植物微rna及其使用方法

專利名稱：：植物微rna及其使用方法
技術領域：
：本發明公開了新的微RNA(microRNA)和微RNA前體，還公開了包含這些新的miRNA,miRNA前體和對應于miRNA的miRNA識別位點的重組DNA構建體。本發明包括表現出非生物_脅迫_應答表達的新的miRNA和miRNA前體。本發明還提供miRNA誘騙序列(decoysequence)，在其基因組中含有本發明重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞、植物和種子，以及利用本發明重組DNA構建體來調控基因表達的方法。
背景技術：
：已經描述了參與RNA介導的基因抑制的若干細胞途徑，其各自在特征性途徑和特異性組成上不同。有關綜述參見例如Brodersen和Voinnet(2006),TrendsGenetics,22268-280、以及Tomari和Zamore(2005)Genes&Dev.，19:517_529。siRNA途徑包括將雙鏈RNA(“RNA雙鏈體”)非定相切割(non-phasedcleavage)為小干擾RNA(siRNA)。微RNA途徑包括微RNA(miRNA)，是通常介于約19至約25個核苷酸(在植物中通常為約20-24個核苷酸)的非蛋白質編碼RNA，其指導靶轉錄物的反式切割，負調節參與各種調節和發育途徑的基因表達。植物miRNA以一組特征來定義，包括由DCLl加工成約21個核苷酸的單個特異性miRNA的莖環前體，表達來自具有2個核苷酸的3’突出端(overhang)的RNA雙鏈體的一對miRNA和miRNA*，并能反式沉默特定靶標。參見Bartel(2004)Cell，116:281_297；Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.,6376-385Jones-Rhoadesφ(2006)Annu.Rev.PlantBiol.,5719-53；Ambros等(2003)RNA，9:277_279。在反式作用siRNA(ta_siRNA)途徑中，miRNA的作用是在需要RNA依賴性RNA聚合酶來產生RNA雙鏈體的過程中指導siRNA初級轉錄物的同步加工；反式作用siRNA定義為缺乏二級結構，缺乏啟動雙鏈RNA產生的miRNA靶位點，需要DCL4和RNA依賴性RNA聚合酶(RDR6)并產生多個完美定相的(perfectlyphased)21個核苷酸小RNA(smallRNA)，其具有含2個核苷酸的3’突出端的完美匹配的雙鏈體(參見Allen等(2005)Cell,121:207_221)。微RNA(miRNA)是非蛋白質編碼RNA，通常介于約19至約25個核苷酸(在植物中通常為約20-24個核苷酸)，其指導靶轉錄物的反式切割，負調節參與各種調節和發育途徑的基因表達(Bartel(2004)Cell,116:281_297)。在某些情況下，miRNA的作用是指導siRNA初級轉錄物的同步加工(參見Alien等(2005)Cell，121=207-221)0已經鑒定出一些微RNA基因(MIR基因)并且在數據庫中是公眾可得的("miRBase，，,在microrna.Sanger,ac.uk/sequences在線可得)。本申請人已在2005年12月15日申請的美國專利申請11/303,745中公開了新的MIR基因、成熟miRNA和miRNA識別位點，通過引用結合到本文中。其它MIR基因和成熟miRNA也描述于美國專利申請公布說明書2005/0120415和2005/144669A1，通過引用結合到本文中。已經報告MIR基因存在于基因間區域，在基因組中或單獨或成簇存在，但也可完整或部分地位于其它基因(蛋白質編碼基因或非蛋白質編碼基因)的內含子中。有關miRNA生物起源的最新綜述，可參見Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.，6:376_385。至少在某些情況下，MIR基因轉錄可處于MIR基因自身啟動子的啟動控制之下。MIR基因轉錄可能通常由RNA聚合酶II介導(參見例如Aukerman和Sakai(2003)PlantCell,15:2730_2741；Parizotto等(2004)GenesDev.，18=2237-2242)，因此可適合已用于其它聚合酶II轉錄基因的基因沉默方法。初級轉錄物(其可以是多順反子)稱為“pri-miRNA”，即miRNA前體分子，其可以相當大(數千堿基)并含有一個或多個局部雙鏈或“發夾”區以及通常具有mRNA的5’“帽子”和聚腺苷酸化尾。參見例如Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.，6:376_385中的圖1。在植物細胞中，認為微RNA前體分子在細胞核中大量加工。pri-miRNA加工為更短的miRNA前體分子，其也包含莖環或折回結構，稱為“pre-miRNA”。在植物中，miRNA和siRNA由不同切酶(DICER)樣(DCL)酶來形成，而在擬南芥屬(Arabidopsis)中，認為核DCL酶(DCLl)是成熟miRNA形成所需的；參見例如Ambros等(2003)RNA，9:277_279，和Xie等(2004)PLoSBiol.，2:642_652。有關微RNA生物起源和功能的其它綜述可參見例如Bartel(2004)Cell,116:281_297；Murchison和Hannon(2004)Curr.Opin.CellBiol.，16-.223-229；Dugas和Bartel(2004)Curr.Opin.PlantBiol.，7:512_520。因此，可根據RNA(例如成熟miRNA或miRNA前體RNA分子的RNA序列)，或者根據DNA(例如對應于成熟miRNARNA序列的DNA序列或者編碼MIR基因或MIR基因片段或miRNA前體的DNA序列)，對微RNA進行描述。估計MIR基因家族在至少某些基因組中占并能影響或調節全部基因中大約三分之一的表達(參見例如Tomari等(2005)Curr.Biol.，15:R61_64；G.Tang(2005)TrendsBiochem.Sci.,30106-14；Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.，6:376_385)。因為在包括動植物在內的真核生物中，miRNA是重要的調節元件，所以miRNA的轉基因抑制可導致例如對重要生物學過程的了解或者允許操縱某些途徑(例如調節細胞分化、增殖和細胞凋亡)，可用于例如生物技術應用。參見例如0'Donnell等(2005)Nature，435:839_843；Cai等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:5570_5575；Morris和McManus(2005)Sci.STKE,pe41(stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans；2005/297/pe4Lpdf)。微RNA(MIR)基因具有許多標志性特征，包括在植物物種中的保守性、穩定的折回結構和由切酶(Dicer)樣酶對特定miRNA/miRNA*雙鏈體進行加工(Ambros等(2003)RNA，9:277_279)。這些特征已用于在植物中鑒定miRNA及其相應基因(Xie等(2005)PlantPhysiol.，138=2145-2154；Jones-Rhoades禾口Bartel(2004)Mol.Cell,14:787_799；Reinhart等(2002)GenesDev.，161616-1626；Sunkar和Zhu(2004)PlantCell,16:2001_2019)。公眾可得的微RNA基因的目錄列在miRBase上(Griffiths-Jones等(2003)NucleicAcidsRes.,31:439_441)。MiRNA在擬南芥的非常特殊的細胞類型中表達(參見例如Kidner和Martienssen(2004)Nature,42881-84,Millar禾口Gubler(2005)PlantCell,17705-721)。抑制可限制在細胞類型的側面、邊緣或其它分界線，認為它是合適細胞類型圖式形成和特化所必需的(參見例如Palatnik等(2003)Nature，425:257_263)。已經發現，含內源miR171識別位點的GFP報道基因的抑制限制轉基因擬南芥特定細胞的表達(Parizotto等(2004)GenesDev.，18:2237_2242)。已經證實miRNA的識別位點在mRNA的所有區域，包括5’非翻譯區、編碼區和3’非翻譯區，表明miRNA靶位點相對于編碼序列的位置可能并非一定會影響抑制(參見例如Jones-Rhoades和Bartel(2004)，Mol.Cell,14:787-799，Rhoades等(2002)Cell,110:513_520，Allen等(2004)Nat.Genet.,361282-1290，Sunkar和Zhu(2004)PlantCell,16:2001_2019)。本文所公開的成熟miRNA是從通常隸屬于在遠緣植物物種中保守的規范家族(canonicalfamily)的MIR基因加工而來。這些MIR基因及其所編碼的成熟miRNA也可用于例如改變發育途徑，例如通過影響細胞分化或形態發生(參見例如Palatnik等(2003)Nature,425:257_263；Mallory等(2004)Curr.Biol.，141035-1046)，作為用于工程(非天然)miRNA的序列來源，這類工程miRNA經設計成為沉默序列而不是天然miRNA序列所靶向的轉錄物(參見例如Parizotto等(2004)GenesDev.，18=2237-2242；另見美國專利申請公布說明書2004/3411A1和2005/0120415，通過引用結合到本文中)并能使dsRNA穩定化。MIR基因本身(或其天然5’非翻譯區或3’非翻譯區、或其天然啟動子或參與其轉錄的其它元件)可作為靶基因用于基因抑制(例如通過本發明方法)，其中MIR基因所編碼的miRNA的抑制是所需的。MIR基因的啟動子可具有非常特殊的表達圖式(expressionpattern)(例如細胞特異性、組織特異性或時間特異性)，因此可用于重組構建體，來誘導與之操作性連接的DNA序列的這類特異性轉錄。本發明提供從植物(包括作物，例如玉米、水稻和大豆)中鑒定出的新的微RNA和微RNA前體、以及重組DNA構建體，所述構建體包含這些新的miRNA、miRNA前體、miRNA識別位點、miRNA誘騙序列和對應于miRNA的miRNA啟動子。也公開并要求保護在其基因組中含有本發明重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞、植物和種子。還提供了用本發明重組DNA構建體進行基因抑制的方法、以及提供具有所需表型的轉基因植物、尤其是在干旱、營養缺乏、冷或熱脅迫等非生物脅迫條件下具有高產量(相對于非轉基因植物而言)的轉基因植物的方法。發明概述一方面，本發明提供重組DNA構建體，其包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，其中至少一個可轉錄DNA元件選自(a)可轉錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結構的miRNA前體的DNA元件:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中miRNA前體包含玉米、水稻或大豆的miRNA前體序列的至少90%核苷酸的連續區段；(b)可轉錄為從選自以下植物miRNA前體序列折回結構獲得的工程miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA；(c)位于轉基因轉錄單元內或其附近并可轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點可被選自以下的成熟miRNA識別=SEQIDNO.1-1035,SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者可被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；和(d)用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內源miRNA表達的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。本發明的另一方面提供包含任何本發明重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞。還提供含有本發明非天然轉基因植物細胞的非天然轉基因植物，包括任何發育時期的植物，并包括由本文所公開的非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物(其可以是近交或雜交后代植物)、或這類非天然轉基因植物的種子。也提供并要求保護在其基因組中具有本發明所提供的任何重組DNA構建體的轉基因種子。再一方面，本發明提供影響基因抑制的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供非天然轉基因植物，其包括由本發明的非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物；和(b)在非天然轉基因植物中轉錄重組DNA構建體；其中轉錄產生的RNA能夠在非天然轉基因植物中抑制至少一個靶基因，因此相對于在沒有所述重組DNA構建體轉錄時的表達而言，至少一個靶基因被抑制。又一方面，本發明提供同時影響至少一個靶基因的基因抑制和至少一個目標基因的基因表達的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供非天然轉基因植物，其包括由本發明非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物，其中重組DNA構建體還包含用于表達至少一個目標基因的基因表達元件；和(b)在非天然轉基因植物中轉錄重組DNA構建體，其中，當重組DNA構建體在非天然轉基因植物中轉錄時，產生能夠抑制至少一個靶基因的轉錄RNA和編碼至少一個目標基因的轉錄RNA，因此相對于在沒有所述重組DNA構建體轉錄時的表達而言，至少一個靶基因被抑制，而且至少一個目標基因同時表達。再一方面，本發明提供重組DNA構建體，其包含對給定成熟miRNA無應答的合成miRNA-無應答的轉基因序列，其中合成miRNA-無應答的轉基因序列是(a)由天然miRNA-應答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRNA-應答序列內被特定成熟miRNA識別的所有天然miRNA識別位點，和(b)不被給定成熟miRNA識別。另一方面，本發明提供重組DNA構建體，其包含表現出對非生物脅迫應答的表達圖式的miRNA啟動子，例如，表現出特征為在營養脅迫下抑制miRNA的表達圖式的miRNA啟動子，表現出特征為在水脅迫下抑制miRNA的表達圖式的miRNA啟動子，或者表現出特征為在溫度脅迫下抑制miRNA的表達圖式的miRNA啟動子。又一方面，本發明提供重組DNA構建體，其可轉錄為包含至少一個miRNA誘騙序列的RNA轉錄物，所述誘騙序列被內源成熟miRNA識別并結合，但不切割；包括在其基因組中具有該構建體的轉基因植物細胞、植物和種子，以及使用該構建體的方法。本發明相關方面包括重組DNA構建體和用于抑制內源miRNA誘騙序列的方法。也公開了識別并結合其它小RNA(ta-siRNA、nat_siRNA和定相小RNA)但不被切割、因而降低小RNA活性的類似誘騙序列。本發明的其它具體實施方案在以下發明詳述中公開。附圖簡述W010]圖1描繪了選自以下植物miRNA前體序列的折回結構的非限制性實例SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，更準確地講，具有SEQIDNO.1136的miRNA前體序列折回結構，其包含2個短莖環、1個環和2個凸起(bulge)。miRNA前體通過inplanta方式加工為成熟miRNA(在該特定實例中，加工成具有SEQIDN0.32的成熟miRNA)。圖2和圖3描繪了用于抑制靶基因(例如內源miRNA)表達的DNA元件的非限制性實例，如實施例3所述。W012]圖4描繪了從不同玉米組織分離的成熟miRNA的RNA印跡結果，如實施例4所述。W013]圖5描繪了探針組(probeset)序列的轉錄概況，包括具有對玉米雄性生殖組織(花粉)具有特異性的表達圖式的miRNA前體序列，如實施例4所述。W014]圖6描繪了用于大豆植物干旱期的從1.0(無影響或對照)至4.0的相對評分系統，如實施例5所述。W015]如實施例6所述，圖7A描繪了玉米miRM0N18前體(SEQIDN0.3936)的折回結構，圖7B描繪了水稻miRM0N18前體(SEQIDN0.1763)的折回結構，圖7C描繪了擬南芥(Arabidopsisthaliana)miR827前體(SEQIDN0.8743)的折回結構。圖7D描繪了miR827(SEQIDNO.8744)和miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDN0.3227或SEQIDNO.8742)的比較，帶編號的箭頭標明成熟miRNA的位置1、10和21；位置10的核苷酸還具有下劃線。圖8描繪了通過成熟miRM0N1821聚體的RNA印跡測定的miRM0N18的表達圖式(圖8A)和miRM0m8前體的轉錄概況分析(transcriptionprofiling)(圖8B)，如實施例6所述。W017]圖9描繪了在來自缺水(干旱)(圖9A)、低溫(圖9B)和缺氮條件(圖9C)下生長的植物的玉米組織中玉米miRM0N18前體(SEQIDN0.3936)的表達分析，如實施例6所述。圖10描繪了玉米(Zeamaysvar.LH244)小RNA的RNA印跡結果，表明miRM0N18在玉米胚乳和籽粒中表達提高，在葉片中由缺氮誘導的強miRM0N18抑制(圖10A)，以及在磷充足條件下葉片組織中的強miRM0N18表達和在缺磷條件下miRM0N18抑制(圖10B)，如實施例6所述。圖11描繪了含有玉米SPX結構域(如果存在的話，用下劃線標明序列)和玉米MFS結構域(用粗體字標明序列)的新的玉米miRMONIS靶基因的多序列比對，如實施例7所述。圖12描繪了構建用于已鑒定SPX基因的系統樹，如實施例7所述；已經實驗證實含有預測miRMONIS識別位點(在來自并非擬南芥的物種的基因中)或預測miR827識別位點(在來自擬南芥的基因中)的基因用粗體字標明。圖13描繪了miRM0N18基因組序列(SEQIDNO.8800)，如實施例8所述。它顯示了以大寫字母表示的在核苷酸2173-2788的miRM0N18轉錄物、以小寫字母表示的在核苷酸211-2172的miRM0N18啟動子元件、以小寫字母表示的在核苷酸2173-2308的前導元件、以下劃線加上小寫字母表示的在核苷酸2144-2147的規范TATA盒(末端是轉錄起始位點上游的25個核苷酸)、以下劃線加上大寫字母表示的在核苷酸2419-2439的成熟miRM0N18和以下劃線加上大寫字母表示的在核苷酸2322-2341的miRM0N18*。圖14描繪了水稻序列0s02g45520(SEQIDNO.8784)和0s04g48390(SEQIDNO.8786)以及玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的miRM0N18的預測切割，如實施例9所述。圖15描繪了miRM0m8前體(圖15A)和miRM0N18靶標(圖15B)之間的負相關，如實施例9所述。圖15B顯示玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)，表明在缺氮條件下比在氮充足條件下表達水平更高，即表達圖式與miRM0N18前體的表達圖式相反，如圖15A所示。圖16描繪了載體pM0N107261，其包含驅動玉米miRM0N18轉錄物(例如SEQIDN0.8800核苷酸2173-2788)表達的CaMV35S啟動子，如實施例10所述。圖17A描繪了玉米miR399前體的折回結構；圖17B描繪了轉錄概況分析實驗結果，表明Zm-miR399pri-miRNA在缺氮條件(黑柱)下受抑制，而在氮充足條件(白柱)下表達，如實施例11所述。圖18描繪了miR399誘騙序列的玉米cDNA序列與共有序列SEQIDN0.8834的比對，揭示出至少兩組基因含有miR399誘騙序列，如實施例11所述。圖19描繪了比較玉米miR399誘騙序列和miR399前體表達的實驗結果，如實施例11所述。圖19A顯示組lmiR399誘騙基因MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)的轉錄概況，圖19B顯示組2miR399誘騙基因MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)的轉錄概況，表明這些miR399誘騙序列受到缺氮的下調。這些結果通過測定成熟miR399表達(圖19C)和miR399誘騙序列MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)表達(圖19D)的RNA印跡得以證實。圖20描繪了比較不同溫度條件下玉米內源miR399誘騙cDNA序列和相應玉米miR399前體的表達的轉錄概況分析實驗，如實施例11所述。在氮充足條件期間，在玉米葉片中，尤其是在白天時，組2miR399誘騙基因MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)表現出至少10倍以上的較高表達(圖20A)。在根(圖20B)和芽(圖20C)中，在延長低溫處理后，這同一基因表現出至少2倍下調。圖21描繪了在玉米和大豆的不同組織中內源miR399誘騙cDNA序列的表達，如實施例11所述。圖2IA描繪了以下序列的表達水平組1玉米miR399誘騙序列SEQIDN0.8827(MRT4577_47862C,代表為探針AlZM005814_at和AlZM005813_s_at)，和組2玉米miR399誘騙序列SEQIDN0.8829(MRT4577_36567C，代表為探針AlZM048024_at)、以及玉米pri-miR399序列SEQIDN0.8818(MRT4577_22487C.6代表為探針AlZM033468_at)。圖21B描繪了以下序列的表達水平大豆miR399誘騙序列SEQIDN0.8842(MRT3847_217257C.2,代表為探針AlGM031412_at)、SEQIDNO.8844(MRT3847_236871C.2,代表為探針AlGM053788_at)、SEQIDNO.8836(MRT3847_238967C.1，代表為探針AlGM035741_at)和SEQIDNO.8838(MRT3847_241832C.1，代表為探針AlGM069937_at)。圖22A描繪了大豆內源miR319誘騙SEQIDNO.8847(MRT3847_41831C.6，代表為探針AlGM001017_at)在不同大豆組織中的轉錄概況分析數據；圖22B描繪了玉米內源miR319誘騙SEQIDN0.8849(MRT4577_577703C.1，代表為探針AlZM012886_s_at)在不同玉米組織中的轉錄概況分析數據，如實施例11所述。發明詳述除非另有說明，否則所用的所有科技術語都具有本發明所屬領域普通技術人員公知的含義。通常，所用的命名法和下述制造或實驗室步驟都是本領域眾所周知的和常用的。常規方法用于這些步驟，例如本領域和各種通用參考文獻所提供的那些。除非另有說明，否則就本說明書而言的核酸序列是給定的，當從左到右閱讀時，按5’一3’的方向。按照說明，核酸序列可以DNA或RNA形式提供；一個公開必定限定另一個，這是本領域普通技術人員已知的。當給出的術語為單數時，本發明人也以該術語的復數形式來考慮本發明所述方面。所用的命名法和下述實驗室步驟是本領域眾所周知的和常用的。當通過引用結合到本文中的參考文獻中所用的術語和定義有出入時，本申請所用的術語應當具有所給出的定義。所用的其它技術術語具有所屬領域公知的含義，如各種技術詞典所示例。本發明人并不受限于作用機制或作用方式。其中所提供的參考文獻僅用于說明性目的。重組DNA構建體本發明提供重組DNA構建體，其包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，其中至少一個可轉錄DNA元件選自(a)可轉錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結構的miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690,SEQIDN0.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中miRNA前體包含玉米、水稻或大豆的miRNA前體序列的至少90%核苷酸的連續區段；(b)可轉錄為從選自以下植物miRNA前體序列折回結構獲得的工程miRNA前體的DNA元件SEQIDN0.1036-2690,SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA；(c)位于轉基因轉錄單元內或其附近并可轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點可被選自以下的成熟miRNA識別SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者可被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；和(d)用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內源miRNA表達的DNA元件SEQIDN0.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDN0.8816-8819。在標題“靶基因”下描述了其表達可使用本發明重組DNA構建體來調節的靶基因。至少一個可轉錄DNA元件的實施方案和用途描述如下。(A)天然miRNA在非天然條件下的表達。在重組DNA構建體的一個實施方案中，用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件包含可轉錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結構的miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中miRNA前體包含玉米、水稻或大豆的miRNA前體序列的至少90%核苷酸的連續區段。在優選的實施方案中，至少一個靶基因是植物內源基因，重組DNA構建體在植物中的表達導致對至少一個靶基因的抑制。至于“miRNA前體”是指比自miRNA前體加工而來的成熟miRNA大的轉錄RNA，其通常預測可形成含有非完美互補雙鏈RNA區的折回結構。參見Bartel(2004)Cell,116281-297；Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.，6:376_385；Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.PlantBiol.,5719-53；Ambros等(2003)RNA,9:277_279。微RNA前體的實例包括但不限于初級miRNA轉錄物(pri-miRNA)以及天然來自pri_miRNA的pre_miRNA；miRNA前體也包含非天然RNA序列，預測其可形成含有非完美互補雙鏈RNA區的折回結構并一般通過一個或多個切割步驟在體內加工為成熟miRNA。至于“miRNA前體序列”是指這樣的RNA序列其至少包含miRNA前體核苷酸，但也可包含額外核苷酸(致使miRNA前體包含玉米、水稻或大豆的miRNA前體序列至少90%核苷酸的連續區段)。各miRNA前體自身形成折回結構，其與由至少部分相應miRNA前體序列所形成的折回結構相同或幾乎相同。在這些實施方案中，miRNA前體不必包含選自以下植物miRNA前體序列中所含有的所有核苷酸:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，但優選包含選自以下植物miRNA前體序列的至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%核苷酸的連續區段SEQIDN0.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。在優選的實施方案中，至少一個靶基因是植物內源基因，因此重組DNA構建體在植物中的表達導致對至少一個靶基因的抑制。重組DNA構建體在轉基因植物細胞中的轉錄可調節含有與miRNA前體所編碼的成熟miRNA基本互補并被其識別的序列(“miRNA識別位點”)的任何基因(內源基因或轉基因)的表達。通常，重組DNA構建體的轉錄導致對含有被miRNA前體所編碼的成熟miRNA識別的miRNA識別位點的內源基因的抑制。在優選的實施方案中，重組DNA構建體還包含并非miRNA序列天然啟動子的啟動子。這允許成熟miRNA在并不能天然表達的空間或時間或誘導條件下得以表達。例如，可將重組DNA構建體設計成包含組成型啟動子，因而能組成型地表達僅在黑暗條件下才能天然表達的成熟miRNA(即當以處于天然啟動子控制之下的內源miRNA前體的形式表達時)。在標題“啟動子”下描述了可與該重組DNA構建體一起使用的啟動子。在一個非限制性實例中，重組DNA構建體包含用于調節至少一個靶基因表達的可轉錄DNA元件，其中至少一個可轉錄DNA元件包含可轉錄為miRNA前體的DNA元件，所述miRNA前體是由具有SEQIDN0.1136的玉米miRNA前體序列的約90%核苷酸組成的連續區段，并且預測其具有的折回結構與具有SEQIDN0.1136的miRNA前體序列的折回結構基本相同(即在相同或大致相同的位置上具有雙鏈RNA莖和單鏈環或凸起的區域)。具有SEQIDN0.1136的miRNA前體序列的折回結構包含約118個核苷酸，其在折回結構的閉合端的環上伸出兩個短莖環，并在折回結構的主要雙鏈“莖”內具有兩個小凸起(圖1)。通過inplanta方式自miRNA前體(其是包含具有SEQIDN0.1136的玉米miRNA前體序列的約90%核苷酸的連續區段)加工而來的成熟miRNA，優選與由具有SEQIDNO.1136的miRNA前體序列的折回結構(即具有SEQIDNO.32的成熟miRNA)所編碼的相同。該重組DNA構建體的轉錄優選導致對含有被具有SEQIDNO.32的成熟miRNA識別的miRNA識別位點的至少一個內源基因的抑制。盡管具有SEQIDNO.1136的玉米miRNA前體序列在玉米籽粒組織、而不是在葉片中天然表達(參見表2)，但是重組DNA構建體還可包含并非具有SEQIDNO.1136的miRNA前體序列的天然啟動子的啟動子，例如組成型啟動子，以允許具有SEQIDNO.32的成熟miRNA能在除籽粒組織之外的組織中轉錄。(B)成熟的工程miRNA的表達。在重組DNA構建體的另一個實施方案中，用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件包含可轉錄為從選自以下植物miRNA前體序列折回結構獲得的工程miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA。在優選的實施方案中，至少一個靶基因是植物內源基因或者所述植物的有害動物或病原體的內源基因，重組DNA構建體在植物中的表達導致對至少一個靶基因的抑制。至于“工程”是指例如選自以下植物miRNA前體序列的天然miRNA前體序列中的核苷酸被改變(替換、缺失或添加):SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDN0.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，因而產生具有與天然miRNA前體序列折回結構基本相同的折回結構的工程miRNA前體，但其中由工程miRNA前體加工而來的成熟miRNA具有修飾序列(即不同于天然成熟miRNA的序列)，所述修飾序列經設計用于抑制靶基因，該靶基因不同于被天然miRNA前體序列天然抑制的靶基因。