專利名稱：：用于抑制植物病原真菌的八角精油及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及具抗菌活性八角精油的制備和分析,八角精油及其主要成分反式-茴香腦對植物病原真齒的抑制作用，屬于農藥
技術領域：
。植物精油(plantessentialoil)是存在于植物體內的一類可隨水蒸汽蒸餾、且具有一定香味的揮發性油狀液體的總稱，植物精油具有抗菌、殺蟲等多種生物活性，廣泛地用在醫藥、農藥、香料、化妝品和食品等領域。八角(頂ici"加venwiHook.f.)在分類上屬于木蘭科(Magnoliaceac)八角屬，為重耍的藥用植物和香料植物，主要分布在我國的云南、廣西、廣東、福建、安徵、江西、湖南等省份.我國是八角的主產國，世界上八角需要量的80%來自于我國。目前尚未見八角精油對植物病原真菌番茄早疫病菌"/temiriaM/flW)、芒果蒂腐病菌(2^/yoA>/ofifl<A￡o6rtimae〉、玉米,』、斑病菌(丑i)w/a;i紐ma3^f紐〉、,』、麥赤每(Fusari肺gmmmeamm),黃瓜枯萎病菌(Fusai7'uman^Vwrumf.sp.cucumerz'num)、番琉枯賽病菌(尸Mran'uma9^porumf.sp.()v0perfici')、棉花枯賽病幽'(尸usa"'柳。，porumf.spv咖'"yfe加m)、稻瘟菌(Afagn，r/Ae07zae)、瓜果腐每(i^Ai,um.a//ui加V/ermaAim)、小麥紋枯病菌(朋&octoni'acerea泡)、水稻紋枯病菌(/2Aizocfom'aso/朋i')抑制作用的報道。本發明著重于八角精油的制備、八角精油及其主要成分反式茴香腦(frans"anelhole)對上述植物病原真菌的抑制活性研究，為新型植物源殺菌劑的研究與開發提供依據。為了保護環境，保護人類及農業的可持續發展，急霈進行高效、低毒、低殘留的環境相容型農藥的研制.本發明的目的之一是提供八角精油的制備方法；另一個目的是提供八角精油作為髙效抗真菌劑的例子。
發明內容本發明涉及用于抑制植物病原真菌的八角精油及其制備方法，提供如下的技術方法。1、八角精油的制備采用水蒸餾法制備八角精油，得率為7.48%(mg/g干重)2、八角糖油的化學組成分析采用氣相色譜-質譜(GC-MS〉聯用的方法，從八角精油中一共鑒定出了29個化合物(表l),一f總含量的96.19%。其中含量最高的幾種化學成分分別為反式-茴香腦(frons-Anethole,83.483%)、檸樣烯'(Limonene,2.403。/。〉、2-(l-環戊烯基)-呋喃(2"(l"Cyclopentenyl)-fiiran,0.894%),順式-茴香腦(cis-A加thole，0.708%)、Y-萜品醉(Y-Teipineol,0.366°/。〉、異冰片酯(Isobornyltiiiocyanoacetatel,0.356%)等。3、八角精油及其主要成分反式-茵香腦對真茵生長的抑制作用采用菌絲生長速率抑制法測定八角精油和反式-茴香腦對番茄早疫病菌("ter加riQso/朋i)、芒果蒂腐病菌(So/^t^p/(7必o/AeoZwmae)、玉米,J、斑病菌(丑^po/anis加<^^&)、,J、麥赤每(Fusan'umjr咖i'nearum)、黃瓜枯萎病菌(F咖".鵬(M^porumf鄰.cucumerin柳)、番茄枯萎病菌(Fu5。"'umon^porumf,sp.(yc0/wrsi'ci)、棉花枯萎病菌(Fman'umaji^v/Torumf.spvan'n^c/um),稻疽菌(Jl/agn呼or欲egrisea)、'J、-麥紋枯病菌OMizocfo股'acewaZ&)、水稻紋枯病菌(朋&octonfaM/anO等10種植物病原真菌均具有明顯的抑制作用(表2)。4、八角精油及其主要成分反式-茴香腦揮發后對真菌生長的抑制作用八角精油和反式-茴香腦揮發后對瓜果腐每(iyW鵬呼Afl/u&nrnrfwn〉和芒果蒂腐病菌(5o//ya^p/odtorteo6ro/nae)的生長表現出較強的抑制作用(表3)。