專利名稱：：氮限制適應性基因和蛋白質及其調節的制作方法
技術領域：
：本發明涉及通過調節植物細胞中RING型遍在蛋白化連接酶的表達，調節植物農學性狀的方法。本發明尤其涉及改進植物中氮利用的方法。本發明還涉及從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中分離的包含編碼蛋白質的核苷酸序列的核酸分子，所述蛋白質介導氮限制適應性(nitrogenlimitationadaptibility)并最終能夠調節對氮限制的應答，包括氮再循環、花色素苷產生、糖轉移和降低的光合作用。
背景技術：
：對作物植物農學特征的改良從農業開始就一直在進行。大部分適合作物生產的土地目前已被使用。因為人口持續增長，所以會需要改良的作物品種以充分地提供全世界的食物和飼料(Trewavas(2001)PlantPhysiol.125:174-179)。為了避免災難性的饑荒和營養不良，未來的作物栽培種將需要使用等量的農業投入獲得改進的產量。這些栽培種將需要更有效地抵抗不利條件如干旱、土壤鹽堿化或疾病，當貧瘠的土地進行耕種時這會是特別重要的。最后，將期望獲得下述栽培種，其具有改變的營養組成以增強人和動物營養并使得能夠進行有效的食物和伺料加工。對所有這些性狀而言，鑒定控制目的性狀表型表達的基因對于通過常規或轉基因手段加速優良作物種質的開發是決定性的。可獲得大量高效的方法來幫助鑒定在農學重要性狀的表達中起關鍵作用的基因。這些包括遺傳學、基因組學、生物信息學和功能基因組學。遺傳學是遺傳機制的科學研究。通過鑒定改變目的途徑或應答的突變，經典遺傳學(或正向遺傳學)能夠幫助鑒定涉及這些途徑或應答的基因。例如，對疾病具有增加的易感性的突變體可鑒定從病原體識別通向疾病抗性的植物信號轉導途徑的重要組件。遺傳學也是通過育種改良種質的中心組件。通過遺傳雜交的分子和表型分析，控制目的性狀的基因座可以被繪圖并在隨后的世代中被跟蹤。獲知作物增加物(accession)之間表型變異下潛在的基因可使得能夠開發下述標記物，所述標記物大幅提高種質改良方法的效率，并且打開了發現其他優良等位基因的通道。基因組學是對生物基因組的系統水平研究，所述生物基因組包括基因和相應的基因產物——RNA和蛋白質。在初級水平上，基因組方法提供了來自不同植物物種序列信息的巨大數據集，包括模式植物物種擬南芥的全長和部分cDNA序列和全基因組序列。最近，也可以獲得作物植物基因組稻(Oryzasativa)基因組的最初序列草案(drafts叫uence)。全基因組序列的可用性使得可能開發在系統水平上研究其他分子互補物的工具，如陣列和芯片，其用于測定生物在特定條件下表達的基因的互補物。這些數據可被用作某些基因在不同植物表型的表達中起關鍵作用的潛能的最初指示。生物信息學方法與初級水平的基因組數據集直接結合，允許通過注解(annotative)或其他手段處理以揭示目的序列。使用例如相似性搜索、比對和種系發生分析，生物信息學通常可鑒定目的基因產物的同源物(homolog)。非常類似的同源物(例如在蛋白質全長上具有>卯％的氨基酸同一性)非常可能是直向同源物，即在不同的生物中具有同樣的功能。功能基因組學可被定義為對基因及其產物的功能指定。功能基因組學從遺傳學、基因組學和生物信息學中得到鑒定下述基因的途徑，所述基因在具體的目的途徑或應答中是重要的。表達分析例如使用高密度DNA微陣列(長來自基因組規模的生物測序)在單次實驗中監測數千基因的mRNA表達。實驗處理可包括引發目的應答的處理，所述目的應答例如用病原體感染的植物中的疾病抗性應答。為了給出微陣列用途的額外實例，可在一段發育時程內的不同組織中或在受目的應答影響的突變體中監測mRNA表達水平。蛋白組學也可通過在單次實驗中檢驗數百個蛋白質的表達和翻譯后修飾來幫助指定功能。蛋白組學方法在許多情況下與在微陣列實驗中采取的監測mRNA表達的方法類似。蛋白質-蛋白質相互作用也可通過鑒定與途徑或應答的已知組件相互作用的蛋白質，幫助將蛋白質指定至給定的途徑或應答。對于功能基因組學而言，通常使用大^Mt酵母雙雜交實驗研究蛋白質-蛋白質相互作用。指定基因功能的另一方法是在異源宿主例如細菌大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達相應的蛋白質，然后進行純化和酶檢驗。目的基因控制給定性狀的能力的證實可來自例如在目的植物物種中的實驗IHE。轉基因植物目的基因的產生和分析可用于植物功能基因組學，這具有若干優點。基因通常可被超量表達和低表達(underexpressed)("敲除")，從而增加觀察到下述表型的機會，所述表型將該基因與目的途徑或應答聯系在一起。轉基因功能基因組學的兩個方面有助于給予通過該途徑的功能指定以高置信度水平。首先，在生活植物的背景下進行表型觀察。其次，可以檢查觀察到的表型范圍并與觀察到的引入的轉基因表達水平相關聯。轉基因功能基因組學在改良栽培種的開發中特別有價值。只有下述基因作為作物改良成就的候選基因被促進，所述基因在目的途徑或應答中發揮作用并且能夠另外賦予以期望的性狀為基礎的表型。在一些情況下，針對功能基因組學研究開發的轉基因林系可在產品開發的初期直接使用。朝向植物功能基因組學的另一途徑首先鑒定在特定目的基因中具有突變的植物林系，然后在所研究的性狀上對這類基因敲除的結果進行表型評價。這樣的途徑揭示了特定性狀表達必需的基因。通過功能基因組學鑒定的基因可在如上所述通過轉基因手段改良種質的努力中直接使用，或被用于開發在作圖和繁殖種群中鑒定目的等位基因蹤跡的標記物。獲知這類基因也可使得能夠通過大量分子方法中的任意方法來構建自然中不存在的優良等位基因。在過去80年中，行栽作物(rowcrop)中產量的快速增加在大致相等的程度上歸因于改進的遺傳學和改進的農學實踐。具體地，在作物如玉米中，高產雜種和大量氮肥^f吏用的組合在理想的條件下允許大于蒲式耳/英畝(bu/acre)的產量。然而，大量氮肥的使用具有負面的副作用，主要在于增加的該農民投入成本和增加的環境成本，因為硝酸鹽污染是在許多農業地區顯著促成淡水和海洋環境退化的主要問題。通過理解基因型對氮使用的作用來開發更有效利用氮的作物遺傳學在降低生產者投入成本以及環境負荷中會是高度有利的。這對使用高水平氮肥栽培的作物如玉米而言尤其重要。氮使用效率可以以若干種方式定義，盡管最簡單的是產量/應用的N。該方法中存在兩個階段首先，被吸收、儲存和同化為氨基酸和其他重要含氮化合物的可獲得的氮量；其次，被分配至種子而導致最終產量的氮比例。已對多種農業上重要的作物進行了多種產量研究以研究該問題(Lawlorl)W等，2001在LeaPJ，Morot-GaudryJF，編著PlantNitrogen.Berlin:Springer曙Verlag343-367;LafitteHR和EdmeadesGO1994FieldCropsRes39，15-25;LawlorDW2002JExpBot.53，773-87;MollRH等，1982AgronJ74,562-564)。這些實驗已證明存在氮使用效率的遺傳組件，但就確定何種基因對該過程是重要的而言，尚未證明這些實驗是令人滿意的。另外，玉米種植者一般不把在有限的氮肥下維持產量作為目標。這些類型的對氮使用的產量研究就多種使得實驗難以解釋的原因而言是困難的，所述原因包括在測試大田(testfield)中或在任何處理制度下的大田位點(fieldsites)之間缺乏可得氮的均一性，和其他環境因素的互相影響。在植物中，氮涉及兩種作用。首先，氮作為必需的常量營養物影響植物生物量和作物產量(LamHM等，(1996)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.47，569-593)。其次，作為重要的信號，氮調節涉及氮和碳代謝的許多基因的表達(Crawford醒(1995)PlantCell7，859-868;StittM(1999)Curr.Opin.PlantBiol.2，178-186)，并調節植物發育如根分枝和發育、葉生長、莖分枝和開花時間(CrawfordNM&FordeBG(2002)。為了達到最優的生長和發育，植物必須從土壤中獲得足夠的氮營養物，所述足夠的氮量取決于植物物種和發育階段而在植物干重的2%和5%之間變化(Marschner，1995)。然而，因為土壤中的氮含量頻繁地被許多無生物因素和生物因素降低，所以植物頻繁地經受氮限制的生長條件，所述因素如土ii壤4曼蝕、雨水淋洗和微生物消耗(Good等，2004)。因此，氮限制適應性(adaptability)對植物而言是在氮可利用度受限時成功地完成其生命周期以產生后代而不是過早死亡并不育的重要的存活策略。在作物植物中，已發現該氮限制適應性與其產量正相關。Tollenaar和Wu(1999)報道了在過去數十年中提高玉米栽培種對氮限制的耐受顯著地有助于玉米產量的遺傳改良。許多研究已證明在氮限制生長條件下生長時，與較老的雜種相比，較新釋放的玉米雜種能夠更有活力地生長并產生更高的產量，這表明較新的玉米雜種比較老的玉米雜種具有更強的氮限制適應性(Castleberry等，1984;Duvick，1984，1997;McCullough等，1994;Ding等，2005)。這提示增加玉米栽培種對氮限制的適應性能夠提高作物產量并可能允許降低所需的氮肥量。增加作物栽培種的氮限制適應性對目前的農業實踐而言是重要的，所述實踐中大量的氮肥被施用給作物以提高其產量(Frink等，1999)，且其中多于5()%被施用的氮營養物從作物-土壤體系中損失(Peoples等，1995)。因此，大量氮肥的使用必然提高作物生產的成本，并且也導致顯著的氮污染水平(Good等，2004)。開發對氮限制具有增加的適應性的栽培種可4吏得可能降低所述成本同時維持作物產量并減少生產農業對環境的影響(Ding等，2005)。植物適應氮限制生長條件的分子^4']尚未#:詳細描繪，并且尚未系統性地研究特異地涉及植物對氮限制適應的生理學和生物化學因素。然而，已經進行了關于氮脅迫對植物生長和發育的影響的大量研究，從中可推斷出一些期望的植物氮限制適應性應答。這些應答包括生長和光合作用的降^f氐、氮從老的成熟器官到活性生長器官的再轉移，和大量花色素苷的累積(Khamis等，19卯；Geiger等，1999;Ding等，2005;Mei和Thimann，1984;()no等，1996;Bongue-Bartelsman和Phillops，1995;Chalker-Scott，1999;Diaz等，2006)。另外，以下的發現提示植物裝配有支配其對氮限制適應性的分子機制。在擬南芥中，硝酸鹽限制顯著提高了一種高親和力硝酸鹽轉運蛋白NRT2.1的轉錄(Filleur等，2001)。Todd等(2004)發現氮缺乏顯著和特異地上調MYB-樣基因AtNsrl的表達。最近Diaz等(2006)報道在低氮條件下生長的擬南芥植物導致老蓮座葉中葉綠素分解，和全部蓮座中花色素苷的累積。在這些氮限制引起的生長應答的控制中，鑒定了十五種定量性狀基因座(QTL)(Diaz等，2006)。然而，未發現在發生對氮限制的適應性應答中缺陷的突變體。因此，控制該現象的分子機制是完全未知的。花色素苷是多種苯基丙酸類化合物(phenylpropanoid)，生物合成自氨基酸苯丙氨酸的一類來自植物的有機化合物。苯基丙酸類化合物具有廣泛的多種功能，包括防御食草動物、微生物攻擊或其他傷害來源；作為細胞壁的結構組分(即木質素)；作為對紫外光的防護；作為色素(例如花色素苷)；和作為信號傳導分子。花色素苷生物合成始于由酶查耳酮合酶(CHS)從p-香豆酸酰-CoA和丙二酸單酰-CoA縮合產生中間產物查耳酮。p-香豆酸酰-CoA代表了苯基丙酸類化合物代謝中的重要分支點，因為其是花色素苷和木質素二者生產中的中間產物。CHS對p-香豆酸酰-CoA的使用驅動了朝向黃酮類化合物(flavanoid)和花色素苷的苯基丙酸類化合物生物合成，而若干種其他酶對p-香豆酸酰-CoA的使用導致木質素生物合成。花色素苷一般不存在于葉中，直到葉綠素分解為止，此時植物開始合成花色素苷，假定用于氮轉運期間的光保護作用。已知蛋白質遍在蛋白化在調節真核生物中大量的細胞過程中起主要作用。首先，蛋白質遍在蛋白化途徑靶向用于被26S蛋白酶體降解的多種底物，如核轉錄因子、異常細胞質蛋白質和短壽命的調節蛋白質(Glickman和Ciechanover，2002)。其次，用遍在蛋白修飾蛋白質也以蛋白酶體-不依賴性的方式調節蛋白質定位、活性、相互作用配偶體和功能(Schnell和Hicke,2003;Sun和Chen,2004)。RING-型遍在蛋白E3連接酶負責靶向用于遍在蛋白化的特異底物蛋白質。RING結構域是C3HC4型鋅指，其結合兩個鋅原子并涉及介導蛋白質-蛋白質的相互作用。在擬南芥中，一些含RING蛋白質如COP1和S1NATA5的功能表征提示RING結構域的生物學功能是參與遍在蛋白依賴型蛋白質降解(Moon等，2004),并因此在真核生物細胞調節中起主要和13關鍵的作用(Glickman和Ciechanover，2002)。Stone等(2005)報道了擬南芥基因組編碼469個推定的含RING蛋白質，其可分為八類(Stone等，2005)。然而，尚不清楚是否所有的RING-指基因都是E3遍在蛋白連接酶(Moon等，2005)。在植物中，RING-型遍在蛋白連接酶的體內功能仍然極少闡述，其中擬南芥基因組編碼預測的469個RING結構域蛋白質(Stone等，2005)。發明概述在確定控制植物中氮限制適應性的分子機制的努力中，本發明人分離和表征了一種稱作lines(低無機氮誘導的早衰)的擬南芥突變體，其喪失了適應氮限制的能力。當應用了不足量的氮營養物(硝酸鹽或銨)時，該lines突變體植物不能發生關鍵的氮限制適應性應答，并因此比野生型植物衰老得早得多并且更加迅速。可通過對lines植物應用大量氮肥來挽救該低氮誘導的早衰表型。詳細的生理學、生物化學和分子分析證明當對突變體lines植物應用有限的氮營養物(3mM硝酸鹽)時，它們在整組關鍵的氮限制適應性應答的發生中受損，并因此不能適應氮限制生長條件。通過圖位克隆方法進一步鑒定了野生型LINES基因(AtlgOM60)并預測其編碼RING-型遍在蛋白連接酶。這提示功能性LINES蛋白質參與蛋白質遍在蛋白化介導的擬南芥氮限制信號傳導途徑中關鍵負調節物的降解或修飾。由該lines突變體編碼的截短的蛋白質缺乏RING結構域，所述突變體適應氮限制的能力受損。因此，本發明人已提供了對于下述分子機制的首次了解，所述分子機制控制植物對氮限制的適應性。對氮限制的適應性是植物的關鍵性狀，并與作物產量正相關。消耗土壤中氮的大量生物因素和生物因素頻繁地創建氮限制生長條件。為了應付該問題，植物已進化出一套氮限制適應性應答。然而認識僅限于涉及這些適應性應答的生理學和生物化學改變，而操縱植物對氮限制的適應性的分子機制是之前完全未知的。本文公開的RING結構域涉及調節植物對氮限制的適應性應答。因此，本發明涉及調節植物或植物細胞中特征的方法，其包括調節植物或植物細月包中RING-型遍在蛋白E3連接酶的表達。在本發明的一個實施方案中，通過對細胞施用有效量的下述物質調節RING-型遍在蛋白E3連接酶的表達，所述物質能夠調節植物細胞中RING-型遍在蛋白E3連接酶的表達水平。在本發明的又一實施方案中，該物質增加植物細胞中RING-型遍在蛋白E3連接酶的表達水平。植物中待調節的特征可以是任何目的農學性狀。在本發明的一個實施方案中，該特征是受到氮、碳和/或硫代謝、脂質生物合成、營養物感知、營養適應、電子傳遞和/或膜相關能量守恒(membraneassociatedenergyconservation)影響的任何特征。在本發明的又一個實施方案中，該特征選自以下一種或多種氮利用、產量、細胞生長、生殖、光合作用、氮同化作用、疾病抗性、分化、信號轉導、基因調控、非生物脅迫耐受和營養組成。在本發明的又一個實施方案中，被調節的特征是以下一種或多種的提高或改進氮利用、產量、細胞生長、生殖、光合作用、氮同化作用、木質素生物合成、花色素苷生物合成、疾病抗性、分化、信號轉導、基因調控、非生物脅迫耐受和營養組成。植物或植物細胞可來自期望調節其特征的任何植物。在本發明的一個實施方案中，植物細胞為雙子葉植物、棵子植物或單子葉植物。在一個實施方案中，雙子葉植物選自大豆、煙草或棉花。在本發明的又一實施方案中，單子葉植物選自玉米、小麥、大麥、燕麥、棵麥(rye)、粟、高粱(sorghum)、黑小麥(triticale)、黑麥、單粒小麥(einkorn)、斯佩耳特小麥(spdt)、雙粒小麥(emmer)、畫眉草(teff)、蜀黍(milo)、亞麻、格蘭馬草(grammagrass)、磨擦草屬物種(Tripsacumsp.)和類蜀粟(teosinte)。在本發明的一個實施方案中，能夠調節植物細胞中RING-型遍在蛋白E3連接酶基因表達水平的物質包括(a)SEQII)NO:l、3、5、7、9的核苷^列，或其片段或結構域，(b)編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷餅列，其片段或結構域，(c)與(a)或(b)具有基^Nl似性的核苷酸序列；(d)能夠與(a)、(b)或(c)雜交的核苷酸序列；(c)與(a)、(b)、(c)或(d)互補的核苷酸序列；或(f)是(a)、(b)、(c)或(d)的反向互補物的核苷酸序列。在本發明的一個優選實施方案中，被調節的特征是以下一種或多種的提高或改進氮利用、產量、細胞生長、生殖、光合作用、氮同化作用、木質素生物合成、花色素苷生物合成、疾病抗性、分化、信號轉導、基因調控、非生物脅迫耐受和營養組成。在一個具體的實施方案中，本發明涉及改善植物或植物細胞中氮利用的方法，其包括增加植物或植物細胞中RING-型遍在蛋白E3連接酶基因的表達。改善植物中的利用將使得對植物施用減少的氮肥量，伴隨著農民成本和環境成本的降低，因為硝酸鹽污染是在許多農業地區顯著促成淡水和海洋環境退化的主要問題。另外，改善氮利用可允許在下述環境中栽培新的變種和物種，所述環境在其他情況下不適合栽培所述新變種和物種。在本發明的一個實施方案中，增加植物細胞中RING-型遍在蛋白E3連接酶基因表達水平的物質包括編碼RING-型遍在蛋白E3連接酶的核酸分子。在本發明的一個實施方案中，增加植物細胞中RING-型遍在蛋白E3連接酶基因表達水平的物質包括(a)SEQIDNO:l、5、7、9的核苷^列，或其片段或結構域，(b)編碼SEQIDNO:2、6、8、10中任一多肽的核苷齡列，其片段或結構域，(c)與(a)或(b)具有基本相似性的核苷酸序列；(d)能夠與(a)、(b)或(c)雜交的核苷酸序列；(e)與(a)、(b)、(c)或(d)互補的核苷酸序列；或(f)是(a)、(b)、(c)或(d)的反向互補物的核苷酸序列。在一個特定實施方案中，基本的相似性是與SEQIDNO:l所示核苷酸序列或其片段或結構域至少約65%的同一性，特別是約80%的同一性，特16別是卯％，更特別地是至少約95%的序列同一性。在一個實施方案中，與核苷酸序列SEQIDNO:l、其片段或結構域具有基本相似性的序列來自植物。在一個特別的實施方案中，該植物是雙子葉植物。在一個更特別的實施方案中，該雙子葉植物選自大豆、煙草、白楊或棉花。在另一特別的實施方案中，該植物是棵子植物。在另一特別的實施方案中，該植物是單子葉植物。在一個更特別的實施方案中，該單子葉植物是谷物。在一個更特別的實施方案中，該谷物可以是例如玉米、小麥、大麥、燕麥、棵麥、粟、高粱、黑小麥、黑麥、單粒小麥、斯佩耳特小麥、雙粒小麥、畫眉草、蜀黍、亞麻、格蘭馬草、磨擦草屬物種或類蜀粟。在一個特別的實施方案中，分離的核酸包含下述核苷酸序列或由其組成，所述核苷酸序列能夠與類蜀粟SEQIDNO:l所示核苷酸序列或其片段或結構域雜交。在一個特別的實施方案中，雜交允許序列在中嚴檔變或高嚴格度下形成雙鏈體。本發明的實施方案還包含與核苷酸序列SEQIDNO:l或其片段或結構域互補的核苷酸序列。本發明的實施方案還包含與下述核苷酸序列互補的核苷酸序列，所述核苷酸序列與核苷酸序列SEQIDN():l或其片段或結構域具有基本相似性或能夠與之雜交。在一個特別的實施方案中，具有基本相似性的核苷酸序列是核苷^列SEQIDNO:l或其片段或結構域的等位變體。在一個備選的實施方案中，具有基本相似性的序列是天然發生的變體。在另一備選的實施方案中，具有基本相似性的序列是核苷酸序列SEQIDNO:l或其片段或結構域的多態變體。在一個特別的實施方案中，分離的核酸含有大量區域，所述區域具有核苷酸序列SEQIDNO:l或其外顯子或結構域。在一個特別的實施方案中，具有基本相似性的序列含有至少一個核苷酸的缺失或插入。在一個更特別的實施方案中，缺失或插入少于約三十個核苷酸。在最優選的實施方案中，缺失或插入少于約五個核苷酸。在一個特別的實施方案中，具有基本相似性的分離的核酸的序列包含至少一個密碼子的取代或由其組成。在一個特別的實施方案中，該取代是保守的。在本發明的又一個實施方案中，核酸分子包含ATlg02860基因序列SEQIDNO:l或其功能性片段。在本發明的又一個實施方案中，核酸分子包含下述序列，所述序列在中等嚴格條件下與ATlg02860基因SEQIDNO:l或其功能性片段雜交。在本發明的另一實施方案中，核酸分子來自ATlg02860基因SEQIDNO:l的核苷,列并具有下述核苷,列，所述核苷酸序列包含對植物中表達特異的密碼子。在本發明的又一個實施方案中，核酸是ATlg02860基因的lines突變，其包含序列SEQIDNO:3或其編碼多肽SEQIDNO:4的功能性片段。在本發明的另一實施方案中，核酸分子是ATlg02860基因的擬南芥同源物，其包含AT2g38920基因SEQIDNO:5的序列，或其編碼多肽SEQIDNO:6的功能性片段。在本發明的另一實施方案中，核酸分子是ATlg02860基因的稻同源物，其包含核苷*列SEQIDNO:7，或其編碼多肽SEQIDNO:8的功能性片段。在本發明的另一實施方案中，核酸分子是ATlg02860基因的稻同源物，其包含核苷*列SEQII)NO:9，或其編碼多肽SEQIDNO:IO的功能性片段。在另一實施方案中，被調節的特征是以下一種或多種的減少或降低氮利用、產量、細胞生長、生殖、光合作用、氮同化作用、木質素生物合成、花色素苷生物合成、疾病抗性、分化、信號轉導、基因調控、非生物脅迫耐受和營養組成。在這樣的實施方案中，物質會抑制RING-樣遍在蛋白E3連接酶的表達。這類物質描述于第VI部分中，并可選自反義寡核苷酸、適體和雙鏈RNA分子或RNA誘導的沉默復合物。這類物質可干擾SEQIDNO:l、5、7或9的RING-樣遍在蛋白連接酶的表達。在本發明的一個實施方案中，當物質是核酸序列時，該核酸序列在植物的特異位點或組織中表達。該位點或組織為(例如但不限于)表皮、根、維管組織、分生組織、形成層、皮層、髓、葉和/或花。在一個備選的實施方案中，位點或組織為種子。本發明的實施方案還涉及用于調節植物細胞中特征的改組的核酸分子，所述改組的核酸分子含有大量核苷,列片段，其中至少一條片段編碼RING-樣遍在蛋白E3連接酶且其中大量序列片段中至少兩條是從5，到3'的方向，這不是核酸中天然存在的大量片段的方向。在一個特別的實施方案中，含有大量核苷^列片段的改組的核酸分子中所有片段來自單個基因。在一個更特別的實施方案中，大量片段源自至少兩個不同的基因。在一個更特別的實施方案中，改組的核酸與啟動子序列有效連接。另一更特別的實施方案是使用嵌合的多核苷酸用于調節植物細胞中的特征，所述嵌合的多核苷酸包含與改組的核酸有效連接的啟動子序列。在一個更特別的實施方案中，改組的核酸包含在宿主細胞內。在本發明的又一個實施方案中，能夠調節植物細胞中RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因表達水平的物質包括(a)SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一所示的多肽序列，或其片段、結構域、重復或嵌合體；(b)與(a)具有基本相似性的多肽序列；(c)由下述核苷酸序列編碼的多肽序列，所述核苷酸序列與SEQIDN():l、3、5、7、9所示核苷酸序列或其片段或結構域或與之互補的序列相同或具有基本的相似性；或(d)由下述核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在中等嚴格條件下能夠與SEQIDNO:l、3、5、7、9所示核苷酸序列或與之互補的序列雜交。在一個更特別的實施方案中，多肽含有SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一個的多肽序列或其片段。在一個更特別的實施方案中，多肽是植物多肽。在一個更特別的實施方案中，植物是雙子葉植物。在一個更特別的實施方案中，植物是棵子植物。在一個更特別的實施方案中，植物是單子葉植物。在一個更特別的實施方案中，單子葉植物是谷物。在一個更特別的實施方案中，谷物可以是例如玉米、小麥、大麥、燕麥、棵麥、粟、高粱、黑小麥、黑麥、單粒小麥、斯佩耳特小麥、雙粒小麥、畫眉草、蜀黍、亞麻、格蘭馬草、磨擦草屬物種和類蜀粟。在一個實施方案中，多肽在植物各處表達。在一個更特別的實施方案中，多肽在植物的特異位點或組織中表達。在一個更特別的實施方案中，該位點或組織為例如表皮、根、維管組織、分生組織、形成層、皮層、髓、葉和花。在一個最特別的實施方案中，該位點或組織為種子。在一個特別的實施方案中，多肽適用于產生針對下述多肽具有免疫反應性的抗體，所述多肽由核普酸序列SEQIDNO:2或其片段或結構域編碼。在一個特別的實施方案中，與SEQIDNO:2所示多肽序列或其外顯子或結構域具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽序列的等位變體。在另一特別的實施方案中，與SEQIDNO:2所示多肽序列或其外顯子或結構域具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽序列的天然發生的變體。在另一特別的實施方案中，與SEQIDNO:2所示多肽序列或其外顯子或結構域具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽的多態變體。在另一特別的實施方案中，多肽是多肽序列SEQIDNO:2。