用于測定天然miRNA前體序列中核苷酸改變以產生工程miRNA前體、用于制備本發明重組DNA構建體的一個通用的非限制性方法包括下列步驟(a)選擇對靶基因具有特異性的至少18個核苷酸的例如玉米cDNA數據庫和基因組DNA數據庫的獨特靶序列，例如通過使用序列比對工具例如BLAST(參見例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.，215403-410；Altschul^(1997)NucleicAcidsRes.，25:3389_3402)，以鑒定靴轉錄直向同源物和對無關基因的任何潛在匹配，因而避免非靶序列的無意沉默。(b)分析靶基因中不需要的序列(例如與來自非目標物種(尤其是動物)的序列匹配)，并評價每個潛在19聚體區段的GC含量、Reynolds評分(參見Reynolds等(2004)NatureBiotechnol.,22326-330)和特征是自由能為負差異("ΔAG”)的功能不對稱(參見Khvorova等(2003)Cell,115209-216)。優選選擇具有以下所有或大部分特征的19聚體(I)Reyn0Ids評分>4，(2)GC含量介于約40%至約60%，(3)負ΔAG,(4)末端腺苷，(5)缺乏連續4輪以上的同一核苷酸；(6)位置靠近靶基因的3’端；(7)與miRNA前體轉錄物的差異最小。優選選擇多個(3個或更多)19聚體用于試驗。(c)測定所選19聚體的反向互補，用于制備修飾的成熟miRNA；優選位置20的額外核苷酸與所選靶序列匹配，優選選擇位置21的核苷酸不配對，以防靶轉錄物上擴散沉默。(d)測定工程miRNA前體，例如，在土壤桿菌(Agrobacterium)介導的瞬時煙草(Nicotianabenthamiana)測定，用于修飾的成熟miRNA表達和靶抑制。和(e)將最有效的工程miRNA前體克隆到構建體中，用于玉米的穩定轉化(參見標題“制備和使用重組DNA構建體”和“制備和使用非天然轉基因植物細胞和非天然轉基因植物”下的部分)。(C)轉基因的表達與miRNA識別位點在重組DNA構建體的另一個實施方案中，重組DNA構建體還包含轉基因轉錄單元，其中用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件包含位于轉基因轉錄單元內或其附近并可轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點可被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，并且至少一個靶基因包含轉基因轉錄單元所編碼的轉基因，而且其中重組DNA構建體在植物中的表達導致轉基因在成熟miRNA并不能天然表達的植物細胞中得以表達。miRNA識別位點的優選實施方案是預測可被選自以下成熟miRNA中的至少一個成熟miRNA識別的那些SEQIDN0.1-1035、SEQIDN0.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850,或者被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的至少一個成熟miRNA識別的那些SEQIDN0.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。使用以下文獻所述的序列互補法則等本領域已知方法，可完成對識別位點的預測Zhang(2005)NucleicAcidsRes.，33:W701_704和Rhoades等(2002)Cell,110513-520。對miRNA識別位點的預測允許鑒定和證實受到來自天然表達miRNA前體的miRNA調節的內源基因；這可用于例如消除或修飾內源基因內的miRNA識別位點，以便使該基因的表達從由天然調節基因表達的內源miRNA的調節中解脫出來。例如，可以增加涉及位置2至13的堿基(在具有連續21個核苷酸的miRNA識別位點中)的錯配數，以防被miRNA識別并切割。這些重組DNA構建體尤其可用于轉基因在特定的空間、時間或誘導模式下的inPlanta表達，而無需具有該特定表達圖式的啟動子。這些重組DNA構建體允許例如由組成型啟動子或表達超出所需細胞或組織類型的啟動子轉錄的基因的限制性表達。限制性表達可以是在空間或時間上受限制，例如局限在特定組織或細胞類型或形式，或局限在特定發育期、生殖期、生長期或季節期。當在特定條件下(例如在擁擠、異株克生作用(allelopathicinteraction)或有害動物或病原體侵染等生物脅迫下，或者在冷或熱脅迫、干旱脅迫、營養脅迫、重金屬或鹽脅迫等非生物脅迫下)表達miRNA時，相應miRNA識別位點可用于條件特異性抑制，即在特定條件下抑制轉基因。在一個非限制性實例中，本發明重組DNA構建體可用于在非水脅迫條件下在植物中表達轉基因，其中本發明重組DNA構建體編碼(a)轉基因，其處于組成型啟動子控制之下，和(b)miRNA識別位點，其由僅在水脅迫條件下才特異性表達的成熟miRNA識別。在另一個非限制性實例中，本發明重組DNA構建體可用于在植物受到有害動物傷害的條件下在植物根部限制性表達殺蟲蛋白，其中本發明重組DNA構建體編碼(a)表達殺蟲蛋白的轉基因，其處于由創傷特異性誘導的啟動子的控制之下，和(b)miRNA識別位點，其被在非根組織中表達的成熟miRNA識別。轉基因轉錄單元包含至少一個轉基因和任選額外序列，例如但不限于啟動子、啟動子增強子、終止子、信使RNA穩定或去穩定序列(參見例如Newman等(1993)PlantCell,5701-714；Green(1993)PlantPhysiol.，1021065-1070；禾ΠOhme-Takagi等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9011811-11815)、用于將轉基因轉錄物定位或轉運至特定場所(例如線粒體、質體、核仁、過氧化物酶體、內質網等)的序列、或轉基因所需加工相關的其它序列。轉基因轉錄單元所編碼的轉基因可包含任何一個或多個目標基因，包括編碼序列、非編碼序列或這兩者。目標基因可包含“靶基因”下所列出的任何基因，其優選的實例包括轉錄因子編碼基因和酶編碼基因的可翻譯(編碼)序列，所述酶參與目標分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂質、糖類和其它碳水化合物、生物聚合物和次級代謝物(包括生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級代謝物))的生物合成或分解代謝。(D)對內源或天然miRNA的抑制。在重組DNA構建體的又一個實施方案中，用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件包含用于對從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內源miRNA表達進行抑制的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。在優選的實施方案中，至少一個靶基因是植物內源基因，而且該內源基因的表達在發生內源miRNA天然表達的植物細胞中被抑制，因此重組DNA構建體在細胞中的表達導致內源基因在細胞中的表達。用于抑制表達的DNA元件包含以下至少一個(a)包含至少一個反義DNA區段的DNA，該反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的；(b)包含多拷貝的至少一個反義DNA區段的DNA，該反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的；(c)包含至少一個有義DNA區段的DNA，該有義DNA區段是靶基因的至少一個區段；(d)包含多拷貝的至少一個有義DNA區段的DNA，該有義DNA區段是靶基因的至少一個區段；(e)可轉錄為RNA并通過形成雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA，并且該DNA包含至少一個反義DNA區段和至少一個有義DNA區段，該反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的，而該有義DNA區段是靶基因的至少一個區段；(f)可轉錄為RNA并通過形成一個雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA,并且該DNA包含多個連續反義DNA區段和多個連續有義DNA區段，這些反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的，而這些有義DNA區段是靶基因的至少一個區段；(g)可轉錄為RNA并通過形成多個雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA，并且該DNA包含多個反義DNA區段和多個有義DNA區段，這些反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的，而這些有義DNA區段是靶基因的至少一個區段，并且其中多個反義DNA區段和多個有義DNA區段以一系列反向重復序列方式排列；(h)包含從植物miRNA獲得的核苷酸的DNA；⑴包含siRNA的核苷酸的DNA；(j)可轉錄為能結合配體的RNA適配子(aptamer)的DNA；和(k)可轉錄為能結合配體的RNA適配子的DNA，和可轉錄為能調節靶基因表達的調節RNA的DNA，其中調節依賴于調節RNA的構象，而調節RNA的構象受到RNA適配子結合狀態的變構影響。用于抑制表達的DNA元件在實施例3中進一步描述并如圖2和圖3所示。在某些實施方案中，重組DNA構建體包含這樣的DNA其設計成可轉錄為單鏈RNA或至少部分雙鏈RNA(例如以“相吻莖環(kissingstem-loop)”排列)、或可轉錄為假定二級結構或三維構型(例如靶基因或適配子的反義序列的大環)的RNA，該RNA賦予轉錄物額外的所需特性，例如穩定性提高、體內半衰期延長或者細胞特異性或組織特異性提高。在一個實例中，間隔區可轉錄為能連接連續RNA區段第一系列和第二系列的穩定環(參見例如DiGiusto和King(2004)J.Biol.Chem.，279:46483_46489)。在另一個實例中，重組DNA構建體包含可轉錄為包含RNA適配子(例如可結合細胞特異性配體的適配子)在內的RNA的DNA，允許針對重組RNA雙鏈體的細胞特異性或組織特異性尋靶(targetting)。通過常用技術制備重組DNA構建體，例如在標題“制備和使用重組DNA構建體”下描述的那些并示例于工作實施例。重組DNA構建體尤其可用于制備非天然轉基因植物細胞、非天然轉基因植物和轉基因種子，如以下“轉基因植物細胞和轉基因植物”中所討論。通過以下“微RNA誘騙序列”中詳述的替代方法可控制miRNA對其靶基因的作用。靶基因本發明的重組DNA構建體可設計為抑制任何靶基因。靶基因可以是可翻譯(編碼)序列，或者可以是非編碼序列(例如非編碼的調節序列)或者這兩者，并且可包含至少一個選自以下的基因真核靶基因、非真核靶基因、微RNA前體DNA序列和微RNA啟動子。靶基因對于其中重組DNA構建體可轉錄的細胞(例如植物細胞或動物細胞)而言可以是天然(內源)的，或者對于其中重組DNA構建體可轉錄的動植物的有害動物或病原體而言可以是天然的。靶基因可以是外源基因，例如植物中的轉基因。靶基因可以是抑制所靶向的天然基因，有或沒有同時表達外源轉基因，例如通過在重組DNA構建體或在分離的重組DNA構建體中包含基因表達元件。例如，最好用外源轉基因同源物取代天然基因。靶基因可包含單個基因或單個基因的一部分(其可靶向抑制)、或者可包含例如靶基因的多個連續區段、靶基因的多個非連續區段、靶基因的多個等位基因或者來自一種或多種物種的多個靶基因。靶基因可包含來自任何物種(包括但不限于細菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，例如作物、觀賞植物和非馴化植物即野生植物；無脊椎動物，例如節肢動物、環節動物、線蟲和軟體動物；和脊椎動物，例如兩棲類、魚類、鳥類、馴化或野生哺乳動物，甚至人)的任何序列。在一個實施方案中，靶基因對于其中重組DNA構建體可轉錄的植物而言是外源的，但對于植物的有害動物或病原體(例如病毒、細菌、真菌、卵菌和無脊椎動物，其中無脊椎動物例如昆蟲、線蟲和軟體動物)而言是內源的。靶基因可包含多個靶基因、或者一個或多個基因的多個區段。在一個優選的實施方案中，靶基因是植物的無脊椎動物害蟲或病原體基因。這些實施方案尤其可用于提供對一種或多種植物有害動物或病原體具有抗性的非天然轉基因植物，例如，對線蟲(例如大豆胞囊線蟲或根結線蟲)的抗性或對害蟲的抗性。靶基因可以是可翻譯(編碼)序列，或者可以是非編碼序列(例如非編碼的調節序列)或者這兩種。靶基因的非限制性實例包括非翻譯(非編碼)序列，例如但不限于5’非翻譯區、啟動子、增強子、或其它非編碼轉錄區、3’非翻譯區、終止子和內含子。靶基因包括編碼以下RNA的基因微RNA、小干擾RNA、核糖體或核酶的RNA成分、核仁小RNA和其它非編碼RNA(參見例如在rfam.wustl.edu上為公眾提供的非編碼RNA序列；Erdmann等(2001)NucleicAcidsRes.,29189-193；Gottesman(2005)TrendsGenet.，21:399_404；Griffiths-Jones等(2005)NucleicAcidsRes.，33:121_124)。靴基因的一個具體實例包含微RNA識別位點(也就是說，在RNA鏈上的位點，該位點可結合成熟miRNA并誘導切割)。靶基因的另一個具體實例包含對非天然轉基因植物的有害動物或病原體而言是天然的微RNA前體序列，也就是說，編碼微RNA的初級轉錄物、或由該初級轉錄物加工而來的RNA中間產物(例如核局限的pri-miRNA或pre-miRNA，其可從核輸出至細胞質)。參見例如Lee等(2002)EMBOJournal,214663-4670；Reinhart等(2002)Genes&Dev.，16161611626；Lund等(2004)Science，303:95_98；和Millar和Waterhouse(2005)Funct.Integr.Genomics，5129-135。靶基因也可包含轉錄因子編碼基因和酶編碼基因的可翻譯(編碼)序列，所述酶參與目標分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂質、糖類和其它碳水化合物、生物聚合物和次級代謝物(包括生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級代謝物)的生物合成或分解代謝。在多個優選的實施方案中，靶基因是植物有害動物或病原體的必需基因。必需基因包括有害動物或病原體發育為能育的生殖成體所需要的基因。必需基因包含當沉默或受到抑制時能導致生物體(作為成體或處于任何發育期，包括配子)死亡或者導致生物體無法成功繁殖(例如雄性或雌性親本不育或者合子、胚胎或幼蟲致死)的基因。有關線蟲必需基因的描述可參見例如Kemphues,K."EssentialGenes(必需基因)，，(2005年12月24日)，WormBook主編，TheC.eIegansResearchCommunity,WormBook,doi/10.1895/wormbook.1.57.1，可得自以下網址www.wormbook.org。線蟲必需基因的非限制性實例包括精子主要蛋白、RNA聚合酶II和幾丁質合酶(參見例如美國專利申請公布說明書US20040098761Al)；額外的大豆胞囊線蟲必需基因在以下文獻中提供美國專利申請11/360,355(2006年2月23日申請)，通過引用結合到本文中。有關昆蟲基因的描述公眾可從以下數據庫中得到果蠅基因組數據庫(Drosophilagenomedatabase，可得自以下網址flybase.bio.indiana.edu/)。已經通過基于細胞培養的RNA干擾篩選，分析了大部分預測果蠅基因的功能，結果鑒定出438個必需基因；參見Boutros等(2004)Science,303:832_835，支持性材料可得自以下網址www.sciencemag.org/cgi/content/ful1/303/5659/832/DC1。有關細菌和真菌必需基因的描述可得自必需基因數據庫(DatabaseofEssentialGenes，簡稱"DEG”，可得自以下網址tubic.tju.edu.cn/deg/)；參見Zhang等(2004)NucleicAcidsRes.,32:D271_D272。植物有害無脊椎動物包括但不限于有害線蟲、有害軟體動物(鼻涕蟲和蝸牛)。目標植物病原體包括真菌、卵菌、細菌(例如引起葉斑病、枯萎病、冠癭病和細菌性萎蔫病的細菌)、柔膜細菌和病毒(例如引起花葉病、脈結病、斑駁(flecking)、斑點(spotting)或異常生長的病毒)。另見G.N.Agrios，“PlantPathology”(第4版)，AcademicPress,SanDiego，1997，第635頁，對真菌、細菌、柔膜細菌(包括支原體和螺原體)、病毒、線蟲、寄生性高等植物和有鞭毛的原生動物的有關描述，所有這些都是目標植物有害動物或病原體。另見由美國植物病理學會植物病害通用名稱標準化委員會(CommitteeonStandardizationofCommoηNamesforPlantDiseasesofTheAmericanPhytopathologicalSociety)編寫的以下文獻中不斷更新的植物害蟲和病原體和病害名錄AmericanPhytopathologicalSociety“CommonNamesofPlantDiseases",CommitteeonStandardizationofCommonNamesforPlantDiseasesofTheAmericanPhytopathologicalSociety編，1978-2005,可得自以下網址:www.apsnet.org/online/common/top.asp。特別有興趣的真菌性植物病原體的非限制性實例包括例如引起以下病害的真菌白粉病、銹病、葉斑病和葉枯病、猝倒病、根腐病、頸腐病、棉鈴腐病、莖潰瘍病、樹枝潰瘍病(twigcanker)、維管萎蔫病(Vascularwilt)、黑穗病或霉病，包括但不限于鐮孢(Fusariumspp.)、層銹菌(Phakosporaspp.)、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)、赤霉(Gibberellaspp.)、梨抱(Pyriculariaspp.)禾口鏈格孢(Alternariaspp.)。真菌性植物病原體的具體實例包括豆薯層銹菌(Phakosporapachirhizi)(亞洲大豆銹病)、高粱柄銹菌(Pucciniasorghi)(玉米普通銹病)、多堆柄銹菌(Pucciniapolysora)(玉米南方銹病)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)禾口其它鐮抱(Fusariumspp·)、鏈格抱(Alternariaspp·)、青霉(Penicilliumspp·)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、大斑病突臍螺孢菌(Exserohilumturcicum)(玉米大斑病)、玉蜀黍雙極蠕孢(Bipolarismaydis(玉米小斑病)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)(玉米黑粉病)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)(玉米赤霉(Gibberellazeae))、輪狀鐮孢(Fusariumverticilliodes)(串珠狀赤霉(Gibberellamoniliformis))、±曾生鐮孢(F.proliferatum)(藤倉赤霉中間變種(G.fujikuroivar.intermedia))、半粘鐮孢(F.subglutinans)(半粘赤霉(G.subglutinans))、玉米色二孢(Diplodiamaydis)、絲軸團散黑粉菌(Sporisoriumholci-sorghi)、禾生朿Ij盤抱(Colletotrichumgraminicola)、i；SE^it(Setosphaeriaturcica)(Aureobasidiumzeae)、_菜核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)以及美國專利6，194，636的表4和表5中提供的各種真菌種類，所述文獻通過引用全部結合到本文中。植物病原體的非限制性實例包括起先歸類為真菌、但最近歸類為卵菌的病原體。特別有興趣的卵菌性植物病原體的具體實例包括腐霉屬(Pythium)(例如瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum))和疫霉屬(Phytophthora)(例如致病疫霉(Phytophthorainfestans)、大豆疫霉(Phytophthorasojae))的成員和引起霜霉病的生物體(例如粉霜霉(Peronosporafarinosa))。細菌性病原體的非限制性實例包括引起黃化病的支原體和螺原體(例如引起玉米矮縮病的孔氏螺原體(Spiroplasmakunkelii))、真細菌例如燕麥假單胞胃(Pseudomonasavenae)>τ^IixIfilif(Pseudomonasandropogonis)>Εξ文氏菌(Erwiniastewartii)、丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonassyringaepv.syringae)、苛養木桿菌(Xylellafastidiosa)以及美國專利6，194，636的表3中所列舉的各種細菌種類，所述專利文獻通過引用全部結合到本文中。特別有興趣的病毒性植物病原體的非限制性實例包括玉米矮縮花葉病毒(MDMV)、甘蔗花葉病毒(SCMV，以前稱為MDMVB株)、小麥條紋花葉病毒(WSMV)、玉米褪綠矮縮病毒(MCDV)、大麥黃矮病毒(BYDV)、香蕉簇頂病毒(BBTV)以及美國專利6，194，636的表2中所列舉的各種病毒，所述專利文獻通過引用全部結合到本文中。無脊椎動物害蟲的非限制性實例包括胞囊線蟲(Heteroderaspp.)尤其是大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)、根結線蟲(Meloidogynespp·)、紐帶線蟲(Hoplolaimusspp.)、矮化線蟲(Tylenchorhynchusspp.)、螺旋線蟲(Helicotylenchusspp.)、根腐線蟲(短體線蟲(Pratylenchusspp·))、環線蟲(Criconemaspp·)、真滑刃線蟲(Aphelenchusspp.)或滑刃線蟲(Aphelenchoidesspp.)、玉米根蟲、盲蝽(Lygusspp.)、蚜蟲和類似吸食樹汁的昆蟲例如根瘤蚜(葡萄根瘤蚜(Daktulosphairavitifoliae))、玉米螟、切根蟲、粘蟲、葉蟬、日本金龜子、草蜢(蝗蟲)和其它有害鞘翅目、雙翅目和鱗翅目。無脊椎動物害蟲的具體實例包括能夠侵染作物根系的害蟲，例如北方玉米根蟲(Diabroticabarberi)、艮&(Diabroticaundecimpunctata)λMy^iIS-^(Diabroticavirgifera)、玉米根蟲牙(Anuraphismaidiradicis)、黑色切根蟲(球菜夜蛾(Agrotisipsilon))、透翅緩夜蛾(Crymodesdevastator)、暗黑切根蟲(Fsltiaducens)、泥背切根蟲(Agrotisgladiaria)、金針蟲(Melanotusspp.,Aeolusmellillus)、小麥金針蟲(Aeolusmancus)、砂地金針蟲(Horistonotusuhlerii)、玉米象甲(Sphenophorusmaidis)、梯牧草象甲(Sphenophoruszeae)、早熟禾象甲(Sphenophorusparvulus)、南方玉米象甲(Sphenophoruscallosus)、M蟲曹(金龜子(Phyllophagaspp.))、玉米禾中蟲竜(灰地禾中蟲竜(Deliaplatura))、葡萄肖葉甲(Colaspisbrunnea)、玉米籽步甲(Stenolophuslecontei)和玉米籽細步甲(Cliviniaimpressifrons)，以及美國專利6，194，636的表6中所列舉的寄生性線蟲，所述專利文獻通過引用全部結合到本文中。特別有興趣的無脊椎動物害蟲，尤其是但不限于南半球地區(包括美洲中南部地區)包括蚜蟲、玉米根蟲、貪夜蛾、夜蛾(noctuideae)、馬鈴薯瓢蟲、草盲蝽(Lygusspp.)、任何半翅目、同翅目或異翅目、任何鱗翅目、任何鞘翅目、線蟲、切根蟲、谷實夜蛾(earworms)、粘蟲、螟蟲、卷葉螟等。本發明具體涵蓋的節肢動物害蟲包括各種切根蟲，包括切根蟲(Agrotisrepleta)、黑色切根蟲(球菜夜蛾(Agrotisipsilon))、切根蟲(Aniclaignicans)、粒化切根蟲(Feltiasubterranea)、"gusanoaspero"(Agrotismalefida)；地中海粉螟(Anagastakuehniella)、方頸扁甲(Cathartusquadricollis)、跳甲(Chaetocnemaspp)、米蛾(Corcyracephalonica)、玉米根蟲或“vaquitadeSanAntonio，，(Diaboticaspeciosa)、甘蔴螟(Diatraeasaccharalis)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)、褐臭蟲舂(Euschistusspp.)、谷實夜蛾(Helicoverpazea)、扁平谷盜(Laemophloeusminutus)、稻毛脛夜蛾(Mocislatipes)、鋸谷盜(Oryzaephilussurinamensis)Λ紫斑谷蟲冥(Pyralisfarinalis)Λ貞谷蟲冥(Plodiainterpunctella)、玉米葉蟲牙(Rhopalosiphummaidis)、福土蟲舂(brownburrowingbug)或"chinchesubterranea"(Scaptocoriscastanea)、*二&蟲牙(Schizaphisgraminum)、米象(Sitophiluszeamais)、麥蛾(Sitotrogacerealella)、草地粘蟲(Spodopterafrugiperda)、大谷盜(Tenebroidesmauritanicus)、二斑卩十蟲葡(Tetranychusurticae)、赤擬谷盜(Triboleumcastaneum)、棉葉波紋夜蛾(Alabamaargillacea)、棉鈴象甲(Anthonomusgrandis)、豐帛蟲^(Aphisgossypii)Li^H(Bemisiatabaci)Λ^|ij5；(Frankliniellaspp·)、棉鈴蟲(谷實夜蛾(Helicoverpazea))、"orugabolillera，，(例如Helicoverpageletopoeon)、煙夜蛾(Heliothisvirescens)、禾§綠蟲舂Nezaraviridula)、棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)、舌甘菜夜蛾(Spodopteraexigua)、葉螨(Tetranychusspp·)、蔥薊馬(Thripstabaci)、溫室白粉風(Trialeurodesvaporarium)、大豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、斑點玉米葉甲(spottedmaizebeetle)或“astilomoteado，，(Astylusatromaculatus)、“orugadelaalfalfa，，(Coliaslesbia)、"chinchemarr0n，，或"chinchedeIoscuernos，，(Dichelopsfurcatus)、”alquichechico”(Edessamiditabunda)Λblisterbeetles(Epicautaspp.)、"barrenadordelbrote，，(Epinotiaaporema)、"orugaverdedelyuyocolorado，，(Loxostegebifidalis)、根結線蟲、"orugacuarteadora，，(Mocisrepanda)、南方綠盲蟲舂(Nezaraviridula)、”chinchedelaalfalfa，，(Piezodorusguildinii)、苜猜綠夜蛾(Plathypenascabra)、大豆尺夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、尺夜蛾”isocamedidoradelgirasol，，(Rachiplusianu)、黃毛燈蛾(Spilosomavirginica)、黃條粘蟲(Spodopteraornithogalli)、各種象蟲(象蟲科(Curculionidae))、各種金針蟲(叩甲科(Elateridae))和各種蠐螬(金龜子科(Scarabaeidae))。本發明所具體包括的有害線蟲包括以下植物的有害線蟲玉米(針剌線蟲(Belonolaimusspp.)、毛剌線蟲(Trichodorusspp·)、長針線蟲(Longidorusspp·)、維線蟲(Dolichodorusspp·)、優線蟲(Anguinaspp.)、短體線蟲、根結線蟲、胞囊線蟲)、大豆(大豆胞囊線蟲、根結線蟲、針刺線蟲)、香蕉(相似穿孔線蟲(Radopholussimilis)、根結線蟲、螺旋線蟲)、甘蔗(甘蔗胞囊線蟲(Heteroderasacchari)、短體線蟲、根結線蟲)、橙子(半穿刺線蟲(Tylenchulusspp.)、穿孔線蟲(Radopholusspp.)、針刺線蟲、短體線蟲、劍線蟲(Xiphinemaspp·))、咖啡(根結線蟲、短體線蟲)、椰子(傘滑刃線蟲(Bursaphelenchusspp·))、番茄(根結線蟲、針刺線蟲、根瘤線蟲(Nacobbusspp.)、葡萄(根結線蟲、劍線蟲、半穿刺線蟲、小環線蟲(Criconemellaspp.)、檸檬和酸橙(半穿刺線蟲、穿孔線蟲、針刺線蟲、短體線蟲、劍線蟲、可可(根結線蟲、腎形小盤旋線蟲(Rotylenchulusreniformis)、菠蘿(根結線蟲、短體線蟲、腎形小盤旋線蟲、木瓜(根結線蟲、腎形小盤旋線蟲)、葡萄柚(半穿刺線蟲、穿孔線蟲、針刺線蟲、短體線蟲、劍線蟲)和蠶豆(根結線蟲)。來自有害動物的靶基因可包括精子主要蛋白、α微管蛋白、β微管蛋白、液泡ATP酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、RNA聚合酶II、幾丁質合酶、細胞色素、miRNA、miRNA前體分子、miRNA啟動子等物質的無脊椎動物基因，以及其它基因例如以下文獻中公開的那些美國專利申請公布說明書2006/0021087Al、PCT專利申請PCT/US05/11816和美國專利申請公布說明書2004/0098761Al中的表II，所述文獻通過引用結合到本文中。來自病原體的靶基因可包括病毒翻譯起始因子、病毒復制酶、miRNA、miRNA前體分子、真菌微管蛋白、真菌液泡ATP酶、真菌幾丁質合酶、真菌MAP激酶、真菌PaclTyr/Thr磷酸酶、參與營養運輸的酶(例如氨基酸轉運蛋白或糖轉運蛋白)、參與真菌細胞壁生物合成的酶、角質酶、黑素生物合成酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠酶、果膠裂合酶、纖維素酶、蛋白酶等物質的基因，與植物無毒性基因相互作用的基因，以及其它參與病原體在受感染植物中的侵襲和復制的基因。因此，靶基因對于其中重組DNA構建體可轉錄的植物而言不一定是內源的。本發明的重組DNA構建體可在植物中轉錄并用于抑制可侵染植物的病原體或有害動物的基因。合適靶基因的具體的非限制性實例也包括氨基酸分解代謝基因(例如但不限于編碼賴氨酸-酮戊二酸還原酶(LKR)和酵母氨酸脫氫酶(SDH)的玉米LKR/SDH基因、及其同源物)、玉米醇溶蛋白基因、參與脂肪酸合成(例如植物微粒體脂肪酸去飽和酶和植物酰基-ACP硫酯酶，例如但不限于美國專利號6，426，448,6,372，965和6，872，872公開的那些)的基因、參與多步生物合成途徑的基因，其中可能有興趣調節一種或多種中間產物的水平，例如編碼聚羥基鏈烷酸酯生物合成酶的基因(參見例如美國專利號5，750，848)；和編碼細胞周期控制蛋白的基因，例如編碼具有細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑樣活性的蛋白質的基因(參見例如在國際專利申請公布號W005007829A2中公開的基因)。