專利名稱：赤松(Pinus densiflora)組織培養增殖方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體是指赤松組織培養增殖方法。
背景技術：
松屬(尸/wm)是針葉樹各屬中最大也是最重要的一個屬，大約有116個種以及變種和雜 種，在世界上分布、種植極為廣泛，不僅在世界木材、松脂及造紙等方面有突出貢獻，而且 在生態系統中具有非常重要的地位。由于受各種病蟲害的危害，每年均有大量松樹枯死，其 中，受松材線蟲病(Sw^a/^e/^c/u^矽/o/^z7z^)危害最為嚴重。該病目前已導致日本松林總 面積266萬hm2中的45萬hm2發病，損失十分慘重。在我國，因松材線蟲病造成枯死的松樹 累計已達5000萬余株，直接經濟損失25億元，間接經濟損失達250億元，且還在以每年6000 hi^的速度擴散蔓延，對林業生產、森林資源和生態環境造成了嚴重的破壞。
赤松為松屬的一個種，分布于我國華東及北部沿海地區以及日本、朝鮮、蘇聯。通常被 栽植為建筑用材、制槳用材或庭蔭樹、行道樹、防潮林、風景林。該樹種是最容易感染松材 線蟲病的樹種之一。在日本，由于受松材線蟲的嚴重危害，赤松大量枯死。在中國、韓國， 赤松同樣受到松材線蟲病的嚴重威脅。為了挽救瀕危的鄉土樹種，日本林業工作者通過在病 害嚴重發生地選育抗病單株等方式建立了赤松抗病種子園。然而，抗病種子產量非常有限， 難以滿足大規模林業生產的需要。為此，迫切需要尋求能夠快速、大量繁殖現有抗病材料的 有效途徑。
植物組織培養作為一種可替代的無性繁殖方法，在農作物、花卉及速生樹種例如桉樹的 良種繁育中得到了廣泛的應用，在許多針葉樹中亦被證明是可行的。據初步統計，到目前為 止，各國學者已對松屬的60多個種或變種、雜種進行了組織培養，近40個獲得了再生成植 株，其中我國學者沈熙環、黃健秋等對松屬的15個種進行了研究，8個種獲得了再生植株。 盡管松屬樹種的組織培養倍受各國學者重視，但是由于難度較大，現有的組織培養方法中存 在增殖系數低、玻璃化現象嚴重、難以長期繼代培養等問題，使眾多研究僅停留于植株再生 過程的完成，而對中間繁殖體的長期繼代、大量增殖少有研究，造成能實現產業化生產的樹 種鳳毛麟角。
有關赤松組織培養的報道較少。Isikawa (1987)研究了赤松下胚軸和幼苗根尖的器官分 化情況，僅在胚軸上發現有不定根的形成；Choi等(1993)對赤松幼苗器官發生進行了研究， 獲得少量完整植株；Maruyama等(2005)、 Shoji等(2006)分別用未成熟胚誘導出體細胞胚 胎，并獲得再生植株，但存在胚性愈傷誘導率、體胚轉化率極低等問題。目前國內尚未有關 于赤松組織培養形態發生的報道
發明內容
發明目的本發明主要針對抗松材線蟲病赤松成熟種子珍貴而稀少、且赤松組織培養增 殖系數低、大量擴繁難的問題，研究發明一種赤松組織培養增殖方法，以滿足社會生產需要。
技術方案 一種赤松組織培養增殖方法，包括以下步驟
1、 將赤松無菌萌發3 4周的幼苗子葉節(含子葉及剛萌動的上胚軸和6 8mm下胚軸) 接種于含有6-芐基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)的基本培養基GD(Gresshoff and Doy medium, 1972)上，誘導子葉基部產生叢生芽；
2、 將外植體連同已分化的叢生芽轉入含有活性炭(AC)或NAA的基本培養基DCR( Gupta andDurzanmedium, 1985)中，促進叢生芽伸長；
3、 選取生長健壯、長1.5 2.0cm的叢生芽單個切割下來，切去莖尖生長點并將其切割成 長5 8mm的小段，接種至含有6-BA和NAA的基本培養基GD中，誘導叢生芽增殖。
步驟3增殖產生的叢生芽再轉入步驟2所述的培養基中促進其伸長，然后重復步驟3， 循環往復，可獲得大量叢生芽，從而實現叢生芽的大量增殖。步驟2、步驟3繼代周期各為 4~5周。
以上各步驟培養條件為溫度23 25 °C，光照強度2000 Lux，每日光照16 h。
其中，在步驟1中所述誘導子葉基部產生叢生芽的培養基中6-BA的濃度為3.0-5.0 mg/L， NAA的濃度為0.1~0.3 mg/L。
在步驟2中當將外植體連同已分化的叢生芽接入含有AC的DCR培養基上時，AC的濃 度為0.5~1.5 g/L;接入含有NAA的DCR培養基上時，NAA的濃度為0.1-0.3 mg/L。
在步驟3中所述誘導叢生芽增殖的培養基中6-BA的濃度為1.5-2.5 mg/L， NAA的濃度 為0.25 mg/L。
有益效果本發明以赤松無菌幼苗的子葉節為外植體，誘導子葉基部產生叢生芽，叢生