在另一特別的實施方案中，多肽是功能性片段或結構域。在另一特別的實施方案中，多肽是嵌合體，其中該嵌合體可含有功能蛋白結構域，所述功能蛋白結構域包括結構域、重復、翻譯后修飾位點或其他特性。在一個更特別的實施方案中，多肽是植物多肽。在一個更特別的實施方案中，植物是雙子葉植物。在一個更特別的實施方案中，植物是棵子植物。在一個更特別的實施方案中，植物是單子葉植物。在一個更特別的實施方案中，單子葉植物是谷物。在一個更特別的實施方案中，谷物可以是例如玉米、小麥、大麥、燕麥、棵麥、粟、高粱、黑小麥、黑麥、單粒小麥、斯佩耳特小麥、雙粒小麥、畫眉草、蜀黍、亞麻、格蘭馬草、磨擦草屬物種和類蜀粟。在一個特別的實施方案中，多肽在植物的特異位點或組織中表達。在一個更特別的實施方案中，該位點或組織可以是例如表皮、根、維管組織、分生組織、形成層、皮層、髓、葉和花。在另一特別的實施方案中，該位點或組織為種子。在一個特別的實施方案中，由下述核苷酸序列編碼的多肽序列含有至20少一個核苷酸的缺失或插入，所述核苷酸序列與核苷酸序列SEQIDNO:l或其片段或結構域或與之互補的序列具有基本的相似性。在一個更特別的實施方案中，缺失或插入少于約三十個核苷酸。在一個最特別的實施方案中，缺失或插入少于約五個核苷酸。在一個特別的實施方案中，由下述核苷酸序列編碼的多肽序列含有至少一個密碼子的取代，所述核苷酸序列與核苷酸序列SEQIDNO:l或其片段或結構域或與之互補的序列具有基本的相似性。在一個更特別的實施方案中，該取代是保守的。在一個特別的實施方案中，與多肽序列SEQIDNO:2或其片段、結構域、重復或嵌合體具有基本相似性的多肽序列含有至少一個氨基酸的缺失或插入。在一個特別的實施方案中，與多肽序列SEQIDNO:2或其片段、結構域、重復或嵌合體具有基本相似性的多肽序列含有至少一個氨基酸的取代。本發明的實施方案還包括表達盒用于調節植物細胞中特征的用途，所述表達盒包含啟動子序列，所述啟動子序列與編碼RING-樣遍在蛋白E3連接酶的分離的核酸有效連接。在本發明的實施方案中，編碼RING-樣遍在蛋白E3連接酶的分離的核酸由以下組成或包括以下(a)SEQII)NO:l、3、5、7、9的核苷^列，或其片段或結構域，(b)編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷酸序列，其片段或結構域，(c)與(a)或(b)具有基本相似性的核苷酸序列；(d)能夠與(a)、(b)或(c)雜交的核苷酸序列；(e)與(a)、(b)、(c)或(d)互補的核苷酸序列；或(f)是(a)、(b)、(c)或(d)的反向互補物的核苷^列。還包括在本發明中的是包含表達盒的重組載體調節植物細胞中特征的用途，所述表達盒包含啟動子序列，所述啟動子序列與編碼RING-樣遍在蛋白E3連接酶的分離的核酸有效連接。在本發明的實施方案中，重組載體包含下述編碼RING-樣遍在蛋白E3連接酶的分離的核酸，所述核酸由以下組成或包括以下(a)SEQIDNO:l、3、5、7、9的核苷^f列，或其片段或結構域，(b)編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷酸序列，其片段或結構域，(c)與(a)或(b)具有基^目似性的核苷酸序列；(d)能夠與(a)、(b)或(c)雜交的核苷酸序列；(e)與(a)、(b)、(c)或(d)互補的核苷酸序列；或(f)是(a)、(b)、(c)或(d)的反向互補物的核苷酸序列。本發明還包括包含本發明的表達盒的植物細胞的用途，和含有這些植物細胞的植物的用途。本發明還包括包含本發明的表達盒的植物細胞，和含有這些植物細胞的植物。在一個特別的實施方案中，該植物是雙子葉植物。在一個更特別的實施方案中，該雙子葉^i物選自大豆、煙草、白楊或棉花。在另一特別的實施方案中，該植物是棵子植物。在另一特別的實施方案中，該植物是單子葉植物。在一個更特別的實施方案中，該單子葉植物是谷物。在一個更特別的實施方案中，谷物可以是例如玉米、小麥、大麥、燕麥、棵麥、粟、高粱、黑小麥、黑麥、單粒小麥、斯佩耳特小麥、雙粒小麥、畫眉草、蜀黍、亞麻、格蘭馬草、磨擦草屬物種和類蜀粟。在一個實施方案中，表達盒在植物各處表達。在另一實施方案中，表達盒在植物的特異位點或組織中表達。在一個特別的實施方案中，該位點或組織可以是例如表皮、根、維管組織、分生組織、形成層、皮層、髓、葉和花。在一個備選的特別實施方案中，該位點或組織為種子。本發明的實施方案還提供了來自植物的種子和分離產物用于調節植物細胞中特征的用途，所述種子和分離產物含有包含啟動子序列的表達盒，所述啟動子序列與編碼本發明的RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因的分離的核酸有效連接。在一個特別的實施方案中，表達載體包含一個或多個元件，例如但不限于啟動子增強子序列、選擇標記物序列，或復制起點、表位標簽編碼序列，或親和純化標簽編碼序列。在一個更特別的實施方案中，啟動子增強子序列可以是例如CaMV35S啟動子、CaMV19S啟動子、煙草PR-la啟動子、遍在蛋白和菜豆蛋白啟動子。在另一實施方案中，啟動子可在植物中工作，更特別地為組成型或誘導性啟動子。在另一特別的實施方案中，選擇標記物序列編碼抗生素抗性基因。在另一特別的實施方案中，表位標簽序列編碼V5、肽Phe-His-His-Thr-Thr、血凝素或谷胱甘肽-S-轉移酶。在另一特別的實施方案中，親和純化標簽序列編碼多聚氨基酸序列或多肽。在一個更特別的實施方案中，多聚M酸序列為多聚組氨酸。在一個更特別的實施方案中，多肽是殼多糖結合結構域或谷胱甘肽-S-轉移酶。在一個更特別的實施方案中，親和純化標簽序列包含內含肽編碼序列。在一個特別的實施方案中，表達載體是真核生物表達載體或原核生物表達載體。在一個更特別的實施方案中，真核生物表達載體包含組織特異的啟動子。更特別地，表達載體可在植物中工作。本發明的實施方案還涉及通過下述方法修飾的植物，所述方法包括向植物中引入核酸，其中核酸可以在植物中以有效影響修飾的量表達。該修飾可以是以下一種或多種目的性狀的提高或降低。該修飾可包括基因的超量表達、低表達、反義調節、有義阻抑、誘導性表達、誘導性阻遏、或誘導性調節。在本發明的一個實施方案中，修飾涉及目的性狀例如氮利用或產量的提高或改進。在一個實施方案中，表達盒涉及下述功能，所述功能例如但不限于碳、氮和/或硫代謝、氮利用、氮同化作用、光合作用、木質素生物合成、花色素苷生物合成、信號轉導、細胞生長、生殖、疾病抗性、非生物脅迫耐受、營養組成、基因調控和/或分化。在一個更特別的實施方案中，表達盒涉及下述功能，例如氮利用、非生物脅迫耐受、增加的產量、疾病抗性和/或營養組成。在一個實施方案中，植物含有對植物表型或可測量特征的修飾，所述修飾歸因于表達盒中含有的至少一個基因的表達。在一個特別的實施方案中，該修飾可例如是碳、氮和/或硫代謝、氮利用、氮同化作用、光合作用、木質素生物合成、花色素苷生物合成、信號轉導、細胞生長、生殖、疾病抗性、非生物脅迫耐受、營養組成、基因調控和/或分化。本發明的實施方案還提供了來自植物的種子和分離產物，所述種子和分離產物含有包含啟動子序列的表達盒，所述啟動子序列與含有下述核苦酸序列的分離的核酸有效連接，所述核苷酸序列包括(a)SEQIDNO:l、3、5、7、9的核苷紗列，或其片段或結構域，(b)編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷酸序列，其片段或結構域，(c)與(a)或(b)具有基本相似性的核苷酸序列；(d)能夠與(a)、(b)或(c)雜交的核苷酸序列；(e)與(a)、(b)、(c)或(d)互補的核苷酸序列；或(f)是本發明的(a)、(b)、(c)或(d)的反向互補物的核苷酸序列。在一個特別的實施方案中，分離的產物包括酶、營養蛋白質、結構蛋白質、氨基酸、脂質、脂肪酸、多糖、糖、醇、纖維、黃酮類化合物、生物堿、類胡蘿卜素、propanoid、類固醇、色素、維生素和植物激素。本發明的實施方案還涉及通超量表達含下述核苷酸序列的分離的核酸產生的分離產物，所述核苷*列包括(a)SEQIDNO:l、3、5、7、9的核苷,列，或其片段或結構域，(b)編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一多肽的核苷酸序列，或其片段或結構域，(c)與(a)或(b)具有基本相似性的核苷酸序列；(d)能夠與(a)或(b)雜交的核苷酸序列；(e)與(a)、(b)、(c)或(d)互補的核苷酸序列；或(f)是根據^^開內容的(a)、(b)、(c)或(d)的反向互補物的核苷酸序列。在一個特別的實施方案中，產物在植物中產生。在另一特別的實施方案中，產物在細胞培養物中產生。在另一特別的實施方案中，產物在無細胞體系中產生。在另一特別的實施方案中，產物包括酶、營養蛋白質、結構蛋白質、氨基酸、脂質、脂肪酸、多糖、糖、醇、纖維、黃酮類化合物、生物堿、類胡蘿卜素、propanoid、類固醇、色素、維生素和植物激素。在一個實施方案中，產物是RING-型遍在蛋白E3連接酶。在一個特別的實施方案中，產物是含有SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一氨基酸序列的多肽。本發明的實施方案還涉及分離的多核苷酸,其包含至少10個堿基的核苷餅列，所述核苷^>列與SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一序列的區域相同、互補或基本類似，且其中該多核苷酸適應多種用途中的任意用途。在一個特別的實施方案中，多核苷酸被用作染色體標記物。在另一特別的實施方案中，多核苷酸^f皮用作RFLP分析的標記物。在另一特別的實施方案中，多核苷酸^L用作定量性狀關聯育種的標記物。在另一特別的實施方案中，多核苷酸^^用作標記物-輔助育種的標記物。在另一特別的實施方案中，多核苷酸被用作雙雜交系統中的釣餌序列，以鑒定下述序列，所述序列編碼與釣斜序列編碼的多肽相互作用的多肽。在另一特別的實施方案中，多核苷酸被用作對個體或個體群進行基因分型或鑒定的診斷指示劑。在另一特別的實施方案中，多核苷酸被用作遺傳分析，以鑒定基因或外顯子的邊界。本發明的實施方案還涉及包含下述核酸分子或由其組成的表達載體，所述核酸分子包括(a)編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10所示任一多肽的核酸序列，或(b)SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一的片段、一個或多個結構域、或特;f正區i或；或(c)SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一所示的全核紗列或其片段，和異源序列。在一個特別的實施方案中，表達載體包含一個或多個元件，例如但不限于啟動子增強子序列、選擇標記物序列、復制起點、表位標簽編碼序列，或親和純化標簽編碼序列。在一個更特別的實施方案中，啟動子增強子序列可以是例如CaMV35S啟動子、CaMV19S啟動子、煙草PR-la啟動子、遍在蛋白和菜豆蛋白啟動子。在另一實施方案中，啟動子可在植物中工作,25更特別地為組成型或誘導性啟動子。在另一特別的實施方案中，選擇標記物序列編碼抗生素抗性基因。在另一特別的實施方案中，表位標簽序列編碼V5、肽Phe-His-His-Thr-Thr、血凝素或谷胱甘肽-S-轉移酶。在另一特別的實施方案中，親和純化標簽序列編碼多聚M酸序列或多肽。在一個更特別的實施方案中，多聚氨基酸序列為多聚組氨酸。在一個更特別的實施方案中，多肽是殼多糖結合結構域或谷胱甘肽-S-轉移酶。在一個更特別的實施方案中，親和純化標簽序列包含內含肽編碼序列。在一個特別的實施方案中，表達載體是真核生物表達栽體或原核生物表達栽體。在一個更特別的實施方案中，真核生物表達載體包含組織特異的啟動子。更特別地，表達載體可在植物中工作。本發明的實施方案還涉及包含核酸構建體或由其組成的細胞，所述核酸構建體包含表達栽體和與異源序列組合的下述核酸，所述核酸包括編碼SEQIDNO:2、4、6、8、10中任一所示多肽的核酸，或SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一所示的核酸，或其區段。在一個特別的實施方案中，細胞是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞。在一個特別的實施方案中，細胞是植物細胞。在一個更特別的實施方案中，多肽在植物的特異位點或組織中表達。在一個最特別的實施方案中，該位點或組織可以是例如表皮、根、維管組織、分生組織、形成層、皮層、髓、葉和花。在備選的最特別的實施方案中，該位點或組織是種子。在一個特別的實施方案中，多肽涉及下述功能，例如碳、氮和/或硫代謝、氮利用、氮同化作用、光合作用、木質素生物合成、花色素苷生物合成、信號轉導、細胞生長、生殖、疾病抗性、非生物脅迫耐受、營養組成、基因調控和/或分化。本發明的實施方案涉及下述多肽，所述多肽含有由下述分離的多核苷酸編碼的多肽序列，所述分離的多核苷酸含有至少10個堿基的核苷^列，該序列與SEQIDNO:l、3、5、7、9中任一序列的區域或其功能性片段相同、互補或基本相似，且其中該多核苷酸適用于下述用途，包括(a〕26核苷酸位置的用途；(b)作為RFLP分析標記物的用途；(c)作為定量性狀關聯育種的標記物的用途；(d)作為標記物-輔助育種的標記物的用途；(e)作為釣何序列在雙雜交體系中用于鑒定編碼多肽的序列的用途，所述多肽與釣斜序列編碼的多肽相互作用；(f)作為對個體或個體群進行基因分型或鑒定的診斷指示物的用途；或(g)用于鑒定基因或外顯子邊界的遺傳分析的用途。本發明還涉及包含至少10個堿基核苷酸序列的核酸分子的用途，該序列與區域SEQIDNO:3或其功能性片段相同、互補或基本相似，且其中該用途選自下組(i)作為低氮限制適應性標記物的用途；(ii)作為提高的木質素合成的標記物的用途；或(iii)作為低產量標記物的用途。還包括生產包含修飾的植物的方法，其包括步驟(l)提供核酸，其為含有核苷酸序列的分離的核酸，所述核苷酸序列包括(a)如SEQIDNO:l、3、5、7、9所示的核苷酸序列，或其外顯子或結構域，(b)與(a)具有基本相似性的核苷酸序列；(c)能夠與(a)雜交的核苷酸序列；(d)與(a)、(b)或(c)互補的核苷酸序列；或(c)是(a)、(b)或(c)的反向互補物的核苷酸序列；和(2)將核酸分子引入植物，其中所述核酸分子在所述植物中以有效影響修飾的量表達。在一個實施方案中，修飾包括植物中改變的特征，其中所述特征對應于被引入植物的核酸。在其他特別的實施方案中，該特征對應于碳、氮和/或硫代謝、氮利用、氮同化作用、光合作用、木質素生物合成、花色素苷生物合成、信號轉導、細胞生長、生殖、疾病抗性、非生物脅迫耐受、營養組成、基因調控和/或分化。27在另一實施方案中，修飾包括提高或降低的表達，或植物產物的累積。特別地，該產物是植物的天然產物。同等特別地，該產物是植物的新產物或改變的產物。特別地，該產物包括RING-樣遍在蛋白E3連接酶。本文公開的發明還包括制備重組蛋白質的方法，其包括步驟(a)在合適的培養條件下培養包含核酸構建體的重組細胞，所述構建體包含表達栽體和核酸，所述核酸包括編碼如SEQIDNO:2、4、6、8、l()所示蛋白質的核酸，或SEQIDNO:l、3、5、7、9所示核酸序列或其節段；和(b)從重組細胞中分離其表達的重組蛋白質。本發明的實施方案提供了制備重組蛋白質的方法，其中表達載體包含一個或多個元件，包括啟動子增強子序列、選擇標記物序列、復制起點、表位標簽編碼序列，和親和純化標簽編碼序列。在一個特別的實施方案中，核酸構建體包含表位標簽編碼序列，且分離步驟包括使用對該表位標簽特異的抗體。在另一特別的實施方案中，核酸構建體含有多聚氨基酸編碼序列，且分離步驟包括使用包含多聚氨基酸結合物質的樹脂，特別是其中多聚氨基酸為多聚組氨酸且多聚氨基酸結合樹脂為鎳-帶電瓊脂糖樹脂。在另一特別的實施方案中，核酸構建體含有多肽編碼序列，且分離步驟包括使用含多肽結合物質的樹脂，特別是當多肽為殼多糖結合結構域且樹脂含有殼多糖-瓊脂糖凝膠(sepharose)時。本發明的實施方案還涉及通過下述方法修飾的植物，所述方法包括向植物中引入核酸，其中該核酸可在植物中以有效影響修飾的量表達。該修飾可以是例如碳、氮和/或硫代謝、氮利用、氮同化作用、光合作用、木質素生物合成、花色素苷生物合成、信號轉導、細胞生長、生殖、疾病抗性、非生物脅迫耐受、營養組成、基因調控和/或分化。在一個實施方案中，經修飾的植物具有對除草劑、脅迫或病原體的提高或降低的抗性。在另一實施方案中，經i務飾的植物具有對光、水、氮或孩史量元素的增加或減輕的需求。在另一實施方案中，以植物蛋白質級分的比例計，經修飾的植物富含必需氨基酸。該蛋白質級分可以是例如總種子蛋白、可溶蛋白質、不溶蛋白質、可用水提取的蛋白質和脂質結合蛋白質。在另一實施方案中，經修飾的植物具有提高或降低的花色素苷色素。在另一實施方案中，經修飾的植物具有提高或降低的木質素累積。在另一實施方案中，植物對土壤中限制氮條件具有提高的靈敏度。修飾可包括基因的超量表達、低表達、反義調節、有義阻抑、誘導性表達、誘導性阻遏、或誘導性調節。本發明還涉及來自經修飾的植物的種子，或經修飾的植物的分離產物，其中該產物可以是酶、營養蛋白質、結構蛋白質、氨基酸、脂質、脂肪酸、多糖、糖、醇、纖維、黃酮類化合物、生物堿、類胡蘿卜素、propanoid、類固醇、色素、維生素和植物激素。上述"發明概述"列舉了本發明的若干個實施方案，并且在許多情況下列舉了這些實施方案的變更和置換。該概述僅是大量和變化的實施方案的示例。提到給定實施方案的一個或多個特別特征同樣是示例性的。一般可存在具有或不具有所述一個或多個特征的這樣的實施方案；同樣，這些特征可應用于本發明的其他實施方案，無論所述實施方案在概述中是否列出。為了避免過度重復，該概述不列舉或提出這類特征的所有可能的組合。為了概述本發明和達到的超出現有技術的優點，上文已描述了本發明的某些目標和優點。當然，應當理解對本發明的任何具體的實施方案而言，不必須達到所有這些目標和優點。因此，例如本領域技術人員會知道本發明可以以下述方式進行，所述方式達到或最優化本文教導的一個優點或一組優點，而不必須達成本文可教導或提出的其他目標或優點。下面特別實施方案的詳細描述使得本發明的其他方面、特征和優點變得顯而易見。然而，應當理解詳述和特別的實施例盡管指出本發明的優選的實施方案，但是僅以闡述的方式給出，因為本領域技術人員根據該詳細描述會明白在本發明的精神和范圍內的多種改變和修飾。附圖概述圖1是闡述lines突變體中低氮誘導的早衰的一系列圖片。野生型(Columbia,Col)和lines植物在分別含有1、3或10mM硝酸鹽的LB2土29壤中生長18天(A)、26天(B)和32天(C)，供應1或3mM硝酸鹽的lines植物中顯示早衰表型。DAG:種子萌發后天數。箭頭指出死亡的長角果。(D)和(E)是分別來自供應3mM硝酸鉀的lines(上圖)和Col(下圖)植物的莖生葉和發育中的長角果。(E)中的箭頭指出正在衰老的長角果尖端。對正在衰老的lines植物提供15mM硝酸鹽終止了最初用1mM(F)或3mM(G)硝酸鹽栽培的lines植物中的衰老進程。圖2描繪了LINES基因的圖位克隆和lines突變體的互補。(A)通過染色體I上臂上的兩個側翼SSP1標記物NF21B7(12個重組體)和NT7I23(6個重組體)定義LINES基因座的位置。進一步的繪圖將LINES基因座定位在BAC克隆F22D16上，F22D16側接SSLp標記物473993(1個重組體)和CAPS標記物SNP247(1個重組體)。該區域約62.3kb并含有21個有注解的基因，其中僅在基因Atlg02860中檢測到DNA片段缺失。以下的互補測試證實了Atlg02860就是LINES基因。(B)提供3mM硝酸鹽后，用Atlg02860cDNA獨立轉化的野生型和三林lines才直物未顯示提供3mM硝酸鹽時的早衰表型，但是用空載體pGEAD轉化的lines植物和lines自身在種子萌發后26天顯示過早和快速的衰老。(C)和(D):分別通過PCR和RT-PCR在野生型、lines和轉基因lines植物中檢測多種版本的Atlg02860基因組DNA和cDNA。圖3是LINES基因的分子分析。(A)預測的LINES蛋白質氨基酸序列(SEQIDNO:4)。LINES突變中的缺失殘基標有下劃線，(B)具有SPX和RING結構域的LINES結構圖解。在截短的LINES中RING結構域的大部分缺失。(C)LINES直向同源物的系統進化分析，所述LINES直向同源物含有SPX和RING兩種結構域。圖4是在有限的氮供應下生長的lines和Col植物中氮獲取和衰老過程的比較。(A)種子萌發后18天(DAG)莖中總氮含量百分比(w/w)。數值為均值±標準誤(11=3)。(B)20DAG時lines和Col根中兩個主要的硝酸鹽轉運蛋白基因NRT1.1和NRT2.1的表達。(C)26DAG(上圖)和32DAG(下圖)時，來自lines和Col;tt物的蓮座葉中的衰老進展。圖片顯示蓮座中各位置的代表性葉。(D)lines和Col植物中衰老標記物基因SAG12的表達語。圖5是在受限的氮供應下生長的lines和Col植物中，隨著衰老過程改變的氮和碳代謝產物含量以及花色素苷量的分析。測試的代謝產物包括(A)硝酸鹽；(B)總氨基酸；(C)蛋白質；(D)總氮百分比(w/w);(E)葡萄糖；(F)果糖；(G)蔗糖；(H)花色素苷；(I)葉綠素。條棒代表均值土標準差(n=3-6)。圖6是提供了有限氮的lines和Col植物中隨著衰老過程改變的相關基因表達。分析的基因包括涉及氮同化作用(Rl、NR2和GS2)、光合作用(RBCS和CAB1)和花色素苷合成(CHS)的基因。使用SGA12表達作為衰老過程的指示劑。定義為了清楚起見，如下定義說明書中使用的某些術語"關聯/有效連接"是指兩條核酸序列物理上或功能上相關聯。例如，或位置使得調節DNA序列會影響編碼或結構DNA序列的表達水平，則該啟動子或調節DNA序列被稱作與該DNA序列"關聯"。"嵌合構建體，，是重組的核酸序列，其中啟動子或調節核酸序列與核酸序列(所述核酸序列編碼mRNA或被表達為蛋白質)有效連接或關聯，使得調節核酸序列能夠調節關聯的核酸序列的轉錄或表達。嵌合構建體的調節核酸序列通常不與天然存在得而關聯核酸序列有效連接。"輔因子"是酶催化的反應中所需的天然反應物，如有機分子或金屬離子。輔因子為例如NAD(P)、維生素B2(包括FAD和FMN)、葉酸、鉬蝶呤、維生素B"thiamin)、生物素、硫辛酸、泛酸和輔酶A、S-腺苷甲硫氨酸、吡噴醛磷酸、泛醌、甲基萘醌類。任選地，輔因子可以再生和再使用。"編碼序列，，是被轉錄為RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA的核酸序列。特別地，該RNA隨后在生物中被翻譯產生蛋白質。互補的"互補的"是指包含反向平行核苷酸序列的兩條核香酸序列，其能夠通過在反向平行的核苷酸序列中互補的堿基殘基之間形成氫鍵而彼jt匕酉己Xt。酶活性在本文中表示酶催化底物轉化為產物的能力。酶的底物包括酶的天然底物，但是也包括天然底物的類似物，所述類似物也可以被酶轉>化為產物或轉化為產物的類似物。例如通過測定某時間段后反應中的產物量，或通過測定某時間段后反應混合物中剩余的底物量來測量酶活性。還通過測定某時間段后反應混合物中剩余的未使用的反應輔因子的量，或通過測定某時間段后反應混合物中使用的輔因子的量來測量酶活性。還通過測定某時間段后反應混合物中剩余的自由能供體或能量富集分子(例如ATP、磷酸烯醇丙酮酸、乙酰磷酸或磷酸肌酸)的量，或通過測定某時間段后反應混合物中使用的自由能供體或能量富集分子(例如ADP、丙酮酸、乙酸或肌酸)的量來測量酶活性。表達盒本文使用的"表達盒"表示能夠指導具體核苷酸序列在適當宿主細胞組中表達的核酸分子，其包含與目的核苷酸序列有效連接的啟動子，所述目的核苷酸序列與終止信號有效連接。其一般還包含正確翻譯核苷酸序列所需的序列。編碼區通常編碼目的蛋白質，但是也可編碼有義或反義方向上的目的功能性RNA，例如反義RNA或非翻譯的RNA。包含目的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，這表示其至少一個組件對于其至少另一個組件而言是異源的。表達盒也可以是下述表達盒，所述表達盒是天然存在的，但是以適用于異源表達的重組形式獲得。然而，表達盒相對于宿主一般是異源的，即表達盒的具體DNA序列在宿主細胞中天然不存在，并且必須已通過轉化事件被引入宿主細胞或宿主細胞的祖先中。表達盒中核苷酸序列的表達可以位于組成型啟動子或誘導性啟動子的控制下，所述誘導性啟動子僅在所述宿主細胞暴露于一些具體的外部刺激時起始轉錄。在多細胞生物如植物的情況下，啟動子也可以對具體的組織或器官或發育階段是特異的。本文與核酸或蛋白質序列相關使用的術語"功能片段"表示保留全長32序列功能的序列片段或部分。基因術語"基因"被廣泛用于表示與生物學功能相關聯的任何DNA區段。因此，基因包括編碼序列和/或其表達所需的調節序列。基因還包括非表達的DNA區段，例如形成其他蛋白質的識別序列的DNA區段。基因可得自多種來源，包括從目的來源克隆或從已知或預測的序列信息合成，并可包括^皮設計為具有期望參數的序列。異源的/外源的術語"異源的"和"外源的"在本文中涉及核酸序列(例如DNA序列)或基因使用時表示來自具體宿主細胞的外部來源，或如果來自相同來源時，表示對其原始形式進行了修飾。因此，宿主細胞中的異源基因包括對具體宿主細胞是內源的，但是已通過例如DNA改組的使用進行了修飾的基因。該術語還包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多個拷貝。因此，該術語是指對細胞是外源或異源的DNA區段，或對細胞是同源的但是位于宿主細胞核酸中下述位置的DNA區段，該元件通常不存在于所述位置。表達外源DNA區段得到外源多肽。"同源"核酸(例如DNA)序列是與引入該序列的宿主細胞天然關聯的核酸(例如I)NA)序列。雜交短語"與……特異雜交，，是指在嚴格度條件下，當下述序列存在于復雜混合物(例如總細胞)DNA或RNA中時，一個分子只與該具體核苷酸序列結合、形成雙鏈體或雜交。"