靶基因可包括編碼不想要的蛋白質(例如變應原或毒素)的基因，或編碼不想要的化合物(例如不想要的味道或氣味成分)生物合成酶的基因。因此，本發明的一個實施方案是非天然轉基因植物或該植物的組織，該植物通過抑制變應原性蛋白或毒素而得以改良，例如變應原性降低的花生、大豆或小麥籽粒。靶基因可包括參與水果成熟的基因，例如多聚半乳糖醛酸酶的基因。靶基因可包括這樣的基因其表達優選局限于特定細胞或組織或發育期，或者其表達優選是瞬時的，也就是說，其中組成型或一般性抑制、或遍及許多組織的抑制，并非是想要的。因此，合適靶基因的其它實例包括蛋白質編碼基因，當其在轉基因植物中表達時，使得轉基因植物對有害動物或病原體具有抗性(參見例如美國專利號5，763，245中公開的膽固醇氧化酶基因)；其表達受到有害動物或病原體誘導的基因；和可誘導或恢復能育性的基因(參見例如美國專利號6，759，575所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑/芽孢桿菌RNA酶(barstar/barnase)基因)；本段落所引用的所有專利都通過引用全部結合到本文中。重組DNA構建體可設計成對靶基因的抑制更具特異性，例如通過將重組DNA構建體設計成編碼成熟miRNA，使其包含與非靶基因序列基本不相同(或不互補)的區域。非靶基因可包含不會沉默或抑制的任何基因，無論是在含有重組DNA構建體的植物中還是在可能接觸到重組DNA構建體的生物體中。非靶基因序列可包含來自任何物種(包括但不限于細菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，例如作物、觀賞植物和非馴化植物即野生植物；無脊椎動物，例如節肢動物、環節動物、線蟲和軟體動物；和脊椎動物，例如兩棲類、魚類、鳥類、馴化或野生哺乳動物，甚至人)的任何序列。在一個實施方案中，靶基因對于給定物種而言是內源基因，這些給定物種例如給定植物(例如但不限于農業或商業上重要的植物，包括單子葉植物和雙子葉植物)，而非靶基因可以是例如非靶物種(例如另一種植物)的基因，或是病毒、真菌、細菌、無脊椎動物或脊椎動物、甚至人的基因。一個非限制性實例是這樣的其中重組DNA構建體設計為抑制靶基因而不抑制非靶基因，該靶基因對一種物種(例如西方玉米根蟲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte))而言是內源基因，而該非靶基因是例如來自相關、甚至密切相關物種(例如北方玉米根蟲(DiabroticabarberiSmithandLawrence)或南方玉米IHji,(Diabroticaundecimpunctata))白勺―因。在其它實施方案(例如其中最好能抑制跨越多個物種的靶基因)中，最好能設計重組DNA構建體，使其抑制這多個物種(在其中靶基因是沉默的)共同的靶基因序列。因此，可選擇對一個分類單元具有特異性(例如對一個屬、一個科或者甚至更大的分類單元(例如一個門，例如節肢動物門)具有特異性)、但對其它分類單元(例如植物或脊椎動物或哺乳動物)不具特異性的RNA雙鏈體。在該實施方案的一個非限制性實例中，可選擇用于基因沉默的重組DNA構建體，從而靶向致病真菌(例如鐮孢菌)，而不靶向來自有益真菌的任何基因序列。在該實施方案的另一個非限制性實例中，可選擇在玉米根蟲中用于基因沉默的重組DNA構建體對葉甲屬(Diabrotica)所有成員具有特異性。在該實施方案的又一個實例中，可選擇這類靶向葉甲屬的重組DNA構建體，使其不靶向來自有益鞘翅目(例如捕食性瓢蟲(coccinellidbeetle)，通常稱為瓢蟲)或其它有益昆蟲種類的任何基因序列。用于沉默靶基因的本發明重組DNA構建體的所需特異性程度取決于各種因素。這些因素可包括重組DNA構建體所編碼的成熟微RNA的大小和核酸序列、以及降低這種成熟miRNA對非靶基因的抑制潛力的相對重要性。在一個非限制性實例中，當預期這種成熟miRNA大小為21個堿基對時，一個特別優選的實施方案包括編碼成熟miRNA并用于沉默靶基因的DNA，其中成熟miRNA包含與非靶基因序列基本不相同的序列，例如與非靶基因序列的21個連續核苷酸只有少于18、或少于17、或少于16、或少于15的匹配。在某些實施方案中，最好設計用于沉默靶基因的重組DNA構建體，使其包含預測不會產生不想要的多肽的區域，例如通過篩選重組DNA構建體中的可編碼不想要多肽的序列或其密切同源物。不想要的多肽包括但不限于與已知變應原性多肽同源的多肽和與已知多肽毒素同源的多肽。編碼這些不想要的潛在變應原性肽的公眾可得的序列可得自例如食物變應原研究禾口來源項目(FoodAllergyResearchandResourceProgram,FARRP)的變應原數據庫(可得自allergenonline.com)或食品安全數據庫生物技術信；^(BiotechnologylnformationforFoodSafetyDatabases)(可得自www.iit.edu/sgendel/fa.htm)(另外參見例如Gendel(1998)Adv.FoodNutr.Res.,42:63_92)。不想要的序列也可包括例如注釋為已知毒素或潛在或已知變應原并在例如以下公眾可得的數據庫中具有的多肽序列GenBank，EMBL，SwissProt等等，其可通過Entrez系統(www.ncbi.nih.gov/Entrez)來搜索。不想要的潛在變應原性肽序列的非限制性實例包括大豆的大豆球蛋白，花生的油質蛋白和凝集素，小麥的麥谷蛋白，牛乳的酪蛋白，乳清蛋白和乳球蛋白，以及各種貝類的原肌球蛋白(allergenonline.com)。不想要的潛在毒性肽的非限制性實例包括破傷風梭菌(Clostridiumtetani)的破傷風毒素tetA、金黃色葡萄球菌的腹瀉毒素、以及毒物(例如來自芋螺(Conusspp.)的芋螺毒素和來自節肢動物和爬行動物的神經毒素(www.ncbi.nih.gov/Entrez)0在一個非限制性實例中，可篩選重組DNA構建體，以消除編碼以下多肽的可轉錄序列，所述多肽與已知變應原或毒素具有超過8個連續氨基酸的完美同源性，或者與超過至少80個氨基酸具有至少35%同一性；這樣的篩選可以在任何和所有可能讀框上以兩個方向進行，在以AUG(在相應DNA中為ATG)開頭的潛在可讀框上，或在所有可能讀框上，無論它們是否以AUG(或ATG)開頭。當有“命中”或匹配時，也就是說，當鑒別出編碼與已知變應原或毒素具有超過8個連續氨基酸的完美同源性(或與超過至少80個氨基酸具有至少35%同一性)的潛在多肽的序列時，可避免、消除或修飾對應于該命中的核酸序列，當選擇序列用于RNA進行沉默靶基因時。在一個實施方案中，這樣設計重組DNA構建體，使其不含以AUG(在相應DNA中為ATG)開頭的潛在可讀框。可通過本領域技術人員已知的任何方法，來達到避免、消除或修飾不想要的序列。在某些情況下，結果可以是據信在自然界不存在的新的序列，例如，可通過將“干凈”序列一起連接成待用于RHA雙鏈體的新的嵌合序列，從而避免某些序列。申請人:知道，在某些微RNA介導的基因沉默中，不完美匹配的miRNA序列在基因沉默中可能是有效的。例如，已經知道在鄰近miRNA互補位點中心的錯配，比起更遠位置的錯配而言，對miRNA的基因沉默的影響更強一些。參見例如Mallory等(2004)EMB0J.,233356-3364中的圖4。在另一個實例中，已經報道，錯配堿基對的位置和形成錯配的核苷酸特征，這兩者都影響給定siRNA沉默靶基因的能力，而且腺嘌呤-胞嘧啶錯配，除了G:U擺動堿基對之外，具有良好耐受性(參見Du等(2005)NucleicAcidsRes.,331671-1677)。因此，給定鏈的重組DNA構建體不必與規定靶基因總是具有100%序列同一性，但一般會優選與規定靶基因具有基本的序列同一性，例如與規定靶基因具有約95%、約90%、約85%或約80%序列同一性。對于互補性的描述，重組DNA構建體的一條鏈優選設計成與規定目標(例如目標信使RNA或目標非編碼RNA)具有基本互補性，例如與規定目標具有約95%、約90%、約85%或約80%互補性。在一個非限制性實例中，在編碼21個核苷酸的成熟miRNA的重組DNA構建體的情況下，所編碼的成熟miRNA可設計為與靶RNA的21個連續核苷酸基本、但并非完美互補；優選位置21的核苷酸與靶RNA中的相應位置不配對，以避免傳遞性。本領域技術人員將能判斷，相對于其它標準的重要性而言，篩選預測對靶基因具有更高特異性或預測不產生不想要的多肽的區域的重要性，所述其它標準例如但不限于與規定靶基因具有的％序列同一性或預測給定序列的基因沉默效率。例如，編碼成熟miRNA的本發明重組DNA構建體可設計為在若干物種中都具有活性，因此本領域技術人員可確定，在重組DNA構建體中包含編碼對若干目標物種具有特異性的成熟miRNA的DNA更為重要，而篩選預測具有更高基因沉默效率的區域或篩選預測能產生不想要的多肽的區域則沒那么重要。啟動子通常，本發明的重組DNA構建體包含在植物細胞起作用、并與可轉錄DNA元件操作性連接的啟動子。在不同實施方案中，啟動子選自組成型啟動子、空間特異性啟動子、時間特異性啟動子、發育特異性啟動子和誘導型啟動子。適用于本發明重組DNA構建體的非組成型啟動子包括空間特異性啟動子、時間特異性啟動子和誘導型啟動子。空間特異性啟動子可包括細胞器特異性啟動子、細胞特異性啟動子、組織特異性啟動子或器官特異性啟動子(例如質體特異性啟動子、根特異性啟動子、花粉特異性啟動子或種子特異性啟動子，用于分別抑制第一靶RNA在質體、根部、花粉或種子中的表達)。在許多情況下，種子特異性啟動子、胚特異性啟動子、糊粉特異性啟動子或胚乳特異性啟動子尤為有用。時間特異性啟動子可包括在植物生長周期的某些發育階段期間、或在不同晝夜時間中、或在一年的不同季節中能啟動表達的啟動子。誘導型啟動子包括由例如但不限于以下生物脅迫或非生物脅迫的化學物或環境條件誘導的啟動子例如缺水即干旱、熱、冷、高或低營養或鹽水平、高或低光照水平、或者有害動物或病原體侵染。表達特異性動子也可包括通常為組成型表達、但以不同程度或“強度”表達的啟動子，包括通常認為是“強啟動子”或“弱啟動子”的啟動子。特別有興趣的啟動子包括以下非限制性實例從土壤桿菌(Agrobacterium)T-DNA分離的章魚堿(opaline)合酶啟動子；花椰菜花葉病毒35S啟動子；增強型啟動子元件或嵌合啟動子元件，例如連接增強子元件(來自玉米熱激蛋白70的內含子)的增強型花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子；根特異性啟動子，例如美國專利5，837，848；6，437，217和6，426，446中公開的那些；美國專利6，433，252中公開的玉米L3油質蛋白啟動子；美國專利申請公布說明書2004/0216189中公開的用于編碼質體局限性醛縮酶的植物核基因的啟動子；美國專利6，084，089中公開的低溫誘導型啟動子；美國專利號6，140，078中公開的鹽誘導型啟動子；美國專利6，294，714中公開的光誘導型啟動子；美國專利6，252，138中公開的病原體誘導型啟動子；和美國專利申請公布說明書2004/0123347A1中公開的缺水誘導型啟動子，所有上述專利和專利公布說明書公開的啟動子及其應用，尤其是在植物中的重組DNA構建體功能，所述文獻都通過引用結合到本文中。啟動子元件可包括并非天然啟動子或啟動子元件或其同源物、但可調節基因表達的核酸序列。這類“基因獨立性”調節序列的實例包括天然存在的RNA序列或人工設計的RNA序列，其可包含配體結合區或適配子和調節區(其可以是順式作用的)。參見例如Isaacs等(2004)Nat.Biotechnol.，22:841_847;Bayer和Smolke(2005)NatureBiotechnol.,23:337_343；Mandal禾口Breaker(2004)NatureRev.Mol.CellBiol.，5451-463；Davidson禾口Ellington(2005)TrendsBiotechnol.,23109-112；Winkler等(2002)Nature，419:952-956;Sudarsan等(2003)RNA，9:644_647；禾口Mandal禾口Breaker(2004)NatureStruct.Mol.Biol.,11:29_35。可選擇或設計這些“核糖核酸調節物(riboregulator)”具體的空間或時間特異性，例如僅在給定濃度的合適配體存在(或不存在)時才調節外源基因的翻譯。制備和使用重組DNA構津體可通過適合預定用途的任何方法來制備本發明重組DNA構建體，考慮到例如所需表達類型和在構建體用來轉錄的植物中使用的方便性。制備和使用DNA構建體和載體的通用方法是本領域眾所周知的，詳述于例如包括以下在內的手冊和實驗室指南=Sambrook和Russell,"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，(第3版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,20010構建DNA構建體和載體并用于轉化的有用技術的實例公開于美國專利申請公布說明書2004/0115642A1，通過引用結合到本文中。也可使用GATEWAY克隆技術(可得自InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)來構建DNA構建體，該技術使用來自噬菌體λ載體構建的整合酶(Integrase)Aitt系統的位點特異性重組酶LR克隆反應，代替限制性核酸內切酶和連接酶。LR克隆反應公開于美國專利5，888，732和6，277，608和美國專利申請公布說明書2001/283529,2001/282319和2002/0007051，所有這些文獻都通過引用結合到本文中。GATEWAY克隆技術指導手冊(也由Invitrogen提供)提供了將任何所需DNA常規克隆到含有可操作植物表達元件的載體中的簡明指導。另一種載體構建的替代方法使用不依賴連接的克隆，如以下文獻所公開=Aslandis等(1990)NucleicAcidsRes.，18:6069_6074和Rashtchian等(1992)Biochem.，206:91_97，其中將具有單鏈5’端和3’端的DNA片段連接到所需載體中，然后可以在體內擴增。在某些實施方案中，重組DNA構建體的DNA序列包含對于植物已經經過密碼子優化的序列，其中重組DNA構建體在所述植物中表達。例如，可通過本領域已知方法，使在植物中表達的重組DNA構建體具有經密碼子優化的所有或部分序列(例如第一基因抑制元件或基因表達元件)，用于在植物中表達。參見例如美國專利5，500,365中有關植物密碼子優化的描述，通過引用結合到本文中；另見DeAmicis和Marchetti(2000)NucleicAcidsRes.,28:3339-3346。轉基因植物細胞和植物本發明另一方面提供非天然轉基因植物細胞，其包含本發明的任何重組DNA構建體，如以上標題“重組DNA構建體”下所述。還提供含有本發明非天然轉基因植物細胞的非天然轉基因植物。本發明的非天然轉基因植物包括任何發育期的植物，并包括由本文所公開的轉基因植物細胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物(其可以是近交或雜交后代植物)、或這類轉基因植物的種子。也提供并要求保護在其基因組中具有本發明所提供的重組DNA構建體的轉基因種子。可通過本領域眾所周知的方法制備本發明的非天然轉基因植物細胞、非天然轉基因植物和轉基因種子，如以下標題“制備和使用非天然轉基因植物細胞和非天然轉基因植物”下所述。非天然轉基因植物細胞可包括分離的植物細胞(例如單獨的植物細胞或在人工培養基中或人工培養基上生長的細胞)，或可包括未分化組織(例如愈傷組織或任何聚集的植物細胞)中的植物細胞。非天然轉基因植物細胞可包括至少一種分化組織中的植物細胞，所述分化組織選自葉(例如葉柄和葉片)、根、莖(例如塊莖、根狀莖、匍匐莖、鱗莖和球莖)、莖稈(例如木質部、韌皮部)、木材、種子、果實(例如堅果、谷物、肉質果)和花(例如雄蕊、花絲、花藥、花粉、心皮、雌蕊、子房、胚珠)。本發明的非天然轉基因植物細胞或非天然轉基因植物可以是任何合適的目標植物細胞或植物。瞬時轉化和穩定轉化的植物細胞都包含在本發明之內。特別優選穩定轉化的轉基因植物。在多個優選的實施方案中，非天然轉基因植物是可收獲種子的能育的轉基因植物，而且本發明還要求保護這些轉基因植物的轉基因種子，其中種子優選也含有本發明的重組構建體。制備和使用非天然轉基因棺物細胞和非天然轉基因棺物盡管本發明的重組DNA構建體用于產生本發明的非天然轉基因植物細胞、非天然轉基因植物或轉基因種子，但轉化可包括任何眾所周知的并已證明的方法和組成。用于植物轉化的合適方法其實包括將DNA導入細胞的任何方法，例如通過直接遞送DNA(例如通過PEG介導的原生質體轉化、通過電穿孔、通過用碳化硅纖維攪拌、以及通過DNA包被顆粒加速(accelerationofDNAcoatedparticles))、通過土壤桿菌介導的轉化、通過病毒或其它載體等。一種植物轉化的優選方法是微彈轟擊，例如以下文獻所述美國專利5，015，580(大豆)、5，550，318(玉米)、5，538，880(玉米)、6，153，812(小麥)、6，160，208(玉米)、6，288，312(水稻)和6，399，861(玉米)和6，403，865(玉米)，所有這些文獻都通過引用結合到本文中。植物轉化的另一種優選方法是土壤桿菌介導的轉化。在一個優選的實施方案中，可通過含二元Ti質粒系統的土壤桿菌轉化的方法，得到本發明的非天然轉基因植物細胞，其中土壤桿菌攜帶第一Ti質粒和含有野生型Ti質粒的至少一個T-DNA邊界的第二嵌合質粒、在轉化植物細胞中具有功能并與本發明基因抑制構建體操作性連接的啟動子。參見例如美國專利5，159，135所述的二元系統，通過引用結合到本文中。另見DeFramond(1983)Biotechnology,1262~269；和Hoekema等，(1983)Nature,303:179。在這樣的二元系統中，可在合適的替代宿主(例如大腸桿菌)中方便地構建含有T-DNA邊界的較小質粒，并轉移至土壤桿菌中。用于土壤桿菌介導的植物(尤其是作物)轉化的具體方法包括例如以下文獻中公開的方法美國專利5,004,863,5,159，135和5，518，908(棉花)；5，416，011、5，569，834、5，824，877和6，384，301(大豆)；5，591，616和5，981，840(玉米)；5,463,174(蕓薹屬)和美國專利申請公布說明書2004/0244075(玉米)，所有這些文獻都通過引用結合到本文中。對于以下雙子葉植物和單子葉植物等許多植物而言都報道了類似方法花生(Cheng等(1996)PlantCellRep.,15653)；蘆筍(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,845345)；大麥(Wan和Lemaux(1994)PlantPhysiol.，10437)；水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology,610；Zhang等(1988)PlantCellRep.，7379；小麥(Vasil等(1992)Bio/Technology,10667；Becker等(1994)PlantJ.，5299),苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.，5313)；和番茄(Sun等(2006)PlantCellPhysiol.,47:426_431)。另見美國專利申請公布說明書2003/0167537A1中有關轉化擬南芥(Arabidopsisthaliana)植物的載體、轉化方法和生產的描述，其中轉錄因子由CaMV35S啟動子組成型表達，該文獻通過引用結合到本文中。也可通過用其它載體的轉化而得到轉基因植物細胞和轉基因植物，所述其它載體例如但不限于病毒載體(例如煙草蝕紋病毒(tobaccoetchpotyvirus，TEV)、大麥條狀花葉病毒(BSMV)、以及Edwardson和Christie(〃ThePotyvirusGroup:MonographNo.16,1991,Agric.Exp.Station,Univ.ofFlorida)中所述的有關病毒、質粒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細菌人工染色體)或任何其它合適的克隆載體，當用于例如以下合適轉化方案時細菌感染(例如用如上所述的土壤桿菌)、二元細菌人工染色體構建體、DNA的直接遞送(例如通過PEG介導的轉化、脫水/抑制介導的DNA攝取、電穿孔、用碳化硅纖維攪拌和微彈轟擊)。本領域普通技術人員顯而易見的是，各種轉化方法都可用于或經修改用于自許多目標植物物種產生穩定的轉基因植物。優選在組織培養基和受控環境中實施能提供含穩定整合的重組DNA的轉基因植物細胞和轉基因植物的轉化方法。“培養基”是指用于在體外(即在完整的活生物體之外)培養細胞的多種營養混合物。受體細胞靶標包括但不限于分生組織細胞、愈傷組織、未成熟胚或部分胚、以及配子細胞例如小孢子、花粉、精子和卵細胞。可再生為能育植物的任何細胞都可作為有用的受體細胞，用于本發明的實踐。愈傷組織可來自各種組織來源，包括但不限于未成熟胚或部分胚、幼苗頂端分生組織、小孢子等。能夠增殖為愈傷組織的這些細胞可作為受體細胞，用于遺傳轉化。用于制備本發明非天然轉基因植物的實用的轉化方法和材料(例如各種培養基和受體靶細胞、未成熟胚的轉化、以及其后的能育轉基因植物的再生)都公開于例如美國專利6，194，636和6，232，526和美國專利申請公布說明書2004/0216189，通過引用結合到本文中。轉基因植物包括轉基因植物組織或部分，例如轉基因砧木或轉基因嫁接或接穗材料，其可與非轉基因植物組織或部分組合使用。在通常的轉化實踐中，在任何一個轉化實驗中，DNA僅能導入到少量靶細胞中。標記基因通常用于提供鑒定穩定轉化的細胞的有效系統，這樣的細胞是通過接受轉基因DNA構建體并將它整合到其基因組中而得到的。優選的標記基因提供賦予選擇劑(例如抗生素或除草劑)抗性的選擇標記。植物細胞對其具有抗性的任何抗生素或除草劑都可以是有用的選擇劑。使潛在的轉化細胞接觸選擇劑。在存活細胞群體中的細胞就是賦予抗性的基因整合并以允許細胞存活的足夠量表達的細胞。還可進一步測定細胞，以證實重組DNA的穩定整合。常用的選擇標記基因包括賦予抗生素抗性或除草劑抗性的基因，這些抗生素例如卡那霉素或巴龍霉素(nptll)、潮霉素B(aphIV)和慶大霉素(aac3和aacC4)，這些除草劑例如草銨膦(bar或pat)和草甘膦(EPSPS)。有用的選擇標記基因和選擇劑的實例可參見美國專利5，550，318,5,633，435,5,780，708和6，118，047，所有這些文獻都通過引用結合到本文中。也可使用篩選標記或報道基因，例如提供可目測鑒定轉化子的能力的標記。有用的篩選標記的非限制性實例包括例如表達這樣的蛋白質的基因該蛋白質通過作用于發色底物(例如葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(uidA)或螢光素酶(luc))而產生可檢測顏色，或者它自身是可檢測的，例如綠色熒光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子。本領域技術人員將會知道，許多其它有用標記或報道基因都可使用。重組構建體在本發明非天然轉基因植物中轉錄而表達靶基因(或同時表達目標基因)，可通過蛋白質檢測方法(例如蛋白質印跡、ELISA和其它免疫化學方法)、酶活性測定或核酸檢測方法(例如DNA印跡、RNA印跡、PCR、RT-PCR、熒光原位雜交)等任何合適的方法，來檢測或測定所述靶基因表達上的變化。根據大量可用的手冊，這些方法是本領域普通技術人員眾所周知的；參見例如Jos印hSambrook和Davidff.Russell,"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，(第3版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,2001；FrederickM.Ausubel^(lle^)"ShortProtocolsinMolecularBiology"(H5版)JohnWiley和Sons，2002JohnM.Walker(編著)“ProteinProtocolsHandbook，，(第2片反),HumanaPress,2002；禾口LeandroPena(編著)“TransgenicPlants:MethodsandProtocols，，，HumanaPress,2004。重組DNA在本發明非天然轉基因植物中轉錄而表達靶基因(或同時表達目標基因)，還可通過其它合適的方法來檢測或測定所述靶基因表達上的變化，包括測定能直接或間接指示靶基因在重組DNA可轉錄的轉基因植物(相對于不轉錄重組DNA的轉基因植物)中的表達(或目標基因的同時表達)的任何其它性狀，例如總體或顯微形態學性狀、生長率、產量、生殖或補充(recruitment)率、對有害動物或病原體的抗性、或對生物或非生物脅迫(例如缺水脅迫、鹽脅迫、營養脅迫、熱或冷脅迫)的耐性。這些方法可用于直接測定表型性狀或間接測定(例如在植物中，這些測定包括植物部分測定例如葉或根的測定，以測定非生物脅迫耐性)。通過例如表達或抑制其它基因，可將本發明的重組DNA構建體與賦予額外性狀(例如就轉化植物而言，包括除草劑抗性、抗蟲性、低溫發芽耐性、缺水耐性等性狀)的其它重組DNA疊加在一起(stack)。用于調節基因表達增減的構建體公開于美國專利申請公布說明書2004/0126845A1，通過引用結合到本文中。可收獲能育轉基因植物的種子并用于培育后代，包括在其基因組中包含重組DNA構建體的本發明非天然轉基因植物的雜交后代。因此，除了用重組DNA構建體直接轉化植物之外，可通過將具有重組DNA的第一植物與缺乏構建體的第二植物雜交，制備本發明的非天然轉基因植物。例如，可將重組DNA導入適于轉化的植物系中以產生非天然轉基因植物，其可與第二植物系雜交，將重組DNA漸滲入所得后代中。可將攜帶一個重組DNA(導致靶基因表達變化)的本發明非天然轉基因植物與具有賦予一種或多種額外性狀(例如但不限于除草劑抗性、抗蟲性或抗病性、環境脅迫抗性、營養含量改變和產量提高)的其它重組DNA的植物系雜交，產生具有同時賦予所需靶序列表達行為和額外性狀的重組DNA的后代植物。通常，在合并性狀的育種中，提供額外性狀的轉基因植物是雄性品系，而攜帶基礎性狀的轉基因植物是雌性品系。這種雜交后代發生分離，使得某些植物攜帶同時具有雙親性狀的DNA，而某些只攜帶一方親本性狀的DNA；可通過與親本重組DNA締合的標記來鑒定這類植物。可將攜帶同時具有雙親性狀的DNA的后代植物與雌性親本系多次回交，例如通常6-8代，產生具有與一個原始轉基因親本系基本相同的基因型的后代植物，如果沒有其它轉基因親本系的重組DNA的話。本發明的再一方面是自本發明轉基因種子培育而來的非天然轉基因植物。本發明涵蓋自含有重組DNA的轉基因種子直接培育而來的非天然轉基因植物以及植物后代，包括近交或雜交植物系，其通過將自轉基因種子直接培育而來的轉基因植物與并非由同一轉基因種子培育而來的第二植物雜交而制備。雜交可包括例如以下步驟(a)按照本發明，種植第一親本植物(例如非轉基因或轉基因)和轉基因的第二親本植物的種子；(b)將第一和第二親本植物的種子培育為長花的植物；(c)用第二親本的花粉給第一親本的花授粉；和(d)在攜帶能育花的親本植物上收獲長出的種子。最好是將重組DNA漸滲入原種中，例如通過回交，將一個來源的特定所需性狀轉移到缺乏該性狀的近交或其它植物中。這可通過例如以下步驟來完成將優良近交系(“A”)(回歸親本)與攜帶具有目標性狀的合適基因(例如按照本發明制備的構建體)的供體近交系(“B”)(非回歸親本)第一次雜交。在第一次雜交的所得后代中選出具有從非回歸親本“B”轉移的所需性狀的后代，所選后代再與優良回歸親本“A”回交。經過選擇所需性狀的5代以上回交后，后代在控制所轉移性狀的基因座上是半合子，但在大多數或幾乎所有其它基因上都類似于優良親本。回交的的最后一代自己生長出的后代，對所轉移(即一次或多次轉化事件)的基因而言是純系。經過一序列育種操縱，所選DNA構建體可從一個品系移至完全不同的另一品系，而無需進一步重組操縱。因此可產生近交植物，其可真實育種用于一個或多個DNA構建體。通過將不同近交植物雜交，可得到具有不同DNA構建體組合的大量不同雜種。按照這種方式，可產生具有通常與雜交有關的所需農藝學特性(“雜交優勢”)以及由一種或多種DNA構建體賦予的所需特性的植物。遺傳標記可用于幫助將本發明的一個或多個DNA構建體從一個遺傳背景漸滲到另一個。相對于常規育種而言，有助于選擇的標記具有優勢，因為它可用于避免因表型變異而引起的錯誤。此外，遺傳標記可提供數據，無論原種種質(elitegermplasm)在具體雜交的單個后代中的相對程度如何。例如，當具有所需性狀并具有非農藝學所需遺傳背景的植物與原種親本雜交時，遺傳標記可用于選擇不僅具有目標性狀、而且具有相當大比例的所需種質的后代。這樣，將一種或多種性狀的基因漸滲到特定遺傳背景所需的傳代次數最小。采用標記有助于在本發明非天然轉基因植物的育種中進行選擇，有用的分子標記的種類例如但不限于SSR和SNP，可參見PCT申請公布說明書W002/062129和美國專利申請公布號2002/0133852,2003/0049612和2003/0005491，各自通過引用全部結合到本文中。在某些本發明的非天然轉基因植物細胞和非天然轉基因植物中，最好同時表達(或抑制)目標基因，同時也調節靶基因的表達。因此，在某些實施方案中，非天然轉基因植物含有重組DNA，所述重組DNA還包含基因表達(或抑制)元件，用于表達至少一個目標基因，而靶基因表達的調節優選受到至少一個目標基因在轉基因植物中同時表達(或抑制)的影響。因此，如本文所述，通過采用本領域已知的或本文所公開的任何合適的瞬時或穩定、整合或非整合的轉化方法，可得到本發明的非天然轉基因植物細胞或非天然轉基因植物。重組DNA構建體可在任何植物細胞或組織中或者在完整植物的任何發育期轉錄。轉基因植物可來自任何單子葉植物或雙子葉植物，例如但不限于具有商業或農業價值的植物，例如作物(尤其是作為人類食物或動物飼料的作物)、生產木材或紙漿的樹木、蔬菜植物、水果植物和觀賞植物。目標植物的非限制性實例包括谷類作物(例如小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、小黑麥、水稻、稷、高粱、奎藜籽(quinoa)、莧菜和蕎麥)；飼料作物(例如飼用禾草和飼用雙子葉植物，包括苜蓿、野豌豆、三葉草等)；油料作物(例如棉花、紅花、向日葵、大豆、甘蘭型油菜(亦稱雙低油菜，canola)、白菜型油菜(rapeseed)、亞麻、花生和油棕)；樹堅果(例如核桃、腰果、榛子、山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、棗椰、橄欖、甜菜、茶和咖啡；木材用樹或紙漿用樹；蔬菜作物例如豆類(例如菜豆、豌豆、兵豆、苜蓿、花生)、萵苣、蘆筍、朝鮮薊、芹菜、胡蘿卜、蘿卜、蕓薹類(例如甘藍、羽衣甘藍、芥菜和其它葉用蕓薹類、椰菜、花椰菜、孢子甘藍、蕪菁、球莖甘藍)、食用葫蘆科類(例如黃瓜、甜瓜、夏西葫蘆、冬西葫蘆)、食用蔥屬(例如洋蔥、大蒜、韭菜、火蔥、細香蔥)、茄科(Solanaceae)的食用成員(例如番茄、茄子、馬鈴薯、辣椒、燈籠果(groundcherry))、和藜科(Chenopodiaceae)的食用成員(例如甜菜、牛皮菜、菠菜、奎藜籽、莧菜)；水果作物例如蘋果、梨、柑橘類水果(例如橙子、酸橙、檸檬、葡萄柚等)、核果類(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠蘿、葡萄、獼猴桃、木瓜、鱷梨和漿果類；和觀賞植物，包括觀賞用花卉植物、觀賞用喬木和灌木、觀賞用地被植物和觀賞草。優選的雙子葉植物包括但不限于甘蘭型油菜、椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、白菜、黃瓜、干豆類、茄子、茴香、四季豆、葫蘆、萵苣、甜瓜、秋葵、豌豆、辣椒、西葫蘆(pumpkin)、蘿卜、菠菜、南瓜(squash)、西瓜、棉花、馬鈴薯、奎藜籽、莧菜、蕎麥、紅花、大豆、甜菜和向日葵。優選的單子葉植物包括但不限于小麥、燕麥、大麥、玉米(包括甜玉米和其它品種)、黑麥、小黑麥、水稻、觀賞用禾草和飼用禾草、高粱、稷、洋蔥、韭菜和甘蔗，更優選玉米、小麥和水稻。植物轉化的最終目標是得到對人類有用的植物。就此而言，本發明的非天然轉基因植物可用于對生產者或消費者視為有價值的任何實際目的。例如，人們可以希望收獲轉基因植物本身，或收獲轉基因植物的轉基因種子(用于種植)，或者可以用轉基因植物或其種子來生產各種產品，例如油、淀粉、乙醇或其它發酵產品、動物飼料或人類食物、醫藥和各種工業產品。