5、八角糖油及其主要成分反式-茴香腦對稻旌菌孢子萌發的抑制作用八角精油和反式-茴香腦對稻瘟菌孢子萌發的半抑制濃度分別為0.32/tg/mL和0.384/ig/niL。圖l:八角果實精油氣相色譜圖。圖2:正烷烴CVC4o的氣相色譜圖。本發明的優點本發明首次明確了八角精油具有廣譜的抗植物病原真菌的活性，反式茴香腦是八角精油中的主要抗菌活性成分，八角精油中的活性成分主要為揮發性物質。目的是利用植物資源，以求獲得抗菌活性成分，為植物源農藥的研究與開發，為探討植物精油的生理生態功能提供依據。為了更好地理解本發明，下面結合本發明的實施例進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容并不局限于此。具體實施方式實施例l:八角糖油的制備將陰干的八角果實粉碎至40目，準確稱取適量的粉碎材料，加入一定量的蒸餾水，浸泡1小時后進行水蒸餾.在每5mL油水混合的餾出液中，加入lmg的NaCl,用無水乙醚進行萃取(重復3次，每次10mL),用無水硫酸鈉(2g)干燥后，讓乙醚自然揮發，得精制的八角精油，于4。C密封保存。計算得油率(v/w):得油率(%)=~~植物材料的質量(g)實施例2:八角精油的化學組成分析GC條件色譜柱為安捷倫公司(Agilent)HP-5石英毛細管柱，[SOmxO.ZSmmxOJSjim(5%苯基)-甲基聚硅氧烷]。進樣口溫度250"C,傳輸線溫度240"C。程序升溫如下:起始柱溫50。C停留lmin;以3。C/min升至150-C,停留lmin:然后以8。C/min升至230°C,停留2min;最后以20°C/min升至260。C,停留5nrin。載氣為髙純氣(99.999%);柱流量1mL/min,用實施例1所述的方法制備精油，精油進樣量每次為l.OfiL(分流比1:20)。八角果實精油氣相色譜圖見圖1。GC-MS分析釆用Agilent6890GC—5973MSD氣質聯用儀完成。GC條件如上所述。MS條件如下離子源溫度280-C:電離方式EI,電離能量70eV:質暈掃描范圍m/z:50-500。保留系數(RetentionIndices,RI〉的擁定系列正院烴QrC40(Sigma)用氣仿稀釋50倍，然后與上述GC條件一樣進樣分離，記錄(VC4o各正烷烴保留時間。用線性升溫公式計算各成分的RI值RI=lOO;i+100(l的-l織,)/(l織，+rlg/，)，其中t、"和^;分別為被分析的組分和碳原子數處于n和n+l之間的正烷烴(^<^々，+|)的流出峰保留時間(min)。正垸烴C8-C40的氣相色譜圖見圖2。數據庫的檢索各組分峰相對含量(Relativeamoimte，RA)的確定采用峰面積歸一化法.各組分峰用NISTLibrary(2002版)質譜庫進行檢索，同時與相關文獻RI值進行比較，最后以質譜匹配度和RI值匹配度最高的化學結構為最佳鑒定結果:無RI值匹配性的以質譜匹配度最髙的化學結構為鑒定結果.GC-MS分析結果見表l。從八角精油中一共鑒定出了29個化合物，占總含量的96.19%。其中含暈最商的兒種化學成分分別為反式-茴香腦(ftww-Anefliole,83.483%)、擰樣烯(Limoncne，2.403°/。〉、2-(l-環戊烯基)"呋喃(2-(l-Cyclopentenyl)-ftiTan，0.894%)、順式-茴香腦(c紐-Anethole，0.708%)、7"薛品醇(TTerpineol，0.366°/。)、異冰片酯(Isobomylthiocyanoacetatel，0.356%)等，表l八角糖油的化學成分GC-MS分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>14Linalooloxide(fiiianoid)15Teipinole加16Linalool17Bomeol181,4-Tetpineol19Isobomylthiocyanoacetate20"y-Teipineol21cis-Anethole22的fu-Anetfaole23iS-Elemene13.03510860.01213.67211000.10114.24211140.31716.18011590.01217.61111890.17318.24812