基本結合"是指探針核酸和靶核酸之間包含小量錯配的互補雜交，可以通過降低雜交介質的嚴格度來調節所述錯配，以達到靶核酸序列的期望檢測。抑制劑使蛋白質如生物合成酶、受體、信號轉導蛋白質、結構基因產物或運輸蛋白的酶活性失活的化學物質。在本文中使用術語"除草劑"(或"除草化合物")定義下述抑制劑，對任何發育階段的植物應用該抑制劑，藉此該除草劑抑制植物的生長或殺死植物。相互作用相互作用的品質或狀態使得一種蛋白質或化合物對另一種蛋白質的有效性或毒性是抑制(拮抗劑)或增強(激動劑)的。當核酸序列編碼的多肽與參考核酸序列編碼的多肽具有相同氨基^列時，該核酸序列與參考核酸序列是"同類編碼"的。等基因的在遺傳上等同的植物，只是因為存在或不存在異源DNA序列而不同。分離的在本發明的上下文中，分離的DNA分子或分離的酶是通過人的介入遠離其天然環境并因此不是天然產物的DNA分子或酶。分離的I)NA分子或酶可以以純化的形式存在，或可存在于非天然的環境中，例如存在于轉基因宿主細胞中。成熟蛋白質其中轉運肽、信號肽和/或前肽部分已被去除的蛋白質。最小啟動子可支持任何轉錄的最小的啟動子部分，如TATA元件。在缺失上游激活時，最小啟動子一般具有被大幅降低的啟動子活性。存在合適的轉錄因子時，最小啟動子發揮允許轉錄的作用。修飾的酶活性與植物中天然存在的酶活性不同的酶活性(即在缺失人對這類活性的直接或間接操作時天然存在的酶活性)，其對抑制天然存在的酶活性的抑制劑耐受。固有的是指存在于未經轉化的植物細胞基因組中的基因。天然存在的術語"天然存在的"用于描述可在自然中發現的物體，其與由人人工生產的不同。例如，存在于生物體(包括病毒)中的蛋白質或核苷酸序列是天然存在的，所述蛋白質或核苷酸序列可從天然來源分離，并且未由人在實驗室中有意地修飾。核酸術語"核酸，，是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的多聚體。除非特別地限制，該術語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，其與參考核酸具有類似的結合特性，并以類似于天然存在的核苷酸的方式代謝。除非另有說明，具體的核酸序列還含蓄地包括其經保守修飾(例如簡并密碼子取代)的變體和互補序列以及明確指出的序列。特別地，可通過產生下述序列達成簡并密碼子取代，所述序列中一個或多個選定的(或所有)密碼子的第三個位置被混合性堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer等，NucleicAcidRes.19:5081(1991);Ohtsuka等，丄Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等，Mol.Cell.Probes8:91-9834(1994))。術語"核酸"或"核酸序列"也可與基因、cDNA和基因編碼的mRNA互換4吏用。"ORF"表示可讀框。百分比同一性在兩條核酸或蛋白質序列的上下文中，短語"百分比同一性"或"百分比相同"是指針對最大對應進行比較和比對時，具有例如6()%，特別是70%,更特別是80。/。，仍然更特別是90。/。，進一步更特別是95%和最特別是至少99%的核苷酸或氨基酸殘基同一性的兩條或多條序列或亞序列(subsequence),其使用以下序列比較算法之一測量或通過視覺檢查測量。特別地，百分比同一性存在于長度為至少約50個殘基的序列區域中，更特別地存在于至少約IOO個殘基的區域中，最特別地，百分比同一性存在于至少約150個殘基中。在一個特別特定的實施方案中，百分比同一性存在于編碼區的全長中。為了進行序列比較，通常一條序列發揮參考序列的作用，測試序列與該參考序列比較。使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機中，如果需要的話指定亞序列坐標，并指定序列算法程序參數。序列比較算法隨后基于指定的程序參數計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分比。可例如通過Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通過Needleman&W扁ch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對算法，通過Pearson&Lipman，Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的搜索相似性方法，通過這些算法的計算機化執行(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr"Madison,WI)或通過視覺檢查(一般參見Ausubel等，下文)，對用于比較的序列進行最佳比對。適用于測定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的一個實例是BLAST算法，其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(19卯)中。公眾可通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得運行BLAST分析的軟件。該算法涉及首先通過鑒定查詢序列中長度為W的短字長(shortword)鑒定高分#^列對(HSP)，所述短字長與數據庫序列中相同長度的字長比對時匹配或滿足一些正值的閾值分數T。T是指鄰域字長分數閾值(Altschul等，19卯)。這些初始的鄰域字長匹配(hit)發揮起始下述搜索的種子的作用，所述搜索尋找含有它們的更長的HSP。該字長匹配隨后在兩個方向上沿著各序列擴展，直到累積的比對分數能夠被提高為止。對核苷酸序列而言，使用參數M(—對匹配殘基的獎勵分數；始終〉0)和N(錯配殘基的罰分；始終<0)計算累積的分數。對氨基,列而言，使用評分矩陣計算累積分數。當累積的比對分數從其達到的最大值跌落數量X、累積的分數由于一個或多個負分殘基比對的累積而達到或低于零、或達到任一序列的末端時，停止字長匹配在各方向上的擴展。BLAST算法參數W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對核苷酸序列而言)使用11的字長(W)、10的預期(E)、100的截斷、M-5、=-4和兩條鏈的比較作為默認值。對M酸序列而言，BLASTP程序使用3的字長(W)、10的預期(E)和BLOSUM62評分矩陣作為默i^值(見Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))。除了計算序列同一性百分比外，BLAST算法還在兩個序列之間進行相似性的統計學分析(見例如Karlin&AItschul，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA卯5873-5787(1993))。由BLAST提供的相似性的一種度量為最小概率和(P(N))，其提供了兩條核苷酸或氨基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果在測試核酸序列與參考核酸序列的比較中，最小概率和小于約O.l，更特別地小于約0.01，和最特別地小于約0.001，則認為測試核酸序列與參考序列相似。前蛋白質通常靶向細胞器(如葉綠體)并且仍包含其天然轉運肽的蛋白質。純化的應用于核酸或蛋白質時，術語"純化的"表示核酸或蛋白質基本上不含其他分子組件，所述分子組件在天然狀態下與所述核酸或蛋白質相連。盡管其可以是干燥的或在水性溶液中，但是其特別地處于同質狀36態(homogeneousstate)。通常4吏用分析化學技術如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相層析測定純度和同質性。在制品中是優勢種類的蛋白質是基本純化的。術語"純化的"表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中基本上給出一個條帶。具體地，這表示核酸或蛋白質至少約50%純凈，更特別地至少約85。/。純凈，和最特別地至少約99%純凈。當來自兩條核酸各自的序列在子代核酸中組合時，該兩條核酸是"重組的"。當核酸均為重組的底物時，這兩條序列是"直接"重組的。當序列使用中間體如交換(cross-over)寡核苷酸重組時，兩條序列是"間接重組的"。對間接重組而言，不多于一條序列是重組的真實底物，并且在一些情況下，序列均不是重組的底物。"調節元件"是指涉及控制核苷酸序列表達的序列。調節元件包括與目的核苦酸序列有效連接的啟動子和終止信號。它們一般還包括核苷,列適當翻譯所需的序列。顯著的提高大于測量技術中固有誤差的卩艮度的酶活性提高，特別是在存在抑制劑時野生型酶活性提高約2倍或更大，更特別地提高約5倍或更大，最特別地提高約IO倍或更大。顯著更少表示酶反應的產物量被減少得多于測量技術中固有誤差的限度，特別是在缺失抑制劑時野生型酶活性減少約2倍或更大，更特別地減少約5倍或更大，最特別地減少約IO倍或更大。特異的結合/免疫交叉反應性兩條核酸序列或蛋白質基本相同的指標是第一核酸編碼的蛋白質與由笫二核酸編碼的蛋白質免疫雜交反應或特異結合。因此，例如當兩個蛋白質僅由保守取代區別時，蛋白質一般與第二蛋白質M本相同的。涉及蛋白質或肽時，短語"與抗體特異(或選擇性)結合"或"與……特異(或選擇性)免疫反應"是指在存在蛋白質的異源群體和其他生物制品時決定蛋白質存在的結合反應。因此，在指定的免疫測定條件下，特定的抗體與具體的蛋白質結合，并且不以顯著的量與樣品中存在的其他蛋白質結合。在這類條件下與抗體的特異結合可需要下述抗體，所述抗體因其對具體蛋白質的特異性而被選擇。例如，可選擇針對下述蛋白質產生的抗體獲得與該蛋白質特異免疫反應而不與其他蛋白質(除多態變體以外)特異免疫反應的抗體，所述蛋白質具有本發明的任何核酸序列編碼的氨基酸序列。可使用多種免疫測定方式選擇與具體蛋白質特異免疫反應的抗體。例如，常規地使用固相ELISA免疫測定、Western印跡、或免疫組織化學選擇與蛋白質特異免疫反應的單克隆抗體。可用于測定特異免疫反應性的免疫測定方式和條件的描述見Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPublications,NewYork"HarlowandLane")。特異或選擇性的反應通常會是背景信號或噪音的至少兩倍，更通常是背景的多于10到IOO倍。在核酸雜交實驗如Southern和Northern雜交的語境中，"嚴格雜交條件"和"嚴格雜交洗滌條件"是序列依賴性的，并在不同的環境參數下不同。更長的序列在更高的溫度下特異雜交。核酸雜交的廣泛指南見Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分第2章，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays"Elsevier,NewYork。一般地，高嚴格度雜交和洗滌條件被選擇為比確定的離子強度和pH下特異序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。通常在"嚴格條件"下，探針會與其靶亞序列雜交，但不與其他序列雜交。Tm是50%的靶序列與優選的匹配的探針雜交的溫度(在確定的離子強度和pH下)。非常嚴格的條件被選擇為等于具體探針的Tm。在Southern或Northern印跡的濾紙上用于互補核酸雜交的嚴格雜交條件的實例是42。C下含lmg肝素的50。/。甲酰胺中過夜進行雜交，所述互補核酸具有多于100個互補的殘基。高度嚴格洗滌條件的實例是72'C下0.15MNaCl約15分鐘。嚴格洗滌條件的實例是65。C下0.2xSSC洗滌15分鐘(SSC緩沖液的描述見Sambrook，下文)。通常，在高嚴格度洗滌之前進行低嚴格度洗滌，去除背景探針信號。用于例如多于100個核苷酸雙鏈體的中嚴格度洗滌的實例是45。C下lxSSC15分鐘。例如多于100個核苷酸雙鏈體的低嚴格度洗滌的實例是40。C下4-6xSSC15分鐘。對短探針(例如約10到5038個核苷酸)而言，嚴格條件通常涉及在pH7.0到8.3下少于約1.0MNa離子的鹽濃度，通常約0.01到1.0MNa(或其他鹽)離子濃度，而溫度通常至少約30°C。也可通過去穩定劑如曱酰胺的添加達到嚴格條件。一般地，是具體雜交實驗中針對無關探針觀察到的信噪比2倍(或更高)的信噪比表示檢測到特異雜交。如果其所編碼的蛋白質M本相同的，則在嚴格條件下彼此不雜交的核酸仍然M^目同的。這發生于例如使用遺傳密碼子允許的最大密碼子簡并性產生核酸拷貝時。以下是雜交/洗滌條件集合的實例，其可用于克隆與本發明的參考核苷酸序列同源的核苷酸序列參考核苷酸序列與所述參考核苷酸序列在7%十二烷基^克酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、1mMEDTA中于50。C下特異雜交，在2XSSC、0.1%SDS中于50。C洗滌；更期望在7。/。十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、1mMEDTA中于5(TC下特異雜交，在1XSSC、0.1%SDS中于50。C下洗滌；進一步更期望在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNal)04、1mMEDTA中于50。C下特異雜交，在0.5XSSC、0.1%SDS中于50。C下洗滌；特別地在7%十二烷1^克酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、1mMEI)TA中于50。C下特異雜交，在0.1XSSC、0.1%SDS中于50。C下洗滌；更特別地在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04、lmMEDTA中于50。C。C下特異雜交，在0.1XSSC、0.1%SDS中于65。C下洗滌。"亞序列"是指分別包含更長的核酸或氨基酸(例如蛋白質)序列的一部分的核酸或M酸序列。基本相似性在兩條核酸或蛋白質序列的語境中，術語"基本相似性"是指基本相似的兩條或更多序列或亞序列，例如具有50%，特別是60%，更特別是70%，進一步更特別是80%，仍然更特別是卯％，還更特別是95%和最特別是99%序列同一性。底物底物是酶天然識別并在酶天然發揮其功能的生物化學途徑中轉化為產物的分子，或是該分子經修飾的版本，該版本也被酶識別并在于天然發生的反應相似的酶反應中被酶轉化為產物。轉化用于將異源DNA引入植物細胞、植物組織或植物中的方法。39轉化的植物細胞、植物組織或植物理解為不僅包括轉化過程的終產物，而且包括其轉基因后代。"轉化的"、"轉基因的"和"重組的"是指其中已引入異源核酸分子的宿主生物，如細菌或植物。核酸分子可被穩定整合進宿主的基因組中，或核酸分子也可作為染色體外分子存在。這類染色體外分子可以自我復制。轉化的細胞、組織或植物理解為不僅包括轉化過程的終產物，而且包括其轉基因后代。"非轉化的"、"非轉基因的"或"非重組的"宿主是指不含有異源核酸分子的野生型生物，例如細菌或植物。存活力本文使用"存活力"是指植物的適應度(fitness)參數。針對植物發育的純合表現對其進行測定，指出何種蛋白質對于植物生長是必要的。發明詳述I.性狀功能基因組學的一般描述功能基因組學的目的是鑒定控制生物表型表達的基因，并使用多種方法學，包括擔不限于生物信息學、基因表達研究、基因和基因產物相互作用、遺傳學、生物化學和分子遺傳學。例如，生物信息學能夠通過在異源生物中鑒定在氨基酸或核苷酸水平上具有高相似性(同源性)程度的基因，為給定的基因指定功能。基因在mRNA或蛋白質水平上的表達能夠通過將基因的表達與環境應答、發育過程或遺傳(突變)或分子遺傳(基因超量表達或低表達)干擾相關聯來指定功能。基因在mRNA水平上的表達可單獨(Northern分析)或與其他基因一起(微陣列分析)檢查，而基因在蛋白質水平上的表達能夠單獨(天然或變性的蛋白質凝膠或免疫印跡分析)或與其他基因一起(蛋白質組分析)檢查。對蛋白質/蛋白質和蛋白質/DNA相互作用的了解能夠通過鑒定在相同生物學過程中一起發揮作用的蛋白質和核酸序列來指定功能。遺傳學可通過證明基因中的DNA損傷(突變)對生物具有可計量的影響來對基因指定功能，所述影響包括擔不限于其發育；激素生物合成和應答；生長和生長習性(植物結構)；mRNA表達譜；蛋白質表達謙；抗病能力；對非生物脅迫的耐受；獲得營養物的能力；光合作用效率；改變的初級和次級代謝；和多種植物器官的組成。生物化學可通過證明由基因編碼的蛋白質(特別是在異源生物中表達時)單獨或與其他蛋白質一起具有某種酶活性來指定功能。分子遺傳學能夠通過在天然植物或在異源生物中超量表達或低表達基因，并觀察上文遺傳學功能指定中所述的可定量影響來指定功能。在功能遺傳學中，使用任何或所有這些方法(通常一起使用)，基于大量生物表型中的任意表型為基因指定功能。本領域才支術人員明白，所有這些不同的方法學均可提供證明具體基因功能的數據，并且這類證據隨著遞增數量的數據而更強大，所述數據用于功能指定特別是來自一種方法學，更特別地來自兩種方法學，并且進一步更特別地來自多于兩種方法學。另外，本領域技術人員明白，不同的方法學在證明基因功能指定的證明力度中可不同。通常生物化學、遺傳學和分子遺傳學證據的資料被認為比生物信息學或基因表達證據的資料更有力，但不總是如此。最后，本領域技術人員明白，對不同的基因而言，來自一種方法學的一種資料在證據的力度方面可以是不同的，所述證據由用于這些不同基因功能指定的各種不同資料提供。森林物種性狀功能基因組學(silviculturalspeciestraitfunctionalgciHmiics)的目的是鑒定性狀基因，即能夠在森林植物中賦予有用性狀的基因。這類性狀包括但不僅限于增加的產量，無論是質量還是品質；增加的營養物獲取和增加的代謝效率；用于建筑、纖維(組織)或加工的植物組織增強或改變的營養物組成；增加的工業加工實用性；增加的植物抗病性；增強的不良環境條件(非生物脅迫)耐受，所述不良環境條件包括但不僅限于干旱、過冷、過熱、或過量的土i裏鹽度或極端^或M;和植物結構或發育中的改變，包括發育時間的改變。通過轉基因或非轉基因手段鑒定的這類性狀基因的運用可以為了森林學的利益顯著地改良森林植物。作物性狀功能基因組學(croptraitfunctionalgenomics)的目的是鑒定作物性狀基因，即能夠在作物植物中賦予有用的農業性狀的基因。這類農業性狀包括但不僅限于增加的產量，無論是質量還是品質；增加的營養物獲取和增加的代謝效率；用于食品、飼料或加工的植物組織增強或改變的營養物組成；增加的農業或工業加工實用性；增加的植物抗病性；增強的不良環境條件(非生物脅迫)耐受，所述不良環境條件包括但不僅限于干旱、過冷、過熱、或過量的土壤鹽度或極端g或M;和植物結構或發育中的改變，包括發育時間的改變。通過轉基因或非轉基因手段鑒定的這類性狀基因的運用可以為了農業的利益顯著地改良作物植物。對人和動物消耗而言，谷物均是地球上最重要的作物植物。在稻、玉米、小麥、大麥、棵麥、燕麥和其他農業重要的單子葉植物中觀察到遺傳同線性(大染色體區段內基因順序的保守)，這有助于以單個谷物基因的序列為1^出對來自不同谷物物種的直向同源基因進行繪圖和分離。稻在谷物中具有最小(420Mb)的基因組，并且近期是公眾和私人的基因組測序與EST測序努力的主要焦點。為了在稻[小麥基因組中鑒定控制[性狀的作物性狀基因，以一種或多種功能基因組方法為基礎對來自稻基因組草圖[小麥EST數據庫的基因進行優先順序處理(prioritize)。例如，4吏用凈皮稻稻瘟菌(Magnaporthegrisea)感染的稻植物的全基因組表達研究對控制疾病抗性的候選基因進行優先順序處理。然后可以以稻全基因組序列的分析為基礎，預測稻性狀基因候選者的全長和部分cDNA,并使用可商業獲得的PCR引物挑選程序通過設計和使用PCR擴增引物將其分離。引物被用于從稻cDNA文庫或第一鏈cI)NA中PCR擴增全長或部分cDNA。使用植物分子遺傳學方法將得自任一方法的cDNA克隆用于構建載體，所述載體被設計為改變這些基因在轉基因植物中的表達，所述分子遺傳學方法在下文詳述。通過在轉基因植物中超量表達或低表達關鍵性狀基因來改變植物表型是對植物基因指定功能的一種有力和確定的方法。鑒定具有改變的目的性狀的轉基因植物的實驗被用于明確地指定這些基因用于通過轉基因方法或經典育種方法改良稻(并擴展至其他谷物)的實用性。II.cI)NA的鑒定、克隆和測序42本發明cDNA的克隆和測序在實施例1中描述。本發明的分離的核酸和蛋白質可在大范圍的植物、棵子植物、單子葉植物和雙子葉植物中使用，尤其是在單子葉植物如稻、小麥、大麥和玉米中^f吏用。在一個更特別的實施方案中，單子葉植物是谷物。在一個更特別的實施方案中，谷物可以是例如玉米、小麥、大麥、燕麥、棵麥、粟、高粱、黑小麥、黑麥、單粒小麥、斯佩耳特小麥、雙粒小麥、畫眉草、蜀黍、亞麻、格蘭馬草、磨擦草屬物種或類蜀粟。在一個最特別的實施方案中，谷物是稻。其他植物的屬包括，但不僅限于南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、胡桃屬(Juglans)、Gragaria、百樂M艮屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食草屬(Onobrychis)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛癡屬(Atropa)、辣豐權屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、花薄荷屬(Majorana)、菊苣屬(Cichorium)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵屬(Pelargonium)、黍屬(Panie畫)、狼尾草屬(Penniset腿)、毛K屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、喇叭舌屬(Salpiglossis)、香瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(PhaseoIus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(()ryza)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、蔥屬(Allium)和小麥屬(Triticum)。本發明還提供了對包含本發明核酸分子的植物或植物部分進行基因分型的方法。任選地，該植物是單子葉植物，例如但不僅限于稻或小麥。基因分型提供了區分染色體對同源物的手段，并可用于在植物種群中區分分離體。分子標記物方法可用于系統發生研究，表征作物變種間的親緣關系，鑒定雜交種或體細胞雜種(somatichybrid),定位影響單基因性狀的染色體43區段，圖位克隆，和研究定量的遺傳(參見PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,第7章，Clark編著，Springer-Verlag，Berlin1997;Paterson，A.H.，"TheDNARevolution",GenomeMappinginPlants中的第2章，Paterson,A.H.編著，Academic出版/R.GLandsCo.,Austin,Texas1996)。基因分型方法可使用任何數量的分子標記物分析技術，例如但不僅限于限制長度多態性(RFLP)。如本領域所公知的，RFLP由DNA限制片段長度中的差異產生，所述差異得自相同基因的等位基因之間的核苷酸差異。因此，本發明提供了以下通過使用RFLP分析分離本發明的基因或核酸或遺傳上連鎖的染色體序列的方法。連鎖的染色體序列在本發明核酸的50厘摩(50cM)內，40或30cM內，特別地在20或10cM內，更特別地在5、3、2或1cM內。III.目的'性狀本發明包括編碼下述蛋白質的多核苷酸的鑒定和分離，所述蛋白質涉及氮利用、花色素苷生物合成和木質素生物合成。改變與這些性狀相關的基因的表達能夠用于根據期望改良或修飾植物、木材和/或谷物。實施例描述了分離的目的基因，和分析表達改變及其對植物特征的影響的方法。本發明的一個方面提供了用于改變(即提高或降低)本發明的核酸分子和多肽在植物中的水平的組合物和方法。具體地，本發明的核酸分子和多肽被組成型地、時間或空間(例如在發育階段、某些組織中和/或以一定數量)地表達，這對于非重組改造的植物是不典型的。因此，本發明提供了在這類示范性應用中改變上文鑒定的特定特征的實用性。VI.在轉基因植物中控制基因表達本發明還涉及包含核酸分子的轉化的細胞、轉化的植物、種子和植物部分，和通過改變本發明基因的表達來修飾目的表型性狀的方法。A,修飾編碼序列和相鄰序列來自異源來源的基因在植物中的轉基因表達可涉及對這些基因的修飾，以達到和最優化其在植物中的表達。具體地，在植物中在獨立的轉錄物上表達下述細菌ORF是最佳的，所述細菌ORF編碼獨立的酶但是由天然微生物中同一轉錄物編碼。為了達成該目的，將各微生物ORF各自分離并克隆在盒中，所述盒在ORF的5'末端提供;f直物啟動子序列并在ORF的3，末端提供植物轉錄終止子。分離的ORF序列特別包含起始ATG密碼子和終止STOP密碼子，但是可包含除起始ATG和終止STOP密碼子之外的額外序列。另外，ORF可以是截短的，但仍然保留所需的活性；對尤其長的ORF而言，保留活性的截短的版本對于在轉基因生物中表達可以是優選的。"植物啟動子，，和"植物轉錄終止子"旨在表示在植物細胞中工作的啟動子和轉錄終止子。這包括可來自非植物來源如病毒(一個實例是花椰菜花葉病毒)的啟動子和轉錄終止子。在一些情況下，對ORF編碼序列和相鄰序列的修飾不是必需的。分離含目的ORF的片段并將其插入植物啟動子下游就是足夠的。