例如，玉米可廣泛用于食品及飼料業、以及工業應用。有關玉米用途的進一步討論可參見例如美國專利號6，194，636,6,207，879,6,232，526,6,426，446,6,429，357、6，433，252,6,437，217和6，583，338，通過引用結合到本文中，以及PCT公布說明書TO95/06128和W002/057471。因此，本發明也提供由本發明的轉基因植物細胞、植物或種子制備而來的商品，包括但不限于收獲的葉、根、苗、塊莖、莖、果實、種子或其它植物部分、食物、油類、提取物、發酵或消化產物、碾碎或完整的谷物或植物種子、或任何食品或非食品(包含由本發明轉基因植物細胞、植物或種子制備而來的商品)。本文所涵蓋的對一種或多種商品中本發明重組DNA構建體的一個或多個核酸序列的檢測，是該商品含有或源自本發明轉基因植物細胞、植物或種子的實際證據。在優選的實施方案中，相對于缺乏重組DNA構建體的植物而言，由本發明非天然轉基因植物細胞制備而來的非天然轉基因植物(即在其基因組中含有本發明重組DNA構建體的轉基因植物)具有至少一個額外改變的性狀，其選自以下性狀(a)提高非生物脅迫耐性；(b)提高生物脅迫耐性；(c)改變初級代謝產物組成；(d)改變次級代謝產物組成；(e)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(f)提高產量；(g)提高氮或其它營養物的利用能力；(h)改變農藝學特性；(i)改變生長或生殖特性；和(j)提高收獲、貯存或加工品質。在特別優選的實施方案中，非天然轉基因植物的特性是提高對非生物脅迫的耐性(例如對缺水或干旱、熱、冷、非優化營養或鹽水平、非優化光照水平的耐性)或者對生物脅迫(例如擁擠、異株克生作用或受傷)的耐性；改變初級代謝產物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白質、糖或碳水化合物)組成；改變次級代謝產物(例如生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級代謝物)組成；改變微量元素(例如鐵、鋅)、類胡蘿卜素(例如胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質或其它類胡蘿卜素和葉黃素)或維生素(例如生育酚)組成；提高產量(例如在非脅迫條件下產量提高或在生物或非生物脅迫下產量提高)；提高氮或其它營養物的利用能力；改變農藝學特性(例如延遲成熟；延遲衰老；更早熟或更晚熟；改善耐蔭性；提高根莖倒伏的抗性；提高對莖的“greensnap”的抗性；光周期反應的改變)；改變生長或生殖特性(例如有意矮化；有意雄性不育，用于例如例如改進雜交步驟；營養體生長率提高；提高發芽率；提高雄性或雌性生育力)；提高收獲、貯存或加工品質(例如提高貯存期間對有害動物的抗性，提高對破損的抗性、提高對消費者的吸引)；或這些性狀的任何組合。在一個優選的實施方案中，轉基因種子或由非天然轉基因植物產生的種子具有改變的初級代謝產物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白質、糖或碳水化合物)組成，改變的次級代謝產物(例如生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級代謝物)組成，改變的微量元素(例如鐵、鋅)、類胡蘿卜素(例如胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質或其它類胡蘿卜素和葉黃素)或維生素(例如生育酚)組成，提高的收獲、貯存或加工品質，或這些狀性的組合。例如，最好改變作物(例如甘蘭型油菜、棉花、紅花、大豆、甜菜、向日葵、小麥、玉米或水稻)種子的氨基酸(例如賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或總蛋白)、油(例如脂肪酸組成或總油)、碳水化合物(例如單糖或淀粉)、微量元素、類胡蘿卜素或維生素含量，優選還包括提高種子收獲、貯存或加工品質，并因此提供改良的種子，用于動物飼料或人類食物。在另一個實例中，最好改變轉基因植物或轉基因植物種子的天然成分的含量，例如以降低具有低水平賴氨酸、甲硫氨酸或色氨酸的蛋白質含量，或提高所需氨基酸或脂肪酸的含量，或降低變應原性蛋白或糖蛋白(例如花生變應原，包括arah1；小麥變應原，包括醇溶蛋白和麥谷蛋白；大豆變應原，包括P34變應原、球蛋白、大豆球蛋白和伴大豆球蛋白(conglycinins)或有毒代謝產物(例如木薯中產生氰基的糖苷，茄科成員中的龍葵(solanum)生物堿)的含量。基因抑制的方法本發明再一方面提供影響基因抑制的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供非天然轉基因植物，其包括由本發明非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物、或再生植物的后代植物(如以上標題“轉基因植物細胞和植物”下所述)；和(b)在非天然轉基因植物中轉錄重組DNA構建體；其中轉錄產生在非天然轉基因植物中能夠抑制至少一個靶基因的RNA，因此相對于在沒有轉錄重組DNA構建體時的表達而言，至少一個靶基因被抑制。至少一個靶基因是至少一個選自以下的基因對轉基因植物而言是天然的基因，轉基因植物中的轉基因，以及對轉基因植物的病毒、細菌、真菌或無脊椎動物害蟲或病原體而言是天然的基因。合適的靶基因如以上標題“靶基因”下所述。在某些實施方案中，至少一個靶基因是單個靶基因。在其它實施方案中，至少一個靶基因是多個靶基因。靶基因抑制包括非特異性抑制，例如組成型表達抑制，以及特異性表達抑制，例如空間特異性基因抑制、時間特異性基因抑制、發育特異性基因抑制或誘導型基因抑制。通過本領域技術人員已知技術，可達到對至少一個靶基因抑制的特異性，例如通過選擇具有所需特異性表達圖式的啟動子，或者通過選擇具有所需特異性表達圖式的成熟miRNA識別的微RNA識別位點。通過本領域已知方法進行重組DNA構建體的轉錄。在某些實施方案中，轉錄是組成型的即是非特異性的，例如在組成型啟動子控制之下。在其它實施方案中，轉錄在特定空間、時間或誘導條件下發生。例如，重組DNA構建體可包含空間特異性啟動子、時間特異性啟動子或誘導特異性啟動子。在另一個實例中，重組DNA構建體可包含核糖體開關(riboswitch)(可轉錄為能結合配體的RNA適配子的DNA，和可轉錄為能調節靶基因表達的調節RNA的DNA，其中調節依賴于調節RNA的構象，而調節RNA的構象受到RNA適配子結合狀態的變構影響)，因此允許重組DNA構建體的轉錄受到RNA適配子結合狀態和配體存在(或不存在)的控制。本發明還提供同時影響至少一個靶基因的基因抑制和至少一個目標基因的基因表達的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供非天然轉基因植物，其包括由本發明非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物(如以上標題“轉基因植物細胞和植物”下所述)，其中重組DNA構建體還包含用于表達至少一個目標基因的基因表達元件；和(b)在非天然轉基因植物中轉錄重組DNA構建體，其中當重組DNA構建體在非天然轉基因植物中轉錄時，產生能夠抑制至少一個靶基因的轉錄RNA和編碼至少一個目標基因的轉錄RNA，其中相對于在沒有所述重組DNA構建體轉錄時的表達而言，至少一個靶基因被抑制，而且至少一個目標基因同時表達。目標基因可包含來自任何物種(包括但不限于細菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，例如作物、觀賞植物和非馴化植物即野生植物；無脊椎動物，例如節肢動物、環節動物、線蟲和軟體動物；和脊椎動物，例如兩棲類、魚類、鳥類和哺乳動物)的任何編碼或非編碼序列。由基因表達元件所表達的非編碼序列的非限制性實例包括但不限于5’非翻譯區、啟動子、增強子或其它非編碼轉錄區、3’非翻譯區、終止子、內含子、微RNA、微RNA前體DNA序列、小干擾RNA、核糖體或核酶的RNA成分、核仁小RNA、能結合配體的RNA適配子、和其它非編碼RNA。目標基因的非限制性實例還包括但不限于可翻譯(編碼)序列，例如編碼轉錄因子的基因和編碼參與目標分子(例如氨基酸、脂肪酸和其它脂質、糖和其它碳水化合物、生物聚合物和次級代謝產物，包括生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級代謝物)的生物合成或分解代謝的酶的基因。目標基因對于其中本發明重組DNA構建體可轉錄的細胞(例如植物細胞)而言可以是天然的基因，或者可以是非天然的基因。目標基因可以是標記基因，例如，編碼抗生素抗性、抗真菌劑抗性或除草劑抗性的選擇標記基因，或編碼易于檢測的性狀(例如在植物細胞中，八氫番茄紅素合酶或賦予植物特定色素的其它基因)的標記基因，或編碼可檢測分子的基因，所述可檢測分子例如熒光蛋白、螢光素酶或可分別通過蛋白質或核酸檢測方法而檢測的獨特多肽或核酸“標簽”)。選擇標記是特別用于鑒定本發明構建體的成功加工中的目標基因。目標基因包括在以上標題“靶基因”下描述為靶基因的那些基因。由基因表達元件表達的目標基因可包含至少一個選自以下的基因真核靶基因、非真核靶基因和微RNA前體DNA序列。目標基因可包含單個基因或多個基因(例如多拷貝的單基因、單基因的多個等位基因、或包含來自多個物種的基因的多個基因)。在一個實施方案中，基因表達元件可包含自我水解的肽序列，例如位于編碼一種或多種多肽的多個序列之間(參見例如來自病毒、錐蟲和細菌等不同物種的2A和“2A樣”自我切割序列，公開于Donnelly等(2001)，J.Gen.Virol.,82:1027_1041)。在另一個實施方案中，基因表達元件可包含核糖體“skip”序列，例如位于編碼一種或多種多肽的多個序列之間(參見例如口蹄疫病毒(FMDV)2A核糖體“skip”序列，公開于Donnelly等(2001)，J.Gen.Virol.,821013-1025)。非生物-脅迫-應答MIRNA本發明另一方面涉及表現出對非生物脅迫應答的表達圖式的miRNA，例如表現出特征為被營養脅迫而調節miRNA的表達圖式的miRNA，表現出特征為被水脅迫而調節miRNA的表達圖式的miRNA，或表現出特征為被溫度脅迫而調節miRNA的表達圖式的miRNA。實施例6-11描述了在作物中鑒定的新的miRNA，其俗名為miRMONIS，其表現出特征為在營養脅迫(即缺氮、缺磷或氮磷同時缺乏)下抑制miRNA的表達圖式。成熟miRMONIS是序列為UUAGAUGACCAUCAGCAAACA的21個核苷酸的miRNA，是從水稻(SEQIDNO.393)、玉米(SEQIDNO.3227)和大豆(SEQIDNO.8742)的小RNA文庫中克隆而來的。在水稻(SEQIDNO.1763)和玉米(SEQIDNO.3936)中鑒定出前體序列。本發明的重組DNA構建體在以上標題“重組DNA構建體”下有詳細描述，可用于本文所公開的任何miRNA，例如選自以下的成熟miRNA:SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921,SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560,SEQIDN08742,SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。本發明重組DNA構建體的描述也可一般性用于本發明的實施方案，其可更具體地涉及具有特定表達圖式的miRNA，例如本節所描述的營養_脅迫_應答的植物miRNA(例如miRM0N18和實施例所述的其它miRNA)。以下描述涉及miRM0N18，但也可用于被非生物脅迫調節的其它miRNA，尤其是表現出特征為在營養脅迫下抑制miRNA的表達圖式的miRNA，表現出特征為在水脅迫下抑制miRNA的表達圖式的miRNA，或表現出特征為在溫度脅迫下抑制miRNA的表達圖式的miRNA；被非生物脅迫調節的miRNA的非限制性實例包括miR399和miR319。因此，本發明提供重組DNA構建體，其包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，其中至少一個可轉錄DNA元件選自(a)可轉錄為具有選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列折回結構的miRNA前體并加工為具有序列UUAGAUGACCAUCAGCAAACA(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的成熟miRM0N18miRNA的DNA元件；(b)可轉錄為從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列折回結構獲得的工程miRNA前體的DNA元件，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRM0N18miRNA;(c)位于轉基因轉錄單元內或其附近并可轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點可被從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA識別；和(d)用于抑制從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0m8前體序列獲得的內源miRNA表達的DNA元件。這些涉及miRM0N18的實施方案詳述如下。(A)天然miRM0N18在非天然條件下的表達。本發明提供重組DNA構建體，其包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，其中至少一個可轉錄DNA元件包含可轉錄為具有選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列折回結構的miRNA前體并加工為具有SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0N18miRNA的DNA元件，并且至少一個靶基因是植物內源基因，并且其中重組DNA構建體在植物中的表達導致對至少一個靶基因的抑制。在一個優選的實施方案中，miRNA前體包含miRM0N18前體序列的至少90%核苷酸的連續區段。這些構建體尤其可用于以并非天然miRM0N18表達圖式的表達圖式來表達miRM0N18(例如在不同組織、在不同時間或以不同表達水平)。miRM0N18前體不必包含選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列中所含有的所有核苷酸，但優選包含選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列的至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%核苷酸的連續區段。在一個優選的實施方案中，miRNA前體包含選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列的至少90%核苷酸的連續區段。無論所使用的具體核苷酸序列如何，miRM0N18前體構成與由選自SEQIDN0.1763和SEQIDNO.3936的miRMONIS前體序列構成的折回結構相同或近似相同的折回結構并經過一個或多個步驟在體內加工為具有SEQIDNO.393,SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0m8miRNA。在優選的實施方案中，至少一個靶基因是包含至少一個miRMONIS識別位點(靶位點)的植物內源基因，而且重組DNA構建體在植物中的表達導致對至少一個靶基因的抑制。在優選的實施方案中，至少一個靶基因是植物內源基因，因此重組DNA構建體在植物中的表達導致對至少一個靶基因的抑制。在優選的實施方案中，重組DNA構建體還包含并非天然miRMONIS啟動子的啟動子。這允許在不能天然表達的空間或時間或誘導條件下表達成熟miRM0N18miRNA。例如，重組DNA構建體可設計為包含組成型啟動子，因而可組成型表達成熟miRMONIS，其表達圖式的特征為在營養脅迫(即缺氮、缺磷或氮磷同時缺乏)下抑制miRNA；這將會導致miRM0N18靶基因的組成型抑制。在另一個實例中，重組DNA構建體可設計為包含誘導型根特異性啟動子，因此當誘導時在根中表達成熟miRMONIS；這將會導致在誘導時在根組織對miRMONIS靶基因的抑制。可用于該重組DNA構建體的啟動子在標題“啟動子”下有描述。(B)來自miRM0N18的成熟的工程miRNA的表達。在另一個實施方案中，重組DNA構建體包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，其中用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件包含可轉錄為從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列折回結構獲得的工程miRNA前體的DNA元件，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRM0N18miRNA，其中至少一個靶基因是植物內源基因或者所述植物的有害動物或病原體的內源基因，而且其中重組DNA構建體在植物中的表達導致對至少一個靶基因的抑制。在優選的實施方案中，至少一個靶基因是植物內源基因或者所述植物的有害動物或病原體的內源基因，而且重組DNA構建體在植物中的表達導致對至少一個靶基因的抑制。合適的靶基因描述于以上標題“靶基因”下。至于“工程”是指選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的天然miRMONIS前體序列中的核苷酸被改變(替換、缺失或添加)，因而產生具有與天然miRMONIS前體序列折回結構基本相同的折回結構的工程miRNA前體，但其中由工程miRM0N18前體加工而來的成熟miRNA具有修飾序列(即不同于天然成熟miRM0N18的序列)，所述修飾序列可設計為抑制靶基因，該靶基因不同于被天然miRMONIS前體序列天然抑制的靶基因。用于測定天然miRMONIS前體序列中核苷酸改變以產生工程miRNA前體的一個通用的非限制性方法描述于以上標題“成熟的工程miRNA的表達”下。(C)轉基因的表達和miRM0N18識別位點。在另一個實施方案中，重組DNA構建體包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，并且還包含轉基因轉錄單元，其中用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件包含位于轉基因轉錄單元內或其附近并可轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點可被具有SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0N18miRNA識別，或者被從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRM0N18miRNA識別，并且至少一個靶基因包含轉基因轉錄單元所編碼的轉基因，而且其中重組DNA構建體在植物中的表達導致轉基因在成熟miRMONlSmiRNA并不能天然表達的植物細胞中得以表達。使用以下文獻所述的序列互補法則等本領域已知方法，可完成對miRM0N18識別位點的預測=Zhang(2005)NucleicAcidsRes.,33:W701-704和Rhoades等(2002)Cell，110:513_520；以下工作實施例中提供了miRMONIS識別位點的非限制性實例。對miRM0N18識別位點的預測允許鑒定和證實受到來自天然表達miRM0N18前體的成熟miRM0N18調節的內源基因；這可用于例如消除或修飾內源基因內的miRM0N18識別位點，以便將該基因的表達從由天然調節基因表達的內源miRMONIS的調節中解脫出來。在一個實施方案中，可增加miRM0N18識別位點與成熟miRM0N18之間的錯配數(尤其是對應于成熟miRM0N18的位置2至13的錯配)，以防被內源miRM0N18識別并切割。這些重組DNA構建體尤其可用于根據miRMONIS的內源表達而限制的轉基因的inplanta表達，也就是說，當例如在營養脅迫(即缺氮、缺磷或氮磷同時缺乏)下miRMONIS被抑制時，表達轉基因。轉基因的表達還可通過使用合適啟動子來控制。在一個非限制性實例中，本發明的重組DNA構建體可用于在缺氮(或缺磷)條件下在植物根部表達轉基因，其中本發明的重組DNA構建體編碼(a)轉基因，其處于根特異性啟動子控制之下，和(b)miRNA識別位點，其由僅在缺氮(或磷)條件下才被特異性抑制的成熟miRMONIS識別。轉基因轉錄單元包含至少一個轉基因和任選額外序列，例如但不限于啟動子、啟動子增強子、終止子、信使RNA穩定或去穩定序列(參見例如Newman等(1993)PlantCell,5701-714；Green(1993)PlantPhysiol.，1021065-1070；禾ΠOhme-Takagi等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9011811-11815)、用于將轉基因轉錄物定位或轉運至特定場所(例如線粒體、質體、核仁、過氧化物酶體、內質網等)的序列、或轉基因所需加工相關的其它序列。轉基因轉錄單元所編碼的轉基因可包含任何一個或多個目標基因，包括編碼序列、非編碼序列或這兩者。目標基因可包含“靶基因”下所列出的任何基因，其優選的實例包括轉錄因子編碼基因和酶編碼基因的可翻譯(編碼)序列，所述酶參與目標分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂質、糖類和其它碳水化合物、生物聚合物和次級代謝物(包括生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級代謝物))的生物合成或分解代謝。(D)對內源或天然miRMONIS的抑制。在另一個實施方案中，重組DNA構建體包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，其中至少一個可轉錄DNA元件包含用于對從選自SEQIDN0.1763和SEQIDN0.3936的miRM0N18前體序列獲得的內源成熟miRM0N18miRNA表達進行抑制的DNA元件，其中至少一個靶基因是植物內源基因，而且其中該內源基因的表達在發生內源成熟miRM0N18miRNA天然表達的植物細胞中被抑制，而且其中重組DNA構建體在細胞中的表達導致內源基因在細胞中的表達。這些構建體尤其可用于抑制天然或內源miRMONIS，因此允許具有一個或多個miRMONIS識別位點的基因表達。在優選的實施方案中，至少一個靶基因是植物內源基因并包含一個或多個miRMONIS識別位點，而且內源基因的表達在發生成熟miRM0N18的天然表達的植物細胞中被抑制，因此重組DNA構建體在細胞中的表達導致內源靶基因在細胞中的表達。用于抑制表達的DNA元件包含以下至少一個(a)包含至少一個反義DNA區段的DNA，該反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的；(b)包含多拷貝的至少一個反義DNA區段的DNA，該反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的；(c)包含至少一個有義DNA區段的DNA，該有義DNA區段是靶基因的至少一個區段；(d)包含多拷貝的至少一個有義DNA區段的DNA，該有義DNA區段是靶基因的至少一個區段；(e)可轉錄為RNA并通過形成雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA，并且該DNA包含至少一個反義DNA區段和至少一個有義DNA區段，該反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的，而該有義DNA區段是靶基因的至少一個區段；(f)可轉錄為RNA并通過形成一個雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA,并且該DNA包含多個連續反義DNA區段和多個連續有義DNA區段，這些反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的，而這些有義DNA區段是靶基因的至少一個區段；(g)可轉錄為RNA并通過形成多個雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA，并且該DNA包含多個反義DNA區段和多個有義DNA區段，這些反義DNA區段對靶基因的至少一個區段而言是反義的，而這些有義DNA區段是靶基因的至少一個區段，并且其中多個反義DNA區段和多個有義DNA區段以一系列反向重復序列方式排列；(h)包含從植物miRNA獲得的核苷酸的DNA；⑴包含siRNA的核苷酸的DNA;(j)可轉錄為能結合配體的RNA適配子的DNA；和(k)可轉錄為能結合配體的RNA適配子的DNA，和可轉錄為能調節靶基因表達的調節RNA的DNA，其中調節依賴于調節RNA的構象，而調節RNA的構象受到RNA適配子結合狀態的變構影響。用于抑制表達的DNA元件在實施例3中進一步描述并如圖2和圖3所示。通過以下“微RNA誘騙序列”中詳述的替代方法可控制miRNA對其靶基因的作用。在某些實施方案中，重組DNA構建體包含這樣的DNA其設計成可轉錄為單鏈RNA或至少部分雙鏈RNA(例如以“相吻莖環”排列)、或可轉錄為假定二級結構或三維構型(例如靶基因或適配子的反義序列的大環)的RNA，該RNA賦予轉錄物額外的所需特性，例如穩定性提高、體內半衰期延長或者細胞特異性或組織特異性提高。在一個實例中，間隔區可轉錄為能連接連續RNA區段第一系列和第二系列的穩定環(參見例如DiGiusto和King(2004)J.Biol.Chem.，279:46483_46489)。在另一個實例中，重組DNA構建體包含可轉錄為包含RNA適配子(例如可結合細胞特異性配體的適配子)在內的RNA的DNA，允許針對重組RNA雙鏈體的細胞特異性或組織特異性尋靶。(E)miRNA-無應答的轉基因，包括miRM0N18-無應答的轉基因。也公開并要求保護重組DNA構建體，其包含對給定成熟miRNA無應答的合成miRNA-無應答的轉基因序列，其中合成miRNA-無應答的轉基因序列是(a)由天然miRNA-應答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRNA-應答序列內被給定成熟miRNA識別的所有天然miRNA識別位點，和(b)不被給定成熟miRNA識別。非限制性實施方案包括重組DNA構建體，其包含對選自以下的成熟miRNA無應答的合成miRNA-無應答的轉基因序列SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560,SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者對從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA無應答SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中合成miRNA-無應答的轉基因序列是(a)由天然miRNA-應答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRNA-應答序列內被給定成熟miRNA識別的所有天然miRNA識別位點，和(b)不被給定成熟miRNA識別。使用以下文獻所述的序列互補法則等本領域已知方法，可完成對識別位點的預測=Zhang(2005)NucleicAcidsRes.，33:W701_704和Rhoades等(2002)Cell，110:513_520。一個非限制性優選實施方案是重組DNA構建體，其包含合成miRMONIS-無應答的轉基因序列，其中合成miRM0N18-無應答的轉基因序列是(a)由天然miRMONIS-應答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRM0N18-應答序列內的所有天然miRM0N18miRNA識別位點(也就是說，缺失或修飾被具有SEQIDNO.393,SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0N18miRNA識別或者被從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRM0N18miRNA識別的任何識別位點)，和(b)不被成熟miRM0N18miRNA識別。(F)非生物-脅迫-應答的miRNA啟動子，包括miRM0N18啟動子。也公開并要求保護重組DNA構建體，其包含表現出特征為被非生物脅迫而調節的表達圖式的miRNA啟動子，例如，表現出特征為被營養脅迫而調節miRNA的表達圖式的miRNA啟動子，表現出特征為被水脅迫而調節miRNA的表達圖式的miRNA啟動子，或表現出特征為被溫度脅迫而調節miRNA的表達圖式的miRNA啟動子。優選的實施方案包括重組DNA構建體，其包含表現出特征為被營養脅迫而調節miRNA的表達圖式的miRNA啟動子，其中營養脅迫包括選自缺氮和缺磷的至少一種營養缺乏。在一個實施方案中，啟動子是被缺氮抑制的miRNA啟動子。在另一個實施方案中，啟動子是被缺無機磷抑制的miRNA啟動子。在又一個實施方案中，啟動子是被同時缺氮和缺磷抑制的miRNA啟動子。在再一個實施方案中，啟動子是被缺氮或缺磷上調的miRNA啟動子。特別優選的實施方案包括重組DNA構建體，其包含表現出特征為在營養脅迫下抑制miRNA的表達圖式的miRNA啟動子，其中營養脅迫包括選自缺氮和缺磷的至少一種營養缺乏，并且其中啟動子包含以下至少一個(a)在葉組織中表現出在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制的玉米miRNA啟動子；(b)在葉組織中表現出在磷充足條件下強表達、而在缺磷條件下抑制的玉米miRNA啟動子；(c)具有SEQIDNO.8804序列的miRM0N18啟動子；(d)與SEQIDNO.8804區段具有至少85%同一性的至少約50個連續核苷酸的片段。也優選這樣的實施方案其中啟動子與以下至少一個操作性連接(a)基因抑制元件，和(b)基因表達元件；優選這些實施方案可用于在植物中表達重組DNA構建體。非限制性實例包括具有SEQIDN0.8800的核苷酸211-2172序列的啟動子；與SEQIDN0.8800的核苷酸211-2172具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%同一性的至少約50、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、或至少500個連續核苷酸的片段，其中所述片段在至少一種植物組織中具有啟動子活性，其特征為在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件條件下強表達、而在缺磷條件下抑制；而且至少約50、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、或至少500個連續核苷酸的片段與SEQIDN0.8804具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%同一性，其中所述片段在至少一種植物組織中具有啟動子活性，其特征為在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件條件下強表達、而在缺磷條件下抑制。(G)非生物-脅迫-應答的轉基因植物細胞和植物。還公開和要求保護非天然轉基因植物細胞，其包含該標題(“非生物-脅迫-應答的miRNA”)下所公開的任何重組DNA構建體。一個優選的實施方案包括由包含重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞制備而來的非天然轉基因植物，該重組DNA構建體包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，其中至少一個可轉錄DNA元件包含可轉錄為具有選自SEQIDN0.