萌發；(2)原球莖及種苗的誘導和培養播種子后的培養瓶置于原球莖及種苗誘導條件下培養，培養條件為溫度10-27℃，光照為紅光，綠光，無光，黃光，藍光；種子萌發形成原球莖或種苗；(3)無菌苗的生根根據需要，將上述條件下培養的種苗轉移到誘導生根的條件下培養，以獲得大量性狀優良的無菌苗；誘導生根的培養條件為自然光或日光燈，每日光照8-24小時，光照強度500-6000Lx；培養溫度為10-30℃；(4)無菌苗的增殖及壯苗培養生根的無菌苗可以經過增殖、壯苗程序獲得大量無菌苗；也可以直接在壯苗培養基中進行壯苗；增殖方法為在以下兩種培養基中交替培養，在每種培養基上的培養周期均為3-6個月，交替1-2次；兩種培養基的組成分別為①N6培養基，蔗糖，瓊脂；②N6培養基，蔗糖，天然附加物，瓊脂；增殖和壯苗培養的培養條件均為自然光或日光燈，每日光照8-16小時，光照強度為1000-6000Lx，培養溫度為10-30℃，繼代周期為3-6個月，最終獲得壯苗；壯苗培養基組成為N6培養基，蔗糖，活性碳，天然附加物，瓊脂；(5)無菌苗的練苗及移栽壯苗培養后的無菌苗，經過練苗，即可出瓶移栽。
2、 根據權力要求1中所述的方法，其特征在于無菌苗增殖方法中所用的兩種培養基的組成，按重量百分比計分別為(1) N6培養基，蔗糖40-60g/L， pH5. 5-6.0，瓊脂7-15g/L;(2) N6培養基，蔗糖40-60g/L， pH5. 5-6. 0，瓊脂7-15g/L，在此培養基上添加天然附 加物，天然附加物可以是椰子汁60-200g/L，香蕉汁60-200g/L， 土豆汁60-200g/L，番茄 汁50-150g/L，綠豆汁50-200g/L。
3、 根據權力要求1中所述的方法，其特征在于壯苗培養基的組成，按重量百分比計分別為N6培養基，蔗糖40-60g/L，活性炭0.5-3g/L， pH5. 5-6. 5，瓊脂7_15g/L，天然附加物可 以是椰子汁60-200g/L，香蕉汁60-200g/L， 土豆汁60_200g/L，番茄汁50-150g/L，綠豆 汁50-150g/L。
4. 根據權力要求1中所述方法，其特征在于無菌苗的練苗方法可以為先將培養瓶從壯苗培養條件轉移到遮蔭和自然變溫的條件下，放置7-14天；然后打開培養瓶的瓶口，再放置 2-4天。
5.根據權力要求1中所述方法，其特征在于出瓶移栽的方法為無菌苗出瓶后，用自來 水洗凈培養基后，栽種到花盆或育苗盤或苗圃中；栽種基質為碎石塊木塊或樹皮水苔=1-3: 1-2: 0.3-1;栽種后要保持環境通風、遮陽，濕度60%-90%;按時澆水，待苗成活， 長出新根、新葉后即可移栽大田。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，涉及一種鐵皮石斛無菌苗的無激素培養及快速繁殖方法，內容包括鐵皮石斛種子的無菌萌發，原球莖及幼苗的形成與保存，無菌苗的生根、增殖和壯苗培養，無菌苗的練苗和移栽。該項技術操作簡便，占用空間小，生產成本低，便于大規模工業化生產應用。利用該項技術繁殖鐵皮石斛，有利于保持種苗的優良性狀，提高種苗使用的安全性。
文檔編號A01C1/00GK101564008SQ20081009395
公開日2009年10月28日 申請日期2008年4月24日 優先權日2008年4月24日
發明者侯曉強, 房慧勇, 燕 李, 邢曉科, 郭順星, 陳曉梅 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所