例如，Gaffncy等(Science261:754-756(1993))在轉基因植物中成功地表達了位于CaMV35S啟動子和CaMVtml終止子控制下的假單胞桿菌(Pseudomonas)nahG基因，而未修飾編碼序列，且假單胞菌基因ATG上游的核苷酸和STOP密碼子下游的核苷酸仍然與nahGORF相連。特別地，應該留下盡可能少的相鄰微生物序列連接在ATG上游和STOP密碼子下游。事實上，這類構建可取決于限制性位點的可用性。在其他情況下，來自微生物來源的基因的表達可在表達中產生問題。這些問題已在本領域中充分表征，并且對來自某些來源如芽孢桿菌(Bacillus)的基因而言尤其常見。這些問題可適用于本發明的核苷^列，且這些基因的修飾可使用本領域目前公知的技術進行。可遇到以下的問題l.密碼子選擇。植物中特定的密碼子選擇與某些^:生物中特定的密碼子選擇不同。將克隆的微生物ORF中的密碼子選擇與植物基因(尤其是來自耙植物的基45因)中的選擇進行比較，會使得能夠識別ORF中應當被特別改變的密碼子。通常，植物進化趨向于在單子葉植物的第三個堿基位置中對核苷酸C和G的有力偏好，而雙子葉植物常在該位置使用核苷酸A或T。通過修飾基因以摻入具體靶轉基因物種的特定密碼子選擇，會解決下文所述關于GC/AT含量和不合理剪接的許多問題。2.GC/AT含量。植物基因通常具有多于35°/。的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列能夠在植物中引起若千問題。首先，ATTTA基序被認為引起信號的去穩定化并存在于在許多短壽命mRNA的3，末端。其次，多腺苷酸化信號如AATAAA在信息中不適當位置的發生被認為引起轉錄的過早截斷。另外，單子葉植物可將富含AT的序列識別為剪接位點(見下文)。3.與起始的曱硫氨酸相鄰的序列。植物與微生物的區別在于其信息不具有確定的核糖體結合位點。更確切地說，認為核糖體與信息的5，末端結合并掃描第一個可獲得的ATG，在這里開始翻譯。然而，認為存在對與ATG相鄰的某些核苷酸的偏好，并且可通過在ATG處包含真核生物共有的翻譯起始子來增加^^生物基因的該表達。Clontech(1993/1994目錄，第210頁，引入本文作為參考)提出一條序列作為大腸桿菌uidA基因在植物中表達的共有翻詞，起始子。另外，Joshi(N.A.R.15:6643-6653(1987)，引入本文作為參考)比較了與ATG相鄰的許多植物序列，并提出另一共有序列。在植物中表達微生物ORF時遇到困難的情況下，在起始ATG處包含這些序列中的一條可促進翻譯。在這些情況下，共有序列的最后三個核苷酸可由于其對第二個AA殘基的修飾而不適合包含在修飾的序列中。與起始甲硫氨酸相鄰的特定序列可在不同的植物物種間不同。對位于GenBank數據庫中14個玉米基因的調查提供了以下的結果14個玉米基因中起始ATG前的位置_10-9-8-7-6-5-4-3-2-1C38462560107T3034321110A2314323723G6360654615可對核苷酸要摻入其中的期望的植物物種和為了摻入特定核苷酸而被修飾的與ATG相鄰的序列進行該分析。4.去除不合理的剪接位點。從非植物來源克隆并且未針對在植物中表達進行最優化的基因也可含有在植物中被識別為5'或3，剪接位點并被切割的基序，因此產生截短的或刪除的信息。可使用本領域公知的技術去除這些位點。修飾編碼序列和相鄰序列的技術是本領域公知的。在微生物ORF的原始表達低并認為如上文所述改變序列是合適的的情況下，可根據本領域公知的方法完成合成基因的構建。這些方法例如描述于公開的專利公開文本EP0385962(屬于Monsanto)、EP0359472(屬于Lubrizol)和WO93/07278(屬于Ciba-Gdgy)中，其均引入本文作為參考。在大部分情況下，優選使用瞬時測定方案(這是本領域公知的)在基因構建體轉移至轉基因植物之前測定其表達。B.構建植物表達盒旨在在轉基因植物中表達的編碼序列首先被裝配在表達盒中的可在植物中表達的合適啟動子之后。該表達盒也可包含轉基因表達所需或選擇的任何其他序列。這類序列包括但不限于轉錄終止子、增加表達的外來序列如內含子、關鍵序列(vitalsequence),和旨在將基因產物靶向特定細胞器和細胞區室的序列。然后可將這些表達盒容易地轉移至下文所述的植物轉化載體。以下描述了典型的表達盒的多種組件。l.啟動子用于表達盒中的啟動子的選擇會確定轉基因在轉基因植物中的空間和時間表達模式。選擇的啟動子會在特異的細胞類型(如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)或在特異的組織或器官(例如才艮、葉或花)中表達轉47基因，且該選擇會反映期望的基因產物累積位置。或者，選擇的啟動子可驅動基因在不同的誘導^H牛下表達。啟動子的強度(即啟動轉錄的能力)不同。根據使用的宿主細胞體系，可使用大量合適啟動子之任一，包括基因固有的啟動子。以下是可用于表達盒中的啟動子的非限制性實例。a.組成型表達，遍在蛋白啟動子遍在蛋白是已知在許多細胞類型中累積的基因產物，且其啟動子從若干物種中被克隆用于在轉基因植物中使用(例如向日葵-Binet等，PlantScience79:87-94(1991);玉米-Christensen等，PlantMolec.Biol.12:619-632(1989);和擬南芥-Callis等，J.Biol.Chem.265:12486-12493(1990)和Norris等，PlantMol，Biol.21:895-906(1993))。已在轉基因單子葉植物體系中個開發了玉米遍在蛋白啟動子，并且其構建用于單子葉植物轉化的序列和載體在專利公開EPO342926(屬于Lubrizol)中公開，該文獻引入本文作為參考。Taylor等(PlantCellRep.12:491-495(1993))描述了包含玉米遍在蛋白啟動子和第一內含子的載體(pAHC25)，以及通過微粒轟擊被引入后其在大量單子葉生物細胞懸浮液中的高活性。對于用于本發明核苷#列，擬南芥遍在蛋白啟動子是理想的。遍在蛋白啟動子適用于在轉基因植物(單子葉植物和雙子葉植物二者)中的基因表達。合適的載體是pAHC25的衍生物或該申請中描述的任何轉化載體，其通過引入適當的遍在蛋白啟動子和/或內含子序列被修飾。b.組成型表達，CaMV35S啟動子質粒pCGN1761的構建描述于公開的專利申請EP0392225(實施例23)中，該文獻引入本文作為參考。pCGN1761含有"雙，，CaMV35S啟動子和tml轉錄終止子，在啟動子和終止子之間具有特有的EcoRI位點，并具有pUC-型主鏈。構建了具有^"飾的多接頭的pCGN1761的f汴生物，其除了已有的EcoRI位點外還包含NotI和XhoI位點。該衍生物被命名為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX適用于為了在轉基因植物中在35S啟動子的控制下表達的目的，在其多接頭內克隆cDNA序列或編碼序列(包括微生物ORF序列)。這類構建體的整個35S啟動子-編碼序列-tml終止子盒可通過啟動子5，的HindIII、Sphl、Sail和Xbal位點和終止子，3的Xbal、BamHI和BglI位點切割用于轉移至轉化載體，如下文所述的轉化栽體。另外，可通過HindIII、Sphl、Sall、Xbal或Pstl的5'切割或任何多接頭限制性位點(EcoRI、NotI或XhoI)的3'切割去除雙35S啟動子片段，用于置換另一啟動子。如果期望的話，可通過引入可增加翻譯的序列在克隆位點附近進行修飾。這尤其適用于期望超量表達時。例如，可通過如美國專利No.5,639,949的實施例37所述最優化翻譯起點來修飾pCGN1761ENX,所述文獻引入本文作為參考。c.組成型表達，肌動蛋白啟動子已知若干種肌動蛋白同種型在大部分細胞類型中表達，因此肌動蛋白啟動子是組成型啟動子的良好選擇。具體地，已克隆和表征了來自稻Actl基因的啟動子(McElroy等，PlantCell2:163-171(19卯))。發現啟動子的1.3kb片段含有在稻原生質體中表達所需的所有調節元件。另外，已構建了基于Actl啟動子的大量表達載體，它們尤其用于單子葉植物(McElroy等，Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))。這些載體整合了Actl-內含子1、Adhl5，側翼序列和Adhl-內含子l(來自玉米醇脫氫酶基因)和來自CaMV35S啟動子的序列。顯示最高表達的載體是35S與Actl內含子或Actl5，側翼序列與Actl內含子的融合物。(GUS報告子基因)起始ATG附近序列的最優化也增加了表達。McElroy等(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))所述的啟動子表達盒可被容易地修飾用于基因表達，并尤其適合在單子葉植物宿主中使用。例如，從McElroy構建體中取出含啟動子的片段并用于置換pCGN1761ENX中的雙35S啟動子，然后所述pCGN1761ENX可用于插入特異的基因序列。然后可將由此構建的融合基因轉移至適當的轉化栽體。在獨立的報道中，也發現稻Actl啟動子與其第一個內含子指導在培養的大麥細胞中的高表達(Chibbar等，PlantCellRep.I2:506-509(1993))。d.誘導性表達，PR-1啟動子pCGN1761ENX中的雙35S啟動子可用選擇的任何另一啟動子代替，49所述另一啟動子會導致適當的高表達水平。舉例而言，美國專利No.5,614,395中所述的可化學調節的啟動子之一(如煙草PR-la啟動子)可代替雙MS啟動子。或者，可使用Lebel等，PlantJ.16:223-233(1998)中所述的擬南芥PR-1啟動子。通過限制性酶將選擇的啟動子從其來源特異切割，但是也可以使用帶有適當末端限制性位點的引物進行PCR擴增從而從其來源特異切割。要進行PCR-擴增時，應當在靶栽體中克隆擴增的啟動子之后對啟動子再測序以檢驗擴增錯誤。將可化學/病原體調節的煙草PR-la啟動子從質粒pCIB1004(用于構建體，見EP0332104的實施例21，該文獻引入本文作為參考)中切割并轉移至質粒pCGN1761ENX(Uknes等，PlantCell4:645-656(1992))。用Ncol切割pCIB1004，并通過用T4I)NA聚合酶處理使得到的線性片段的3'突出端成為平端。然后用HindIII切割該片段，對得到的含PR-la啟動子片段進行凝膠純化并克隆進pCGN1761ENX中，所述pCGN1761ENX已去除了雙35S啟動子。這如下完成用Xhol切割并用T4聚合酶變平端，然后用HindIII切割，并分離含較大載體-終止子的片段，pCIB1004啟動子片段被克隆進上述片段中。這產生了pCGN1761ENX衍生物，其具有PR-la啟動子和tml終止子和具有特有的EcoRI和Notl位點的插入多接頭。可向該載體中插入選擇的編碼序列，隨后將融合產物(即啟動子-基因-終止子)轉移至任何選擇的轉化載體，包括下文所述的轉化載體。可使用多種化學調節劑在根據本發明轉化的植物中誘導選擇的編碼序列表達，所述化學調節劑包括美國專利第5,523,311號和第5,614,395號中公開的苯并噻二唑、異煙酸和水楊酸化合物。e.誘導性表達，乙醇誘導性啟動子也可使用可由某醇或酮(如乙醇)誘導的啟動子賦予本發明編碼序列的誘導性表達。這樣的啟動子例如為來自無冠構巢曲霉(Aspergillusnidulans)的alcA基因啟動子(Caddick等，(1998)Nat.Biotechnol16:177-180)。在構巢曲霉中，alcA基因編碼醇脫氫酶I，其表達在存在化學誘導劑時由AlcR轉錄因子調節。就本發明的目的而言，將質粒palcA:CAT中的CAT編碼序列替換為本發明的編碼序列，以形成編碼序列處于alcA基因啟動子控制下的表達盒，所述質粒palcA:CAT包含與最小35S啟動子融合的alcA基因啟動子序列(Caddick等，(1998)Nat.Biotcchnol16:177-180)。這4吏用本領域>^知的方法完成。f.誘導性表達，糖皮質激素誘導性啟動子還涉及使用基于類固醇激素的系統誘導本發明核*列的表達。例如，使用糖皮質激素介導的誘導體系(Aoyama和Chua(1997)ThePlantJournal11:605-612)并通過應用糖皮質激素誘導基因表達，所述糖皮質激素例如是合成的糖皮質激素，特別是地塞米松，特別是以O.lmM到lmM，更特別是從10mM到100mM范圍內的濃度。就本發明的目的而言，用本發明的核酸序列代替螢光素酶基因序列，形成本發明的核酸序列處于與35S最小啟動子融合的六拷貝GAL4上游激活序列的控制下的表達盒。這使用本領域公知的方法完成。反式作用因子包括與皰疹病毒蛋白VP16(Triezenberg等，(1988)GenesDevel.2:718-729)融合的GAL4DNA-結合結構域(Keegan等，(1986)Science231:699-704),所述皰疹病毒蛋白VP16與大鼠糖皮質激素受體的激素結合結構域融合(Picard等，(1988)Cell54:1073-1080)。融合蛋白的表達由本領域已知的或本文所述的啟動子控制。該表達盒還包含在下述植物中，所述植物包含與6xGAL4/最小啟動子融合的本發明的核酸序列。因此，融合蛋白的組織特異性或器官特異性的實現，導致殺蟲毒素的可誘導的組織或器官特異性。g.根特異表達另一種基因表達模式是根表達。合適的根啟動子是由deFramond(FEBS290:103-106(1991))和美國專利第5,466,785號所述的玉米金屬硫蛋白樣(MTL)基因啟動子，所述文獻引入本文作為參考。將該"MTL"啟動子轉移至用于插入選定基因的合適載體如pCGN1761ENX,并隨后將整個啟動子-基因-終止子盒轉移至目的轉化載體。h.創傷誘導性啟動子創傷誘導性啟動子也適用于基因表達。已描述了大量這類啟動子(例如Xu等，PlantMolec.Biol.22:573-588(1993)，Logemann等，PlantCell1:151-158(1989)，Rohrmeier&Lehle，PlantMolec.Biol.22:783-792(1993)，Firek等,PlantMolec.Biol.22:129-142(1993)，Warner等，PlantJ.3:191-201(1993))且其均適用于本發明。Logemann等描述了雙子葉馬鈴薯wiml基因的5'上游序列。Xu等顯示來自雙子葉植物馬鈴薯的創傷誘導性啟動子(pin2)在單子葉植物稻中有活性。另外，Rohrmeier&Lehle描述了使用標準技術克隆玉米WiplcDNA，該cDNA是創傷誘導的并可用于分離同族(cognate)啟動子。類似地，Firek等，和Warner等描述了來自單子葉植物石刁柏(Asparagusofficinalis)的創傷誘導基因，該基因在局部創傷和病原體侵入位點表達。使用本領域公知的克隆技術，可將這些啟動子轉移至合適的載體，與關于本發明的基因融合，并用于在植物創傷位點表達這些基因。i.髓特異表達專利申請WO93/07278描述了優先在髓細胞中表達的玉米trpA基因的分離，該文獻引入本文作為參考。提出了擴展至轉錄起點-n^bp的基因序列和啟動子。使用標準分子生物學技術，可將該啟動子或其部分轉移至載體如pCGN1761，其中該啟動子能夠替換35S啟動子，并用于驅動外源基因以髓特異的方式表達。事實上，含有髓特異啟動子或其部分的片段可被轉移至任何載體，并針對在轉基因植物中的實用性進行修飾。j.葉特異表達Hudspeth&Grula(PlantMolecBiol12:579-589(1989))已描述了編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。使用標準分子生物學技術，可使用該基因的啟動子驅動任何基因以葉特異的方式在轉基因植物中表達。k.花粉特異表達WO93/07278描述了玉米鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)基因的分離，該基因在花粉細胞中表達。基因序列和啟動子擴展至從轉錄起點"00bp。使用標準分子生物學技術，可將該啟動子或其部分轉移至載體如pCGN1761，其中該啟動子能夠替換35S啟動子，并用于驅動本發明的核52酸序列以花粉特異的方式表達。2.轉錄終止子可獲得大量在表達盒中使用的轉錄終止子。它們負責終止超出轉基因的轉錄并校正mRNA多聚腺苷酸化。適當的轉錄終止子是已知在植物中發揮作用的那些，并包括CaMV35S終止子、tml終止子、胭脂堿合酶終止子和豌豆rbcSE9終止子。其可用于單子葉植物和雙子葉植物。另外，可使用基因的固有轉錄終止子。3.用于增加或調節表達的序列發現來自轉錄單位內的大量序列增加基因表達，并且這些序列可與本發明的基因組合使用，提高本發明的基因在轉基因植物中的表達。多種內含子序列已顯示增加表達，尤其是在單子葉植物細胞中。例如，發現當引入玉米細胞中時，玉米Adhl基因的內含子顯著增加位于其同族啟動子下的野生型基因的表達。發現內含子l是尤其有效的，并在與氯霉素乙酰轉移酶基因的融合構建體中增加表達(Callis等，GenesDevelop.1:1183-1200(1987))。在相同的實驗體系中，來自玉米bronzel基因的內含子具有類似的增加表達的效果。內含子序列已被常規地整合進植物轉化載體中，通常在非翻譯的前導區內。也已知來自病毒的大量非翻譯前導序列增加表達，并且它們在雙子葉植物細胞中尤其有效。特別地，來自煙草花葉病毒(TMV，"W-序列")、玉米萎黃病斑點病毒(MCMV)和苜蓿花葉病毒(AMV)的前導序列已顯示有效增加表達(例如Gallie等，Nucl.AcidsRes.15:8693-8711(1987);Skuzeski等，PlantMolec.Biol.15:65-79(19卯))。本領域已知的其他前導序列包括但不僅限于小核糖核酸病毒前導區，例如EMCV前導區(腦心肌炎5'非編碼區)(Elroy-Stein，O.、Fuerst，T.R.和Moss,B.PNASUSA86:6126-6130(1989));馬鈴薯Y病毒(potyvirus)前導區，例如TEV前導區(煙草蝕斑病毒)(Allison等，I986);MDMV前導區(玉米矮花葉病毒)；Virology154:9-20);人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)前導區(Macejak，D.G.和Sarnow,P.,Nature353:90-94(1991));來自苜蓿花葉病毒外殼蛋白53mRNA(AMVRNA4)的非翻譯前導區(Jobling，S.A.和Gehrke，L.，Nature325:622-625(1987));煙草花葉病毒前導區(TMV)，(Gallie，D.R.等，MolecularBiologyofRNA，第237-256頁(1989));和玉米萎黃病斑點病毒(MCMV)前導區(Lommel，S.A.等，Virology81:382-385(1991))。還參見I)dla畫Cioppa等，PlantPhysiology84:965-968(1987)。除了將一個或多個上述元件整合進本發明的乾表達盒的5，調節區內以外，也可整合乾表達盒特有的其他元件。這類元件包括但不僅限于最小啟動子。最小啟動子旨在表示無上游激活時是無活性的或幾乎無活性的基本啟動子元件。當不存在反式作用子或當不存在增強子或應答元件結合位點時，這樣的啟動子在植物中具有低背景活性。尤其適用于植物中乾基因的一種最小啟動子是Bzl最小啟動子，其得自玉米的bronzel基因。該Bzl核心啟動子通過在位于-53和-58的Nhel位點切割，得自"myc"突變體Bzl-螢光素酶構建體pBzlLucR98。Roth等，PlantCell3:317(1991)。衍生的Bzl核心啟動子片段因此從-53擴展至+227，并在5'非翻譯區包含Bzl內含子-1。還適用于本發明的是通過使用合成的TATA元件創建的最小啟動子。該TATA元件允許RNA聚合酶因子識別啟動子，并在不缺失激活時賦予基底水平的基因表達(一般參見Mukumoto(1993)PlantMolBiol23:995-1003;Green(2000)TrendsBiochemSci25:59-63)。4.基因產物在細胞內的靶向已知在植物中存在靶向基因產物的多種機制，并且已較詳細地表征了控制這些機制功能的序列。例如，基因產物到葉綠體的靶向由存在于多種蛋白質氨基端的信號序列控制，該信號序列在葉綠體輸入時被切割，產生成熟的蛋白質(例如Comai等，J.Biol.Chem.263:15104-15109(1988))。這些信號序列可與異源基因產物融合，影響異源產物進入葉綠體的輸入(vandenBroeck等，Nature313:358-363(1985))。編碼適當信號序列的I)NA可從下述cDNA的5，端分離，所述cDNA編碼RUBISCO蛋白質、CAB蛋白質、EPSP合酶、GS2蛋白質和已知定位于葉綠體的許多其他蛋白質。還參見美國專利第5,639,949號的實施例37中題為"ExpressionWithChloroplastTargeting，，的部分。其他基因產物定位于其他細胞器如線粒體和過氧化物酶體中(例如Unger等，PlantMolec.Biol.13:411-418(1989))。也可利用編碼這些產物的cl)NA影響異源基因產物到這些細胞器的靶向。這類序列的實例是核編碼的ATP酶和線粒體特異的天冬氨酸氨基轉移酶同種型。靶向細胞蛋白質體已由Rogers等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:6512-6516(1985)描述。另外，已^^征了引起基因產物靶向到其他細胞區室的序列。氨基端序列負責到ER、質外體的靶向和從糊粉細胞的胞外分泌(Koehler&Ho，PlantCell2:769-783(19卯))。另外，氨基端序列與氣基端序列組合負責基因產物的液泡孝巴向(Shinshi等，PlantMolec.Biol.14:357-368(19卯)。通過將上述適當的靶向序列與目的轉基因序列融合，可能指導轉基因產物去往任何細胞器或細胞區室。對葉綠體靶向而言，例如將來自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶基因或GS2基因的葉綠體信號序列與轉基因的氨基端ATG融合。選擇的信號序列應包括已知的切割位點，構建的融合物應考慮切割所需的切割位點后的任何氨基酸。在一些情況下，可通過在切割位點和轉基因ATG之間添加少量氨基酸，或者通過替換轉基因序列中的一些氨基酸來滿足該需要。可如下測試針對葉綠體輸入構建的融合物的葉綠體吸收效率將體外轉錄的構建體體外翻譯，然后使用Bartlett等，在Edelmann等(編著)MethodsinChloroplastMolecularBiology,Elsevier,第1081-1091頁(1982)和Wasmann等，Mol.Gen.Genet.205:446-453(1986)中所述的技術進行體外葉綠體吸收。這些構建技術是本領域公知的，并同樣適用于線粒體和過氧化物酶體。分子靶向的上述機制不僅可與其同族啟動子組合使用，而且也可以與異源啟動子組合使用，從而完成在啟動子的轉錄調節下特異的細胞靶向目標，所述啟動子具有與靶向信號來源的啟動子不同的表達才莫式。C.構建植物轉化栽體可用于植物轉化的大量轉化載體是植物轉化領域的普通技術人員已知的，并且與本發明有關的這些基因可與任何這類載體組合使用。載體的選擇應取決于特異的轉化技術和轉化的靶物種。對某些耙物種而言，不同的抗生素或除草劑選擇標記物可以是特異的。轉化中常規使用的選擇標記物包括賦予卡那霉素和相關抗生素抗性的nptll基因(Messing&Vierra.Gene19:259-268(1982);Be糧等，Nature304:184-187(1983))、賦予除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等，Nucl.AcidsRes18:1062(19卯)，Spencer等，Theor.Appl.Genet79:625-631(19卯))、賦予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger&Diggelmann,MolCellBiol4:2929-2931)、和賦予對甲氨蝶呤(methatrexate)抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBOJ.2(7):1099-1104(1983))、賦予草甘膦抗性的EPSPS基因(美國專利第4，940，935號和第5,188,642號)和提供代謝甘露糖的能力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因(美國專利第5,767,378號和第5,994,629號)。l.適用于農桿菌(Agrobacterium)轉化的載體許多載體可用于4吏用才艮瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的轉化。這些栽體通常帶有至少一個T-DNA邊界序列并包括載體如pBINl9(Bcvan，Nucl.AcidsRes.(1984))。下文描述了適用于農桿菌轉化的兩種典型載體的構建。a.pCIB200和pCIB2001:二元載體pCIB200和pCIB2001用于構建與農桿菌一起使用的重組載體，并以如下方式構建。如下創建pTJS"kan:Narl消化pTJS75(Schmidhauser&Helinski,，1.Bacteriol.164:446-455(1985))，該消化允許切除四環素抗性基因，然后插入來自pUC4K的帶有NPTII的Accl片段(Messing&Vierra，Gene19:259-268(1982):Bevan等，Nature304:184-187(1983):McBride等，PlantMolecularBiology14:266-276(19卯))。將Xhol接頭與PCIB7的EcoRV片段連接，所述EcoRV片段含有左側和右側T-DNA邊界、植物可選擇的nos/nptll嵌合基因和pUC多接頭(Rothstein等，Gene53:153-161(1987))，并將Xhol-消化的片段克隆進SalI-消化的pTJS75kan中，創建pCIB200(也見EP0332104，實施例19)。