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列折回結構的miRNA前體的DNA元件，其中miRNA前體包含miRM0N18前體序列的至少90%核苷酸的連續區段并加工為具有序列UUAGAUGACCAUCAGCAAACA(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的成熟miRMON18miRNA，而且至少一個靶基因是植物內源基因并包含SPX結構域，而且其中重組DNA構建體在植物中的表達導致對至少一個靶基因的抑制；通常重組DNA構建體還包含并非天然miRM0N18啟動子的啟動子，以驅動成熟miRM0N18的表達。另一個優選的實施方案包括由包含重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞制備而來的非天然轉基因植物，該重組DNA構建體包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，其中至少一個可轉錄DNA元件包含用于對從選自SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列獲得的內源成熟miRM0N18miRNA表達進行抑制的DNA元件，其中至少一個靶基因是植物內源基因并包含SPX結構域，而且內源基因的表達在發生內源成熟miRM0N18miRNA天然表達的植物細胞中被抑制，而且其中重組DNA構建體在細胞中的表達導致內源基因在細胞中的表達。用于抑制內源成熟miRM0N18miRNA表達的合適DNA元件描述于以上標題“對內源或天然miRM0N18的抑制”下。微RNA誘騙序列植物微RNA通過以下方式調節其靶基因識別并結合靶轉錄物中幾乎完美互補的序列(miRNA識別位點)，再通過RNA酶III酶(例如Agol)切割轉錄物。在植物中，給定miRNA識別位點與相應成熟miRNA之間的某些錯配是不能忍受的，尤其是成熟miRNA位置10和11的錯配核苷酸。以5’至3’方向給出成熟miRNA內的位置；為了清楚起見，圖7D描繪了miRNA、miR827(SEQIDNO.8744)和miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的實例，帶編號的箭頭標明成熟miRNA的位置1、10和21；位置10的核苷酸還具有下劃線。在成熟miRNA的位置10和11上通常需要給定miRNA識別位點與相應成熟miRNA之間的完美互補。參見例如Franco-Zorrilla等(2007)NatureGenetics,391033-1037；和Axtell等(2006)Cell,127:565_577。植物miRNA的這一特征可用于達到預測“微RNA誘騙序列”的法則，也就是說，該序列可被內源成熟miRNA識別并結合而導致miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間的堿基配對，因而形成因miRNA誘騙序列與成熟miRNA間存在錯配而不被切割的抗切割RNA雙鏈體。錯配包括規范錯配(例如G-A、C-U、C-A)以及G::U擺動配對和得失位(indels)(核苷酸插入或缺失)。一般而言，這些法則定義(1)所需錯配，和(2)允許但并非必需的錯配。所需錯配包括(a)miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間在內源成熟miRNA位置9、10或11上的至少1個錯配，或者，(b)在對應于內源成熟miRNA的位置9、10或11的miRNA誘騙序列的位置上的1、2、3、4或5個插入(即額外核苷酸)。在優選的實施方案中，存在(a)miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間在內源成熟miRNA的位置10和/或11上的至少1個錯配，或(b)在對應于內源成熟miRNA的位置10和/或11的miRNA誘騙序列的位置上的至少1個插入。允許但并非必需的錯配包括(a)miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間在內源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個錯配，和(b)miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間在內源成熟miRNA位置12至最后一位(即21個核苷酸的成熟miRNA的位置21)上的0、1、2或3個錯配，其中在內源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個錯配都鄰近至少一個互補堿基對(即使得在內源成熟miRNA位置12至最后一位上有不超過2個連續錯配)。在優選的實施方案中，在內源成熟miRNA的位置1、2、3、4、5、6、7和8上不存在錯配(即所有都是互補堿基對)。miRNA誘騙序列可以是任何長度，只要能被內源成熟miRNA識別并結合，形成抗切割的RNA雙鏈體。在優選的實施方案中，miRNA誘騙序列包含約18至約36個核苷酸。特別要求保護的實施方案包括18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30和31個核苷酸的miRNA誘騙序列。在非限制性實例中，具有在成熟miRNA位置10上的4個核苷酸插入的所需錯配和在成熟miRNA位置20上的1個核苷酸插入的允許錯配的miRNA誘騙序列(對于21個核苷酸的成熟miRNA)總共具有26個核苷酸；具有在成熟miRNA位置11上的5個核苷酸插入的所需錯配以及在成熟miRNA位置20上的1個規范錯配和在成熟miRNA位置23上的1個核苷酸插入的允許錯配的miRNA誘騙序列(對于25個核苷酸的成熟miRNA)總共具有31個核苷酸。因此，本發明的一個實施方案包括重組DNA構建體，其可轉錄為包含至少一個miRNA誘騙序列的RNA轉錄物，該miRNA誘騙序列可被內源成熟miRNA識別并結合、但不切割(例如不被淘金者蛋白(Argonaute)或AGO樣蛋白切割)，其中內源miRNA是選自以下的至少一種miRNA(a)選自以下成熟miRNA的成熟miRNA=SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921,SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560,SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或(b)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDN0.8816-8819；而且miRNA誘騙序列包含約19個至約36個連續RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA誘騙序列被內源成熟miRNA識別并結合，導致miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間的堿基配對，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一個錯配，或在所述miRNA誘騙序列對應于所述內源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一個插入，(b)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個錯配，和(c)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3個錯配，其中在所述內源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個所述錯配都鄰近至少一個互補堿基對。本發明的重組DNA構建體包含至少一個miRNA誘騙序列，并且包含多個miRNA誘騙序列(可以是單miRNA誘騙序列的多拷貝，或不同miRNA誘騙序列的拷貝，或這兩者的組合)。在一個實例中，多拷貝的miRNA誘騙序列在重組DNA構建體中串聯排列，該設計用于降低相應成熟miRNA的活性。在另一個實例中，通過表達可轉錄為多個不同miRNA誘騙序列的單個嵌合重組DNA構建體，來降低不同的成熟miRNA的活性。miRNA誘騙序列的表達可被不同啟動子驅動，這些啟動子包括但不限于組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子、時間特異性啟動子、誘導型啟動子或組成型啟動子，例如在標題“啟動子”下描述的任何啟動子。miRNA誘騙序列可位于轉錄物的不同位置。在也可轉錄為編碼序列、非編碼序列(例如miRNA)或這兩者的重組DNA構建體中，miRNA誘騙序列優選位于內含子內或聚腺苷酸化信號之后，以允許編碼序列、非編碼序列或這兩者的正常轉錄。在本發明的另一些實施方案中，類似誘騙序列可用于調節參與雙鏈RNA介導的基因抑制的其它小RNA的活性，包括反式作用小干擾RNA(ta-siRNA)、天然反義轉錄siRNA(nat-siRNA)和定相小RNA(可參見以下文獻美國專利申請11/897，611，2007年8月31日申請，其通過引用結合到本文中)。基本上采用與預測miRNA誘騙序列相同的法則，來預測這些類似ta-siRNA誘騙序列、nat-siRNA誘騙序列和定相小RNA誘騙序列，并且具有與miRNA誘騙序列類似的用途。miRNA誘騙序列可以是天然存在的序列或人工序列。在一個實施方案中，至少一個miRNA誘騙序列包含天然存在的miRNA誘騙序列，例如，通過生物信息學而鑒定的內源miRNA誘騙序列。在另一個實施方案中，至少一個miRNA誘騙序列包含合成miRNA誘騙序列，例如，經從頭開始設計為結合給定成熟miRNA并形成抗切割RNA雙鏈體的序列。因此，本發明的一個實施方案是重組DNA構建體，其可轉錄為包含至少一個miRM0N18誘騙序列的RNA轉錄物，該miRM0N18誘騙序列可被內源成熟miRM0N18識別并結合、但不切割(例如不被淘金者蛋白(Argonaute)或AGO樣蛋白切割)，其中內源miRMONIS是選自以下的至少一個(a)成熟miRM0N18，或(b)從植物miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA；和包含約19個至約36個連續RNA核苷酸的RNA序列的miRM0N18誘騙序列，其中miRM0N18誘騙序列可被內源成熟miRM0N18識別并結合，導致miRM0N18誘騙序列與內源成熟miRM0N18之間的堿基配對，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)miRNA誘騙序列與內源成熟miRM0N18之間在內源成熟miRM0N18位置9、10或11上的至少一個錯配，或在miRM0N18誘騙序列對應于內源成熟miRM0N18位置10-11的位置上的至少一個插入，(b)miRM0N18誘騙序列與內源成熟miRM0N18在內源成熟miRM0N18位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個錯配，和(c)miRM0N18誘騙序列與內源成熟miRM0N18之間在內源成熟miRM0N18位置12至最后一位上的0、1、2或3個錯配，其中在內源成熟miRM0N18位置12至最后一位上的每個錯配都鄰近至少一個互補堿基對；而且其中至少一個miRMONIS誘騙序列被成熟miRM0N18miRNA識別并結合、但不切害I]。在優選的實施方案中，成熟miRM0N18具有SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.874的序列，或者是從選自SEQIDN0.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA。本發明還提供在選自缺氮和缺磷的至少一種營養缺乏下提供產量提高的非天然轉基因作物的方法，該方法包括在非天然轉基因作物中表達可轉錄為包含至少一個miRM0N18誘騙序列的RNA轉錄物的重組DNA構建體。本發明的另一個實施方案是重組DNA構建體，其可轉錄為包含至少一個miRM0N18誘騙序列的RNA轉錄物，該miRMONIS誘騙序列可被內源成熟miR399識別并結合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO樣蛋白切割)，其中內源miR399是選自以下的至少一個(a)成熟miR399，或(b)從選自SEQIDNO.8816-8819的miR399前體序列獲得的成熟miRNA；而且miR399誘騙序列包含約19個至約36個連續RNA核苷酸的RNA序列，其中miR399誘騙序列被內源成熟miR399識別并結合，導致miR399誘騙序列與內源成熟miR399之間的堿基配對，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)miR399誘騙序列與內源成熟miR399之間在所述內源成熟時1399位置9、10或11上的至少一個錯配，或在miR399誘騙序列對應于內源成熟miR399位置10-11的位置上的至少一個插入，(b)miR399誘騙序列與內源成熟miR399之間在內源成熟miR399位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個錯配，和(c)miR399誘騙序列與內源成熟miR399之間在內源成熟miR399位置12至最后一位上的0、1、2或3個錯配，其中在內源成熟miR399位置12至最后一位上的每個錯配都鄰近至少一個互補堿基對；而且其中至少一個miR399誘騙序列被成熟miR399識別并結合、但不切割。在優選的實施方案中，成熟miR399具有SEQIDNO.8812-8815的序列，或者是從選自SEQIDN0.8816-8819的miR399前體序列獲得的成熟miRNA。本發明還提供在選自缺氮和缺磷的至少一種營養缺乏下提供產量提高的非天然轉基因作物的方法，該方法包括在非天然轉基因作物中表達可轉錄為包含至少一個miR399誘騙序列的RNA轉錄物的重組DNA構建體。本發明的再一個實施方案是對內源miRNA誘騙序列的抑制，例如通過基因抑制元件(例如在標題“用于抑制表達的DNA元件”下所述)，尤其是被細胞特異性啟動子或組織特異性啟動子或誘導型啟動子驅動。本文所述的任何這些重組DNA構建體都可通過常用技術來制備，例如在標題“制備和使用重組DNA構建體”下所述并參見工作實施例。重組DNA構建體尤其可用于制備非天然轉基因植物細胞、非天然轉基因植物和轉基因種子，如以下“轉基因植物細胞和轉基因植物”所述。包含miRNA誘騙序列的重組DNA構建體可用于提供經工程改造以抑制內源基因的合成miRNA的獨特表達圖式；這尤其可用于防止由合成miRNA在某些組織中的不想要的表達而引起的不利表型。例如，合成miRNA可用于僅在植物的特定組織中才抑制內源基因，例如通過重組DNA構建體在植物中的表達，該重組DNA構建體包含(a)驅動合成miRNA表達的組成型啟動子，和(b)驅動miRNA誘騙序列表達的組織特異性啟動子，該miRNA誘騙序列經設計用于隱蔽合成miRNA。本發明還提供用于提供改良的作物的方法。本發明一方面包括提供具有至少一個改變的性狀的非天然轉基因作物的方法，該方法包括在非天然轉基因作物中表達可轉錄為包含至少一個miRNA誘騙序列的RNA轉錄物的重組DNA構建體，該miRNA誘騙序列被內源成熟miRNA識別并結合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO樣蛋白切割)，其中內源miRNA是選自以下的至少一種miRNA(a)選自以下成熟miRNA的成熟miRNA:SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921,SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或(b)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；而且miRNA誘騙序列包含約19個至約36個連續RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA誘騙序列被內源成熟miRNA識別并結合，導致miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間的堿基配對，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一個錯配，或在所述miRNA誘騙序列對應于所述內源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一個插入，(b)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個錯配，和(c)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3個錯配，其中在所述內源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個所述錯配都鄰近至少一個互補堿基對，因而相對于不表達重組DNA構建體的作物而言，導致非天然轉基因作物表現出選自以下的至少一個改變的性狀(i)提高非生物脅迫耐性；(ii)提高生物脅迫耐性；(iii)提高針對植物的有害動物或病原體的抗性；(iv)改變初級代謝產物組成；(v)改變次級代謝產物組成；(vi)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(vii)提高產量；(viii)提高氮或其它營養物的利用能力；(ix)改變農藝學特性；(x)改變生長或生殖特性；和(xi)提高收獲、貯存或加工品質。另一方面，本發明提供具有至少一個改變的性狀的非天然轉基因作物的方法，該方法包括在非天然轉基因作物中抑制至少一個內源miRNA誘騙序列，該內源miRNA誘騙序列被內源成熟miRNA識別并結合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO樣蛋白切割)，其中內源miRNA是選自以下的至少一種miRNA(a)選自以下成熟miRNA的成熟miRNA:SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDN08742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850,或(b)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；而且miRNA誘騙序列包含約19個至約36個連續RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA誘騙序列被內源成熟miRNA識別并結合，導致miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間的堿基配對，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一個錯配，或在所述miRNA誘騙序列對應于所述內源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一個插入，(b)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個錯配，和(c)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3個錯配，其中在所述內源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個所述錯配都鄰近至少一個互補堿基對；因而相對于不表達重組DNA構建體的作物而言，導致非天然轉基因作物表現出選自以下的至少一個改變的性狀(i)提高非生物脅迫耐性；(ii)提高生物脅迫耐性；(iii)提高針對植物的有害動物或病原體的抗性；(iv)改變初級代謝產物組成；(v)改變次級代謝產物組成；(vi)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(vii)提高產量；(viii)提高氮或其它營養物的利用能力；(ix)改變農藝學特性；(x)改變生長或生殖特性；和(xi)提高收獲、貯存或加工品質。可通過包括在非天然轉基因作物中表達基因抑制元件(例如在標題“對內源或天然miRNA的抑制”下所述的用于抑制表達的DNA元件)的任何方法或通過任何其它的基因抑制方法，來達到對至少一個內源miRNA誘騙序列的抑制。在一個非限制性實例中，轉基因植物在營養充足條件下過量表達針對miRNA(其在營養充足條件下高水平天然表達而在營養缺乏條件下低水平天然表達)的至少一個miRNA誘騙序列，因而導致植物在營養缺乏下的性能或產量提高，對營養的利用力提高。例如，miRM0N18和miR399在缺氮或缺磷條件下低水平表達，而在氮磷充足的條件下高水平表達，因而它們的天然靶基因在缺氮或缺磷條件下被抑制，而在氮磷充足條件下以相對高的水平表達；這導致轉基因植物對氮和/或磷的利用力提高。因此，相對于不表達重組DNA構建體的植物而言，過量表達包含至少一個miRM0N18誘騙序列(或至少一個miR399誘騙序列)的重組DNA構建體的轉基因植物，導致在氮磷充足條件下以較高水平表達miRM0N18天然靶基因(或miR399天然靶基因)。在一個非限制性實例中，預期過量表達包含至少一個miRM0N18誘騙序列的重組DNA構建體的轉基因植物能積累相對高水平的天然miRM0N18靶標(例如含有SPX結構域的基因，例如圖12所示的基因，如實施例7、9和10所述)。實施例實施例1本實施例描述鑒定作物(水稻和玉米)微RNA和它們的前體(折回)結構的方法的非限制性實施方案，用于制備本發明的重組DNA構建體。通過高通量測序(Margulies等(2005)Nature，437:376-380)，從成熟水稻(Oryzasativacv.Nipponbare)成熟谷粒(一式三份)和秧苗以及從玉米(Zeamays)葉和玉米籽粒(授粉后39天)中克隆若干小(19-25個核苷酸)RNA文庫。由此得到的序列用于分別在水稻基因組序列和玉米基因組序列中進行miRNA預測，使用來自先前已表征的miRNA的一組法則，再按照手冊指南來消除不良預測的折回結構。與注釋tRNA、rRNA、轉座子/反轉錄轉座子和其它已知重復序列、以及葉綠體基因組或線粒體基因組完美匹配的小RNA排除在分析之外。基因組研究學會(InstituteforGenomeResearch)的水稻基因組注釋4.0版(公眾可得自tigr.org)用于預測310個核苷酸的兩個側翼基因組區段，其中給定的小RNA位于所述區段左端或右端附近，因而得到由280個核苷酸+小RNA+10個核苷酸組成的序列，或由10個核苷酸+小RNA+280個核苷酸組成的序列。按照以下文獻所述，用Vienna軟件包中的RNAfold程序，預測由此得到的各區段的折回結構H0facker等(1994)Monatsh.f.Chemie,125:167_188。為了便于結構預測，各小RNA的假豐度(pseudo-abundance)定為2。根據從以下文獻所述修飾而來的已證實的miRNA前體的特性，來過濾結構Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant.Biol.,5719-53。對于水稻miRNA，過濾要求包括⑴小RNA必須全部位于預測折回(莖環)結構的一個臂內；⑵小RNA與其相反臂中的對應物區段的核苷酸序列必須彼此具有至少75%互補性；和(3)小RNA及其對應物，當形成不完美雙鏈體時，必須不含多于3個核苷酸的對稱凸起(bulge)或多于2個核苷酸的不對稱凸起。滿足以上標準的預測結構還可進一步過濾，即通過選擇(1)僅長度為20或21個核苷酸并且5’端堿基為尿嘧啶的小RNA；或(2)測序至少10次的小RNA。最終過濾步驟包括(1)選擇與基因組具有少于23個完美匹配的小RNA，以除去重復元件，和(2)用于預測的區段不含來自負鏈的小RNA。在當鑒定出多個重疊小RNA的情況下，選擇其中最豐富的成員作為代表性的序列。就玉米miRNA預測而言，預測/過濾步驟是從用于水稻miRNA的步驟修改而來，因為尚不可使用完整玉米基因組。獨立分析來自玉米葉和玉米籽粒文庫的小RNA，以便使用小RNA豐度來進行miRNA預測。將小RNA作圖到MaizeAssembledGeneIslands(MAGI第4版)，這是公眾可得的裝配玉米基因組序列數據庫，描述于Fu等(2005)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:12282-12287。具有來自正負鏈的小RNA的序列排除在外。采用與水稻所用的相同需要，預測和過濾微RNA折回結構，并且進一步手工檢查，以消除具有大(>100個核苷酸)或高不配對環區的結構。通過過濾而排除的先前表征的miRNA用于表明假陰性。分析來自水稻的大小范圍在19-25個核苷酸的總共260676個獨特小RNA中推定的新miRNA。過濾并手工檢查后，對應于1072基因座的840個小RNA被鑒定為新的水稻miRNA。iiilt后，了miRNA^igj#"miRBase"(bJHgmicrorna.sanger.ac.uk/sequences/)中存在的27個已知miRNA家族和原始獨特序列組22個家族。根據已表征miRNA(miRBase)估計的18.5%的假陰性率表明，通過該方法捕獲大部分miRNA。從來自玉米籽粒的總共126691個小RNA中，鑒定出對應于MAGI第4.0版玉米基因組序列中的281基因座的116個新的玉米miRNA；同樣，從來自玉米葉的總共53103個小RNA中，鑒定出對應于302基因座的79個新的玉米miRNA。水稻miRNA和玉米miRNA以及它們相應的miRNA前體序列、以及各miRNA前體序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列標識號歸于下表1:玉米籽粒miRNA(SEQIDNO.1-116)、玉米葉miRNA(SEQIDNO.117-195)、水稻miRNA(SEQIDN0.196-1035)、玉米籽粒miRNA前體序列(SEQIDNO.1036-1316)、玉米葉miRNA前體序列(SEQIDNO.1317-1618)和水稻miRNA前體序列(SEQIDNO.1619-2690)。總共174個預測的新的玉米miRNA(代表528基因組座位)包括與先前在并非玉米的物種中鑒定的已知miRNA相同的9個miRNA直向同源物；這些都列于下表2。表1玉米和水稻miRNA和miRNA前體<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表1(續)<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>1(續)<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>表2玉米miRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>氺“ptc，，，毛果楊(Populustrichocarpa)；"osa",/JCfS(Oryzasativa)；“ath，，，擬南芥(Arabidopsisthaliana)；"sbi，，，高梁(Sorghumbicolor)實施例2根據以下文獻所述的序列互補法則，使用基因組研究學會(InstituteforGenomeResearch)的水稻基因組注釋第4.0版(公眾可得自www.tigr.org)，對預測是新的水稻miRNA的靶標的水稻基因進行了預測Zhang(2005)NucleicAcidsRes.，33:W701-704和Rhoades等(2002)Cell，110:513_520。這些預測靴標是包含至少一個miRNA識別位點的序列，該識別位點被選自以下的成熟miRNA識別SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921,SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560,SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。表3列出被水稻成熟miRNA(SEQIDNO.197)識別的miRNA識別位點(SEQIDNO.2691-2729)的非限制性實例。表<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>實施例3本實施例描述重組DNA構建體的非限制性實施方案，其中用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件包含用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內源miRNA的表達的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。更具體地講，本實施例說明用于抑制靶基因(例如內源miRNA或內源miRNA誘騙序列)表達的DNA元件的非限制性實例。圖2A示意性描繪了用于抑制靶基因(例如內源miRNA)表達的DNA元件的非限制性實例。這些DNA元件包含用于抑制至少一個第一靶基因的至少一個第一基因抑制元件(“GSE”或“GSE1”)，其中第一基因抑制元件嵌入內含子中，其一側或兩側鄰接非蛋白質編碼DNA。這些DNA元件利用內含子(在許多實施方案中，優選得自5’非翻譯區的內含子或表達增強內含子)來遞送基因抑制元件，而無需任何蛋白質編碼外顯子(編碼序列)的存在。DNA元件可任選包含用于抑制至少一個第二靶基因的至少一個第二基因抑制元件(“GSE2”)，用于表達至少一個目標基因(其可以是編碼序列或非編碼序列或這兩者)的至少一個基因表達元件(“GEE”)或這兩者。在含有任選基因表達元件的實施方案中，基因表達元件可位于內含子之外(例如與內含子相鄰)。在某些實施方案中，含有第一基因抑制元件的內含子是終止子的3’。為了根據現有技術而更明確地區分本發明的DNA元件(含有至少一個基因抑制元件，其嵌入在一側或兩側側接非蛋白質編碼DNA的一個內含子中)，圖2B示意性描繪了重組DNA構建體的現有技術的實例。這些構建體可含有位于鄰近側接蛋白質編碼序列的內含子、或在兩個不連續的內含子之間的基因抑制元件(其中基因抑制元件并不包含在這兩個不連續內含子的任一個之內)，或可包含含有嵌入在內含子中的基因抑制元件的基因表達元件，該內含子側接多個外顯子(例如包含蛋白質編碼序列的外顯子)。圖3描繪了用于抑制靶基因(例如內源miRNA)表達的DNA元件的各種非限制性實例，其可用于本發明的重組DNA構建體。當劃出一條單鏈時(圖3A至圖3E)，這些都按常規以5’至3’(左到右)轉錄方向來描繪；箭頭表明反義序列(箭頭指向左)、或有義序列(箭頭指向右)。這些DNA元件可包含包含至少一個反義DNA區段的DNA，該反義DNA區段對至少一個第一靶基因的至少一個區段而言是反義的，或包含多拷貝的至少一個反義DNA區段的DNA，該反義DNA區段對至少一個第一靶基因的至少一個區段而言是反義的(圖3A)；包含至少一個有義DNA區段的DNA，該區段是至少一個第一靶基因的至少一個區段，或包含多拷貝的至少一個有義DNA區段的DNA，該有義DNA區段是至少一個第一靶基因的至少一個區段(圖3B)；可轉錄為RNA并通過形成雙鏈RNA而抑制至少一個第一靶基因的DNA，并且該DNA包含至少一個反義DNA區段和至少一個有義DNA區段，該反義DNA區段對至少一個靶基因的至少一個區段而言是反義的，而該有義DNA區段是至少一個第一靶基因的至少一個區段(圖3C)；可轉錄為RNA并通過形成一個雙鏈RNA而抑制至少一個第一靶基因的DNA,并且該DNA包含多個連續反義DNA區段和多個連續有義DNA區段，這些反義DNA區段對至少一個第一靶基因的至少一個區段而言是反義的，而這些有義DNA區段是至少一個第一靶基因的至少一個區段(圖3D)；可轉錄為RNA并通過形成多個雙鏈RNA而抑制至少一個第一靶基因的DNA，并且該DNA包含多個反義DNA區段和多個有義DNA區段，這些反義DNA區段對至少一個第一靶基因的至少一個區段而言是反義的，而這些有義DNA區段是至少一個第一靶基因的至少一個區段，并且其中所述多個反義DNA區段和多個有義DNA區段以一系列反向重復序列方式排列(圖3E)；和包含從miRNA獲得的核苷酸的DNA、或包含siRNA的核苷酸的DNA(圖3F)。圖3F描繪了可由DNA元件的實施方案轉錄而來的、用于抑制靶基因表達(例如內源miRNA)的雙鏈RNA的各種非限制性排列，用于本發明的重組DNA構建體。