芽伸長后將其莖尖生長點摘除，進而切割成5-8 mm長的小段，使腋芽從頂端優勢的抑制下 釋放出來，形成叢生芽；增殖培養與伸長培養交替進行的繼代方式克服了組織培養過程中的 玻璃化現象，使得材料能夠長期繼代，從而能夠大量增殖。與選用子葉、成熟胚等外植體誘 導產生的不定芽相比，本發明誘導產生的叢生芽更健壯、生長更迅速，縮短了培養周期，而 且遺傳性狀穩定，不易產生變異。通過本方法，叢生芽每8 10周可增殖一次，且增殖系數始 終保持在3.5~4.6， 一粒種子2年后可增殖出2 3萬株可用于生根的組培苗，為實現抗病材料 的大規模、短周期、高繁殖率的工廠化生產奠定了基礎。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例1:
選取從日本引進的抗松材線蟲病赤松1#、 /優樹成熟種子，置于4 r低溫下處理4周，
4取出用0.1%高錳酸鉀預處理12 h，流水沖洗lh，沖洗完畢后，在無菌條件下剝除種殼，經 70%乙醇表面消毒30 s后置于0.1%升汞浸泡2 min，用無菌水沖洗4~5次后，移入培養基中 培養成無菌苗備用。
挑選萌發3 4周的無菌幼苗，在子葉下6~8 mm處將下胚軸切去，子葉節(含子葉及剛 萌動的上胚軸和6-8 mm下胚軸)作為外植體，接種于GD+6-BA3.0-5.0 mg/L+NAA0.1~0.3 mg/L培養基中，4 5周后，將外植體連同已分化的叢生芽轉入DCR+AC 0.5~1.5 g/L培養基中， 促進芽的伸長，供增殖試驗使用。
將上述長1.5-2.0 cm的叢生芽分別單個切下，切去莖尖生長點后將其切割為5~8 mm小 段，接種于GD+6-BA1.5 2.5 mg/L+NAA0.25 mg/L培養基中誘導叢生芽增殖；4~5周后，將 增殖產生的叢生芽再轉入DCR+AC 0.5-1.5 g/L培養基中促進芽的伸長。叢生芽伸長后再進行 新一輪增殖。
以上叢生芽增殖、伸長的繼代周期分別為4~5周，循環往復，每8 10周叢生芽增殖一次， 2年后，平均一粒種子增殖出可用于生根的組培苗20000~30000株。
培養條件溫度23 25 。C，光照強度2000 Lux，每日光照16 h。
實施例2:
選取從日本引進的抗松材線蟲病赤松5#、 16#優樹成熟種子，在實施例l的基礎上，將 促進叢生芽伸長的培養基更換為DCR+NAA0.1-0.3 mg/L，其余步驟同實施例1，也取得了與 實施例l相當的效果。
下面一些具體的實驗情況將有助于說明本發明所述赤松組織培養增殖方法所用的配方、 外植體切割方式及繼代方式的有效性，所有試驗至少重復3次。
第一，激素對赤松叢生芽增殖的影響
以GD為基本培養基，添加6-BA0.5~2.5 mg/L+NAA0.25 mg/L或者激動素(KT) 0.5~2.5 mg/L+NAA0.25 mg/L，比較不同激素組合對叢生芽增殖的影響。結果表明(表l)， 6-BA對 赤松叢生芽的增殖效果明顯，在添加6-BA1.5~2.5 mg/L的培養基中，增殖系數達3.5~4.6; 而在0.5 2.5mg/L濃度下，KT對叢生芽的增殖幾乎無效，響應的外植體極少。
表1激素對赤松叢生芽增殖的影響
激素種類及濃度(mg/L)接種外植體數響應外植體數(比例％)增殖系數
6-BAKTNAA0.5-0.25306 (20.0)0.3
1.5-0.253021 (70.0)3.5
2.5-0.253025 (83.3)4.6
-0.50.25300 (0)0
-1.50.25332 (6.1)0.06
-2.50.25304 (13.3)0.13
5第二，外植體切割方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響
將未經切割的完整單芽或將單芽切割成3 8 mm小段，接種于GD+6-BA2.5 mg/L+NAA 0.25mg/L培養基中進行增殖。4-5周后結果表明(表2)，外植體切割方式對赤松叢生芽增殖 有一定的影響 一個長1.5-2.0 cm的芽未經切割可獲得3~4倍的增長量，而如果將其切割成 2~3段，則增殖系數提高2 3倍，切割得太小則會導致玻璃化。
表2外植體切割方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響
切割方式叢生芽增殖情況生長情況
完整單芽通常增殖3~4個芽單芽頂梢繼續生長，新增芽細弱
切割成4段(3~4mm)每段通常增殖3 4個芽，增殖系數提高4倍外植體及新增芽玻璃化嚴重
切割成3段(5~6mm)每段通常增殖3 4個芽，增殖系數提高3倍新增芽生長健壯
切割成2段(6~8mm)每段通常增殖3 4個芽，增殖系數提高2倍新增芽生長健壯
第三，繼代方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響