56pCIB200含有以下的特有多接頭限制性位點EcoRI、Sstl、Kpnl、BglII、Xbal和Sall。pCIB2001是通過向多接頭中插入額外的限制性位點創建的pCIB200的衍生物。pCIB2001多接頭中特有的限制性位點是EcoRI、Ss仏Kpnl、BglII、Xbal、Sall、Mhil、Bcll、AvrII、Apal、Hpal和Stul。除了含有這些特有的限制性位點以外，pCIB2001還具有植物和細菌卡那霉素選擇、用于農桿菌介導的轉化的左側和右側T-DNA邊界、用于在大腸桿菌和其他宿主間流通的來自RK2的trfA功能，且OriT和OriV功能也來自RK2。pCIB2001多接頭適用于克隆含有其自身調節信號的植物表達盒。b.pCIB10及其潮霉素選擇衍生物二元載體pCIB10含有用于在植物中選擇的編碼卡那霉素抗性的基因和T-DNA右側和左側邊界序列，并摻入來自廣泛宿主范圍質粒pRK252的序列，這允許其在大腸桿菌和農桿菌二者中復制。其構建由Rothstein等(Genc53:153-161(1987))描述。構建了pCIB10的多種衍生物，其摻入由Gritz等(Gene25:179-188(1983))所述的潮霉素B磷酸轉移酶基因。這些衍生物使得能夠在只有潮霉素(pCIB743)時，或在潮霉素和卡那霉素(pCIB715，pCIB717)上選擇轉基因植物。2.適用于非農桿菌轉化的載體不使用根瘤農桿菌的轉化繞過了選擇的轉化載體中對T-DNA序列的需要，因此除了如上所述含有T-DNA序列的載體外可使用缺乏這些序列的載體。不依賴于農桿菌的轉化技術包括通過粒子轟擊、原生質體吸收(例如PEG和電穿孔)和顯微注射的轉化。載體的選擇主要取決于對被轉化的物種的特異選擇。下文描述了適用于非農桿菌轉化的典型載體的構建。a.pCIB3064:pCIB3064是適用于直接基因轉移技術的來自pUC的載體，所述直接基因轉移技術與除草劑basta(或膦絲菌素)選擇組合。質粒pCIB246包含與大腸桿菌GUS基因和CaMV35S轉錄終止子有效融合的CaMV35S啟動子，并描述于PCT已7>開的申請WO93/07278中。該載體的35S啟動子在起點5，含有兩條ATG序列。以去除ATG并產生限制性位點Sspl和PvuII的方式使用標準PCR技術突變這些位點。新的限制性位點距離特有的Sail位點96和37bp，并距離真實的起點101和42bp。得到的pCIB246矛汴生物被稱作pCIB3025。然后通過用SalI和SacI消化從pCIB3025中切除GUS基因，使末端變平端并重新連接，產生質粒pCIB3060。質粒pJIT82得自JohnInnesCentre,Norwich,切下含有來自綠色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的bar基因的400bpSmal片段并插入pCIB3060(Thompson等，EMBOJ6:2519-2523(1987))的Hpal位點中。這產生了pCIB3064,其包含處于CaMV35S啟動子和終止子控制下的用于除草劑選擇的bar基因、氨千青霉素抗性基因(用于在大腸桿菌中選擇)和具有特有位點SphI、Pstl、HindIII和BamHI的多接頭。該載體適用于克隆含有其自身調節信號的植物表達盒。b.pSOG19和pSOG35:pSOG35是一種轉化載體，其利用大腸桿菌基因二氫葉酸還原酶(DFR)作為賦予甲氨蝶呤抗性的可選擇標記物。使用PCR擴增35S啟動子、來自玉米Adhl基因的內含子6(-550bp)，和來自pSOG10的18bpGUS非翻譯前導序列。還通過PCR擴增編碼大腸桿菌II型二氫葉酸還原酶基因的250-bp片段，并將這兩條PCR片段用來自pB1221(Clontech)的Sacl-Pstl片段裝配，所述Sacl-Pstl片段包含pUC19載體主鏈和胭脂堿合酶終止子。這些片段的裝配產生pSOG19，其含有與內含子6序列、GUS前導區、DHFR基因和胭脂堿合酶融合的35S啟動子。用來自玉米萎黃病斑點病毒(MCMV)的前導序列替換pSOG19中的GUS前導區，產生載體pS()G35。pSOG19和pSOG35帶有氨芐青霉素抗性的pUC基因，并具有可用于克隆外源物質的HmdIII、Sphl、PstI和EcoRI位點。3.適用于葉綠體轉化的載體為了在植物質體中表達本發明的核苷酸序列，使用質體轉化載體pPH143(WO97/32011，實施例36)。將核苷酸序列插入pPH143中，從而替換PROTOX編碼序列。然后將該栽體用于質體轉化，并選擇具有壯觀霉素抗性的轉化體。或者，將核苷酸序列插入pPH143中，使其替換aadH基因。在該情況下，針對PROTOX抑制劑抗性選擇轉化體。D.轉化一旦本發明的核酸被克隆進表達體系內，將其轉化進植物細胞中。可以通過大量本領域認可的方式將本發明的受體和靶表達盒引入植物細胞中。再生植物的方法也是本領域公知的。例如，Ti質粒載體已用于遞送外源DNA,以及直接DNA吸收、脂質體、電穿孔法、顯微注射和微粒。另外，來自農桿菌屬的細菌可用于轉化植物細胞。下文描述了轉化雙子葉植物和單子葉植物的代表性技術，以及代表性的質體轉化4支術。l.雙子葉植物的轉化雙子葉植物的轉化技術是本領域公知的，并包括基于農桿菌的技術和不需要農桿菌的技術。非農桿菌技術涉及原生質體或細胞對外源遺傳材料的直接吸收。這可通過PEG或電穿孔介導的吸收、粒子轟擊介導的遞送或顯孩i注射完成。這些技術的實例由Paszkowski等，EMBOJ3:2717-2722(1984)、Potrykus等，Mol.Gen,Genet.199:169-177(1985)、Reich等，Biotechnology4:1001-1004(1986)和Klein等，Nature327:70-73(1987)描述。在各情況下，使用本領域已知的標準技術將轉化的細胞再生為整林植物。農桿菌介導的轉化是轉化雙子葉植物的特異技術，因為其轉化的高效率和針對許多不同物種的廣泛實用性。農桿菌轉化通常涉及帶有目的外來DNA的二元載體(例如pCIB200或pCIB2001)到適當農桿菌菌抹的轉移，該轉移可取決于宿主農桿菌菌株(例如對pCIB200和pCIBMOl而言是菌林CIB542(Uknes等，PlantCell5:159-169(1993))在共同存在的Ti質粒或染色體上帶有的vir基因的互補物。通過三親本交配步驟，使用帶有重組二元栽體的大腸桿菌、輔助大腸桿菌菌林完成重組二元載體到農桿菌的轉移，所述助手大腸桿菌菌林包含質粒如pRK2013并能夠將重組二元載體移動至靼農桿菌菌抹。或者，可通過DNA轉化將重組二元栽體轉移至農桿菌(Hiifgen&Willmitzer，Nucl.AcidsRes.16:9877(1988))。59通過重組農桿菌轉化乾植物物種常涉及農桿菌與來自植物的外植體的共同培養，并且遵循本領域公知的方案。在可選擇培養基上再生帶有抗生素或除草劑抗性標記物的轉化的組織，所述標記物存在于二元質粒T-DNA邊界之間。用基因轉化植物細胞的另一途徑涉及在植物組織和細胞中推進惰性或有生物學活性的顆粒。該技術在均屬于Sanford等的美國專利第4,945,050號、第5,036,006號和第5，100，792號中公開。一般地，該步驟涉及在有效穿透細胞外表面并在其內部提供整合的條件下在細胞中推進惰性或生物學活性的顆粒。使用惰性顆粒時，可通過用含有期望基因的載體包裹顆粒而將載體引入細胞中。或者，可用載體包圍靶細胞，使得載體通過顆粒的活躍(wake)被帶入細胞中。也可向植物細胞組織中推進生物學活性顆粒(例如干燥的酵母細胞、干燥的細菌或噬菌體，分別含有想要引入的DNA)。2.單子葉植物的轉化現在大部分單子葉植物物種的轉化也已成為常規。特異的技術包括使用PEG或電穿孔技術將基因直接轉移進入原生質體，和粒子轟擊進入愈傷組織中。轉化可用單個DNA物種或多種DNA物種(即共轉化)進行，這兩種技術均適用于本發明。共轉化可具有下述優點避免完整載體構建和產生下述轉基因植物，所述轉基因植物中目的基因和可選擇標記物是未連鎖的基因座，使得能夠在隨后的世代中去除可選擇標記物，這被認為是期望的。然而，使用共轉化的缺點是獨立的DNA物種被整合進基因組中的頻率低于100。/。(Schocher等，Biotechnology4:1093-1096(1986))。專利申請EP0292435、EP0392225和WO93/07278描述了從玉米的良種自交系(eliteinbredline)制備愈傷組織和原生質體、使用PEG或電穿孔轉化原生質體，和從轉化的原生質體再生玉米植物的技術。Gordon-Kamm等，(PlantCell2:603-618(1990))和Fromm等，(Biotechnology8:833-839(1990))已公開了使用粒子轟擊轉化來自A188-的玉米才朱系的技術。另夕卜，WO93/07278和Koziel等，(Biotechnology11:194-200(1993))描述了通過粒子轟擊轉化玉米良種自交系的技術。該技術利用在授粉后天從玉米穗中切下的1.5-2.5mm長的未成熟玉米胚和Pl)S-1000He生物射彈設備用于轟擊。稻的轉化也可利用原生質體或粒子轟擊通過直接基因轉移技術進行。已針對Japonica-型和Indica-型描述了原生質體介導的轉化(Zhang等，PlantCellRep7:379-384(1988);Shimamoto等，Nature338:274-277(1989);Datta等，Biotechnology8:736-740(19卯))。這兩種類型常規地也可使用粒子轟擊轉化(Christou等，Biotechnology9:957-962(1991))。另夕卜，WO93/21335描述了通過電穿孔轉化稻的技術。專利申請EP0332581描述了用于生產、轉化和再生早熟禾亞科(Pooideae)原生質體的技術。這些技術允許轉化鴨茅屬(Dactylis)和小麥。另夕卜，Vasil等(Biotechnology10:667-674(1992))已描述了使用粒子轟擊進C型長期可再生愈傷組織中的小麥轉化，Vasil等(Biotechnology11:1553-1558(1993))和Weeks等(PlantPhysiol.102:1077-1084(1993))還描述了使用粒子轟擊未成熟胚和來自未成熟胚的愈傷組織的小麥轉化。然而，用于小麥轉化的特異技術涉及通過粒子轟擊未成熟胚轉化小麥，并且在基因遞送之前包括高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊之前，將任何數量的胚(長度為0.75-1mm)涂布于含3。/。蔗糖(Murashiga&Skoog，PhysiologiaPlantarum15:473-497(1962))和3mg/12,4-D的MS培養基上用于誘導體細胞胚，這允許在暗中繼續。在選擇的轟擊日，將胚從誘導培養基上取下并置于滲壓劑(即以期望濃度添加蔗糖或麥芽糖的誘導培養基，所述期望濃度通常為15。/。)上。允許胚質壁分離2-3小時，然后進行轟擊。典型的是每個耙平板二十個胚，盡管不是必須的。使用標準步驟將帶有適當基因的質粒(如pCIB3064或pSG35)沉淀在微米大小的金顆粒上。使用~1000psi的爆發壓，使用標準80篩目，用DuPontBiolistics⑧氦設備轟擊各個胚平板。在轟擊后，將胚放置回暗中并恢復約24小時(仍然在滲壓劑上)。24小時后，將胚從滲壓劑上取出并;^文回誘導培養基上，在那里保持一個月后再生。約一個月后，將具有發育中胚胎發生愈傷組織的胚外植體轉移至再生培養基(MS+1mg/升NAA,5mg/升GA)，所述再生培養基還含有適當的選擇劑(在pCIB3064的情況下為10mg/1basta，在pSOG35的情況下為2mg/1曱氨蝶呤)。約一個月后，將發育的莖轉移至已知為"GA7s"的更大無菌容器中，所述容器含有半濃度MS、2。/。蔗糖和相同濃度的選擇劑。還描述了使用農桿菌對單子葉植物的轉化。見WO94/00977和美國專利第5,591,616號，均引入本文作為參考。還參見Negrotto等，PlantCellReports19:798-803(2000)，其引入本文作為參考。對該實例而言，使用稻(Oryzasativa)產生轉基因植物。可使用多種稻栽培種(Hiei等，1994，PlantJournal6:271-282;Dong等，1996，MolecularBreeding2:267-276;Hiei等，1997，PlantMolecularBiology,35:205-218)。另外，下文所述的多種培養基組分可在數量上變化或被取代。通過在MS-CIM培養基(MS基礎鹽，4.3g/升；B5維生素(200x)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/升；酪蛋白水解產物，300mg/升；2，4-D(1mg/ml)，2m1/升；用1NKOH調節pH至5.8;Phytagel,3g/升)上起始胚胎發生應答和/或從成熟的胚建立培養物。接種培養物應答起始階段的成熟胚或確立的培養物林系，并與含有期望的栽體構建體的根瘤農桿菌菌林LBA4404(農桿菌屬)共同培養。在28。C將來自于甘油儲存液的農桿菌在固體YPC培養基(100mg/L壯觀霉素和任何其他適當的抗生素)上培養2天。將農桿菌重懸于液體MS-CIM培養基中。將農桿菌培養物稀釋至OD600為0.2-0.3并添加乙酰丁香酮至200fiM的終濃度。在溶液與稻培養物混合之前添加乙酰丁香酮，以誘導農桿菌將DNA轉移至植物細胞。為了接種，將植物培養物浸入細菌懸浮液中。去除液體細菌懸浮液，將接種的培養物置于共同培養培養基上并在22。C孵育兩天。然后將培養物轉移至含替卡西林(400mg/升)的MS-CIM培養基上以抑制農桿菌的生長。對使用PMI可選擇標記物基因的構建體(Reed等，InVitroCell.Dev.Biol.-Plant37:127-132)而言，在7天后將培養物轉移至含甘露糖作為糖類來源的選擇培養基(含2。/。甘露糖、300mg/升替卡西林的MS),并在暗中培養34周。然后將抗性菌落轉移至再生誘導培養基(不含2，4-D，含0.5mg/升IAA、1mg/升玉米素、200mg/升特美汀、2。/。甘露糖和3%山梨糖醇的MS)，并62在暗中培養14天。然后將增殖的菌落轉移至另一輪再生誘導培養基，并移至光照培養室。將再生的莖轉移至含GA7-1培養基(不含激素并含有2%山梨糖醇的MS)的GA7容器中保持2周，然后當它們足夠大并具有足夠的根時移至溫室。將植物在溫室中移植至土壤(T0世代)，生長至成熟，并收獲T1種子。3.質體的轉化將珊西煙(Nicotianatabacumc.v.'Xanthinc，)的種子在T瓊脂培養基上以l，，的環形陣列每盤七粒播種在T瓊脂培養基上，并在播種后12-14天用1^im鴒顆粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轟擊，所述顆粒如(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS卯，913—917)所述主要用來自質粒pPH143和pPH145的I)NA包裹。將轟擊的幼苗在T培養基上孵育兩天，之后切下葉，并遠軸向上置于光明中(350-500pmol光子/m2/s)含500照/ml鹽酸壯觀霉素(Sigma，St.Louis,MO)的RMOP培養基平板上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(19卯)PNAS87，8526—8530)。將轟擊后三到八周在漂白的葉下出現的抗性莖亞克隆至相同的選擇培養基上，允許形成愈傷組織，并對次生莖進行分離和亞克隆。通過Southern印跡的標準才支術(Sambrook等，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor)評價獨立的亞克隆中轉化的質體基因組拷貝(同質性)的完全分離。在1%Tris-硼酸鹽(TBE)瓊脂糖凝膠上分離BamHI/EcoRI-消化的總細胞DNA(Mettler，I.J.(1987)PlantMolBiolReporter5，346"349)，轉移至尼龍膜(Amersham)并用3￥-標記的隨機引物DNA序列作為探針檢測，該序列對應于0.7kbBamHI/HindlllDNA片段，所述片段來自含有部分rps7/12質體靶向序列的pC8。使同質性莖在含壯觀霉素的MS/IBA培養基(McBride，K.E.等，(1994)PNAS91，7301-7305)上無菌生根，并轉移至溫室。V.育種和種子產生A.育種通過用本發明的核酸序列轉化獲得的植物可以是大量植物物種中任一，包括單子葉植物和雙子葉植物；然而，本發明方法中使用的植物特別地選自上文公開的具有農業重要性的靶作物。本發明基因的表達與具有生產和品質重要性的其他特征組合，可通過育種整合進植物中。育種方法和技術是本領域已知的。參見例如Welsh丄R.，FundamentalsofPlantGeneticsandBreeding,JohnWiley&Sons,NY(1981》CropBreeding,WoodD.R.(編著)AmericanSocietyofAgronomyMadison,Wisconsin(1983》MayoO.，TheTheoryofPlantBreeding,第二版，Clarendon出版，Oxford(1987);Singh,D.P"BreedingforResistancetoDiseasesandInsectPests,Springer-Verlag，NY(1986);和Wricke和Weber，QuantitativeGeneticsandSelectionPlantBreeding,WalterdeGruyter和Co.,Berlin(1986)。操作進入上述轉基因種子和植物中的遺傳特性通過有性生殖或營養生長傳遞，并因此可在后代植物中保留和繁殖。一般地，所述保留和繁殖利用被開發為適應特定目的的已知農業方法，例如耕耘、播種或收獲。也可以使用專門化的方法如水培法或溫室技術。因為生長中的作物容易受到由昆蟲或感染引起的攻擊和損傷以及與雜草植物的竟爭，所以采取手段控制雜草、植物疾病、昆蟲、線蟲和其他不利條件以提高產量。這些包括機械手段如耕耘土i裏或去除雜草和感染的植物，以及應用農藥如除草劑、殺真菌劑、殺配子劑、殺線蟲劑、生長調節劑、熟化劑和殺昆蟲劑。在植物育種中可進一步利用轉基因植物和根據本發明的種子的有利遺傳特性，其目的在于開發具有改良的特性的植物，所述改良特性例如對害蟲、除草劑或脅迫的耐受，改進的營養價值，提高的產量，或引起更少倒伏或落粒損失的改良的結構。多種育種步驟由明確確定的人為介入表征，例如選擇待雜交的林系、指導親M系的傳粉、或選擇適當的后代植物。根據期望的特性，采取不同的育種手段。相關技術是本領域公知的，包括但不僅限于雜交、近交、回交育種、多林系育種(multilinebreeding)、變種摻合(varietyblend)、種間雜交、非整倍體技術等等。雜交技術還包括通過機械、化學或生物化學手段對植物不育化，產生雄性或雌性不育植物。用64不同林系的花粉對雄性不育植物異花傳粉確保雄性不育但雌性能育植物的基因組會均一地獲得兩種親a系的特性。因此，根據本發明的轉基因種子和植物可用于改良的植物林系育種，例如提高常規方法如除草劑或殺蟲劑處理的有效性，或允許植物由于其修飾的遺傳特性而進行所述方法。或者，可獲得具有改進的脅迫耐受的新作物，其由于最優化的遺傳"裝置"產生收獲的產物，該產物比不能耐受同等不利發育條件的產物具有更好的品質。B.種子生產在種子生產中，萌發品質和種子的均一性是關鍵的產物特征。因為難以使作物不含其他作物和雜草的種子，所以為了控制種子帶有的疾病和生產具有良好萌發的種子，在培育、調節(conditioning)和銷售純凈種子領域有經驗的種子生產者開發了相當廣泛和明確定義的種子生產實踐。因此對農民而言，購買滿足特定品質標準的經過^r驗的種子而不是使用從其自己作物收獲的種子是常見的實踐。作為種子使用的繁殖材料通常用防護涂層處理，所述防護涂層包含除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或其混合物。通常使用的保護性涂層包含化合物如環己烯亞胺、萎銹靈(carboxin)、塞侖(TMTD^))、methalaxyl(Apron6)和甲基嘧咬磷(Actdlic6)。如果期望的話，將這些化合物與制劑領域常用的其他運載體、表面活性劑或促進應用的佐劑一起配制，提供針對細菌、真菌或動物害蟲引起的損傷的保護。可通過用液體制劑浸漬遺傳材料，或通過用組合的濕或干制劑涂布來應用保護性涂層。其他應用方法如在芽或果實處定向處理也是可能的。VI.改變核酸分子的表達以如下途徑之一實現本發明核酸分子表達的改變A."有義"阻抑通過"有義，，阻抑獲得本發明核苷酸序列表達的改變，特別是其表達的降低(參考例如Jorgensen等，(1996)PlantMol，Biol.31,957-973)。在該情況下，本發明核苷酸序列的整體或部分包含在DNA分子中。該DNA分子與在包含耙基因的細胞(特別是植物細胞)中有功能的啟動子特異地有效連接，并被引入該細胞，其中該核苷酸序列可表達。核苷酸序列以"有義方向"插入DNA分子中，這意味著核苷酸序列的編碼鏈可以被轉錄。在一個特別的實施方案中，核苷酸序列是可完全翻譯的，且核苷酸序列中包含的所有遺傳信息或其部分被翻譯為多肽。在另一特別的實施方案中，核普酸序列是可部分翻譯的，并且翻譯了一條短肽。在一個特別的實施方案中，這通過在核苷酸序列中插入至少一個過早的終止密碼子實現，所述終止密碼子使翻譯停止。在另一個更特別的實施方案中，核苷酸序列被轉錄，但是未產生翻譯產物。這通常通過去除核苷酸序列編碼的多肽的起始密碼子例如"ATG"實現。在一個更特別的實施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子被穩定整合在植物細胞的基因組中。在另一特別的實施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子包含在染色體外復制分子中。在含有上段所述DNA分子之一的轉基因植物中，對應于DNA分子中包含的核苷酸序列的核苷酸序列的表達被特異降低。特別地，DNA分子中的核苷酸序列與其表達被降低的核苷酸序列至少70%相同，更特別地至少8()%相同，還更特別地至少卯％相同，還更特別地至少95%相同，還更特別地至少99%相同。B."反義"阻抑在另一特別的實施方案中，通過"反義"阻抑獲得發明核苷酸序列表達的改變，特別是其表達的降低。本發明核苷酸序列的整體或部分包含在I)NA分子中。該DNA分子與在植物細胞中有功能的啟動子特異地有效連接，并被引入該細胞，其中該核苷酸序列可表達。核苷酸序列以"反義方向，，插入DNA分子中，這意味著核苷酸序列的反向互補物(有時也稱作非編碼鏈)可以被轉錄。在一個特別的實施方案中，包含核苷酸序列或其部分的I)NA分子被穩定整合在植物細胞的基因組中。在另一特別的實施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子包含在染色體外復制分子中。引用了描述該途徑的若千出版物用于進一步闡述(Green,P.J.等，Arm.Rev.Biochem.55:569-597(1986);vanderKrol，A.R.等，AntisenseNuc.Acids&Proteins,第125-141頁(1991);Abd，P.P.等，PNASroc.Natl.Acad.Sci.USA86:6949-6952(1989);Ecker，丄R.等，Proc.Natl.Acad.Sci,USANAS83:5372-5376(1986年8月))。在含有上段所述DNA分子之一的轉基因植物中，對應于DNA分子中包含的核苷酸序列的核苷酸序列的表達被特異降低。特別地，DNA分子中的核苷酸序列與其表達被降低的核苷酸序列至少70%相同，更特別地至少80%相同，還更特別地至少90%相同，還更特別地至少95%相同，還更特別地至少99%相同。C.同源重組在另一特別的實施方案中，通過同源重組在基因組中修飾了對應于本發明核苷,列的至少一個基因組拷貝，所述同源重組如Paszkowski等，EMBOJournal7:4021-26(1988)中所進一步闡述的。該技術利用同源序列的下述特性識別;f皮此并通過本領域已知為同源重組的過程互相交換核苷列。同源重組可在細胞中核苷*列的染色體拷貝和通過轉化？1入細胞的核苷^列的進入拷貝之間發生。特異的修飾因此被精確地引入核苷酸序列的染色體拷貝中。在一個實施方案中，修飾了本發明核苷酸序列的調節元件。這類調節元件可通過使用本發明核苷酸序列或其部分作為探針篩選基因組文庫容易地獲得。現存的調節元件被不同的調節元件代替從而改變核苦酸序列的表達，或其被突變或缺失從而消除核苷酸序列的表達。在另一實施方案中，通過缺失部分核苷酸序列或整體核苷酸序列或通過突變修飾核苷酸序列。本發明還涉及突變的多肽在植物細胞中的表達。已描述了對破壞內源植物基因的這些技術更近期的改進(Kempin等，Nature389:802-803(1997)，以及Miao和Lam，PlantJ.，7:359-365(1995)。在另一特別的實施方案中，通過用嵌合寡核苷酸轉化細胞在核苷^列的染色體拷貝中引入突變，所述嵌合寡核苷酸由雙鏈體構型的一段連續的RNA和DNA殘基組成，其末端上帶有雙重發夾帽。寡核苷酸的另一特性是例如RNA殘基處2，-O-甲基化的存在。RNA/DNA序列被設計為與本發明核苷酸序列的染色體拷貝序列排列在一條鏈上(align),并含有期望的核苷酸改變。例如，該4支術在美國專利5,501,967和Zhu等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8768-8773中進一步闡述。D.核酶在另一實施方案中，用對編碼本發明多肽的RNA特異的催化性RNA或核酶切割編碼本發明多肽的RNA。核酶在轉基因植物中表達并導致植物細胞中編碼本發明多肽的RNA數量減少，從而導致細胞中累積的多肽數量減少。該方法在美國專利4,987,071中進一步闡述。