當形成這樣的雙鏈RNA時，它可抑制一個或多個靶基因，并且可形成一個雙鏈RNA或多個雙鏈RNA、或一個雙鏈RNA“莖”或多個“莖”。當形成多個雙鏈RNA“莖”時，它們可以“錘頭”或“三葉草”形式排列。在某些實施方案中，雙鏈莖可形成“假結(pseudoknot)”排列(例如當一個雙鏈莖的間隔區或環RNA形成第二雙鏈莖部分時)；參見例如以下文獻中對假結構造的描述Staple和Butcher(2005)PLoSBiol.,3(6):e213。間隔DNA(位于dsRNA區之間或鄰近dsRNA區)是任選的，但通常包含和一般包含不符合靶基因的DNA(盡管在某些實施方案中可包含靶基因的有義或反義DNA)。間隔DNA可包含以下序列其可轉錄為單鏈RNA或至少部分雙鏈RNA(例如以“相吻莖環”排列)、或可轉錄為假定二級結構或三維構型(例如靶基因或適配子的反義序列的大環)的RNA，該RNA賦予轉錄物額外的所需特性，例如穩定性提高、體內半衰期延長或者細胞特異性或組織特異性提高。用于抑制靶基因表達的DNA元件和方法的其它描述可參見例如美國專利申請公布說明書2006/0200878，其通過引用結合到本文中。實施例4本實施例描述使用微RNA、微RNA前體、微RNA識別位點和微RNA啟動子來調節至少一個靶基因表達的方法的非限制性實施方案。miRNA或其識別位點的不同潛在用途由miRNA的表達圖式來表示。有關給定成熟miRNA的表達的空間或時間分布或誘導性的知識可用于例如設計以空間或時間或誘導型特異性方式來表達的重組構建體。確定成熟miRNA的表達圖式的一個非限制性方法是通過分離成熟miRNA(或其前體)并通過用合適探針(即對成熟miRNA或miRNA前體具有特異性的探針)的RNA印跡來分析表達圖式。圖4描繪了從不同玉米組織中分離的成熟miRNA的RNA印跡結果的非限制性實施例。將一個探針與來自兩個家族(miR156和miR157)的成熟miRNA雜交。各個成熟miRNA在特定細胞或組織中以不同水平表達，例如Zm-miR390在根和成長葉中不表達或僅以低水平表達，而miR156在根、葉和雄花穗(tassel)中表達。因此，例如，包含由組成型啟動子驅動的轉基因轉錄單元和被玉米miR390成熟miRNA識別的miRNA識別位點的本發明重組DNA構建體可用于轉基因在根和成長葉組織中表達，但不在高水平表達成熟miR390的組織中表達。為了進一步說明本發明的構建體和方法在調控轉基因表達中的用途，用報道基因作為轉基因本身，或者作為轉基因的替代物。例如，當需要報道基因(例如綠色熒光蛋白，GFP)在玉米稈和未成熟穗組織中表達時，將miR156靶位點包含在GFP表達盒中并在穩定的轉基因玉米植物中、在CaMV35S啟動子控制之下表達。在強表達miR156的組織(例如根、葉和雄花穗)中，GFP表達被抑制。抑制表型可局限于受抑制組織內非常特殊的細胞類型，而鄰近細胞表現出在鄰近表達成熟miR156的細胞的GFP的表達或表達梯度。確定成熟miRNA的表達圖式的另一個非限制性方法是通過分析包含成熟miRNA序列的核酸序列的轉錄概況，例如通過包括以下步驟的通用方法(a)提供包含莖環區的起始miR序列，例如來自"miRBase，，數據庫(可得自microrna.sanger.ac.uk/sequences)中的公眾可得的miR序列；(b)使用序列分析算法，例如本領域眾所周知的BLAST(參見Altschul等(1990)J.Mol.Biol.，215:403_410)，鑒定同源或相同序列(例如根據用玉米全基因組DNA制備的微陣列探針組上的專有序列)；和(c)分析步驟(b)中鑒定的同源探針組序列的轉錄概況并鑒定在所需組織(即雄性或雌性生殖組織)中具有表達圖式的miRNA。優選加上第4步(d)對于發現具有所需轉錄概況的同源探針組序列來說，證實對miRNA基因的鑒定，即通過將起始miR序列的莖環序列與探針組序列進行比對，或者對于潛在新的miRNA，確定序列預測能折疊成miRNA的莖環結構特征。還優選使用任選步驟，其中包括針對額外序列數據組(dataset)(而不是探針組序列數據組)的一個或多個BLAST比較(在以上步驟(b)之前)，允許對落入miR基因預測折回區之外的探針進行進一步鑒定；假陽性(例如因為在包含不正確剪接片段重疊群(contigs)的額外序列數據組的匹配所致的假陽)，因其缺乏miRNA特征(例如合適折回結構)而得以鑒定并除去。圖5描繪了探針組序列的轉錄概況，這些序列用前述段落所述方法鑒定為包含對玉米雄性生殖組織(花粉)具有特異性的表達圖式的miRNA前體序列。這些miRNA前體適用于本發明重組DNA構建體，其設計用于在非天然條件下(例如在對miRNA前體而言并非天然啟動子的啟動子的控制之下)表達天然miRNA(在該實施例中，為花粉特異性miRNA)。這些miRNA前體也可用于提供可經修飾或工程改造以抑制并非天然或內源靶基因的靶基因的“支架(scaffold)”序列。本發明的重組DNA構建體的一個非限制性實例包含用于驅動編碼蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)殺蟲蛋白或蛋白片段(“Bt”)的轉基因轉錄單元表達的強組成型啟動子和花粉特異性miRNA的識別位點，導致Bt在除花粉之外的植物組織中強表達。另外，這些miRNA前體的天然啟動子可用于任何目標基因的花粉特異性表達。在一個替代方法中，使用例如以下文獻所述的序列互補法則，可鑒定現有(天然或內源)miRNA識別位點Zhang(2005)NucleicAcidsRes.,33:W701_704和Rhoades等(2002)Cell，110:513_520。使天然miRNA識別位點充分突變(例如通過化學誘變)，以減少或防止切割(參見Mallory等(2004)Curr.Biol.，141035-1046)。因此，可使含有天然miRNA識別位點并具有所需效應(例如葉片或種子大小增加)的基因發生突變，因而其表達水平比當存在未突變天然或內源miRNA識別位點時更高。一個實施方案是用工程同源物替代天然基因，其中天然miRNA已發生突變或者甚至缺失，這樣對給定miRNA切割的敏感性更低。該方法的另一具體實例是在玉米根中基本不表達、但在大多數其它組織表達的成熟miRNA(例如但不限于miRNA162、miRNA164或miRNA390，如圖4所示)的一個或多個識別位點包含在重組DNA構建體中，用于以轉基因的形式表達蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白或蛋白片段(“Bt”，參見例如以下文獻中公開的蘇云金芽孢桿菌殺蟲序列和方法及其應用美國專利號6，953，835和美國臨時專利申請號60/713，111，2005年8月31日申請，通過引用結合到本文中)，例如在包含表達盒e35S/Bt/hspl7的構建體中。表達盒中包含這些識別位點中的一個或多個，能降低轉錄物在并非根的大多數組織中的表達，但在根中維持高水平的Bt靶RNA表達，例如最好用于害蟲例如玉米根蟲的防治。在類似實施方案中，構建體中包含不同miRNA識別位點的組合，以便在一種或多種特定組織中得到所需表達圖式。_例5本實施例描述作物微RNA及其前體(折回)結構的額外非限制性實施方案，用于制備本發明的重組DNA構建體。通過30個玉米文庫的高通量測序(Margulies等(2005)Nature,437:376_380)，總共得到1327933個獨特小RNA(長度為20-24個核苷酸)。所得序列用于根據玉米基因組序列來預測玉米微RNA及其前體結構，使用以上實施例1所述的方法。在1576個專有玉米基因組序列中預測共有1192小RNA是新miRNA。玉米miRNA及其相應的miRNA前體、以及各miRNA前體序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列標識號歸于下表4玉米miRNA(SEQIDNO.2730-3921)和玉米miRNA前體序列(SEQIDNO.3922-5497)。表4玉米和水稻miRNA和miRNA前體<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>4(續)<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>實施例5本實施例描述作物微RNA及其前體(折回)結構的額外非限制性實施方案，用于制備本發明的重組DNA構建體。自在水脅迫和對照條件下生長的玉米(Zeamays)或大豆(Glycinemax)制備小RNA文庫(表5)。用從1.0(無影響或對照)至4.0的相對評分系統評價干旱期的大豆；大豆植物各期的實例見圖6。由此得到的小RNA序列用于分別根據玉米或大豆基因組序列預測額外的新的微RNA及其前體(折回)結構，使用以上實施例1所述的方法。從玉米中，在1725個玉米基因組序列中預測1186個玉米miRNA，而從大豆中，在181個大豆基因組序列中預測134個大豆miRNA(表6)。這些miRNA及其相應的miRNA前體序列、以及各miRNA前體序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列標識號歸于下表6玉米miRNA(SEQIDNO.5498-6683)、玉米miRNA前體序列(SEQIDN0.6684-8408)、大豆miRNA(SEQIDN0.8409-8560)和大豆miRNA前體序列(SEQIDN0.8561-8417)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>*對于自大豆制備的文庫39和41，將所示各期的樣品合并在一起；大豆干旱期用以下相對評分系統進行評價1.O=無影響1.5=分生組織或1片三小葉枯萎2.O=2片三小葉枯萎2.5=所有三小葉都枯萎3.O=底部三小葉完全干枯易碎3.5=除頂部一片之外，所有三小葉都完全干枯易碎，頂部三小葉仍然柔軟4.0=所有都完全干枯易碎表6:玉米和大豆miRNA和miRNA前體<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>6(續)<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>表<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>6(續)<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>表<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>也發現類似用途，這類miRNA例如在營養充足和營養不足條件、或者在熱脅迫和熱非脅迫條件下具有差異表達圖式的miRNA。合適方法包括將外源miRNA識別位點引入序列，缺失或修飾序列中的內源miRNA識別位點，工程改造天然miRNA或miRNA前體序列，以便識別并非內源靶序列的序列，以及利用miRNA啟動子來提供特定表達圖式。實施例6本實施例描述具有特定表達圖式的作物miRNA(miRMONIS)的鑒定，所述表達圖式的特征為在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強表達、而在缺磷條件下抑制。按照實施例1和實施例5所述技術，從水稻(Oryzasativacv.Nipponbare)、玉米(Zeamaysvar.LH244)和大豆(Glycinemaxvar.A3525)的不同組織和發育期克隆小RNA并鑒定推定的miRNA。將各文庫的小RNA豐度標準化，并按照轉錄物/四分之一百萬序歹ll(transcriptsperquartermillionsequence,tpq)來計算。在水禾(SEQIDNO.393)、玉米(SEQIDNO.3227)和大豆(SEQIDNO.8742)小RNA文庫中鑒定出具有序列UUAGAUGACCAUCAGCAAACA的推定的成熟miRNA(小RNA編號為370903，已確定俗名為"miRM0N18”)。該序列與miRBase中的已知miRNA不匹配。從水稻基因組中鑒定出miRM0m8前體序列為CCAUGAACCU⑶UUUGUUGCUG⑶CAUCUAGCUACCCGUGCAUGCCUGGAGAUUGGAGAAUAAUUGACGAUGCAGCAGUCGGCUUAUUGGCUCUUGGGCACGC⑶GGUUAGAUGACCAUCAGCAAACAA⑶UC⑶GAG,(SEQIDNO.1763，圖7B)。從可用的玉米基因組數據中鑒定出另一推定的miRM0m8前體序列為CUCCGAACCU⑶UUUGUUGGUG⑶CAUUUAACCAUGCAUGCUUCGAUCGAUGGAUUGGUGCAUGCAUGGAUUAUUGCAUA⑶⑶GAUGCAUGUGGCGCAUCA⑶GCAUGGUUAGAUGACCAUCAGCAAACAU⑶UCUUGAG(SEQIDN0.3936，圖7A)。成熟miRM0N18的位置在以上這些前體序列(SEQIDN0.1763和SEQIDN0.3936)中用下劃線標明。各miRM0N18前體預測能形成折回結構(圖7A和7B)，成熟miRNA(miRMONIS)位于折回結構3’臂內，而預測miRNA*(“miRM0N18*”)位于5，臂；這與相對于在單個玉米基因座MRT4577_378723C.3中觀察到的miRM0N18*而言、豐富得多的成熟miRM0N18是一致的。在擬南芥中鑒定出具有序列UGCAACCCUUGAAUGUGUUUGUUGAUUGAUAUCUACACAUGUUGAUCAUCCUUGUGUUGAUCGAUUGGUUUAGAUGACCAUCAACAAACUCUUUCGUG⑶UUUGCA(SEQIDN0.8743，圖7C)的折回結構為序列UUAGAUGACCAUCAACAAACU(miR827,SEQIDN0.8744)的相對成熟miRNA的前體。在擬南芥中僅觀察到低豐度的成熟miR827。這兩種成熟miRNA的比對表明，miR827與miRM0N18有2個核苷酸的差異(圖7D)。miRMONIS與miR827間的這2個核苷酸差異看來是在單子葉植物和雙子葉植物中是保守的，其中在玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)和甘蔗(Saccharumofficinarum，數據未顯示)中鑒定出miRM0N18，而在雙子葉植物(擬南芥)中鑒定出miR827。RNA印跡證實miRM0N1821聚體在采自正常(非脅迫)條件下生長的植物的至少水稻(谷粒和秧苗)和玉米(籽粒、葉和根)組織樣品中表達，見圖8A。微RNA前體起源自由RNA聚合酶II產生的聚腺苷酸化轉錄物，玉米miRM0N18前體(SEQIDN0.3936，對應于探針組AlZM068928_at)的標準轉錄概況分析進一步證實在玉米胚乳、愈傷組織和幼苗中表達提高(圖8B)，而在該樣品其它組織中的表達落入500單位的檢測截止閾值以下。對玉米miRM0N18前體(SEQIDN0.3936)在缺水(干旱)(圖9A)、低溫(圖9B)和缺氮條件下(圖9C)生長的植物的玉米組織中的表達進行了分析。miRMONIS前體的表達在根、芽、穗、籽粒和雄花穗中相對不受水條件的影響，而相對于水充足條件而言，在缺水條件下在葉和穗絲(silk)中的表達增加(圖9A)；表達也相對不受溫度的影響(圖9B)。然而，miRMONIS表達對氮條件高度應答，其中相對于在充足氮(20毫摩爾(mM)硝酸銨)時觀察到的表達而言，在氮限制(2毫摩爾(mM)硝酸銨)時觀察到約2倍抑制(圖9C)。通過對小RNA樣品的RNA印跡的磷光體成像定量測定(phosphorimagequantification)，證實了這種氮_應答表達圖式，在3個時間點顯示出對成熟miRMONIS21聚體的平均9.6倍的抑制(圖10A)。因此，miRM0N18在玉米胚乳和玉米籽粒中顯示出總表達增加，而在缺氧誘導的葉中強抑制。在另一實驗中，在水培系統中在充足磷下培養玉米，直到V3期，然后剝奪磷多達3天。在磷剝奪開始后的第1天和第3天采集葉組織樣品。在第3天，讓植物恢復到磷充足條件，恢復后30分鐘和6小時采樣。在各時間點從在磷充足條件下持續培養的植物中采集對照樣品。圖IOB描繪了用miRMONIS探針分析的RNA印跡結果，證明在該實驗中，在葉組織中，玉米miRM0N18成熟miRNA在磷充足條件下表現出強表達，而在缺磷條件下表現出抑制。實施例7本實施例描述具有被作物miRNA(miRM0N18)天然調節的miRNA識別位點(miRMONIS識別位點)的基因的鑒定，其中表達圖式的特征為在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強表達、而在缺磷條件下抑制。鑒定出成熟miRM0N18(UUAGAUGACCAUCAGCAAACA，SEQIDΝ0·393，SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的推定靶標，其包含SPX(“SYGl/Pho81/XPRl”)結構域家族中的基因進化枝。SPX結構域屬于名稱為PfamPF03105的蛋白質家族/結構域，并且發現它是若干蛋白質的N-端的疏水結構域，通常包含約180個殘基的一段，其具有35-47個氨基酸的3個較小亞結構域；參見例如JaneliaFarmsResearchCampusoftheHowardHughesMedicalInstitute的Pfam數據庫的SPX詞條，公眾可得自pfam.janeIia.org/family？acc=PF03105。SPX結構域家族中的大多數蛋白質在其C-端都包含其它保守結構域。例如，SPX結構域家族中的若干蛋白質在其C-端也包含EXS("ERDUXPRl和SYGl”)結構域，PfamPF03124，其可參與蛋白質分選；參見例如pfam.janeIia.org/family？acc=PF03124。其它SPX蛋白包括保守VTC(液泡轉運蛋白(vacuolartransporter)陪伴分子2)結構域，PfamPF09359；參見例如pfam.janelia.org/family？acc=PF09359。若干SPX蛋白包含保守MFS_1或MFS("majorfacilitatorsuperfamily”)結構域，PfamPF07690，其可參與小的糖和無機鹽等小溶質的轉運，以應答化學滲透離子梯度；參見pfam.janelia.org/family？acc=PF07690。SPX結構域可能是轉錄因子，并且可作為二聚化結構域。SPX蛋白包含PHO基因所編碼的那些，其可參與將無機磷加載到根的木質部；參見例如Wang等(2004)PlantPhysiol.，135:400_411，該作者描述了對若干PHOl同源物的鑒定、在這些蛋白質內SPX結構域的保守性、以及PHOl啟動子在根、葉、莖或花等維管組織和某些非維管組織中的優勢表達。SPX結構域家族中的蛋白質可能參與G-蛋白締合的信號轉導(因此可能是無機磷的感受器)；參見Ticconi和Abel(2004)TrendsPlantSci.,9548-555。PHOl基因同時包含SPX結構域和EXS結構域。PHO進化枝成員也包含RING結構域(Atlg02860和At2g38920)或MFS結構域(At4g22990、At4gll810和Atlg63010)；參見Wang等(2004)PlantPhysiol.，135:400_411，尤其是圖3和圖6d。目前，已報道名稱為NLA的基因是在擬南芥中低氮利用率的適應性所需的；參見Peng等(2007)PlantCell，50:320_337。NLA("AtNLA，，，locusAtlg02860)，稱為UniProtKB/Swiss-Prot檢索號Q2V4F9，具有序列MRT3702_101115C，SEQIDNO.8745；有關NLA蛋白的注釋公眾可自beta,uniprot.org/uniprot/Q2V4F9禾口pfam.janeIia.org/protein？id=Q94C80_ARATH。具有序列SEQIDNO.8745的擬南芥NLA基因含有SPX結構域、MFS_1結構域和RING結構域，并包含位于核苷酸位置135至155的miR827識別位點(靶)序列TGTTTGTTGATGGTCATCTAA(SEQIDN0.8746)，其已證實為擬南芥miR827的靶標。NLA編碼C3HC4-型環指(RING-finger)泛蛋白連接酶(AT1G02860.1,SEQIDN0.8747)；該基因若發生突變就會破壞擬南芥對氮限制的適應性。對AtNLA基因的10個額外克隆進行了測序。克隆1、4和5含有部分AtNLA序列(SEQIDN0.8748)。克隆2含有缺乏SPX結構域的AtNLA序列(SEQIDN0.8749)。克隆3含有缺乏RING結構域的AtNLA序列(SEQIDN0.8750)。克隆6含有具有位于核苷酸位置2142-2162的破壞的miR827識別位點(靶序列)的基因組AtNLA片段(SEQIDN0.8751)。克隆7含有另一AtNLA序列(Atlg63010，SEQIDNO.8752)。克隆8含有具有位于核苷酸位置2142-2162的破壞的miR827識別位點(靶序列)的另一基因組AtNLA片段(Atlg63010，SEQIDNO.8753)。克隆9含有缺乏SPX結構域的另一AtNLA序列(Atlg63010，SEQIDNO.8754)。克隆10含有缺乏MFS結構域的AtNLA序列(Atlg63010，SEQIDNO.8755)。大量“實際”cDNA自玉米基因組和cDNA序列裝配，描述了miRM0N18所靶向的獨立基因。這些新的miRM0N18靶標(“SPX_MFS_117961287”，來自BAC的GI117961287)中的第一個具有序列SEQIDN0.8756并包含核苷酸位置326-328的ATG起始密碼子和核苷酸位置2414-2416的TGA終止密碼子；由SEQIDN0.8756編碼的最長可讀框(翻譯框=2)具有氨基酸序列SEQIDN0.8757。這第一個新的miRM0N18靶基因的一個替代剪接形式是SEQIDN0.8758(“SPX_MFS_117961287_2”)，其包含核苷酸位置87-89的ATG起始密碼子和核苷酸位置1137-1139的TGA終止密碼子；由SEQIDN0.8758編碼的最長可讀框(翻譯框=3)具有氨基酸序列SEQIDN0.8759。這些新的miRM0N18靶標中的第二個具有序列SEQIDN0.8760(“SPX_MFS2”，來自BAC的GI=118200525)并包含核苷酸位置201-203的ATG起始密碼子和核苷酸位置2295-2297的TGA終止密碼子；由SEQIDN0.8760編碼的最長可讀框(翻譯框=3)具有氨基酸序列SEQIDN0.8761。這個第二新的miRM0N18靶基因的一個替代剪接形式是SEQIDN0.8762(“SPX_MFS_117961287_2”)，其包含核苷酸位置145-147的ATG起始密碼子和核苷酸位置1189-1191的TGA終止密碼子；由SEQIDN0.8762編碼的最長可讀框(翻譯框=1)具有氨基酸序列SEQIDN0.8763。第三個新的miRM0N18靶標包含來自EST數據的凹凸(stitched)cDNA序列并具有序列SEQIDN0.8764(來自BAC的GI126116193)并在核苷酸位置217-219和1034-1036包含2個可能的ATG起始密碼子以及在核苷酸位置2093-2095包含TGA終止密碼子。通過同源性從兩個可能可讀框預測2種蛋白質；第一種蛋白(預測移碼為1)含有625個氨基酸并具有序列SEQIDN0.8765，而第二種蛋白含有353個氨基酸并具有序列SEQIDN0.8766。用ClustalWa.82版)對這些新的玉米miRM0N18靶基因所編碼的肽進行比對；所得多序列比對見圖11，顯示出玉米SPX結構域(用下劃線序列表示，如果有的話)和玉米MFS結構域(用黑體序列表示)。自BAC115312385的額外克隆工作證實第一miRM0m8的序列(“SPX—MFS—117961287”，SEQIDNO.8756)并產生基因組SPX—MFS2序列SEQIDNO.8767，其中進一步鑒定出前導序列(用斜體表示)、5’內含子(用下劃線表示)、外顯子(用大寫字母表示)和miRM0N18識別位點(位于SEQIDNO.8767核苷酸2628-2648并用黑體表示)導序列(用斜體表示)、5’內含子(用下劃線表示)、外顯子(用大寫字母表示)和miRMONIS識別位點(位于SEQIDNO.8767核苷酸2628-2648并用黑體表示)gttacaaggcaatatttttgtagaataaaatcttaaaggaaactcaactccacgaattggtcacttgcattaaatcatattgtgggtctcttttagttgcatcttaagatggcggcaacaagatttcaagcactttttatctagtgaccgcaatgcactggagataaataagaatccaaatattatttttgataaccttgacactatttaaatcttcttataagtgacgaagtagtttgatcaacaataaaaacgtatagatttcaacattttttgcgattgtaggatatatgttagcaaatattttaagcaaaataatatttttatctataatctctatatggattattctagattttggggaccctatataaaattagctatgagtattaacacttgataatcttgcctagaatgtcttcgatttctgggtctaccactacacctaactgagtttaaccctgcaataaataattaatctcgtgaaatcatttggagattttgactcaatttaaataggtagctactgtgtagttaggttgaaccaggacaccaggtgtaacacgagtcacatatgcatgcatgtgtattgactcaatcggccggcgcacgctatgatggtgctagaaaatgttttatacggctgtgaaaggtgtaacctgtgctgtgtcgcaaacaatatattgtttaactttgtttggccttgaactcctgggggcaaacataagatataaaagatcgatatgcctttcatgattccgtcataatctcgaccgtaattaaggcccgctctatataaacctttaaagcaaattgttagtcatataataatttattagttggattgatgcaacaaataacaactatttatttaagattaactaacttctcagttaaatttagtcactaactattagttttagaggtttggaacatgttataagaacctaaccggtctctcaacgttacaaaagctatcatatttgaacccccgtcatcggagcgcacacgttttattttgttctgttcatgtctatgctgagatactaaaattttgtgcacaagactacaaggacgagagcacctaatgaggtattaatcggttattcaaattccgtaagagttgggggtattggaagagattattagaatttttgacctgttaagatttaaacccacttaatttcttgcaacacatactgcaggtcctcagatagcgaggcgcagtcgcgcagaccgcagagcgccgaatcgtgagaaggatcagaagtgcttgttacttccgtacgggttagagcatctccaacaacgtgacctataaaaatgccctataatttgaaaatgagtatattttatagaatttagggcaccaacaaaacaccccgctccaacagtaaagccccaaatctagattatagggcagcccactacggtgtagtatatttgagtcacttgagagggtgccctatagttttttgacaaaattttatgaaatggagcactgttggagtagtttttcctgtgtagagccctatatttcaatttgaggcactagtttgaggcattgttggagatgctcttacaaatacacggaacatatttgggttcagcaacagggacggacggacggcgcgccgtgttctacagacttgccgtcgctgcttctgcatctgttcgaaaaccgtaacccccgtgcaccgctggtcagtagtcgtcgtttcgtttcgtttcgtttcgtcgcggcgatcttcgaaccgatgaagcgtggcacttggctggttggtggtggtacgccgggccagaaggtgacctgcctcgatccgaataccatgcatcgatctgtgcacgtgcctgttctcttcctactccgattaccgatagtccgggccgggaaaaagagcgcgaagccagatctgaccactaggggtctgtttggttggtttctctcgccaacctggctgtgtgagccaggatcactggagcctggctctgaagatacgaccaatctgctcgtatctggtgagectggcccaaggtgctttaaggatcgtgcgagtctggattcaaatctacatgcagacaaccaaacacagagctcgcacgcgcatagcttggctcatagcaaccaaacagcagctacccgcatcccgcgacgcaagcacgcgcagatgcaggcaaccaaacagaccccaggtgatccaggtcgtcgaatgttccacgcgaaccgcagccgcgagtgccgtctccggctccgccacaggtagagctcagagcagaaaatgctccagccacctgtctctcttcttcctccttcctgccctgcacgcggctataagtacccaccgccatctcactttgcccagcagcacggcagtagctgcgccattgcacgcctccggccggcggctgcttgtcttgctgcttctgccgcacatccgtgatccgtacgtcgtcacctcaccactcacgcacaagcacaaagagcgttaatttcttgctggagattctattctatttctatggcgtgtccctgatcgaatcctaaatcctaaacctctgtggtgcactgcagggcagaaggtgcttcgttcgttgcaggcctggcgccacgccgtaccgtgcaagcgCGTTTGCTGATGTTCATCTAAttactgtataataatatctccgggcgaaagagctagcaatcgtcggcgggggaggaggggctcgattgctgctcaaggtgagttgtaattccttggctctggatttccctatctgttggctgttcatggatcatccaatggatggatggcgctccctgttctctacacctgcgtgctcttcttccctcgcctcgccggggtcttgtgtcagttactgtatctccctgttgattttaaaatctaagaagcaacaacaaaagatgattcaaaaaaatattcaaatttgaaggaccacaatgcgtgtgctactgctagctatgctaccattagagcatgccttcactgcattcttcttcttttgttacgagtgcttaatctcatggctcgctcccttaattcttgctaccattagagcatcttcaatactttctaaaaaaaaccacttgacaaactaatgaaatcagttggtaaactaataagtttcacgagtgactaaaaaaaagataggagctagcttctagtcctagataatgctcttatgagctttccttgtccagttgtcccaactcccaacgaacaaaaaaaaaaaggtaagaaaacacatttggcctttcttcttttttcttttcaactcaaaacgatcgctcagttacaaaaaaaaaagagagcttgcaattgcgagcgagataccaccgttacagggaaaaaaaagacaagttgttcaagttctctactagcttcctagcgcttccgtgtcgttctagatgagcttctctagcaaaggacaataatttggttgccacgtcagatgtcgactcagtgtcatttgctaccagctggcttatcaacttgggagattattgctcgcacctggacccggtgtccagtcaattattaatgatgttgatccatcttcgtatttttatcttggcaagaaactgttagtattaagttactgtcacctttggaagctgaatctcccctcgaagatatcagtatgggcatatagccatccgttcttatacacagctatttacgtctattttacaattttatatcttcgtcttcctcttttacacctacattcgaaccatctatttagagctttcaatgtgcaattcgtctttggtcattgtcaacatgaaccgtccagtgataatgctttgatgctgactaaRaaRtacRRtctccRRttcttaaatatttattRtctaatatttatttttaaaataaaacatRataaataaaaaaRaacRRaRtRaRtaRaatacattRtRaRctRttRttRRtttRttRcacattctttacttRtttttttttacRaacatttRttRcaaRcatcaRcaaaRCCRtataaacttRtRcaRctctaRataRCRatttttttaaacaaaaccttaatattaRattttRRaRcattRatttaRaaaRctRaRcaactccaatRRRaRaRRtRtttattttctcRtccatccacatcCRccRttRRcccRttRtttcttttctacccRcRcctRtRRRRcccaaccRtccRRtcaaccRaccaRcRtttcctRttccaccRtacRtcRtcRttctcgticggtcgttttcgttcccctacctccagtccagtcccaggtccgagccggaccttgatcgccgccgigcctcggcgcaaggaatggggccttcggtcttacccttgcacgcgccgccggcatcaggagacgtctUgtS^gcMcgccgtgccttcagccgtagccggcgccgcatcagcgtgctccagagaggaccgcagcttccagcacgtgtcccigacaccgccccacactggattgggaagggCcRctRaccccacRcacctRcccRctRRccaRtRttRRaaRRtttRRRaaatRaRatRt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actatgagacgctattgccatttatgatcatttatgtttatctttttagccttatgttatttgaatttgtctaatcaatgccatcttccatcacgagcacatcattgacatattactgatggatagacctttttgggacgtgagatgctaaaggcacaacctatatagctgaaaatttctaacatatttatcaataataccaagatgcctttgttgtttatcaattgcacattatttcaacgtaaatgcaattttgttaaatatgtcatggtgtcgagcctactgcttaccccagcatgttgaattgctgccttaagcagaaacatcgaaaaacctgcgtagattccacgatccaacaatcctctccgttcatttttttagttccatatgaaaggaccgattacgtctgaaagaagagtttcattagacaatctatttcttttaactaatgcctctagtttttcaaaacctatgcaataaataggtgtaactatagttttgactaagggttgtaatctctttgtaaaatatttatgcaatctcgatttcaaatctatccactagcctaacaactaataagataaaacatacaaccaagatacataatataaatacgggagcttaaatacgatatacatataaactcttattgatgactccattgtttttatcgagataccaagaaagacgcaagtttctccctagtcctcattggagcccagtccgcgcgagtaccaagctctcggtcaggtaacattgtggatagcctaggttttttgccacacacaagtgggtctttagtgtagcctcttctaaatgctctctatcaaaggtggtccaggaaaagattcaaaatggggccctagcagtagtagtattactactaacaacaataatgataaataagtaaatgctcaatgtgcataaaattgatctaagaagtacttgtaaactcatgtaatgttgtaaacttatttgcttatttctttatgtttcttttctcacatccgaacagattccttctagaggacatgattgtaagttaaaaaataaaatagaacactaattaaatcaaagctatcgctacttgctgagttacaaaattattaaatctatttataaaatactaccaattatgtcgtacttccaaattatcaaacaattgaatagattacaaaataatatttaatcaatagattacaaaatacctactacaaattcacaaaacaatttgtctagtttagtaattattcaaactatagttgtacatagtaattaatttggctttggtttagaccctcggccttggtgaacgacgaacaacgaggtatcctatgtgtagtcatgtatgatgcgtctaggatgtagatgcagtggccagtggcaatcctcagtcttcacgaatcaggatgaacatatggagggtggggcctcgcggaatagggggactagggta(SEQIDNO.8767)0對于SPX基因，搜索TIGR轉錄物數據庫中的SPX:MFS結構域編碼序列。這些基因的鑒定可支持高等植物中存在保守調節途徑。通過搜索起始密碼子上游5’非翻譯區中與miRM0N18互補的保守序列，發現推定的miRM0N18靶位點。在葡萄(Vitisvinifera)中鑒定出推定的mirM0N18靶(TA40434_29760)，其序列為SEQIDNO.8768，其中miRM0N18識別位點位于SEQIDNO.8768的核苷酸323-343。同樣，在萵苣(Lactucasativa)中鑒定出miRM0N18靶標(TA5852_4236)，其序列為SEQIDNO.8769，其中miRM0N18識別位點位于SEQIDNO.8769的核苷酸64-84。在玉米、水稻和大豆等各種不同物種中鑒定出含有直向SPX-結構域的基因，包括NLA樣基因。當序列可用時，在5’UTR中鑒定出推定的miRM0N18或miR827靶序列(識別位點)。圖12描繪了為已鑒定SPX基因而構建的系統樹，通過ClustalW比對氨基酸序列，用10000次迭代測定自引(bootstrap)值；通過實驗證實的含有預測miRM0N18識別位點(在來自并非擬南芥的物種的基因中)或預測miR827識別位點(在來自擬南芥的基因中)的基因用黑體表示。除了含有SPX結構域和RING結構域的擬南芥NLA基因AtNLA(MRT3702_101115C，Atlg02860,SEQIDNO.8770，其包含在核苷酸135-155的miR827識別位點并編碼序列為SEQIDN0.8771的蛋白質)之外，系統樹中的基因還有玉米NLA樣基因ZmNLA(SEQIDN0.8772，編碼序列為SEQIDN0.8773的蛋白質)、大豆NLA樣基因GmNLA(SEQIDN0.8774，編碼序列為SEQIDN0.8775的蛋白質)、水稻NLA樣基因0sNLA(SEQIDNO.8776，編碼序列為SEQIDN0.8777的蛋白質)；擬南芥序列Atlg63010(SEQIDNO.8778，其包含核苷酸153-173的miR827識別位點并編碼序列為SEQIDN0.8779的蛋白質)、AT2g26660(SEQIDNO.8780，編碼序列為SEQIDN0.8781的蛋白質)和AT5g20150(SEQIDNO.8782，編碼序列為SEQIDN0.8783的蛋白質)；水稻序列0s02g45520(SEQIDNO.8784，其包含核苷酸395-415的miRM0N18識別位點，并編碼序列為SEQIDN0.8785的蛋白質)和0s04g48390(SEQIDNO.8786，其包含核苷酸334-354的miRM0N18識別位點，并編碼序列為SEQIDN0.8787的蛋白質)；和玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788，其包含核苷酸1660-1680的miRM0N18識別位點，并編碼序列為SEQIDN0.8789的蛋白質)、MRT4577_51705C(SEQIDNO.8790，編碼序列為SEQIDN0.8791的蛋白質)、MRT4577_375264C(SEQIDNO.8792，編碼序列為SEQIDN0.8793的蛋白質)、MRT4577_46983C(SEQIDNO.8794，編碼序列為SEQIDN0.8795的蛋白質)、MRT4577_340665C(SEQIDNO.8796，編碼序列為SEQIDN0.8797的蛋白質)和MRT4577_319995C(SEQIDNO.8798，編碼序列為SEQIDN0.8799的蛋白質)。幾千堿基對的序列是玉米和水稻NLA樣編碼序列的可用上游，其中從初步測序工作中未鑒定出miRM0N18靶位點。根據表達概況分析數據，看來ZmNLA(SEQIDN0.8772)RNA水平對氮利用率不應答。相比之下，圖12所示的SPX-MFS結構域進化枝(SEQIDN0.8788、SEQIDNO.8786、SEQIDNO.8784和SEQIDNO.8778)在充足氮條件下、在玉米和擬南芥中受到抑制，并且預測會受到miRMONIS的調節；該進化枝中的序列含有經實驗證實的miRM0N18(或miR827)識別位點。樹的頂端所顯示的SPX進化枝(SEQIDN0.8798、SEQIDNO.8796、SEQIDNO.8794、SEQIDNO.8782、SEQIDNO.8780、SEQIDNO.8792和SEQIDNO.8790)(圖12)僅含有可識別的SPX結構域，被有限氮抑制，并且也可預測會受到miRM0N18的調節。在玉米中，對應于進化枝1的基因(SEQIDN0.8798、SEQIDNO.8796、SEQIDNO.8794,SEQIDNO.8792和SEQIDNO.8780)的TxP數據與miRM0N18前體表達相關；miRMONIS前體的表達和進化枝1基因的表達都在氮充足條件下被上調。SPX-MFS進化枝2中的基因(SEQIDN0.8788,SEQIDNO.8786、SEQIDNO.8784和SEQIDNO.8778)受到miRM0N18的直接抑制，而進化枝1基因缺乏直接靶標，表明miRM0N18可通過抑制進化枝2基因而間接調節進化枝1基因表達。實施例8本實施例描述具有特定表達圖式的作物miRNA(miRM0N18)啟動子的鑒定，所述表達圖式的特征為在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強表達、而在缺磷條件下抑制。玉米miRM0N18基因的進一步表征涉及miRM0N18前體(SEQIDNO.3936)與cDNA文庫和微陣列元件的BLAST匹配，和來自玉米(Zeamaysvar.LH244)的miRM0N18基因組序列(SEQIDN0.8800)的反向PCR克隆，使用基于來自克隆LIB5025-018-A1-XP1-B6的cDNA序歹Ij(SEQIDNO.8801)的反向PCR引物。該miRM0N18基因組序列(SEQIDNO.8800)具有圖13所示的注釋序列，其中以大寫字母給出SEQIDNO.8800的核苷酸2173-2788的miRM0N18轉錄物。該基因組序列也包含以小寫字母表示的SEQIDNO.8800的核苷酸211-2172的miRM0N18啟動子元件、以小寫字母表示的SEQIDN0.8800的核苷酸2173-2308的前導元件、以下劃線加上小寫字母表示的SEQIDN0.8800的核苷酸2144-2147的規范TATA盒(末端是轉錄起始位點上游的25個核苷酸)、以下劃線加上大寫字母表示的SEQIDN0.8800的核苷酸2419-2439的成熟miRM0N18、以及以下劃線加上大寫字母表示的SEQIDN0.8800的核苷酸2322-2341的miRM0N18*。為了證實miRM0N18啟動子的表達圖式，在二元載體中構建了2個重組DNA構建體(SEQIDN0.8802和SEQIDN0.8803)，其包含驅動新霉素磷酸轉移酶II(nptll)作為選擇標記的水稻肌動蛋白1啟動子。質粒PM0N111971中的構建體(SEQIDN0.8802)依次包含miRM0N18啟動子(SEQIDN0.8804)和驅動GUS基因(SEQIDN0.8806)表達的miRM0N18前導序列(SEQIDN0.8805)、和NOS終止序列(SEQIDN0.8807)。質粒pM0N111967中的構建體(SEQIDN0.8803)含有DnaK內含子(SEQIDN0.8808)并且還依次包含miRM0N18啟動子(SEQIDN0.8804)、miRM0N18前導序列(SEQIDN0.8805)、GUS基因(SEQIDNO.8806)和NOS終止序列(SEQIDNO.8807)。用標題“制備和使用非天然轉基因植物細胞和非天然轉基因植物”下所述的標準技術，用土壤桿菌介導的轉化和抗生素選擇，將載體轉化到玉米中。在氮充足和磷充足條件下，在轉化玉米葉中觀察到強miRM0N18-啟動子驅動的GUS的表達。在缺氮或缺磷條件下在轉化玉米葉中⑶S表達被抑制。用于驅動轉基因以天然miRMONIS基因的表達圖式而表達的(即在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強表達、而在缺磷條件下抑制)替代miRM0N18啟動子序列包含具有SEQIDN0.8800的核苷酸211-2172的序列的啟動子；與SEQIDN0.8800的核苷酸211-2172具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%同一性的至少約50、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、或至少500個連續核苷酸的片段，其中所述片段在至少一種植物組織中具有啟動子活性，其特征是在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強表達、而在缺磷條件下抑制；和與SEQIDN0.8804具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%同一性的至少約50、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、或至少500個連續核苷酸的片段，其中所述片段在至少一種植物組織中具有啟動子活性，其特征是在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強表達、而在缺磷條件下抑制。通過常規技術證實對替代啟動子序列的鑒定，例如證實TATA盒在啟動子序列內和證實在至少一種植物組織中的啟動子活性(例如通過測定重組DNA構建體包含啟動子驅動的報道基因(例如GUS或螢光素酶)在瞬時表達實驗或在穩定轉化的植物中的表達)。實施例9本實施例描述作物miRNA(miRM0N18)識別位點的鑒定，其中表達圖式的特征為在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強表達、而在缺磷條件下抑制。也公開了miRNA、miRNA啟動子和miRNA識別位點的使用方法。非限制性實例包括在缺氮或缺磷條件下提供產量提高的非天然轉基因作物的方法，即通過在轉基因作物中表達包含miRMONIS-無應答的轉基因的重組DNA構建體，以及在缺氮或缺磷條件下提供產量提高的非天然轉基因作物的方法，即通過在轉基因作物中表達包含miRMONIS識別位點的重組DNA構建體包含miRM0N18識別位點，所述位點已經添加到正常miRM0N18_無應答的基因的序列中。使用以下文獻所述的序列互補法則等本領域已知方法，可完成對識別位點的預測Zhang(2005)NucleicAcidsRes.，33:W701_704和Rhoades等(2002)Cell,110513-520。經實驗證實預測miRNA識別位點的一個非限制性方法是稱為RNA連接酶介導的cDNA5，端快速擴增(“5，RLM-RACE”)的技術，其鑒定miRNA切割模式；參見例如Kasschau等(2003)Dev.Cell,4:205_217和Llave等(2002)Science,297:2053_2056。該方法依賴于RNA銜接分子與切割位點5’端的連接并且依賴于RNA酶III酶(包括Agol)留下的5’磷酸。對所得PCR產物進行了測序，與預測miRNA在相對于miRNA5’端而言的核苷酸10和11之間的切割位點比對的克隆的相對數量提供對miRNA活性的估計值。圖14描繪了對水稻序列0s02g45520(SEQIDNO.8784)和0s04g48390(SEQIDNO.8786)和玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的miRM0N18的預測切割。5，RLM_RACE測定的結果用于證實在水稻序列0s02g45520(SEQIDN0.8784)和0s04g48390(SEQIDNO.8786)中的預測miRMONIS識別位點(靶位點)切割，其中對24個克隆中的3個和16個克隆中的13個分別測序，發現具有預測切割模式(在相對于miRMONIS5’端而言的核苷酸10和11)。5'-RACE實驗也部分證實了玉米SPX_MFS2序列SEQIDN0.8767中的miRM0N18識別位點(數據未顯不)。實驗證實了預測miRNA識別位點的另一非限制性方法是檢查推定靶標的表達水平，例如通過轉錄概況分析實驗。可以預測，當不表達miRNA時，真正的miRNA靶標的表達水平是高的，而當表達miRNA時，miRNA靶標的表達水平則是低的。因此，當不表達miRM0N18時(即在缺氮或缺磷條件下)，miRM0N18靶標預測具有較高表達，而當表達miRM0N18時(即在氮磷充足條件下)，miRMONIS靶標預測表達則較低。圖15B描繪了含有預測miRMONIS識別位點的玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的表達概況。MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)不受水利用率或溫度的影響(在水充足或干旱條件下、或者在低溫或常溫下，觀察到轉錄物水平沒有大的差異；數據未顯示)，但在缺氮條件下比在氮充足條件下表現出更高的表達水平，即表達圖式與miRM0N18的相反，如圖15A所示(另見圖9和圖10)，表明MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的確受到miRM0N18的調節。這些數據證實，miRM0N18調節含有保守SPX結構域的基因。miRM0N18的表達在缺氮或缺磷時被抑制，允許在這樣的條件下表達內源miRMONIS-調節的基因。對成熟miRM0N18miRNA或miRM0N18靶標(至少在miRM0N18識別位點包含的基因)表達的操作可用于改變植物對缺氮或缺磷的應答。本發明一方面包括在缺氮或缺磷條件下提供產量提高的非天然轉基因作物的方法，即通過在轉基因作物中表達miRMONIS-無應答的轉基因。一個實施方案是在非天然轉基因作物中表達包含合成miRMONIS-無應答的轉基因序列的重組DNA構建體，其中合成miRM0N18-無應答的轉基因序列是(a)由天然miRM0N18_應答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRM0N18-應答序列內的所有天然miRM0N18miRNA識別位點(也就是說，消除或改變天然miRMONIS-應答序列的核苷酸)，所述識別位點被具有SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0N18miRNA識別，或被從選自SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRM0N18miRNA識別，和(b)不被成熟miRM0N18miRNA識別。在一個非限制性實例中，在圖12所示的任何含保守SPX-結構域的基因中的miRMONIS識別位點都缺失或修飾，使得修飾SPX基因不被內源成熟miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)識別和結合，而且因此從miRMONIS的調節中解脫出來并因此也從缺氮或缺磷的影響中解脫出來。在一個非限制性具體實例中，玉米基因MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)可從miRM0N18調節中解脫出來并因此通過表達修飾MRT4577_36529C基因而從缺氮或缺磷的影響中解脫出來，其中miRM0N18識別位點在其5，非翻譯區(SEQIDN0.8788的核苷酸1660-1680)已經缺失或修飾，使得修飾MRT4577_36529C基因不被成熟miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)識別和結合。修飾miRM0N18_無應答的MRT4577_36529C用組成型啟動子或組織特異性啟動子在玉米中表達，在氮充足和磷充足條件下提高營養攝取和利用并導致在正常條件下、優選在缺氮或缺磷條件下使產量提高。或者，miRM0N18識別位點經工程改造成為正常miRM0N18_無應答-基因，其在氮充足條件下被抑制，而在缺氮條件時表達；這是一個有用的方法，例如用氮轉運基因，其在氮或磷限制條件下具有增加的表現或產量，而在非限制條件下表達時則沒有益處。實施例10可用于根據對miRMONIS或SPX基因表達的操作而提高氮或磷利用的方法和重組DNA構建體的額外非限制性實例如下所述。(A)在限制條件下調節SPX基因表達以提高氮利用。在該實施方案中，經工程改造而在5’UTR缺乏miRM0N18識別位點(或在擬南芥中為miR827識別位點)的含有SPX-結構域的基因在植物中表達。將SPX基因從內源miRM0N18(或在擬南芥中為miR827)調節中解脫出來，提供在氮或磷充足條件下對營養利用率的適應性，并導致產量提高。SPX-MFS進化枝(SEQIDN0.8788、SEQIDNO.8786、SEQIDNO.8784和SEQIDNO.8778)(圖12)表達提高的一個想要的結果就是，在氮或磷充足條件期間，通過在庫(sink)組織中增加營養利用率，在至少一種植物組織(例如葉、莖稈、根或種子)中提高蛋白質含量。在擬南芥中評價了幾種載體(參見表7)，以模擬SPX基因的功能。在植物中上調AtNLA(Atlg02860，其含有SPX-RING結構域，SEQIDN0.8745)的預測表型對低氮或低磷條件而言是組成型適應性的并提高植物對營養的總體運輸和利用；在SPX-RING進化枝(SEQIDN0.8772、SEQIDNO.8770、SEQIDNO.8774和SEQIDN0.8776)中有關基因的上調預測也具有類似表型(圖12)。載體編號1至5是嵌合轉錄物，其包含非靶向5，非翻譯區和3，非翻譯區和AtNLA編碼區(SEQIDN0.8745)；載體編號6包含基因組AtNLA(SEQIDN0.8745)片段，其包含自內源AtNLA啟動子至終止序列的序列(以防止異位表達)，但其中天然miR827識別位點已缺失或修飾，以防止被成熟miR827識別。上調SPX-MFS進化枝基因(SEQIDN0.8788、SEQIDN0.8786、SEQIDΝ0·8784和SEQIDNO.8778)(圖12)的預測表型是增加營養(尤其是氮和/或磷)運輸，尤其是從來源到庫(sink)組織，導致產量增加。載體編號7、9和10是嵌合轉錄物，其包含非靶向5’非翻譯區和3，非翻譯區和Atlg63010編碼區(SEQIDNO.8778)；載體編號8包含基因組Atlg63010(SEQIDNO.8778)片段，其包含自內源Atlg63010啟動子至終止序列的序列(以防止異位表達)，但其中天然miR827識別位點已缺失或修飾，以防止被成熟miR827識別；載體編號11是嵌合轉錄物，其包含非靶向5’非翻譯區和3’非翻譯區和0s04g48390編碼區(SEQIDNO.8786)；載體編號12包含基因組0s04g48390(SEQIDNO.8786)片段，其包含自內源0s04g48390啟動子至終止序列的序列(以防止異位表達)，但其中天然miRM0N18識別位點已缺失或修飾，以防止被成熟miRMONIS(或在擬南芥中為成熟miR827)識別。通過MRT4577_319995C(SEQIDNO.8798)的表達，用載體13-15(表7)，評價了未分類功能、但預測被低氮利用率阻遏的SPX進化枝基因的上調效應。類似表達實驗在玉米中進行。構建包含具有保守SPX結構域的基因(參見圖12)的載體(表7)并轉化玉米。載體變異體包括含SPX基因的基因組序列的載體和含SPX基因克隆的、受天然啟動子驅動的cDNA的載體。在非限制性實例中，載體16-18使用來自MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的編碼序列，并具有破壞的miRM0N18識別位點，允許在僅可表達天然啟動子的充足氮條件下表達轉基因。也會制備僅表達來自MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的MFS結構域的第三構建體(其代表缺乏SPX的天然替代剪接同種型)并在玉米中測試氮的同化。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>*35S，花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子；FDA，果糖二磷酸醛縮酶啟動子(維管束鞘(bundlesheath)啟動子)；PPDK，丙酮酸正磷酸二激酶啟動子(葉肉細胞啟動子)；RCc3，水稻RCc3基因啟動子(根特異性啟動子)(B)在充足氮條件下使用MIRM0N18啟動子的基因表汰。在該實施方案中，miRMONIS啟動子用于消除在限制氮條件下表達轉基因所得到的不想要的表型(非正常型(off-types))。例如，當氮不限制時，天冬酰胺合成酶的表達產生想要的高蛋白表型。在限制氮條件下，過量表達天冬酰胺合成酶引起產量減少。由MIRMONIS啟動子驅動的天冬酰胺合成酶的表達在充足氮利用率下得到高蛋白表型，但在限制氮條件下，轉基因被關掉以防止產量懲罰(penalty)。構建含以下部分的載體玉米miRM0N18啟動子(SEQIDNO.8804)、玉米miRM0N18前導序列(SEQIDNO.8805)和與天冬酰胺合成酶基因融合的miRM0N18折回結構。天冬酰胺合成酶基因的非限制性實例包括大豆(Glycinemax)天冬酰胺合成酶(SEQIDNO.8809)、Galdieriasulphuraria天冬酰胺合成酶(SEQIDNO.8810)和玉米(Zeamays)天冬酰胺合成酶(SEQIDNO.8811)。用這些載體轉化玉米，然后在限制氮和充足氮條件下，在所得轉基因玉米植物中評價產量和蛋白質品質。(C)在限制氮條件下使用miRM0N18識別位點序列的基因抑制。該實施方案的非限制性實例是包含轉基因轉錄單元和外源miRMONIS識別位點的重組DNA構建體，其中重組DNA構建體在植物中表達，導致轉基因的表達，當不表達成熟miRM0N18miRNA時。高等植物中含有SPX-結構域的基因的5，UTR賦予在充足氮條件下通過內源成熟miRM0N18或miR827的調節而抑制mRNA。在本發明的一個非限制性實施方案中，由miRM0N18或miR827調節SPX基因的5，UTR，例如但不限于AtNLA(SEQIDNO.8770)、Atlg63010(SEQIDNO.8778)、0s02g45520(SEQIDNO.8784)、0s04g48390(SEQIDNO.8786)和MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)，都摻入到轉基因表達盒的前導序列中。這導致在充足氮條件下對轉基因的抑制，無論所用的啟動子序列如何，以消除與未調節的轉基因表達相關的非正常型(off-types)。在一個優選的實施方案中，將miRM0N18或miR827識別位點的切割位點上存在的保守4個核苷酸的序列AUG(G/U)變為GUGG，以防止不想要的起始，同時保留對成熟miRNA的堿基配對。或者，將合成miRM0N18或miR827識別位點摻入到非翻譯區中或編碼區內，而不改變蛋白質功能，從而在充足氮條件下賦予抑制。在另一實例中，將0s04g48390(SEQIDNO.8786)的5，UTR與由組成型啟動子驅動的GUS融合；構建含有內源水稻序列的一種形式(其中存在于miRMONIS切割位點上的AUG已修飾為GUG)和另一形式(其中在miRM0N18切割位點上的AUG已修飾為GUG)。也評價了將串聯(2個或更多)合成miRMONIS識別位點引入到3’UTR的第三構建體。在不同營養(氮或磷)條件下生長的轉化玉米植物和不同組織中評價這些載體的GUS表達。(D)MIRM0N18異位表汰限制SPX基因表汰。在該實施方案中，miRM0m8(或在擬南芥中為miR827)表達是由組成型啟動子或組織特異性啟動子驅動的，導致對所有miRM0N18-調節的(或miR827調節的)基因(例如保守SPX基因)的抑制。一個非限制性實例包含載體PM0N107261(圖16)，其包含CaMV35S啟動子，驅動玉米miRM0N18轉錄物(例如SEQIDNO.8800的核苷酸2173-2788)的表達。評價用該載體轉化的轉基因玉米和擬南芥植物的表型，并選擇在氮或磷限制條件下表現出改良性狀(例如產量增加)的植物。實施例11本實施例描述重組DNA構建體，其可轉錄為包含至少一個miRNA誘騙序列的RNA轉錄物，所述miRNA誘騙序列被內源成熟miRNA識別并結合，但不切割。在本發明的一個優選的實施方案中，內源成熟miRNA是對營養脅迫應答的miRNA-例如成熟miRNA，其表達可受到營養缺乏條件的上調或下調，相對于營養充足條件下的表達而言。更具體地講，本實施例描述對營養脅迫應答的成熟miRNA(miR827,miRM0N18和miR399)的miRNA誘騙序列。實施例6-10描述表現出以下表達圖式的2種miRNA即miR827(SEQIDNO.8744)和miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)，其表達圖式的特征為營養脅迫對miRNA的調節(例如在缺氮、缺磷或氮磷同時缺乏條件下抑制miRNA)。另一miRNA即在擬南芥中鑒定的miR399具有序列UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG(SEQIDNO.8812)；通過小RNA測序，在玉米(SEQIDNO.8813)水稻(SEQIDNO.8814)和大豆(SEQIDNO.8815)中鑒定出相同miRNA。發現玉米miR399基因可應答氮利用率。從專有cDNA數據組中鑒定出玉米miR399前體，其包含具有序列SEQIDNO.8816的Zm_miR399cDNA序列(MRT4577_22484C.8)，其在SEQIDNO.8816的核苷酸71-175含有Zm_miR399前體(SEQIDNO.8817)；并包含具有序列SEQIDNO.8818的另一Zm_miR399cDNA序列(MRT4577_22487C.6)，其在SEQIDNO.8818的核苷酸136-330含有Zm_miR399前體(SEQIDN0.8819)。玉米miR399前體的折回結構見圖17A；圖17B描繪了用對應于MRT4577_22487C.6(SEQIDNO.8818)的探針AlZM033468_at的轉錄概況分析實驗結果，這些結果表明Zm-miR399pri-miRNA(SEQIDNO.8817)在缺氮條件下被抑制(黑色條柱)，而在氮充足條件下表達(白色條柱)。在擬南芥中，已經報道miR399能應答無機磷利用率并抑制基因進化枝，這些基因包含擬南芥PH02基因(At2g33770，編碼E2結合酶(conjugase))和來自各種植物的推定PH02直向同源物。無機磷剝奪可誘導miR399的表達；miR399在磷充分供應條件下過量表達可阻遏PH02的表達并導致葉中的高磷濃度。參見Fujii等(2005)Curr.Biol.，152038-2043；Chiou等(2006)PlantCell,18412~421；Aung等(2006)PlantPhysiol..1411000-1011；和Bari等(2006)PlantPhysiol.，141:988_999。在擬南芥IPS1轉錄物和基因的Mt4_TPSI家族的其它成員中發現的一個保守的23個核苷酸的基序據報道對miR399具有序列互補性，除了對應于成熟miR399的位置10和11的錯配環之外，這可阻止miR399:IPS1雙鏈體的切割；參見Franco-Zorrilla等(2007)NatureGenetics,39:1033_1037。