030.35618.70912140.36621.75612830.70823.508132489.48326.32713890.050<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>實施例3:/^l糖油及其主要成分反式-菌香腦的抗真菌活性(1)培養基馬鈴1F葡萄糖諒脂培養基和痛麥西紅柿培養基馬鈴暮葡萄t^脂培養基(PDA):配制1L的馬鈴蹇葡萄糖瓊脂培養基(Potatodextroseagar,PDA〉的步驟為將洗凈去皮的馬鈴墓200g，切成小塊，加去離子水lOOOmL，煮沸30min,過濾，取濾液，加瓊脂20g和葡萄糖20g,加熱使瓊脂融化后，趁熱用紗布過濾，然后加去離子水定容至1000mL。121°C濕熱滅菌20min。該培養基用于除稻瘟菌和瓜果腐g以外的真菌培養。燕麥西紅柿培養基(OTA):配制1L的燕麥西紅柿培養基(Oat-tomatoagarmediumOTA)的步驟為將完全成熟的兩紅柿切碎，用榨汁機榨汁，汁液用四層紗布過濾，取已過濾的汁液150mL待用.同時，稱取燕麥片30g,加入1000mL去離子水，煮沸30min,注意邊煮邊攏拌.煮好的燕麥片用兩層紗布過濾.收集濾液，然后往濾液中加入已準備好的番茄汁150mL和20g瓊脂，加熱融化，趁熱用紗布過濾，然后加去離子水定容至1000mL。分裝后121T濕熱滅菌2Qmin。該培養基用于稻瘟菌和瓜果腐霉的培養。(2)供試的植物病原真苗番茄早疫病菌"teniarian^ani)、芒果蒂腐病菌(丑o吵ot^/otto《Aeo&ramae)、玉米小斑病菌(丑i]po/咖is咖;vdis〉、小麥赤每(FVuan'鵬gr鵬i'"e。rM/R)、黃瓜枯麥病菌(尸um"'柳0W。nwM￡sp.cucumen7ium)、番莉枯賽病菌(尸itfon'umaxj^porM/wf.sp.(ycoperfi'ci')、棉花枯妻病幽(尸usaniimoqv/70"101f-甲va5i'ny^c加in)、稻疽I^Gl/dignapoWAeozyzae)、,J、麥紋枯病菌(及Aizoctoni'acerea/^)、水稻紋枯病菌(劃&octo"iaso/ani')。(3)實驗設計釆用帶毒平板法，將八角精油配成終濃度為0.05nL/mL、0.08jiL/mL、0.10nL/mL、0.15(iL/mL、0.20iiL/mL和0.25nL/mL(稻瘟菌、黃瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、番茄枯萎病菌采用0.05nUmL、0.08uL/mL、0.10(iL/mL、0.20nLAnL、0.25jiL/mL和0.30|iL/mL)，測定其對植物病原真菌生長的抑制率，培養皿($=60mm)，計算各濃度對耙標真菌的抑制率，試驗結果采用MicrosoftExcel軟件進行數據整理，在分析中，供試樣品濃度取對數，抑制率換算成生物統計機率值，求得相關回歸方程，從而可以求得抑制中濃度(IC5。)。實驗設空白對照和陽性對照(1.5pgAnL多菌靈)，每個處理二個重復。(4)制備菌餅，制備菌餅應在無菌條件下進行，用打孔器($=5mm)在培養好的菌落外緣切下帶菌培養基柱-菌餅.這種來自菌落外緣的菌餅接在新鮮培養基上的生長速率的差異較小。(5)制備帶毒瓊鷹培養基分別吸取0.005mL、0.008mL、O.OlmL、0.015rnL、0.02mL和0.025mL純化精油(黃瓜枯萎病菌，芒果蒂腐病菌，玉米小斑病菌，番茄枯萎病菌分別吸取0.005mL、O.OOSinL、O.OlmL、0.02rnL、0.025mL、和0.03mL),在PDA培養基未凝同前(約50。C),加入到lOOmL培養基中，充分混合均勻后倒入培養皿$=60mm內(每皿lOmL〉冷凝即成帶毒培養基。八角精油終濃度分別為0.05nLAnL、0.08fiL/mL、0.10nL/mL、0.15nL/mL、(K2nL/mL和0.25jiL/mL(黃瓜枯萎病菌，芒果蒂腐病菌，玉米小斑病菌，番茄枯蔞病菌的帶毒平板八角精油終濃度分別為0.05(iUmL、0.08nL/mL、0.10nL/mL、0.2jiLAnL、0.25nL/mL承l0.3jiL/mL)，陽性對照的含量為1.5jig/mL多菌靈。