E.顯性失活突變體在另一特別的實施方案中，改變了本發明核苷酸序列編碼的多肽活性。這通過在轉基因植物中表達蛋白質的顯性失活突變體導致內源蛋白質活性喪失來實現。F.適體在又一實施方案中，通過在轉基因植物中表達與蛋白質特異結合的核酸配體(即所謂的適體)抑制本發明多肽的活性。優選地通過SELEX(通過指數式富集法對配體的系統性進化)方法獲得適體。在SELEX方法中，具有隨機化序列區域的單鏈核酸的候選混合物與蛋白質接觸，并從候選混合物的剩余部分分離對靶具有提高的親和力的那些核酸。擴增分離的核酸產生富含配體的混合物。若干次重復后獲得對多肽具有最優親和力的核酸，并用于在轉基因植物中表達。該方法在美國專利5,270,163中進一步闡述。G.鋅指蛋白也使用與本發明核苷酸序列或其調節區結合的鋅指蛋白改變核苷#列的表達。特別地，核苷酸序列的轉錄被降低或提高。鋅指蛋白例如描述于Beerli等，(1998)PNAS95:14628-14633.中或WO95/19431、WO98/54311或WO96/06166中，所述文獻均通過參考整體并入本文。H.dsRNA還通過如例如WO99/32619、WO99/53050或WO99/61631中所述的dsRNA干擾獲得本發明核苷酸序列表達的改變，所述文獻均通過參考整體并入本文。在另一特別的實施方案中，通過雙鏈RNA(dsRNA)干擾獲得本發明核苷酸序列表達的改變，特別是表達的降低。本發明核苷酸序列的整體，特別是其部分包含在DNA分子中。該DNA分子的大小特別地為100到1000個核苷酸或更多；最佳大小可根據經驗確定。同一DNA分子的兩個拷貝是連接的，由間隔DNA分子隔開，使得第一拷貝和第二拷貝處于相反的方向。在特別的實施方案中，DNA分子的第一拷貝M向互補物(也已知為非編碼鏈)，第二拷貝是編碼鏈；在最特別的實施方案中，第一拷貝是編碼鏈，第二拷貝是反向互補物。間隔DNA分子的大小特別地為200到10,000個核苷酸，更特別地為400到5000個核苷酸，最特別地為600到1500個核苷酸長。間隔特別地是DNA的隨機片段，更特別地是與dsRNA干擾的靼生物無同源性的DNA隨機片段，最特別地是被靶生物有效剪接的功能性內含子。被間隔分開的DNA分子的兩個拷貝與在植物細胞中有功能的啟動子有效連接，并被引入植物細胞中，核苷酸序列可在該細胞中表達。在一個特別的實施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子被穩定整合進植物細胞的基因組中。在另一特別的實施方案中，包含核苷酸序列或其部分的DNA分子包含在染色體外復制的分子中。引用了描述該方法的若干出版物用于進一步闡述(Waterhouse等，(l998)PNAS95:13959-13964;Chuang和Meyerowitz(2000)PNAS97:4985-4990;Smith等，(2000)Nature407:319-320)。通過dsRNA干擾改變核苷酸序列的表達還描述于例如WO99/32619、WO99/53050或WO99/61631中，其均通過參考整體并入本文。在含有上段所述DNA分子之一的轉基因植物中，對應于DNA分子中包含的核苷酸序列的核苷酸序列的表達被特異降低。特別地，DNA分子中的核苷酸序列與其表達被降低的核苷酸序列至少70%相同，更特別地至少80%相同，還更特別地至少卯。/。相同，還更特別地至少95%相同，還更特別地至少99%相同。I.插入DNA分子(插入誘變)在另一特別的實施方案中，DNA分子^L插入本發明核苷酸序列的染色69體拷貝或其調節區中。特別地，這類DNA分子包含能夠在植物細胞中轉錄的轉座元件，例如Ac/Ds、Em/Spm、突變子(mutator)。或者，DNA分子包含農桿菌T-DNA的T-DNA邊界。T-DNA分子也可包含重組酶或整合酶識別位點，該位點可用于從植物細胞的染色體去除DNA分子的部分。也包括使用T-DNA、轉座子、寡核苷酸的插入誘變方法或本領域技術人員已知的其他方法。使用T-DNA和轉座子用于插入誘變的方法描述于Winklcr等，(1989)MethodsMol.Biol.82:129-136和Martienssen(1998)PNAS95:2021-2026中，其通過參考整體并入本文。丄缺失誘變在另一實施方案中，通過缺失核苷酸序列或調節序列的一部分，在細胞或植物中序列的基因組拷貝中創建本發明核酸分子的突變。缺失誘變的方法是本領域技術人員已知的。參見例如Miao等，(1995)PlantJ.7:359。在另一實施方案中，通過化學誘變或輻射在大的植物群體中隨機產生缺失，并通過正求或反求遺傳學分離在本發明的基因中具有缺失的植物。已知用快中子或y射線輻照引起植物中的缺失突變(Silverstone等，(19卵)PlantCdl，10:155-169;Bruggemann等，(1996)PlantJ"10:755-760;Redei和Koncz，在MethodsinArabidopsisResearch,WorldScientific出版(1992)，第16-82頁)。如在秀麗新小桿線蟲(C.elegans)中所示(Liu等，(1999)，GenomeResearch,9:859-867.)，可使用PCR在反求遺傳學策略中恢復本發明基因中的缺失突變，所述PCR使用合并的基因組DNA集合。正求遺傳學策略應涉M示PTGS的林系的誘變，隨后針對PTGS的缺失篩選M2后代。可期望這些突變體中的一些破壞了本發明的基因。這可通過針對本發明基因的Southern印跡或PCR，用來自這些突變體的基因組DNA進行評價。K.在植物細胞中超量表達在另一特別的實施方案中，本發明的編碼多肽的核苷酸序列^^量表達。用于超量表達本發明核酸分子的核酸分子和表達盒的實例在上文描述。本發明還包括本領域技術人員已知用于超量表達核酸分子的方法。70在一個特別的實施方案中，在植物的每個細胞中改變了本發明核苷酸序列的表達。這例如通過同源重組或通過在染色體中插入獲得。也可通過例如在下述啟動子的控制下表達有義或反義RNA、鋅指蛋白或核酶獲得，所述啟動子能夠在植物的每個細胞中表達有義或反義RNA、鋅指蛋白或核酶。組成型表達，誘導性、組織特異性或發育調節性表達也在本發明的范圍內，并導致本發明的核苷酸序列在植物細胞中表達的組成型、誘導性、組織特異性或發育調節性改變。根據本發明的教導(例如如下文所述)制備下述構建體并轉化進植物細胞中，所述構建體用于表達有義或反義RNA、鋅指蛋白或核酶，或用于超量表達本發明的核苦酸序列。VII.多肽本發明還涉及包含氨基斷列SEQIDNO:2、4、6、8、IO的分離的多肽。具體地，本發明涉及包含氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、8、10的分離的多肽和具有保守氨基酸修飾的變體。本領域技術人員會明白，對核酸、肽、多肽或蛋白質序列的各個取代、缺失或添加(其改變、添加或缺失編碼的序列中單個氨基酸或小比例的氨基酸)是"保守修飾"，所述修飾導致用化學上類似的氨基酸取代氨基酸。保守修飾的變體提供與未經修飾的多肽相似的生物學活性。列出功能類似的氨基酸的保守取代的表格是本4頁i或已知的。參見Crighton(1984)Proteins,W.H.FreemanandC()mpany。在一個特別的實施方案中，與多肽序列SEQIDNO:2具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽序列的等位變體，包括多肽序列SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10或其外顯子或結構域。在另一特別的實施方案中，與SEQIDNO:2所示多肽序列具有基本相似性的多肽或其外顯子或結構域，是SEQIDNO:2所示多肽序列的天然存在的變體。在另一特別的實施方案中，與SEQIDNO:2所示多肽序列具有基本相似性的多肽或其外顯子或結構域，是SEQIDNO:2所示多肽序列的多態變體。在另一特別的實施方案中，具有基本相似性的序列含有至少一個氨基酸的缺失或插入。在一個更特別的實施方案中缺失或插入為少于約10個氨基酸。在一個最特別的實施方案中，缺失或插入為少于約三個氨基酸。在一個特別的實施方案中，具有-基本相似性的序列編碼至少一個氨基酸處的取代。在另一特別的實施方案中，具有基本相似性的多肽是SEQIDNO:2所示多肽序列或其片段、結構域、重復或嵌合體的等位變體。在另一特別的實施方案中，分離的核酸包含來自下述核苷酸序列編碼的多肽序列的大量區域，所述核苷酸序列與SEQIDNO:l所示核普酸序列或其片段或結構域或與之互補的序列相同或具有基本相似性。在另一特別的實施方案中，多肽是SEQIDNO:2所示多肽。在另一特別的實施方案中，多肽是功能性片段或結構域。在另一特別的實施方案中，多肽是嵌合體，其中該嵌合體可包含功能性蛋白質結構域(包括結構域、重復、翻譯后修飾位點)或其他特征。在一個更特別的實施方案中，多肽是植物多肽。在一個更特別的實施方案中，植物是雙子葉植物。在一個更特別的實施方案中，植物是棵子植物。在一個更特別的實施方案中，植物是單子葉植物。在一個更特別的實施方案中，該單子葉植物是谷物。在一個更特別的實施方案中，谷物可以是例如玉米、小麥、大麥、燕麥、棵麥、栗、高粱、黑小麥、黑麥、單粒小麥、斯佩耳特小麥、雙粒小麥、畫眉草、蜀黍、亞麻、格蘭馬草、磨擦草屬物種和類蜀粟。在另一特別的實施方案中，谷物是稻。在一個特別的實施方案中，多肽在植物的特異位點或組織中表達。在一個更特別的實施方案中，該位點或組織為例如但不限于表皮、維管組織、分生組織、形成層、皮層或髓。在一個最特別的實施方案中，該位點或組織為葉或鞘、根、花和發育中的胚珠或種子。在一個更特別的實施方案中，該位點或組織可以是例如表皮、根、維管組織、分生組織、形成層、皮層、髓、葉和花。在一個更特別的實施方案中，該位點或組織為種子。在一個特別的實施方案中，由下述核苷酸序列編碼的多肽序列是SEQII)NO:l所示核苷酸序列的突變體并包含至少一個核苷酸的取代、缺失或72插入，所述核苷酸序列與SEQIDNO:l所示核苷酸序列具有基本相似性，包括核苷齡列SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9或其片段或結構域或與之互補的序列。在一個更特別的實施方案中，缺失或插入少于約三十個核苷酸。在一個最特別的實施方案中，缺失或插入少于約五個核苷酸。在一個特別的實施方案中，由下述核苷酸序列編碼的多肽序列包含至少一個密碼子的取代，所述核苷酸序列與SEQIDNO:l、3、5、7、9所示核苷酸序列或其片段或結構域或與之互補的序列具有基本的相似性。在一個更特別的實施方案中，該取代是保守的。在一個特別的實施方案中，與SEQII)NO:2所示多肽序列或其片段、結構域、重復或嵌合體具有基本相似性的多肽序列包含至少一個氨基酸的取代、缺失或插入。本發明的多肽、其片段或變體可包含來自本發明多肽的任何數量的連續氨基酸殘基，其中所述殘基數量選自由10到本發明全長多肽的殘基數組成的整數組。特別地，多肽的部分或片段是功能性蛋白質。本發明包括下述活性多肽，其具有天然(非合成的)內源多肽比活性的至少20%、30%或40%，特別地至少50%、60%或70%,最特別地至少80%、卯％或95%。另夕卜，底物特異性(kcat/Km)任選地與天然(非合成的)的內源多肽基本相似。通常，Km會是天然內源多肽的至少30%、40%或50%;更特別地是至少60%、70%、80%或卯％。測定和定量測定活性和底物特異性的方法是本領域技術人員公知的。作為免疫原存在時，本發明的分離的多肽會引發與本發明多肽特異反應的抗體的生產。因此，為了例如但不僅限于免疫測定或蛋白質純化技術的目的，本發明的多肽可用作免疫原，用于構建與本發明的蛋白質免疫反應的抗體。測定結合的免疫測定法是本領域技術人員公知的，例如但不僅限于ELISA或竟爭性免疫測定法。本發明的實施方案還涉及由^^開內容的分離的核酸分子編碼的嵌合多肽，其包括含有由下述分離的核酸編碼的多肽序列的嵌合多肽，所述分離的核酸含有下述核苷酸序列，其包括(a)如SEQIDNO:l、3、5、7、9所示的核普酸序列或其外顯子或結構域，(b)與(a)具有基本相似性的核苷酸序列；(c)能夠與(a)雜交的核苷酸序列；(d)與(a)、(b)或(c)互補的核苷酸序列；或(e)是(a)、(b)或(c)的反向互補物的核苷酸序列；或(f)其功能性片段。含有由分離的核酸編碼的多肽序列的多肽，所述核酸含有編碼下述多肽的核苷M列、其互補物或其反向互補物，所述多肽包含下述多肽序列(a)SEQIDNO:2所示的多肽序列，或其結構域、重復或嵌合體；(b)與(a)具有基本相似性的多肽序列，包括SEQIDNO:4、SEQIDN():6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:IO所示的多肽序列；(c)由下述核苷酸序列編碼的多肽序列，所述核苷酸序列與SEQIDN():l、3、5、7、9所示核苷酸序列或其外顯子或結構域或與之互補的序列相同或具有基本的相似性；(d)由下述核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在中等嚴格條件下能夠與SEQIDNO:l、3、5、7、9所示核苷酸序列或與之互補的序列雜交；和(a)、(b)、(c)或(d)的功能性片段；或(c)其功能性片段。本發明的分離的核酸分子適用于在重組改造的細胞如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物或植物細胞中表達本發明的多肽。該細胞在非天然條件(例如數量、組成、定位和/或時間)下產生多肽，因為其4皮遺傳改變為如此。本領域技術人員知道可用于表達編碼本發明蛋白質的核酸的大量表達體系，并且不在下文中詳細描述這些體系。簡言之，通常例如通過將核酸或eDNA與啟動子(組成型或可調節的)有效連接，然后整合M達載體中實現編碼本發明的多肽的分離的核酸的表達。載體適用于在原核生物或真核生物任一中復制和/或整合。常用的表達載體包含轉錄和翻譯終止子、起始序列和用于調節編碼多肽的核酸分子表達的啟動子。為了獲得所克隆的核酸分子的高水平表達，期望使用指導轉錄的包含強啟動子、用于翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄/翻譯終止子的表達栽體。本領域技術人員應當明白可對本發明的多肽進行修飾而不減小其生物學活性。可進行一些修飾來利于本發明多肽的克隆、表達或進入融合蛋白的整合。此類修飾是本領域公知的，并包括但不僅限于在氨基端添加以提供起始位點的甲硫氨酸，或置于任一末端以創建方便定位純化序列的額外氨基酸(例如多聚組氨酸)。也可向載體中引入限制性位點或終止密碼子。在一個特別的實施方案中，表達載體包含一個或多個元件，例如但不限于啟動子增強子序列、選擇標記物序列、復制起點、表位標簽編碼序列，或親和純化標簽編碼序列。在一個更特別的實施方案中，啟動子增強子序列可以是例如CaMV35S啟動子、CaMV19S啟動子、煙草PR-la啟動子、遍在蛋白啟動子和菜豆蛋白啟動子。在另一實施方案中，啟動子可在植物中工作，更特別地為組成型或誘導性啟動子。在另一特別的實施方案中，選擇標記物序列編碼抗生素抗性基因。在另一特別的實施方案中，表位標簽序列編碼V5、肽Phe-His-His-Thr-Thr、血凝素或谷胱甘肽-S-轉移酶。在另一特別的實施方案中，親和純化標簽序列編碼多聚氨基酸序列或多肽。在一個更特別的實施方案中，多聚氨基酸序列為多聚組氨酸。在一個更特別的實施方案中，多肽是殼多糖結合結構域或谷胱甘肽-S-轉移酶。在一個更特別的實施方案中，親和純化標簽序列包含內含肽編碼序列。可使用原核細胞作為宿主細胞，例如但不僅限于大腸桿菌和本領域已知的其他微生物菌抹。用于在原核生物中表達蛋白質的方法是本領域技術人員公知的，并可見于許多實驗室手冊如MolecularCloning:ALaboratoryManual,丄Sambrook等，(1989，ColdSpringHarborLaboratory出版)中。本領域技術人員可獲得大量控制表達的啟動子、核糖體結合位點和操縱子，也可獲得可選擇標記物如抗生素抗性基因。選擇的載體類型是為了允許最佳生長和在選定的細胞類型中表達。可獲得大量真核生物表達體系，例如但不僅限于酵母、昆蟲細胞系、植物細胞和哺乳動物細胞。異源蛋白質在酵母中的表達和合成是^^知的(見Sherman等，MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratory出版，1982)。廣泛用于產生真核生物蛋白質的常用酵母菌林是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)，并且可從商業供應商(例如Invitrogen)獲得用于表達的載體、菌林和方案。可用用于產生蛋白質的表達載體轉染哺乳動物細胞體系。本領域技術人員可獲得許多合適的宿主細胞系，例如但不限于HEK293、BHK21和CH()細胞系。用于這些細胞的表達載體可包含表達控制序列如復制起點、啟動子(例如CMV啟動子、HSVtk啟動子或磷酸甘油酸酯激酶(pgk)啟動子)、增強子和蛋白質加工位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸化位點和轉錄終止序列。適用于產生蛋白質的其他動物細胞系可商業獲得或來自保藏機構如美國典型培養物保藏中心。用于在昆蟲細胞中表達蛋白質的表達載體通常來自SF9桿狀病毒或本領域已知的其他病毒。可獲得大量合適的昆蟲細胞系，包括但不僅限于蚊幼蟲、蠶、黏蟲(armyworm)、蛾和果蠅(Drosophila)細胞系。轉染動物和低等真核細胞的方法是已知的。使用大量方法制備真核細胞感受態以引入DNA，所述方法包括但不僅限于磷酸4丐沉淀、受體細胞與含有DNA的細菌原生質體的融合、用含有DNA的脂質體處理受體細胞、l)EAE糊精、電穿孔、生物射彈和將DNA直接顯微注射進細胞中。轉化的細胞使用本領域公知的手段培養(參見Kuchler，R.J"BiochemicalMethodsinCellCultureandVirology,l)owden，HutchinsonandRoss,Inc.1997)。一旦本發明的多肽被表達，可使用本領域技術人員已知的方法將其從細胞中分離和純化。可使用Western印跡技術或放射免疫測定或其他標準的免疫測定4支術監測純化過程。蛋白質純化技術是本領域技術人員公知和4吏用的(參見R.Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag，NewYork1982:Deutscher，GuidetoProteinPurification,Academic出版(19卯))。本發明的實施方案提供了產生重組蛋白質的方法，其中表達載體包含一個或多個元件，包括啟動子增強子序列、選擇標記物序列、復制起點、表位標簽編碼序列，和親和純化標簽編碼序列。在一個特別的實施方案中，核酸構建體包含表位標簽編碼序列，且分離步驟包括使用對該表位標簽特異的抗體。在另一特別的實施方案中，核酸構建體含有多聚氨基酸編碼序列，且分離步驟包括使用包含多聚氨基酸結合物質的樹脂，特別是多聚氨基酸為多聚組氨酸且多聚氨基酸結合樹脂為鎳-帶電瓊脂糖樹脂。在另一特別的實施方案中，核酸構建體含有多肽編碼序列，且分離步驟包括使用含多肽結合物質的樹脂，特別是多肽為殼多糖結合結構域且樹脂含有殼多糖-瓊脂糖凝膠。本發明的多肽可以使用本領域技術人員已知的非細胞合成方法合成。用于固相合成的才支術由Barany和Mayfield，Solid-PhasePeptideSynthesis,在Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第2巻第3-284頁，SpecialMethodsinPeptideSynthesis,PartA;Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.85:2149-56(1963)和Stewart等，SolidPhaseP印tideSynthesis,第二版，PierceChem.Co.,Rockford，IL(1984)描述。本發明還提供了修飾(即提高或降低)植物或其部分中本發明多肽的濃度或組成的方法。修飾可通過提高或降低植物中的濃度和/或組成(即本發明多肽的比例)實現。該方法包括向植物細胞中引入表達盒以獲得轉化的植物細胞或組織，并培養轉化的植物細胞或組織，所述表達盒含有本發明的核酸分子，或編碼如上所述SEQIDNO:l、3、5、7、9的序列的核酸。核酸分子可處于組成型或誘導性啟動子的調節下。該方法還可括以足夠修物中的表達。的植物或植物部分進行分析和選擇，所述方法包括但不限于Southern印跡、DNA測序或4吏用該核酸分子特異引物的PCR分析，并檢測由其產生的擴增子。77一般，相對于缺4^達盒的對照植物、植物部分或細胞，濃度或組成提高或降低至少50/。、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或卯％。對氮限制的適應性是植物的關鍵性狀，并與作物產量正相關。消耗土壤中氮的大量生物因素和非生物因素頻繁地產生氮限制生長條件。為了應付該問題，植物已進化出一套氮限制適應性應答。然而認識僅限于涉及這些適應性應答的生理學和生物化學改變，而操縱植物對氮限制的適應性的分子機制是之前完全未知的。本文公開的RING結構域蛋白質涉及調節植物對氮限制的適應性應答。該基因增加的表達可產生具有增加的產量的植物，尤其是對氮限制適應性的控制可導致增強的氮利用并改變種子、塊莖、根和其他儲存器官中的源-庫關系。本發明會參考以下的詳細實施例進一步描述。除非另有說明，這些實施例僅就說明的目的提供，而非旨在限制。實施例本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域公知的，并由J.Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版，ColdSpringHarbor,NY:ColdSpringHarborLaboratory出版(2001);由T.丄Silhavy、M丄.Berman和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)和由Ausubd，F.M.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,NewYork,JohnWiley和SonsInc.,(1988)，Reiter等，MethodsinArabidopsisResearch,WorldScientific出版(1992)和Schultz等，PlantMolecularBiologyManual,KluwerAcademicPublishers(1998)描述。實施例1植物生長條件和lines突變體的分離從ABRC種子貯存物中鑒定擬南芥純合T-DNA插入突變體林系(哥倫比亞背景中)的標本。在具有受控的環境條件("。C白天/18。C夜晚，l5078pmol/m、的白色熒光照明，16小時光/8小時暗，和75%相對濕度)的栽培室內，將這些T-DNA林系種植在無營養物的土壤LB2(SunGroHorticultureCanadaLtd.BC.加拿大)中，每周在營養物溶液(10mMKH2P04pH5.6，2mMMgS04，1mMCaCl2,0.1mMFe畫EDTA，50一H3B04，12jtMMnS04，1|liMZnCl2，1,CuS04，0.2,Na2Mo04)中提供3或10mM硝酸鉀，提供四周。根據低硝酸鹽誘導的早衰表型，從這些T-DNA株系中分離lines突變體。生物化學分析收集在含3mM硝酸鹽的LB2土壤中生長不同天數的lines和Col植物的第5-8片蓮座葉，在液氮中冷凍并儲存于-80。C用于以下的生物化學分析。從冷凍葉中提取硝酸鹽并根據CIothern等，(1975)測定。連續用HEPES-KOH緩沖液(pH7.4)中80%、50%、0。/。乙醇提取總氨基酸，并將合并的上清液用于Rosen(1957)所述的總氨基酸測定。為了提取可溶蛋白質，將冷凍的葉粉末重懸于100mMHEPES-KOH(pH7.5)+0.1%TritonX-IO()緩沖液中并以14,000轉/分鐘離心10分鐘。^f吏用商業蛋白質測定試劑盒(Bio-Rad，Hercules,CA)測定上清液中的總可溶蛋白質含量。為了測定氮含量，將冷凍葉粉末的等分式樣真空干燥過夜，并使用NAI500C/H/N分析J義(CarloErbaStrumentazione,Milan,意大利)通過Micro-Dumas燃燒分析法測量1.5mg干粉中的總氮。如Geiger等(1998)所述提取可溶糖，并使用可商業獲得的試劑盒(Megazyme，愛爾蘭)測定葡萄糖、果糖和蔗糖含量。為了分析葉綠素，將冷凍葉粉末懸浮于80。/。丙酮中，并以13,000轉/分鐘離心。將提取重復兩次，并根據Arnon(1949)測量合并的上清液中的葉綠素含量。如Noh和Spalding(1998)中所述從冷凍葉粉末中提取并測定花色素苷。通過RT-PCR的表達分析使用TriZol物質(Invitrogen)從多種擬南芥植物組織中提取總RNA。用試劑盒(Fermentas)從總RNA樣品中合成第一鏈cDNA并用于PCR。通過半定量PCR檢測涉及硝酸鹽代謝(NR1，NR2，GS2，NRTl.l，NRT2.1)、79光合作用(RBCS和CAB1)、花色素苷合成(CHS)和衰老(SAG12)的擬南芥基因的表達，并使用遍在蛋白-10表達作為內標。需要時可獲得這些基因的特異引物和PCR條件。LINES基因的圖位克隆(map-basedcloning)將一林純合的lines植物(Col背景中)與Landsbergerecta野生型植物雜交。在分離的F2后代中，選擇518抹顯示lines突變體表型的植物用于基于PCR的繪圖，所述F2后代在含3mMKN03的LB2土壤中栽培。根據Lukowitz等(2000)進行第一輪繪圖。用于以下精細繪圖的SSLP和CAPS標記物得自擬南芥基因組序列數據庫(www.arabidopsis.org)。