組培苗增殖通常是將外植體連續繼代于含有6-BA的增殖培養基中，這種方式常常導致 組培苗的玻璃化，因此比較了不同繼代方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響。首先將外植體 接種于所篩選出的叢生芽增殖培養基GD+6-BA2.5mg/L+NAA0.25mg/L (Ml)中，4~5周后 分別轉接到逐漸降低6-BA濃度的培養基(M2、 M3、 M4、 M5)或無任何激素但添加AC的 培養基(M6)中，4-5周后再轉移到增殖培養基Ml中。結果顯示(表3):連續繼代于含有 較高濃度6-BA培養基中的叢生芽玻璃化現象嚴重；將增殖培養基中產生的叢生芽轉接于只 含NAA或AC的培養基中培養伸長后再進行增殖的方式克服了玻璃化現象，即表3中的 M1-M5-M1或M1-M6-M1程序為適宜的繼代方式。
表3繼代方式對赤松叢生芽增殖和生長的影響
繼代方式增殖系數芽的長度(mm)芽的長勢
M卜M卜M17.32~380%的芽玻璃化(針葉墨綠、腫脹或細弱、皺縮巻曲)
M1-M2-M16.23~435%的芽玻璃化
M1-M3-M16.53~415。/。的芽玻璃化
M卜M4-M16.54~5叢生芽生長尚好，針葉粗短
M1-M5-M14.35~6叢生芽生長較好，針葉嫩綠挺拔
M1掘-M14,55~6叢生芽生長健壯，針葉嫩綠挺拔
注M2、 M3、 M4、 M5培養基中6-BA濃度分別為2.0、 1.0、 0.5、 Omg/L，其余與M1相同。
綜上所述，中間繁殖體的大量增殖是松屬樹種組織培養最重要的階段之一，往往成為規 模化生產的主要瓶頸。本發明采用的增殖配方、外植體切割方式及增殖培養與伸長培養交替 進行的繼代方式解決了赤松組織培養的長期繼代與增殖問題。
權利要求
1、一種赤松組織培養增殖方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)將赤松無菌萌發3～4周的幼苗子葉節(含子葉及剛萌動的上胚軸和6～8mm下胚軸)接種于含有6-芐基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)的基本培養基GD上，誘導子葉基部產生叢生芽；(2)將外植體連同已分化的叢生芽轉入含有活性炭(AC)或NAA的基本培養基DCR中，促進叢生芽伸長；(3)選取生長健壯、長1.5～2.0cm的叢生芽單個切割下來，切去莖尖生長點并將其切割成5～8mm小段，接種至含有6-BA和NAA的基本培養基GD中，誘導叢生芽增殖。步驟(3)增殖產生的叢生芽再轉入步驟(2)所述的培養基中促進其伸長，然后再重復步驟(3)，循環往復，可獲得大量叢生芽，從而實現叢生芽的大量增殖。步驟(2)、步驟(3)的繼代周期分別為4～5周。
2、 根據權利要求1所述的赤松組織培養增殖方法，其特征在于步驟(1)中所述誘導子 葉基部產生叢生芽的培養基中6-BA的濃度為3.0 5.0 mg/L， NAA的濃度為0.1-0.3 mg/L。
3、 根據權利要求1所述的赤松組織培養增殖方法，其特征在于步驟(2)中當將外植體 連同已分化的叢生芽轉入含有AC的DCR培養基上時，AC的濃度為0.5-1.5 g/L。
4、 根據權利要求1所述的赤松組織培養增殖方法，其特征在于步驟(2)中當將外植體 連同已分化的叢生芽轉入含有NAA的DCR培養基上時，NAA的濃度為0.1~0.3 mg/L。
5、 根據權利要求1所述的赤松組織培養增殖方法，其特征在于步驟(3)中所述誘導叢 生芽增殖的培養基中6-BA的濃度為1.5-2.5 mg/L， NAA的濃度為0.25 mg/L。
全文摘要
一種赤松組織培養增殖方法，該方法以赤松無菌幼苗子葉節(含子葉及剛萌動的上胚軸和6～8mm下胚軸)為外植體，接種于GD+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L培養基中誘導子葉基部產生叢生芽；4～5周后將外植體連同已分化的叢生芽轉入添加活性炭或NAA的培養基中促進芽的伸長；待叢生芽長達1.5～2.0cm時將其分別單個切下，并切割成5～8mm小段，接種于GD+6-BA1.5～2.5mg/L+NAA0.25mg/L培養基中進一步誘導叢生芽增殖。增殖的叢生芽經過培養伸長后可再用于新一輪增殖。采用本發明，叢生芽增殖系數達3.5～4.6，一粒種子2年后可增殖出2～3萬株可用于生根的組培苗。
文檔編號A01H4/00GK101485291SQ200810019270
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月18日 優先權日2008年1月18日
發明者葉建仁, 吳小芹, 戴培培, 朱麗華 申請人:南京林業大學