(6)移植菌餅用接種針或消毒的攝子將菌餅反面(有菌絲的一面向下和培養基貼合〉移植到帶每培養基上，一個培養皿中央接一個菌餅，(7〉結果觀察和數據處理待空白對照苗落接近培養皿邊緣時觀察結果，取出培養皿用卡尺測紫菌落直徑，每個菌落十宇交叉測兩次直徑。用下述公式計算抑制率(計算抑制率時用溶劑作對照)菌落擴展直徑(mm)=測量菌落的平均擴展直徑(mm)-5(菌餅直徑mm)站韭翻凍對照菌落擴展直徑-處理菌落擴展直徑xinno/相對抑制率--對照菌落擴展直徑-Xl00%試驗結果采用MicrosoftExcel軟件進行數據整理，在分析中，供試樣品濃度取對數(JSf),抑制率換算成生物統計幾率值(10,求得毒力回歸方程(r=aAr+b),從而可以求得抑制中濃度(IC50)。通過實施例2對八角果實精油的分析結果，反式-茴香腦占83.483%,為其主耍成分。從東京化成:丄:業株式會杜購買到反g-茴香腦(trans"anethole〉標準品。采用菌絲生長速率抑制法測定八角精油和反式-茴香腦對番茄早疫病菌、芒果蒂腐病菌、玉米小斑病菌、小麥赤S、黃瓜枯泰病菌、番茄枯賽病菌、棉花枯姿病菌、稻瘟菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌等10種植物病原真菌的抑制作用(結果見表2),其中對番茄早疫病菌、芒果蒂腐病菌、玉米小斑病菌和小麥赤蹇表現山較強的抑制活性。表2八角精油和反式-茴香腦對植物病原真菌的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4:八角糖油揮發性成分的抗真苗活性(1)培養基同實施例3。(2)供試的植物病原真菌瓜果腐S(i^說i柳呼A朋iVtermaAim)和芒果蒂腐病菌(勘吵《^/</&(3)實驗設計在一個密封的大培養皿($-150mm)中放入三個單獨的小培養皿(*=60mm)，其中兩個不含精油的PDA平板分別,種瓜果腐籌和芒果蒂腐病菌，而第三個培養皿中加入lOmL含有一系列八角精油或反式-茴香腦濃度的PDA培養基，每個處理重復三次.這樣真菌就沒有直接與精油接觸，W此菌絲生長的任何影響都可看作是揮發性物質作用的結果。(4)制備苗餅-.同實施例3。(5)制備帶毒瓊脂培養基同實施例3。(6〉移植菌餅同實施例3。(7)結果觀察和數據處理同實施例3。八角精油和反式-茴香腦對瓜果腐每和芒果蒂腐病菌生長(表3)表現出較強的抑制作用。表3八角精油和反式-茴香腦揮發后對植物病原真菌的抑制作用植物病原真菌糖油或反式-茴香腦毒性抑制回歸方程相關系數(R)IQ。(Mg/mL)瓜果腐萄八角精油y=4.386x+7.838~~反式茴香腦y=4.045x+7.7990.9830.199芒果蒂腐病菌八角精油y=3.223x+6.4790.9890.343反式茴香腦y=2.972x+6.6460.9790.274實施例5:八角精油及其主要成分反式-茴香腦對稻疽菌孢子萌發的抑制作用(1)培養基同實施例3。(2)供試的植物病原真菌稻瘟菌(A/a￡^rMeooie)。(3)實驗設計將供試樣品配制成一系列濃度，測定其對稻瘟菌孢子萌發的抑制率，計算各濃度的抑制率，試驗結果釆用MicrosoftExcel軟件進行數據整理，在分析中，供試樣品濃度取對數，抑制率換算成生物統計幾率值，求得毒力回歸方程，從而可以求得抑制中濃度(ICso)。實驗設空白對照、溶劑對照(15°/0丙酮，v/v)和陽性對照(5.0jig/inL多菌靈)，每個處理兩個重復。(4)稻痕菌活化培養用滅菌的接種針從保存菌種試管中挑取少至菌絲，接種到燕麥番茄汁培養基平板上，用封口膜封好，25。C下培養，(5)稻旌菌繼代培養倒燕麥番茄汁培養基平板，每皿倒約40mL。用移液槍在稻瘟菌菌落中央滴加無菌水1mL,然后用滅菌后的接種針輕輕擦洗菌落表面，注意用力要輕，以免擦破培養基表面，待無菌水變渾濁后，再用移液槍吸取100pL滴加到倒好的燕麥番茄汁培養基平板表面，然后用玻璃涂棒將其涂散均勻，待培養基表面干燥后，蓋好倒置25°(:下培養.(6)機*!|激誘導產孢接種活化的稻瘟菌室溫下培養48h后，在其表面滴加無菌水約3mL,然后用滅菌后的棉簽輕輕擦洗菌絲，將菌絲機械擦斷，連續擦洗兩次，待灰色菌落變為黑色后即可，將表面的水倒掉，然后倒扣于滅菌后的吸水紙上，晾干水分，晾置半小時后用三層滅菌后的紗布將皿口封住，置丁-干燥有光的條件下培養，(7)配制糖油溶液分別吸取精油稱100jxL到滅菌過的Eppendorf管中，加入0.3mL的丙酮(100%),再加入適量無菌水定容至1mL,振蕩溶解，配制成精油的濃度為100jiL/mL。然后分別吸取上述母液l、2、4、6、8、10、20jiL,加入0.3mL丙兩，再分別加無菌水定容至lmL，配制成O.l、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0nL/mL的溶液.(8)配制孢子條浮液往活化的稻瘟菌菌落上滴加無菌水，然后用無菌棉簽輕輕擦洗菌落表面，洗下孢子，將洗液裝到1mL的離心管中，進行離心，離心時設置離心機的轉速為10000rpm,每次離心10min。每次離心完后，倒掉上層液，再加無菌水進行洗條，然后再離心，離心后倒掉上層液，然后配制孢子懸浮液。利用血球記數板測定孢子濃度，將孢子濃度配制為10^個/rnL,(9)進行活性測定準備千凈培養皿，然后在每個培養皿中放上四層吸水紙，進行滅菌，滅齒后，往每皿中加無菌水5mL。在吸水紙上平行放置兩根無菌牙簽。另準備好凹玻片，用100%的乙醇浸泡2411,然后晾干，晾干后在每個凹洞上滴加25(iL的孢子懸浮液和25nL的藥劑(注意滴加前應在振蕩器上紫蕩片刻，以保證孢子懸浮液和藥劑溶液均勻)，這樣得到精油的檢測終濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和l.OjiLZmL,溶劑終濃度為15%丙酮，每處理3個重復，然后將凹玻片放在培養皿中的牙簽上，室溫卜'培養7h后進行觀察。(10)觀察記錄實驗結果和孢子萌發率的計JT:在顯微鏡10x10(目鏡x物鏡〉倍下觀測每一凹玻片上的孢子萌發情況，選擇不同的2個視野，每個視野中100以上個孢子，共數100個孢子，用計數器記下萌發孢子數，將4個重復合到一塊計箅孢子萌發率。払，*必袖"，、溶劑對照萌發率-處理萌發率.抱子萌發抑制率(％)=-沾^w加廿必由-^x100溶劑對照萌發率試驗結果采用MicrosoftExcel軟件進行數據整理，在分析中，供試樣品濃度取對數(AT),抑制率換笄成生物統計幾率值(JO,求得毒力回歸方程(y-aAT+b),從而可以求得抑制中濃度(ICS0)。八角精油和反式-茴香腦對稻瘟菌孢子萌發的半抑制濃度分別為0.32/tg/mL和0.384/ig/mL,權利要求1、八角精油在制備抑制植物病原真菌藥物中的應用。2、一種按權利要求l所述的精油，其主要抗菌活性成分為反式-茴香腦。3、一種按權利要求1所述的精油，對番茄早疫病菌、芒果蒂腐病菌、玉米小斑病菌、小麥赤每、黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟菌、瓜果腐霉、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌等真菌具有明顯抑制活性。全文摘要本發明涉及一種抑制植物病原真菌的植物精油及其制備方法。本發明所述的精油是從八角果實中提取出來的，經氣相色譜-質譜分析含有29種主要成分，其中反式-茴香腦占83.483％。本發明首次明確反式-茴香腦是八角精油中的主要抗菌活性成分，同時明確了八角精油及其主要成分反式-茴香腦對番茄早疫病菌、芒果蒂腐病菌、玉米小斑病菌、小麥赤霉、黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟菌、瓜果腐霉、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌等多種植物病原真菌具有明顯抑制活性，可用于防治植物病害。文檔編號A01N65/00GK101223891SQ20081005684公開日2008年7月23日申請日期2008年1月25日優先權日2008年1月25日發明者周立剛,姜微波,張小娟,趙江林,郭澤建,黃永富,龔佑文申請人:中國農業大學