產生轉基因擬南芥植物為了確定Atlg02860是否是LINES基因，使用一對引物UNEScDNA-F5，ACAACCGGTTTGAGGGCTGAATTTGTTTG3，(SEQIDNO:ll)和L腿ScDNAR5，ACAGAATTCTATATCATATTCCAGTGAAGCT3'(SEQIDNO:12)通過RT-PCR擴增Atlg02860的編碼序列。將PCR產物克隆進二元載體pEGAD(Cutler等，2000)的AgeI和EcoRI位點中，在該栽體中Atlg02860cDNA表達將由植物中的35S啟動子驅動。如CloughandBent(1998)所迷將構建體轉化進lines突變體植物中，并通過對Tl幼苗播灑除草劑BASTA(1:500稀釋度，Aventis，Strasbourg,France)篩選轉化體。將來自三林獨立的Tl轉基因林系的T2種子播種在含3mM硝酸鹽的LB2土壤中用于表型測試。結果lines突變體顯示低無機氮誘導的早衰表型在大部分土壤條件下作物植物可獲得的主要無機氮化合物是硝酸鹽(Crawford和Forde，2002)。為了研究擬南芥植物如何應答多變的硝酸鹽供應，建立了一種生長體系，其中10mM硝酸鹽為擬南芥植物提供足量的氮營養物，而3mM硝酸鹽顯著地限制擬南芥植物的生長(Bi等，2005)。觀察到對不足氮供應的以下適應性應答。供應3mM硝酸鹽的擬南芥植物與供應10mM硝酸鹽的植物相比生長降低30%(Bi等，2005)，并顯示蓮座葉紅色的增加，這指出花色素苷的累積(圖1A到C)。另外，它們比在IOmM硝酸鹽下生長的植物至少提前兩周開始在蓮座葉中的衰老過程(數據未顯示)。為了篩選對氮限制生長條件具有改變的生長應答的突變體，從擬南芥生物資源中心(ABRC)種子貯存物中鑒定純合T-DNA插入抹系的標本(Alonso等，2003),并在硝酸鹽應用受控體系中生長以評價其生長表現。供應3mM硝酸鹽時，一林T-DNA插入抹系不能適應氮限制生長條件，并比野生型早得多開始衰老而且衰老得更加迅速(圖1)。因此，該T-DNA插入抹系被稱作低無機氮誘導的早衰(lines)突變體。圖1A到C中顯示，供應10mM硝酸鹽的lines突變體植物具有與野生型相似的生長和發育模式。將硝酸鹽濃度降低至3mM時，lines植物在萌發后第24天(DAG)在第5片蓮座葉中開始衰老，并且在該點后衰老快速發展，所有的蓮座葉在第261)AG顯示衰老癥狀，且整個蓮座在第32DAG死亡。相反，野生型植物直到笫32DAG才在第5片蓮座葉中顯示衰老癥狀。在野生型植物中，衰老過程從第5片蓮座葉到更年輕的蓮座葉緩慢和逐步地進行，并且所有蓮座葉顯示衰老癥狀花費至少兩周。lines植物中的莖生葉在第MDAG開始衰老，比野生型植物至少提前10天(圖1D)。另外，發育中的lines長角果在第32DAG時在其尖端開始衰老，而野生型長角果在其整個發育中均不顯示衰老癥狀，但是累積了豐富的花色素苷，這在lines長角果中未觀察到(圖1E)。隨著硝酸鹽濃度降低至lmM，lines植物蓮座葉中衰老表型的發生加速至第20DAG，并且發育中的lines長角果的嚴重衰老導致其在30DAG左右死亡，而不生產有活力的種子。在與lmM硝酸鹽相同的生長條件下，野生型植物直到第26DAG才在蓮座葉中開始衰老，并產生生殖力旺盛的長角果(圖1C)。為了進一步證實lines突變體中的早衰表型依賴于不足的硝酸鹽供應，本發明人用1或3mM硝酸鹽栽培lines植物。當衰老癥狀剛剛在第5片蓮座葉中開始時，對這些植物提供15mM硝酸鹽。結果，正在衰老的lines植物中的衰老過程停止，衰老的蓮座葉恢復其生長，并且新的蓮座葉沒有衰老癥狀。另外，產生了新的側枝，并且在莖生葉和長角果中未觀察到衰老癥狀(圖1F和G)。最后，這些lines植物中的長角果在供應15mM硝酸鹽后成為生殖力旺盛的(圖1F)。除了硝酸鹽外，無機氮肥包括銨和硝酸銨。本發明人發現不足的銨和硝酸銨供應也誘導lines突變體的早衰表型。在20mM銨或10mM硝酸銨上生長的lines植物具有與野生型植物相似的生長和發育模式(數據未顯示)。在5.0mM銨或2.5mM硝酸銨上生長時，lines植物在24DAG左右在蓮座葉中開始衰老過程，并且隨后在整個蓮座、莖生葉和長角果中快速發生衰老。在相同的氮限制條件下，野生型植物直到32DAG才在第5蓮座葉中顯示明顯的衰老癥狀(數據未顯示)。另外，也可以通過對衰老中的lines突變體提供大量銨或硝酸銨來恢復不足的銨和硝酸銨在lines突變體中誘導的早衰表型(數據未顯示)。因為三種無機氮形式對lines突變體具有相同的影響，所以本發明人在以下的實驗中使用硝酸鹽作為氮源。LINES基因的圖位克隆為了測定低無機氮誘導的早衰表型在lines突變體中的遺傳，本發明人將lines突變體與野生型回交。在3mM硝酸鹽上生長時，Fl植物顯示與野生型植物相同的表型。在F2世代中，野生型和lines突變體表型以3:1的比例分離(數據未顯示)，這表明lines突變體表型是隱性的，并作為單個孟德爾性狀遺傳。Southern印跡分析揭示了lines突變體的基因組含有五個T-DNA插入，但是在遺傳上與低氮誘導的早衰表型均無聯系(數據未顯示)，這表明lines突變體中的負責基因未被T-DNA插入標記。后來，lines突變體與野生型成功地回交四次，沒有一個T-DNA插入纟皮留在lines突變體中。因為在lines突變體中LINES基因未被T-DNA標記，所以使用圖位克隆方法分離LINES.通過將lines突變體與Landsbergerecta野生型雜交產生F2繪圖種群。將來自50個F2lines突變體植物的基因組DNA混合，并用于使用來自Lukowitz等(2000)的22個簡單序列長度多態性(SSLP)標記物的最初的繪圖。在LINES和染色體1上臂上的SSLP標記的(market)F21M12之間檢測到緊密連鎖(數據未顯示)。使用其他可獲得的SSLP標記物(www.arabidopsis.org)的進一步繪圖將LINES定位在下述區域中，所述區域邊界是兩個SSLP標記物NF21B7和NT7I23并被七個BAC覆蓋(圖2A)。使用這兩個SSLP標記物，在F2繪圖種群中518林lines植物間鑒定了18個重組體。使用這18個重組體和更多SSLP和切割的擴增的多態序歹'J(cleavedamplifiedpolymorphicsequence,CAPS)標記物的精細繪圖將LINES基因座的位置限制在BAC克隆F22D16上的SSLP標記物473993和CAPS標記物SNP247之間的基因組區域。該區域大約為62.3kb并含有21個有注解的基因(圖2A)。十三個基因可以是LINES的候選者，并通過RT-PCR和PCR從lines突變體植物中分別擴增其編碼區和相應的基因組序列。這些PCR產物與其來自野生型的復本進行比較，揭示了僅Atlg02860基因在lines突變體的基因組和編碼序列中被縮短(圖2C和D)。linesAtlg02860基因的完全測序顯示在lines突變體中Atlg02860的第三個內含子和第四個外顯子缺失(圖2A),且剩余的外顯子3和5框內融合(圖2A)。這導致了lines突變體中檢測到截短的Atlg02860cDNA(圖21))。為了證實Atlg02860的確是LINES基因，將由35S啟動子驅動的野生型Atlg02860cDNA轉化進lines突變體中。PCR和RT-PCR分析揭示了三個獨立的轉化體，其基因組中含有截短的Atlg02860基因組序列(1.4kb)和轉化的Atlg02860cDNA(1.0kb),并相應地含有截短的(0.9kb)和野生型(1.0kb)的Atlg02860mRNA(圖2C和D)。與野生型植物類似，對這三個轉化體供應3mM硝酸鹽時其未顯示早衰表型(圖2B)。相反，用空的二元栽體pGEAD(Culter等，2000)轉化的對照lines植物未表達野生型Atlg02860cDNA(圖2D)，并顯示低氮誘導的早衰表型(圖2B)。所有的數據明確地將Atlg02860指定為LINES基因，且突變的Atlg02860基因負責lines突變體中低氮誘導的早衰表型。LINES編碼RING-型遍在蛋白E3連接酶LINES基因由六個外顯子和五個內含子組成，并編碼335個氨基酸的蛋白質(圖2A和3A)，該蛋白質具有38,110道爾頓的分子量和4.59的pl。該LINES蛋白質具有兩個已知的結構域RING和SPX(圖3A和B)。該RING結構域位于LINES蛋白質中的第230位-第282位氨基酸，是結合兩個鋅原子的C3HC4型鋅指并參與介導蛋白質-蛋白質相互作用。在擬南芥中，一些含RING的蛋白質(如COP1和SINATA5)的功能表征提示RING結構域的生物學功能是參與遍在蛋白依賴型蛋白質降解(Moon等,2004)，并因此在真核生物細胞調節中起主要和關鍵的作用(Glickman和Ciechanover，2002)。Stone等(2005)才艮道了擬南芥基因組編碼469個推定的含RING蛋白質，其可分為八類，且LINES屬于RING-HCa型(Stone等，2005)。SPX結構域位于LINES的N端，從第1位氨基酸到第180位氨基酸(圖3A和B)。該結構域根據酵母蛋白質SYG1和PH081和哺乳動物蛋白質XRP1命名，所有這些蛋白質在其N端均含有該180個氨基酸的結構域。盡管SPX結構域的精確生物學功能是未知的，但是酵母SYGl能夠直接與G-蛋白P亞基結合并阻抑交配信息素信號轉導的發現(Spahi等，1995)提示具有N端SPX結構域的蛋白質參與G-蛋白關聯的信號轉導。將來自突變和野生型LINES蛋白質的氨基酸序列進行比較，揭示了在突變的LINES蛋白質中缺失RING結構域(圖3A和B)。盡管截短的LINES的包含SPX結構域的剩余氨基酸序列與野生型復本相同，但是截短的LINES不能執^f亍其野生型復本的生理功能，并因此導致低氮誘導的早衰表型。另外，為了確定野生型RING結構域是否能夠恢復lines的表型，本發明人在lines才直物中表達了N-端截短的Atlg02860cDNA，其編碼完整的RING結構域但是沒有SPX。然而，所有的轉化體維持了低氮依賴型早衰表型(數據未顯示)。這些結果指出RING結構域是LINES中非常關鍵的部分，并且其生理學功能不能與SPX結構域分離。盡管擬南芥基因組含有約20個含SPX的蛋白質(Wang等，:20(M)和469個含RING的蛋白質，但是只有分別由Atlg02860和At:2g38920編碼的LINES和NP—181426既包含SPX又包含RING結構域。這兩種蛋白質具有41.2%的序列同一性和61.7。/。的相似性。這是At化38920(SALK—I29"8中的T-DNA插入突變體。然而，該基因中的純合突變未顯示低氮誘導的早衰表型(數據未顯示)，這表明Atlg02860是擬南芥植物適應氮限制生長條件所特異需要的。將推導的LINES氨基酸序列與目前數據庫中已存的進4亍比較，揭示LINES在稻(Oryzasativa)中具有兩個、在裂殖酵母(Schizosascharomycespombe)中有一個、在真菌中有六個直向同源物(圖)。系統進化分析指出LINES與稻中的XP—479476最緊密相關(圖3C)。然而，所有這些LINES直向同源物的生物學功能仍然未知。lines突變體未改變其獲得氮的能力，但是具有改變的氮限制介導的衰老過程。lines植物發生低無機氮誘導的早衰表型存在兩種可能的原因。首先，當氮供應不足時lines植物獲取比野生型更少的氮營養物。為了解決該問題，本發明人檢查了野生型和lines植物中的總氮含量。供應高(10mM)或低(3mM)硝酸鹽時，野生型和lines植物在18DAG時鮮重(數據未顯示)和總氮百分比(圖4A)彼此相似。因此，lines突變體關于總氮含量與野生型密切相似。另外，兩種主要的硝酸鹽轉運蛋白NRT1.1(低硝酸鹽親和力轉運蛋白)和NRT2.1(高硝酸鹽轉運蛋白)在提供3或10mM硝酸鹽的野生型和lines植物的根中具有非常相似的表達水平(圖4B)這些結果提示lines和野生型植物具有相似的獲取氮營養物的能力，無論氮供應是高是低。lines植物僅在氮供應受限時產生早衰表型的第二種可能的原因可能是該lines植物適應性應答的發育受損，所述適應性應答4吏得擬南芥植物能夠適應氮限制生長條件。一種這樣的適應性應答是氮限制介導的衰老，這對于將氮營養物從老的、成熟的蓮座葉中再移動至年輕和處于活性生長的器官(例如年輕的葉和未成熟的種子)中是關鍵性的(Thimann，1980;MeiandThimann，1984)。因此，詳細地檢查了野生型和lines蓮座葉中氮限制介導的衰老過程(圖4C)。用3mM硝酸鹽栽培時，直到第32DAG野生型植物在第5片和更年輕的蓮座葉中未顯示衰老癥狀。衰老緩慢進行并且是很有組織的，這由下述事實指出蓮座葉的顏色從綠色逐步改變為深綠85和紅色，并在整個衰老過程中維持其膨脹度。在供應3mM硝酸鹽的lines植物中，衰老不僅比野生型中開始得早很多，而且也*得更迅速，因為所有的蓮座葉在26DAG就顯示衰老癥狀，并且顯示突然的葉顏色改變和快速的葉膨脹度消失。正在衰老的葉的較低葉邊緣仍然是綠色和膨脹的，而較高部分已經死亡(圖4C)。另外，衰老中的葉未從綠色轉為紅色，且死亡的葉是帶有一些紅色的棕色，指出在lines植物的衰老過程中合成較少的花色素苷。擬南芥SAG12是一個衰老相關的基因，并被定義為真實衰老分子標記物(NohandAmasino，1999)。為了更便利和精確地跟蹤衰老的發生和取樣蓮座葉用于該研究中的生物化學實驗，本發明人在用3mM硝酸鹽栽培的野生型和lines植物的第5-8片蓮座葉中測定了SAG12的表達。如圖2D中所示，SAG12表達在第24天DAG的lines植物中被檢測到，并隨著衰老的進行在28DAG時提高。另一方面，野生型植物中SAG12直到第32I)AG時才表達，并在蓮座中發生嚴重衰老的第36DAG時顯著提高。SAG12基因的表達譜與兩種基因型中視覺衰老癥狀的出現一致(圖4C)，這表明SAG12表達水平的確反應了蓮座葉中的衰老過程。lines突變體含有高水平的氮代謝產物，但是在正在衰老的蓮座葉中不能累積可溶的糖。為了在限制生長的條件下充分利用所有能獲得的氮，植物可從衰老的葉和器官中向年輕和正在發育的葉和器官中輸出氮。因此，測試的第二種氮限制適應性應答是氮從衰老葉的再移動。lines植物中快速的蓮座葉衰老和死亡可損傷氮從這些正在衰老的葉向年輕葉、花和正在發育的長角果的再移動，并因此可導致lines蓮座葉中的高氮代謝物含量。為了檢驗該假說，在野生型和lines植物的第5-8片蓮座葉中測定了硝酸鹽、氨基酸、可溶蛋白質和總氮含量水平，所述植物在整個衰老過程中于受限氮條件下生長。在第18DAG，在開始衰老前，野生型和lines植物含有非常相似的三種含N化合物含量(圖5A到C)，并且總氮含量無顯著差異(圖5D)。在野生型蓮座葉中發生衰老的第32DAG時，與未觀察到衰老癥狀的l8DAG相86比，硝酸鹽、總氨基酸、可溶蛋白質和總氮的含量分別被降低75%、80%、75"/。和70%。隨著衰老的進展，第36DAG時野生型蓮座葉中硝酸鹽、總氨基酸、可溶蛋白質和總氮的含量分別被降低90%、90%、90%和80%(圖5A到1))。相反，lines蓮座葉中衰老的發生(第24DAG)和發展(第28DAG)不伴隨硝酸鹽、總氨基酸、可溶蛋白質和總氮含量的顯著降低(圖5A到D)。例如，當第28DAG在lines蓮座葉中發生嚴重的衰老時，硝酸鹽、總氨基酸、可溶蛋白質和總氮含量與第18DAG相比進分別降低33。/。、5%、20%和6%(圖5A到D)。這些結果提示氮從正在衰老的野生型蓮座葉中再移動，但是氮留在lines的正在衰老的葉中。在生物化學分析后，本發明人通過RT-PCR測定了涉及氮代謝的基因的表達。如圖6所示，NR1、NR2和GS2的表達隨著野生型蓮座葉中衰老的發生和#而降低。然而，這未在lines植物中發生，其中在衰老發生之前或之后收獲的蓮座葉之間，這些基因的表達未改變。已發現可溶性糖(包括葡萄糖、果糖和蔗糖)在葉中的累積與葉衰老和氮缺乏的發生有力關聯(Paul和Driscoll,1997;Wingler等，2006)。對可溶性糖的實驗顯示在野生型植物中葡萄糖、果糖和蔗糖隨著葉衰老的開始和*而顯著累積，但是在lines植物中，當衰老在其蓮座葉中發生時，三種可溶性糖的含量僅具有輕微的提高(圖5E到G)。例如，在葉衰老尚未開始的第18I)AG,野生型和lines植物具有類似的葡萄糖、果糖和蔗糖含量。當葉衰老發生時，野生型植物中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量分別提高卯％、84%和46%(第36DAG),而在lines植物中僅分別提高5%、8%和20%(第28DAG)。衰老期間lines突變體在花色素苷累積和光合作用能力的降低中受損累積的花色素苷和降低的光合作用是兩種重要的氮限制適應性應答，并被擬南芥中多重QTL控制(Diaz等，2006)。為了確定lines植物是否能夠產生這類適應性應答，在野生型和lines植物中測量了花色素苷含量和光合作用能力。在有限的氮下生長的野生型^t物在其生長和衰老期間顯著提高花色素苷含量(圖5H)。在18DAG,野生型的第5-8片蓮座葉含有4.8單位/g鮮重(FW)的花色素苷，這在第28DAG提高至31單位/gFW，此時蓮座葉仍然未顯示任何衰老癥狀。隨著第32DAG野生型植物的第5-8片蓮座葉中衰老的發生，它們的花色素苷含量提高至>40單位/gFW。相反，正在衰老的lines蓮座葉中未發生花色素苷累積(圖5H)。在lines植物未顯示分子和形態學衰老癥狀的第18DAG，所述lines植物含有4.0單位/gFW花色素苷。在第5-8片蓮座葉中發生衰老的第24DAG，它們仍然含有3.5單位/gFW花色素苷。在第28DAG當lines植物中所有蓮座葉均顯示嚴重的衰老癥狀時，未觀察到花色素苷含量的提高(圖5H)。對應于野生型和lines植物中不同的花色素苷累積模式，編碼花色素苷合成途徑中限速酶的查耳酮合酶基因(CHS)在lines植物的整個衰老過程中未提高其轉錄水平，但是在野生型植物中CHS基因的表達隨著衰老的開始和發展而顯著提高(圖6)。植物光合作用能力可以通過葉綠素含量和兩種光合作用標記物基因RBCS和CAB在葉中的表達水平來指示，所述基因RBCS和CAB分別編碼核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)的小亞基和葉綠素a/b結合蛋白(Martin等，2002)。在提供有限氮的野生型和lines植物中測定葉綠素含量。如圖51中所示，野生型和lines植物在第18DAG分別含有0.99和0"5mg葉綠素/gFW。隨著野生型植物中衰老的開始(32DAG)和進展。6DAG)，葉綠素含量分別降低50%和70%。然而，當lines植物中嚴重地發生衰老時，第28DAG葉綠素含量僅降低15%。RT-PCR分析揭示當第32DAG在野生型蓮座葉中發生低氮介導的衰老時，RBCS和CAB的表達猛烈降低(圖6)。相反，lines植物中RBCS和CAB的表達在其蓮座葉中發生衰老之前和之后始終較高(圖6)。這些數據表明與野生型植物不同，用有限氮營養物栽培的lines植物在花色素苷累積和光合作用能力的降低中受損，所述花色素苷累積和光合作用能力降低是關鍵的氮限制適應性應答。lines突變體在磷限制和高蔗糖脅迫誘導的花色素苷合成途徑中沒有缺陷除了氮限制外，磷限制和高蔗糖脅迫也誘導植物中的花色素苷合成。為了確定lines突變體在磷限制引起的花色素苷累積中是否有缺陷，在含0.5mM磷的土壤中栽培lines突變體和野生型植物。已發現該磷應用顯著地限制擬南芥植物生長。在用3mM硝酸鹽栽培的lines突變體植物已經顯示早衰表型和花色素苷累積受損的第28DAG，供應0.5mM磷的lines突變體和野生型均劇烈地增加花色素苷合成，并產生約24單位/gFW的花色素苷。另外，用受限的硝酸鹽(3mM)和磷(0.5mM)栽培的lines突變體植物在第28DAG不僅累積了高花色素苷含量(20單位/gFW)，而且未顯示氮限制誘導的早衰表型。為了研究高蔗糖是否能夠在lines突變體中誘導花色素苷累積，用1mM硝酸鹽和3%或5%蔗糖體外栽培lines突變體和野生型植物。在第21DAG,供應3%蔗糖的lines突變體產生比野生型少得多的花色素苷，并顯示早衰表型。相反，用5%蔗糖栽培時，該lines植物累積與野生型類似量的花色素苷，并且不顯示早衰表型。所有的數據表明磷限制和高蔗糖脅迫誘導的花色素苷合成途徑不受lines突變影響，并且lines突變體特異地在氮限制誘導的花色素苷途徑中有缺陷。這些結果還證明花色素苷在lines突變體中的累積可有效地防止氮限制誘導的早衰表型。lines突變將氮限制增加的花色素苷合成轉換為木質素生產植物中的苯基丙酸類化合物途徑在第四步分為兩條分支一條用于黃酮類化合物生物合成，另一條用于木質素生物合成。在用3mM硝酸鹽栽培的lines突變體植物中，許多涉4質素合成的結構基因在第22到28DAG被顯著上調。該結果和lines突變體植物中氮限制誘導的花色素苷累積的顯著下降提示lines突變可將氮限制增加的花色素苷合成轉換為木質素生產。為了證實該假說，用3mM硝酸鹽栽培lines突變體和野生型植物，并在第22到28DAG(此時lines突變體和野生型植物均具有1-2cm的花序)分析初級花序中的木質素含量，野生型植物幾乎不含有木質素，而在lines突變體中明顯地觀察到木質素。在第24DAG在氮限制誘導的早期衰老發生前，lines突變體仍具有比野生型多得多的木質素。隨著衰老的開始和發展，lines突變體植物降低其生長，并在第28DAG具有與野生型相似的木質素含量。為了維持lines突變體在氮限制生長條件下的生長，對它們供應高二氧化碳(C02)。在該生長條件下，盡管lines植物在第28DAG顯示早衰表型并產生極少的花色素苷，但是它們維持其生長并在莖干中累積木質素，這導致lines植物植物含有比野生型多得多的木質素和長得多的statute。所有這些結果指出LINES基因參與木質素生物合成的控制，并且lines突變將氮限制增加的花色素苷合成轉換為木質素生產。討論氮和磷均為植物生長和發育的必需常量營養物(Marschner，1995)。與植物對氮限制的應答相反，植物中磷限制的感知、信號傳導和相關的基因調控已經被充分研究和理解。在擬南芥中，PH03、PSR1、PDR2和PHR1基因中的突變破壞了磷限制信號傳導(Zakhleniuk等，2001;Chen等，2000，Ticconi等，2004;Rubio等，2001)。AtSIZl調節PHR1的活性，并可在磷限制感知途徑的下游發揮作用(Miura等，2005)。活生物中氮限制感知和信號傳導途徑存在的證據來自于酵母和細菌。在酵母中，銨通透酶Mep2p能夠感知環境中的氮可利用度并產生氮限制信號供酵母調節其生長和發育，以適應不利的生長條件(Lorenz和Heitman，1998;Gagiano等,2002;Biswas和MorschMuser，2005)。在細菌中，已發現PII-型信號轉導蛋白質在氮限制信號轉導途徑中起主要作用，其功能和與其他蛋白質的相互作用被響應細胞內氮狀態(不足或充足)的磷酸化、尿苷酰化或腺苷酰化修飾(Arc()ndeguy等，2001;Schwarz和Forchhammer,2005)。盡管植物具有酵母Mep2p和細菌PII的同源物，但是它們在植物的氮限制適應性中不具有相似的功能(Crawford和Forde，2002;Moorhead和Smith,2003)。在該研究中，發明人展示生理學、生物化學和分子遺傳數據，清楚地證明LINES是氮限制適應性應答的發生所必需的，并且是支配植物氮限制適應性的分子機制中的關鍵組件。已知氮限制脅迫顯著地影響植物生長和發育，同時關于植物對氮限制適應性的認知是模糊的。在該研究中，發明人證明擬南芥植物能夠通itil生一組氮限制適應性應答適應氮限制生長條件(圖4和5)。首先，光合作用能力被降低。該應答不僅能夠顯著地降低植物對氮營養物的需求，而且限制了合成含N分子(如氨基酸、蛋白質和核酸)時對光合產物的利用。其次，花色素苷的合成被顯著提高。該光防護色素的提高允許缺氮植物避免由氮限制引起的光抑制損傷(Bongue-Bartelsman和Phillops，1995;Chalker-Scott，1999)。第三，可作為葉衰老和氮缺乏的信號作用的可溶性糖凈皮累積(Paul和Driscoll，1997;Wingler等，2006)。已知葉衰老對于擬南芥中的氮再循環是重要的，因為成熟蓮座葉中多于80%的總氮通過衰老過程輸出(Himelblau和Amasino，2001)。在氮限制生長條件下，對擬南芥植物有效地使用有限的氮營養物而言，該衰老介導的氮再循環變得更加重要，并且因此是關鍵的氮限制適應性應答。在該研究中，用有限的氮供應時栽培的擬南芥植物在進入抽莒階段后在老的成熟蓮座葉中開始衰老，并且衰老從較老的成熟蓮座葉逐步*至較年輕的蓮座葉(圖4)。同時，正在衰老的蓮座葉中總氮含量和含N化合物如蛋白質、氨基酸和葉綠素的量顯著地降低，這表明這些葉中的氮被輸出至年輕的、正在發育的器官，如花芽和長角果(圖5)。因此，隨著擬南芥植物中氮限制引起的衰老的產生和發展，涉及光合作用和氮同化作用的基因的表達水平降低，并且花色素苷合成中的限速基因CHS的轉錄被增加(圖6)。擬南芥植物中涉及氮限制適應應答的這些大量的生理學、生物化學和分子改變提示氮限制的感知或信號轉導途徑;陂激活，以開啟對低氮的這種復雜的代謝應答。在有限的氮下生長時，lines突變體僅發生早衰表型，并且該表型以三種方式被證實。首先，在有限的氮(3mM硝酸鹽)下生長的lines植物比野生型植物至少提前一周開始在蓮座葉中衰老，而供應了充足氮營養物(10mM硝酸鹽)的lines植物在其整個生命周期中的每個生長和發育方面都與野生型類似(圖1A到C)。其次，對正在衰老的lines植物提供充足的氮營養物(15mM硝酸鹽)能終止衰老程序(圖1F和G)。第三，lines突變體被暴露于與低氮組合的低磷或高蔗糖條件下時不顯示早衰表型。氮限制下lines植物中早衰表型的出現可通過氮獲取的缺陷或者通過對氮限制生長條件適應性的喪失來解釋。因為提供3mM或10mM硝酸鹽時lines和野生型植物具有非常類似的總氮含量(圖4A)，所以排除了第一種可能性。另一方面，lines突變體的詳細分析清楚地證明，在供應了有限氮的lines植物中，氮限制適應性應答關鍵性的所有生理學、生物化學和分子改變均未發生(圖4到6)。