也含有對應于成熟miRNA位置10和11的錯配的一個類似的非切割序列據報道用于miR390；參見Axtell等(2006)Cell,127:565_577。開發了用于預測內源“微RNA誘騙序列”的法則，該序列可被內源成熟miRNA識別并結合，導致miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間的堿基配對，因而形成因miRNA誘騙序列與成熟miRNA間存在錯配而不被切割的抗切割RNA雙鏈體。一般而言，這些法則定義(1)所需錯配，和(2)允許但并非必需的錯配。錯配包括規范錯配(例如G-A、C-U、C-A)以及G::U擺動配對和得失位(indels)(核苷酸插入或缺失)。所需錯配包括(a)miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間在內源成熟miRNA位置9、10或11上的至少1個錯配，或者，(b)在對應于內源成熟miRNA的位置9、10或11的miRNA誘騙序列的位置上的1、2、3、4或5個插入(即額外核苷酸)。在優選的實施方案中，存在(a)miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間在內源成熟miRNA的位置10和/或11上的至少1個錯配，或(b)在對應于內源成熟miRNA的位置10和/或11的miRNA誘騙序列的位置上的至少1個插入。允許但并非必需的錯配包括(a)miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間在內源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個錯配，和(b)miRNA誘騙序列與內源成熟miRNA之間在內源成熟miRNA位置12至最后一位(即21個核苷酸的成熟miRNA的位置21)上的0、1、2或3個錯配，其中在內源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個錯配都鄰近至少一個互補堿基對(即使得在內源成熟miRNA位置12至最后一位上有不超過2個連續錯配)。在優選的實施方案中，在內源成熟miRNA的位置1、2、3、4、5、6、7和8上不存在錯配(即所有都是互補堿基對)。這些法則可用于從專有cDNA數據組中鑒定出大量含有內源miRNA誘騙序列的玉米序列或大豆序列。表8提供針對miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的玉米(Zeamays)內源miRNA誘騙序列；miRNA誘騙序列中的錯配在miRNA與miRNA誘騙序列之間的比對中用下劃線表示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表9提供針對miR399(SEQIDNO.8812、SEQIDNO.8813、SEQIDNO.8814或SEQIDNO.8815)的玉米(Zeamays)內源miRNA誘騙序列；miRNA誘騙序列中的錯配在miRNA與miRNA誘騙序列之間的比對中用下劃線表示。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>在2個cDNA序列(SEQIDNO.8831和SEQIDNO.8833)的負鏈中鑒定出微RNAmiR399誘騙序列。表9提供的cDNA序列的6框翻譯分析沒有顯示任何長可讀框，對這些相同序列進行BLAST搜索，在公共數據庫中也沒有鑒定出任何蛋白質，表明這些基因可能是非編碼序列。miR399誘騙序列的玉米cDNA序列的比對見圖18，其中共有序列為SEQIDNO.8834，并且顯示出至少兩組基因含有miR399誘騙序列第一組含有密切相關基因MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)、MRT4577_521786C.1(SEQIDNO.8831)和MRT4577_135578C.1(SEQIDNO.8833)，而第二組含有MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)。在含有miR399誘騙序列(SEQIDNO.8827、SEQIDNO.8831和SEQIDNO.8833)的第一組玉米基因的miRNA誘騙序列與擬南芥IPS1(AT3G09922.l)miR399“模擬”位點(由Franco-Zorrilla等報道，Franco-Zorrilla等(2007)NatureGenetics，391033-1037)之間僅有1個核苷酸差異；SEQIDNO.8826、SEQIDNO.8830和SEQIDNO.8832的位置12上的保守G在擬南芥miR399“模擬”位點中被C取代。然而，玉米基因(SEQIDNO.8827、SEQIDNO.8831和SEQIDNO.8833)與擬南芥IPS1(AT3G09922.1)基因之間的同源性局限于miRNA誘騙序列位點。表10提供針對miR399(SEQIDNO.8812、SEQIDNO.8813、SEQIDNO.8814或SEQIDNO.8815)的大豆(Glycinemax)內源miRNA誘騙序列；miRNA誘騙序列中的錯配在miRNA與miRNA誘騙序列之間的比對中用下劃線表示。轉錄概況分析數據用于比較內源miRNA誘騙cDNA序列和相應miRNA前體的表達；探針組包括AlGM035741_at(對應于SEQIDNO.8836)、AlGM069937_at(對應于SEQIDNO.8838)、AlGM074873_at(對應于SEQIDNO.8840)、AlGM031412_at(對應于SEQIDNO.8842)和AlGM053788_at(對應于SEQIDNO.8844)。表10SEQIDNO.miR399誘騙序列玉米cDNA名稱和SEQIDN0.(編碼miRNA誘騙序列在cDNA中的核苷酸位置)以3'至5'方向(上方)表示的miR399與以5，至3，方向(下方)表示的miRNA誘騙序列之間的比對8835UAGGGCAACUUCGAUCCUUUGGCAMRT3847—238967C.1(SEQIDN0.8836)(390-413)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUuagggcaacuucgauccuuuggca8837UAGGGCAACUUCUAUCCUUUGGCAMRT3847—241832C.1(SEQIDNO.8838)(393-416)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUuagggcaacuucuaucCuuuggca8839AAGGGCAACUUCAAUCCUUUGGCAMRT3847—336885C.1(SEQIDNO.8840)(96-119)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUaagggcaacuucaauccuuuggca8841AAGGGCAACUUCCAUCCUUUGGCAMRT3847—217257C.2(SEQIDNO.8842)(179-202)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUaagggcaacuuccauccuuuggca8843AAGGGCAACUUCCAUCCUUUGGCAMRT3847—236871C.3(SEQIDNO.8844)(238-261)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUaagggcaacuuccauccuuuggca轉錄概況分析實驗用于比較玉米內源miR399誘騙cDNA序列和相應的玉米miR399前體在不同氮條件下的表達。組lmiR399誘騙基因MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)在缺氮條件下在玉米葉中表現出約2倍下調(圖19A)；組2miR399誘騙基123因MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)在缺氮條件下在玉米葉中表現出至少IO倍以上的更明顯下調(圖19B)。通過RNA印跡對成熟miR399(圖19C)和miR399誘騙序列MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)(圖19D)的表達測定，證實這些結果。用來自低氮(2毫摩爾)或高氮(20毫摩爾)下生長的玉米V6葉的5微克總RNA/泳道，進行RNA印跡，同樣檢測成熟21個核苷酸的miR399(圖19C)和miR399誘騙序列MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)(圖19D，主要條帶在約600bp)的印跡。玉米miR399誘騙序列在氮充足條件下更高表達水平反映出玉米miR399前體在氮充足條件下更高表達水平(圖17B)。類似轉錄概況分析實驗用于比較玉米內源miR399誘騙cDNA序列和相應的玉米miR399前體在不同溫度條件下的表達.組2miR399誘騙基因MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)在氮充足條件下在玉米葉中表現出至少10倍以上的高表達，尤其是在白天時間里(圖20A)。這同樣的基因當長期低溫后在根(圖20B)和芽(圖20C)中表現出至少2倍的下調。也將內源miR399誘騙cDNA序列在玉米和大豆的不同組織中的表達進行比較。圖21A描繪了以下序列的表達水平組1玉米miR399誘騙序列SEQIDNO.8827(MRT4577_47862C,代表為探針AlZM005814_at和AlZM005813_s_at)和組2玉米miR399誘騙序列SEQIDN0.8829(MRT4577_36567C，代表為探針AlZM048024_at)、以及玉米pri-miR399序列SEQIDN0.8818(MRT4577_22487C.6，代表為探針AlZM033468_at)。圖21B描繪了以下序列的表達水平大豆miR399誘騙序列SEQIDN0.8842(MRT3847_217257C.2,代表為探針AlGM031412_at)、SEQIDNO.8844(MRT3847_236871C.2,代表為探針AlGM053788_at)、SEQIDN0.8836(MRT3847_238967C.1，代表為探針AlGM035741_at)和SEQIDNO.8838(MRT3847_241832C.1，代表為探針AlGM069937_at)。這些數據證實在包括玉米和大豆在內的作物中的新的氮-應答表達圖式，用于成熟miR399(和miR399前體)以及內源miR399誘騙序列。miR399的各種用途包括過量表達成熟miR399(例如通過過量表達pri-miR399序列)，表達設計用于抑制并非天然成熟miR399所天然靶向基因的基因的工程miR399，表達處于miR399啟動子控制之下的轉基因(編碼序列或非編碼序列或這兩者)，表達添加或除去miR399識別位點的轉基因，過量表達miR399誘騙序列，以及抑制內源miR399誘騙序列。表11提供針對miR319,UUGGACUGAAAGGAGCUCCU(SEQIDNO.8845)的大豆(Glycinemax)和玉米(Zeamays)內源miRNA誘騙序列，所述miR319已在大量植物物種(包括擬南芥、水稻、玉米和大豆)中鑒定出來(參見公眾可得的miRBase中的實例，microrna.Sanger,ac.uk/cgi-bin/sequences/query,pi？terms=miR319)；miRNA誘騙序歹[J中白勺錯配在miRNA與miRNA誘騙序列的比對中用下劃線表示。圖22A描述了在不同大豆組織中大豆內源miR319誘騙SEQIDN0.8847(MRT3847_41831C.6，代表為探針A1GM001017_at)的轉錄概況分析數據；圖22B描述了不同玉米組織中玉米內源miR319誘騙SEQIDN0.8849(MRT4577_577703C.1，代表為探針AlZM012886_s_at)的轉錄概況分析數據。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>由miR319調節的靶基因是參與葉發育的TCP基因和參與花發育的MYB基因。本發明的一個實施方案是通過抑制內源成熟miR319在轉基因植物中的轉錄來改變植物的葉或花結構或發育模式，或通過miR319誘騙序列在轉基因植物中的過量表達而改變內源miR319活性。在再一個實施例中，miR398b(SEQIDNO.8850)已經顯示出調節CSDl和CSD2(銅/鋅過氧化物歧化酶)的表達；參見Sunkar等(2006)PlantCell，18:2051_2065。過氧化物歧化酶有助于通過將O2轉化為H2O2而凈化活性氧中間體(ROS)并能減少由過氧化物或過氧化物來源的ROS引起的潛在損傷。miR398被氧化脅迫輕微下調并被Cu利用率強下調；參見Yamasaki等(2007)J.Biol.Chem.，28216369-16378。本發明的一個實施方案包括在氧化脅迫-誘導型啟動子的控制下表達包含miR398b誘騙序列(例如SEQIDN0.8851-8852)的嵌合轉錄物，導致在脅迫條件下對miR398b活性的進一步抑制并提高CSDl和CSD2的蓄積和脅迫保護作用。按照以上所公開的內容所述，可制備和使用本文所公開和要求保護的所有材料與方法，而無需過多的實驗。盡管根據優選的實施方案和說明性的實施例已經描述了本發明的材料與方法，但對本領域技術人員顯而易見的是，在不偏離本發明的構思、精神和范圍的條件下，可以對本文所述的材料與方法進行修改。本領域技術人員顯而易見的所有這些類似替換和修改都視為落入所附權利要求書所定義的本發明的精神、范圍和構思之內。權利要求一種重組DNA構建體，所述構建體包含(a)合成miRMON18-無應答的轉基因序列，其中所述合成miRMON18-無應答的轉基因序列是(i)由天然miRMON18-應答序列獲得，即通過缺失或修飾所述天然miRMON18-應答序列內的所有天然miRMON18miRNA識別位點，和(ii)不被具有序列SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742的成熟miRMON18miRNA識別；或(b)合成miRNA-無應答的轉基因序列，其中所述合成miRNA-無應答的轉基因序列是(i)由天然miRNA-應答序列獲得，即通過缺失或修飾所述天然miRNA-應答序列內被至少一個選自以下的特定成熟miRNA識別的所有天然miRNA識別位點SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，和(ii)不被所述至少一個特定成熟miRNA識別；或(c)合成miR399-無應答的轉基因序列，其中所述合成miR399-無應答的轉基因序列是(i)由天然miR399-應答序列獲得，即通過缺失或修飾所述天然miR399-應答序列內的所有天然miR399識別位點，和(ii)不被成熟miR399miRNA識別；或(d)合成miR319-無應答的轉基因序列，其中所述合成miR399-無應答的轉基因序列是(i)由天然miR319-應答序列獲得，即通過缺失或修飾所述天然miR319-應答序列內的所有天然miR319miRNA識別位點，和(ii)不被成熟miR319miRNA識別。2.一種重組DNA構建體，所述構建體包含用于調節至少一個靶基因表達的至少一個可轉錄DNA元件，其中所述至少一個可轉錄DNA元件選自(a)(i)轉錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結構的miRNA前體的DNA元件=SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述miRNA前體包含所述植物miRNA前體序列的至少90%核苷酸的連續區段，而且所述重組DNA構建體任選還包含并非所述miRNA前體序列天然啟動子的啟動子；或(ii)轉錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結構的miRNA前體的DNA元件:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述miRNA前體包含所述植物前體miRNA序列的至少90%核苷酸的連續區段，而且所述至少一個靶基因是植物內源基因，而且所述重組DNA構建體任選還包含并非所述miRNA前體序列天然啟動子的啟動子，而且其中所述重組DNA構建體在所述植物中的表達導致對所述至少一個靶基因的抑制；(b)(i)轉錄為具有miRM0N18前體序列折回結構的miRNA前體并加工為成熟miRM0N18miRNA的DNA元件，而且所述重組DNA構建體任選還包含并非所述miRM0N18前體序列天然啟動子的啟動子；或(ii)轉錄為具有miRMONIS前體序列折回結構的miRNA前體并加工為成熟miRM0N18miRNA的DNA元件，而且所述至少一個靶基因是植物內源基因，而且所述重組DNA構建體任選還包含并非所述miRMONIS前體序列天然啟動子的啟動子，而且其中所述重組DNA構建體在所述植物中的表達導致對所述至少一個靶基因的抑制；(c)⑴轉錄為從選自以下植物miRNA前體序列的植物miRNA前體序列折回結構獲得的工程miRNA前體的DNA元件:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA；或(ii)轉錄為從選自以下植物miRNA前體序列折回結構獲得的工程miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA，其中所述至少一個靶基因是植物內源基因或者所述植物的有害動物或病原體的內源基因，而且其中所述重組DNA構建體在所述植物中的表達導致對所述至少一個靶基因的抑制；(d)(i)轉錄為從miRMONIS前體序列折回結構獲得的工程miRNA前體的DNA元件，其中所述工程miRNA前體包含修飾的成熟miRM0N18miRNA；或(ii)轉錄為從miRM0N18前體序列折回結構獲得的工程miRNA前體的DNA元件，其中所述工程miRNA前體包含修飾的成熟miRMONISmiRNA，其中所述至少一個靶基因是植物內源基因或者所述植物的有害動物或病原體的內源基因，而且其中所述重組DNA構建體在所述植物中的表達導致對所述至少一個靶基因的抑制；(e)(i)位于轉基因轉錄單元內或其附近并轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點被選自以下的成熟miRNA識別SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819;或(ii)位于轉基因轉錄單元內或其附近并轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點被選自以下的成熟miRNA識別SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744,SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識別SEQIDNO.1036-2690,SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，并且所述至少一個靶基因包含由所述轉基因轉錄單元編碼的轉基因，而且其中所述重組DNA構建體在植物中的表達導致所述轉基因在并非天然表達所述成熟miRNA的所述植物的細胞中表達；(f)(i)位于轉基因轉錄單元內或其附近并轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點被成熟miRM0N18miRNA或從miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA識別；或(ii)位于轉基因轉錄單元內或其附近并轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點被成熟miRM0N18miRNA或從miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA識別，并且所述至少一個靶基因包含由所述轉基因轉錄單元編碼的轉基因，而且其中所述重組DNA構建體在植物中的表達導致所述轉基因在并非天然表達所述成熟miRMONISmiRNA的所述植物的細胞中表達；(g)⑴用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內源miRNA表達的DNA元件=SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；或(ii)用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內源miRNA表達的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述至少一個靶基因是植物內源基因，而且所述內源基因的表達在發生所述內源miRNA天然表達的所述植物細胞中受到抑制，而且其中所述重組DNA構建體在所述細胞中的表達導致所述內源基因在所述細胞中表達；和(h)(i)用于抑制從miRM0N18前體序列獲得的內源成熟miRM0N18miRNA表達的DNA元件，所述至少一個靶基因是植物內源基因，而且所述內源基因的表達在發生所述內源成熟miRM0N18miRNA天然表達的所述植物細胞中受到抑制，而且其中所述重組DNA構建體在所述細胞中的表達導致所述內源基因在所述細胞中表達；或(ii)用于抑制從miRMONIS前體序列獲得的內源成熟miRM0N18miRNA表達的DNA元件，其中所述至少一個靶基因是植物內源基因，而且所述內源基因的表達在發生所述內源成熟miRMONISmiRNA天然表達的所述植物細胞中受到抑制，而且其中所述重組DNA構建體在所述細胞中的表達導致所述內源基因在所述細胞中表達。3.一種包含啟動子的重組DNA構建體，所述啟動子選自(a)表現出特征為受到非生物脅迫調節的表達圖式的miRNA啟動子；(b)表現出特征為受到營養脅迫調節的表達圖式的miRNA啟動子，其中所述營養脅迫包括選自缺氮和缺磷的至少一種營養缺乏；(c)在葉組織中表現出在氮充足條件下強表達、而在缺氮條件下抑制的玉米miRNA啟動子；(d)在葉組織中表現出在磷充足條件下強表達、而在缺磷條件下抑制的玉米miRNA啟動子；(e)具有序列SEQIDNO.8804的miRM0N18啟動子；和(f)與SEQIDNO.8804區段具有至少85%同一性的至少約50個連續核苷酸的片段；其中所述啟動子與基因抑制元件和基因表達元件中的至少一個操作性連接。4.權利要求4的重組DNA構建體，其中所述啟動子至少與天冬酰胺合成酶基因的編碼區操作性連接。5.一種重組DNA構建體，所述構建體轉錄為包含至少一個miRNA誘騙序列的RNA轉錄物，所述誘騙序列被內源成熟miRNA識別并結合、但不切割，其中所述內源miRNA是選自以下的至少一種miRNA(a)選自以下成熟miRNA的成熟miRNA:SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850；或(b)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA=SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；和所述miRNA誘騙序列包含約19個至約36個連續RNA核苷酸的RNA序列，其中所述miRNA誘騙序列被所述內源成熟miRNA識別并結合，導致所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間的堿基配對，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一個錯配，或在所述miRNA誘騙序列對應于所述內源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一個插入，(b)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個錯配，和(c)所述miRNA誘騙序列與所述內源成熟miRNA之間在所述內源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3個錯配，其中在所述內源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個所述錯配都鄰近至少一個互補堿基對。6.權利要求5的重組DNA構建體，其中所述至少一個miRNA誘騙序列包含(a)天然存在的miRNA誘騙序列，或(b)合成miRNA誘騙序列，或(c)天然存在的miRNA誘騙序列和合成miRNA誘騙序列兩者。7.權利要求5的重組DNA構建體，其中所述至少一個miRNA誘騙序列被選自以下的至少一種miRNA識別并結合、但不切割(a)具有序列SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742的成熟miRM0N18miRNA或者從選自SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA；(b)具有序列SEQIDNO.8815、SEQIDNO.8816、SEQIDNO.8817或SEQIDNO.8818的成熟miR399或者從選自SEQIDNO.8819、SEQIDNO.8820、SEQIDNO.8821和SEQIDNO.8822的miR399前體序列獲得的成熟miRNA；和(c)具有序列SEQIDNO.8845的成熟miR319。8.一種非天然轉基因植物細胞，所述細胞包含權利要求1-7中任一項的重組DNA構建體。9.一種非天然轉基因植物，所述植物包括由權利要求8的非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物，或由權利要求8的非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物的后代植物，其中相對于缺乏所述重組DNA構建體的植物而言，所述非天然轉基因植物具有選自以下性狀的至少一個改變的性狀(b)提高非生物脅迫耐性；(c)提高生物脅迫耐性；(d)提高針對所述植物的有害動物或病原體的抗性；(e)改變初級代謝產物組成；(f)改變次級代謝產物組成；(g)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(h)提高產量；(i)提高氮或其它營養物的利用能力；(j)改變農藝學特性；(k)改變生長或生殖特性；和(1)提高收獲、貯存或加工品質。10.一種影響基因抑制的方法，所述方法包括(a)提供非天然轉基因植物，所述植物包括由包含權利要求2的重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物，或者由包含權利要求2的重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物的后代植物；和(b)在所述非天然轉基因植物中轉錄所述重組DNA構建體；其中所述轉錄產生能夠在所述非天然轉基因植物中抑制所述至少一個靶基因的RNA，因此相對于在沒有所述重組DNA構建體轉錄時的表達而言，至少一個靶基因被抑制。11.權利要求10的方法，其中所述至少一個靶基因是選自以下的至少一個基因對所述非天然轉基因植物而言是天然的基因，所述非天然轉基因植物中的轉基因，以及對所述非天然轉基因植物的病毒、細菌、真菌或無脊椎動物害蟲或病原體而言是天然的基因。12.權利要求10的方法，其中所述至少一個靶基因是多個靶基因。13.權利要求10的方法，其中所述基因抑制包括空間特異性基因抑制、時間特異性基因抑制、發育特異性基因抑制或誘導型基因抑制。14.一種同時影響至少一個靶基因的基因抑制和至少一個目標基因的基因表達的方法，所述方法包括(a)提供非天然轉基因植物，所述植物包括由包含權利要求2的重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物，或者由包含權利要求2的重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞制備而來的再生植物的后代植物，其中所述重組DNA構建體還包含用于表達所述至少一個目標基因的基因表達元件；和(b)在所述非天然轉基因植物中轉錄所述重組DNA構建體，其中，當所述重組DNA構建體在所述非天然轉基因植物中轉錄時，產生能夠抑制所述至少一個靶基因的轉錄RNA和編碼所述至少一個目標基因的轉錄RNA，因此相對于在沒有所述重組DNA構建體轉錄時的表達而言，所述至少一個靶基因被抑制，而且所述至少一個目標基因同時表達。15.一種非天然轉基因植物，所述植物由包含權利要求2的重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞制備而來，其中用于調節至少一個靶基因表達的所述至少一個可轉錄DNA元件包含轉錄為具有選自以下miRMON18前體序列折回結構的miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800，其中所述miRNA前體包含所述miRM0N18前體序列的至少90%核苷酸的連續區段并加工為具有序列SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDN0.8742的成熟miRM0N18miRNA，而且所述至少一個靶基因是植物內源基因，而且其中所述重組DNA構建體在所述植物中的表達導致所述至少一個靶基因被抑制，其中所述至少一個靶基因包含SPX結構域。16.一種非天然轉基因植物，所述植物由包含權利要求2的重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞制備而來，所述重組DNA構建體還包含轉基因轉錄單元，其中用于調節至少一個靶基因表達的所述至少一個可轉錄DNA元件包含位于所述轉基因轉錄單元內或其附近并轉錄為包含miRNA識別位點的RNA的DNA元件，所述miRNA識別位點被具有序列SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDN0.8742的成熟miRM0N18miRNA識別或者被從選自SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRMONISmiRNA識別，而且所述至少一個靶基因包含由所述轉基因轉錄單元編碼的所述轉基因，而且其中所述重組DNA構建體在植物中的表達導致所述轉基因在并非天然表達所述成熟miRMONISmiRNA的所述植物的細胞中表達，其中所述至少一個靶基因包含SPX結構域。17.一種提供具有至少一個改變的性狀的非天然轉基因作物的方法，所述方法包括在所述非天然轉基因作物中抑制至少一個內源miRNA誘騙序列，因而相對于不表達所述重組DNA構建體的作物而言，導致所述非天然轉基因作物表現出選自以下性狀的至少一個改變的性狀(i)提高非生物脅迫耐性；()提高生物脅迫耐性；(iii)提高針對所述植物的有害動物或病原體的抗性；(iv)改變初級代謝產物組成；(ν)改變次級代謝產物組成；(vi)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(vii)提高產量；(viii)提高氮或其它營養物的利用能力；(ix)改變農藝學特性；(x)改變生長或生殖特性；和(xi)提高收獲、貯存或加工品質。18.—種在缺氮或缺磷條件下提供產量提高的非天然轉基因作物的方法，所述方法包括在所述非天然轉基因作物中表達權利要求7的重組DNA構建體。全文摘要本發明公開了新的微RNA和它們的前體，還公開了包含這些新的miRNA、miRNA前體、miRNA啟動子和對應于miRNA的miRNA識別位點的重組DNA構建體。本發明包括表現出營養-應答表達的新的miRNA和miRNA前體。本發明也公開了miRNA誘騙序列。本發明還提供了在其基因組中含有本發明重組DNA構建體的非天然轉基因植物細胞、植物和種子，以及利用本發明重組DNA構建體來調控基因表達的方法。文檔編號A01H1/00GK101802215SQ200780045788公開日2010年8月11日申請日期2007年10月12日優先權日2006年10月12日發明者B·S·戈德曼,E·K·克里格爾,E·艾倫,J·K·羅伯茨,S·E·黑塞爾,S·I·伊瓦舒塔,張遠記,郭亮,黃士杰申請人:孟山都技術有限公司