從晚期營養階段到生殖期，在有限的氮供應下生長的lines植物未累積花色素苷，并且進具有光合作用的輕微降低和可溶糖含量的少量提高(圖5)。有趣的是，不能累積花色素苷伴隨著提高的木質素累積，這提示LINES調節木質素生產和花色素苷生產之間的苯基丙酸類化合物生物合成分支點。這些lines植物最突出的特征是它們經歷了與野生型中顯著不同的由氮限制引起的衰老途徑。首先，供應有限氮的lines植物中，所有蓮座葉中的衰老不僅比野生型中開始得早得多而且*得更迅速，但是這也在年輕的、處于活性生長的器官如莖生葉和不成熟的長角果中發生(圖4)。其次，隨著lines蓮座葉中衰老的開始和*,正在衰老的lines葉中總氮含量和含N化合物如蛋白質和總氨基酸僅輕微地降低(圖5)，這表明正在衰老的lines蓮座葉中未發生衰老介導的氮再移動。這也通過lines的年輕蓮座葉和莖生葉和正在發育的長角果中的快速衰老得到證明，所述衰老最可能歸因于較低的氮輸入。另外，在lines植物中，涉及光合作用、氮同化作用和花色素苷合成的基因在衰老期間不具有改變的表達水平。這與在野生型植物中觀察到的顯著不同(圖6)。lines突變體不能發生這些關鍵的氮限制適應性應答強烈地提示LINES基因中的突變破壞了氮限制感知或信號傳導途徑，使得lines突變體不能對氮限制生長條件進行感知或信號傳導。相反，lines突變體維持生理學、生物化學和分子狀態，仿佛氮供應沒有受限制一樣。通過圖位克隆方法鑒定了該LINES基因，并且其顯示編碼與SPX結構域連接的RING-型遍在蛋白連接酶(圖2和3)。在lines突變體中，RING結構域從LINES蛋白質中缺失，且LINES的截短引起低氮誘導的早衰表型(圖2B)。對在At2g38920(其為擬南芥基因組中LINES的唯一)中具有T-DNA插入的突變體提供不足量的氮時，其不顯示lines表型，進一步指出LINES對擬南芥中氮限制適應性應答的發生是有特別重要性的。然而，該表型的缺乏可反映LINES賦予的冗余。已知蛋白質遍在蛋白化在真核生物中大量細胞過程的調節中起主要作用。首先，蛋白質遍在蛋白化途徑靶向用于被26S蛋白酶體降解的多種底物，如核轉錄因子、異常細胞質蛋白和短壽命的調節蛋白質(Glickman和Ciechanover，2002)。其次，用遍在蛋白修飾蛋白質也以非蛋白酶體依賴性的方式調節蛋白質定位、活性、相互作用配偶體和功能(SchnelI和Hicke,2003;Sun和Chen,2004)。在該研究中lines突變體的表征證明擬南芥中氮限制適應性應答的發生涉及大量生理學、生物化學和分子改變(圖4到6),對這些改變而言，負責的分子過程如氮限制感知和信號傳導應當^皮激活。根據本文的發現(LINES編碼遍在蛋白連接酶，并且lines突變體中LINES的敲除導致不能發生所有關鍵的氮限制應答)可以假設LINES可通過蛋白質遍在蛋白化途徑參與一種或多種底物蛋白質的降解或修飾，且該一種或多種底物蛋白質可以是氮限制感知或信號傳導途徑中的關鍵負調節物。在lines突變體中因為從LINES中缺失了RING結構域，所以該負調節物不會為了降解或修飾而適當地遍在蛋白化。對氮限制具有強適應性的作物如玉米在拉丁美洲、非洲和亞洲的發展中國家中是最想要的，在這些國家中農民負擔不起巨大的氮^，同時食物需求非常高(Loomis，1997;Duvick,1997)。理解控制植物對氮限制的適應性的分子機制會有希望加速這類作物栽培種的開發。該研究中LINES的克隆和功能表4正不僅證明植物裝配有適應氮限制的分子機制，而且也是鑒定下述分子組件的第一步，所述分子組件涉及控制植物氮限制傳感、信號傳導和相關基因調控。通過之前的實施例(其不旨在用于限制)描述了本發明的具體實施方案后，接下來在以下的權利要求書中進一步公開本發明。本領域技術人員會明白該權利要求書也允許包括在權利要求書文字范圍以外的等價物。參考文獻93Alonso,J.M.等,(2003)Genome-wideinsertionalmutagenesisofArabidopsisthaliana.Science301，653-657.Arcondeguy，T.、Jack,R.和Merrick,M.(2001).PHsignaltransductionproteins,pivotalplayersinmicrobialnitrogencontrol.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65，80—105.Arnon，D.I.(1949)Copperenzymesinisolatedchloroplasts.PolyphenoloxidaseinBetavulgaris.PlantPhysiol.24:1-15.Bi,Y.M.、Zhang,Y.、Signorelli,T.、Zhao,R.、Zhu，T.,和Rothstdn,S丄(2005)GeneticanalysisofArabidopsisGATAtranscriptionfactorgenefamilyrevealsanitrate-induciblememberimportantforchlorophyllsynthesisandglucosesensitivity.PlantJ.44:680-92.■Biswas,K.和Morschhauser，J.(2005)TheMep2pammoniumpermeasecontrolsnitrogenstarvation-inducedfilamentousgrowthinCandidaalbicans.Mol.Microbiol.56:3,649-669.B(mguc畫Bartelsman,M.和Phillips,D.A.(1995)Nitrogenstressregulatesgeneexpressionofenzymesintheflavonoidbiosyntheticpathwayoftomato.PlantPhysiol.Biochem.33:539-546.Castleberry,R.M.、Crum，C.W.和Krull,R(1984)GeneticyieldimprovementofU.S.maizecultivarsundervaryingfertilityandclimaticenvironments.CropSci.24:33—36.Cataldo，D.A.、Haroon,M.、Schrader,T.E,和Youngs,V丄.(1975)Rapidcolorimetricdeterminationofnitrateinplanttissuebynitrationofsalicylicacid.Commun.SoilSci.andPlantAnal.6:71—80.Chalker誦Scott,L.(1999)Environmentalsignificanceofanthocyaninsinplantstressresponses.Photochem.Photobiol.70:1—9.Chen,D.L.、Ddatorre,C.A.、Bakker,A.和Abel,S.(2000)Conditionalidentificationofphosphate-starvation-responsemutantsinArabidopsisthaliana.Planta211:13—22.Clough，S丄和Bent,A.F.(1998)Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.16:735-743.Crawford,N.M.(1995)Nitrate:nutrientandsignalforplantgrowth.PlantCell7:859-68.Crawford,N.M.和Forde，B.G.(2002)Molecularanddevelopmentalbiologyofinorganicnitrogennutrition.In:Meyerowitz，E.andSomerville，C.eds，TheArabidopsisBook.AmericanSocietyofPlantBiologists,Rockville,MD，doi/10.1199/tab.0011，http:〃www.aspb.org/i3ublicatioiis/arabidopsisCutler,S.R.、Ehrhardt，D.W.、Griffitts，J.S.和Somerville,C.R.(2000)RandomGFP::cDNAfusionsenablevisualizationofsubcellularstructuresincellsofArabidopsisatahighfrequency.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:3718-3723.Diaz,C.、Purdy,S,、Christ,A.、Morot-Gaudry,J.-R、Wingler，A.和Masclaux-Daubresse,C.(2005)CharacterizationofmarkerstodeterminetheextentandvariabilityofleafsenescenceinArabidopsis.Ametabolicprofilingapproach.PlantPhysiol.138:898—卯8.Diaz,G,、Saliba-Colombani，V.、Loudet,O.、Belluomo，P.、Moreau，L.、Daniel-Vedele，F.、Morot-Gaudry,J.F.和Masclaux-Daubresse,C.(2006)LeafyellowingandanthocyaninaccumulationaretwogeneticallyindependentstrategiesinresponsetonitrogenlimitationinArabidopsisthaliana.PlantCellPhysiol.47:74-83.I)ing，L.、Wang,K丄、Jiang,G.M.、Bis謂，D.K.、Xu，H.、Li,LF.和J^Y.fl.(2005)Effectsofnitrogendeficiencyonphotosynthetictraitsofmaizehybridsreleasedindifferentyears.AnnBot(Lond).96:925-930.l)uvick，D.N.(1984)GeneticcontributionstoyieldgainsofU.S.hybridmaize,1930to1980.In:Fehr，W.R.，ed.Geneticcontributionstoyieldgainsoffivemajorcropplants,CSSASpecialPublication7.Madison,WI:ASAandCSSA，15-47.Duvick，D.N.(1997)Reviewofthesymposiumondevelopingdroughtandl()w-Ntolerantmaize.In:Edmeades,G，O.，Banziger，M.，Mickelson,H，R.andPena-Valdicia,C，B.eds.DevelopingdroughtandlowN-tolerantmaize.ElBatan，Mexico:CIMMYT,554-556.Fdler，U.和Fischer,A.(1994)Nitrogenmetabolisminsenescingleaves.CRCCrit.Rev.PlantSd.13:241-273,Filleur，S.、Dorbe，M.F.、Cerezo，M.、Orsel，M.、Granier，F.、Gojon，A.和Daniel-Vedele，F.(2001).AnarabidopsisT-DNAmutantaffectedinNrt2genesisimpairedinnitrateuptake.FEBSLett.489:220-224.Frink，C.R.、Waggoner,P.E.和Ausubel，J.H.(1999)Nitrogenfertilizer:retrospectandprospect,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:1175—1180.(;agiano,M.、Bauer,F.F.和Pretorius,J.S.(2002)ThesensingofnutritionalstatusandtherelationshiptofilamentousgrowthinSaccharomycescerevisiae.FEMSYeastRes.2:433-470.Geiger，M.、Walch-Liu,P.、Engels，C.、Harnecker，J.、Schulze，E.-D.、Ludewig，F.、Sonnewald,U.、Scheible,W,R.和Stitt，M.(1998)Enhancedcarbondioxideleadstoamodifieddiurnalrhythmofnitratereductaseactivityinolderplants,andalargestimulationofnitratereductaseactivityandhigherlevelsofaminoacidsinyoungtobaccoplants.Plant,Cell&Environ.21:253-268.Glickman,M.H.和Ciechanover,A.(2002)Theubiquitin-proteasomeproteolyticpathway:destructionforthesakeofconstruction.PhysiolRev.82:373—428Go()d，A.G.、Shrawat，A.K.和M腦ch,D,G.(2004)CanlessyieldmoreIsreducingnutrientinputintotheenvironmentcompatiblewithmaintainingcropproductionTrendsPlantSci.9:597-605.Himelblau,E.和Amasino,R.M.(2001)NutrientsmobilizedfromleavesofArabidopsisthalianaduringleafsenescence.J.PlantPhysiol.158:1317—1323.Khamis,S.、Lamaze，T.、Lemoine，Y.和Foyer,C.(1990)Adaptationofthephotosyntheticapparatusinmaizeleavesasaresultofnitrogenlimitation.PlantPhysiol.94:1436—1443.Kolber，Z.、Zehr，J.和Falkowski，P.(1988)EffectsofGrowthIrradianceandNitrogenLimitationonPhotosyntheticEnergyConversioninPhotosystemII.PlantPhysiol.88:923-929.Lam,H.M.、Coschigano，K.T.、Oliveira,I.C.、Melo-Oliveira,R.、Coruzzi,(;.M.(1996)TheMolecular-geneticsofnitrogenassimilationintoaminoacidsinhigherplants.Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.47:569-593.Lo()mis，R.S.(1997)Developingdroughtandlow-nitrogentolerantmaize:anoverview.In:Edmeades，G.O.，Banziger，M"Mickelson，H.R.andPena-Valdicia,C.B.eds.DevelopingdroughtandlowN-tolerantmaize.ElBatan,Mexico:CIMMYT，552-555.Lukowitz，W.、Gillmor,C.S.和Scheible,W.(2000)PositionalcloninginArabidopsis.Whyitfeelsgoodtohaveagenomeinitiativeworkingforyou.PlantPhysiol.123，795-805.Marschner，H.(1995).Mineralnutritionofhigherplants.London:Academic出版.Martin,T.、Oswald,O.和Graham,LA.(2002)Arabidopsisseedlinggrowth,storagelipidmobilization,andphotosyntheticgeneexpressionareregulatedbycarbon:nitrogenavailability.PlantPhysiol.128:472—481McCulloughD.E.、Girardin,Ph.、Mihajlovic，M.、Aguilera，A.和Tollenaar,M.(1994)InfluenceofNsupplyondevelopmentanddrymatteraccumulationofanoldandanewmaizehybrid.Can.J.PlantSci.9774:471-477.Masclaux，C.、Valadier，M.、Brugi6re，N.、Morot-Gaudry，J.和Hirel,B.(2000)Characterizationofthesink/sourcetransitionintobacco(NicotianatabacumL.)shootsinrelationtonitrogenmanagementandleafsenescence.Planta211:510—518.Mci,H.S.和Thima叫K.V.(1984)Therelationbetweennitrogendeficiencyandleafsenescence.Physiol.Plant62:157-161.Miura，K.、Rus,A.、Sharkhuu，A,、Yokoi,S,、Karthikeyan，A.S.、Raghothama,K.G,、Baek,D.、Koo，Y.D.、Jin,J.B.、Bressan，R.A.、Yun，D丄和Hasegawa,P.M.(2005)TheArabidopsisSUMOE3ligaseSIZlcontrolsphosphatedeficiencyresponses.Proc.Natl,Acad.Sci.USA.102:7760-7765.Moon，J.、Parry,G.和Estelle,M.(2004)Theubiquitin-proteasomepathwayandplantdevelopment.PlantCell16:3181-95.Moorhead,G.B.和Smith,C.S.(2003)Interpretingtheplastidcarbon,nitrogen,andenergystatus.AroleforPIIPlantPhysiol.133:492-492.N()h,B.和Spalding,E.P.(1998)AnionchannelsandthestimulationofanthocyaninaccumulationbybluelightinArabidopsisseedlings.PlantPhysiol.116:503-9.Noh，Y.S.和Amasino,R.M.(1999)Identificationofapromoterregionresponsibleforthesenescence-specificexpressionofSAG12.PlantMolBiol.41:181-94.N()lden,L,、Ngouoto-Nkili，C.E.、Bendt，A.K.、Kramer,R.和Burkovski,&(2001)SensingnitrogenlimitationinCorynebacteriumglutamicum:theroleofglnKandghiD.Mol.Microbiol.42:1281-95.Ono，K.、Terashima,I.和Watanabe，A.(1996)Interactionbetweennitrogendeficitofaplantandnitrogencontentintheoldleaves.PlantandCellPhysiol.37:1083—1089.I)aul，M丄和Driscoll，S.P.1997.Sugarrepressionofphotosynthesis:theroleofcarbohydratesinsignallingnitrogendeficiencythroughsource:sinkimbalance.Plant,Cell&Environ.20:110—116.Peoples,M.B.、Gault，R.R.、Lean,B.、Sykes，J.D.和Brockwell，J.(1995)Minimizinggaseouslossesofnitrogen.In:Bacon,PE.ed,NitrogenFertilizerintheEnvironment,MarcelDekker，pp.565—606.Rogers,A.、Fischer,B.U.、Bryant,J.、Frehner，M.、Blum，H.、Raines,C.A.和Long,S.P.(1998》AcclimationofphotosynthesistoelevatedC02underlow-nitrogennutritionisaffectedbythecapacityforassimilateutilization.Perennialryegrassunderfree-airC02enrichment.PlantPhysiol.118:683—689.Rosen,H.(1957)Amodifiedninhydrincolorimetricanalysisforaminoacids.Arch.Biochem.Biophy.67:10—15.Rubio,V.、Linhares，F.、Solano,R.、Martin,A.C.、Iglesias，J.、Leyva，A.和Pa-Ares,J.(2001)AconservedMYBtranscriptionfactorinvolvedinphosphatestarvationsignalingbothinvascularplantsandinunicellularalgae.GenesDev.15:2122—2133.Schnell，J.D.和Hicke,L(2003)Non-traditionalfunctionsofubiquitinandubiquitin-bindingproteins.J.Biol.Chem.278:35857—35860Spain,B.H.、Koo，D.、Ramakrishnan,M.、Dzudzor,B.和Colicdli,J.(1995)TruncatedformsofanovelyeastproteinsuppressthelethalityofaGproteinalphasubunitdeficiencybyinteractingwiththebetasubunit.J.Biol.Chem.270:25435-44.Stitt，M.(1999)Nitrateregulationofmetabolismandgrowth.Curr.Opin.PlantBiol.2:178-86.Stone,S丄.、Hauksdottir,H.、Troy,A.、Herschleb,J.、Kraft,E.和Callis，J.(2005)FunctionalanalysisoftheRING-typeubiquitinligasefamilyofArabidopsis.PlantPhysiol.137:13—30.S叫L和Chen,Z.J.(2004)Thenovelfunctionsofubiquitinationinsignaling.Curr.Opin.CellBiol.16:119-126.Thima叫K.V.(1980)Senescenceinleaves.In:Thima叫K.V.ed.SenescenceinPlants,C.R.C.出版，BocaRation,FL85-115.Ticconi，C.A.、Delatorre,C.A.、Lahner,B.、Salt,D.E.andAbel,S.(2004)Arabidopsispdr2revealsaphosphate-sensitivecheckpointinrootdevelopment.PlantJ.37:801—814.Todd,C,D.、Zeng,P.、Huete,A.M.、Hoyos,M.E.和Polacco，J.C.(2004)TranscriptsofMYB-likegenesrespondtophosphorousandnitrogendeprivationinArabidopsis.Planta219:1003-1009.Tollenaar，M.和Wu，J.(1999)Yieldimprovementintemperatemaizeisattributabletogreaterstresstolerance.CropSci.39:1597—1604VanNuland,A,、Vandormad,P.、Donaton，M.、Alenquer，M.、Louren^o,A.、Quintino,E.、Versele,M.和Thevelein,J.M.(2006)Ammoniumpermcase-basedsensingmechanismforrapidammoniumactivationoftheproteinkinaseApathwayinyeast.Mol.Microbiol.59:1485-1505.Vitousek,P.M.和Howarth，R.V.(1991)Nitrogenlimitationonlandandinthesea:howcanitoccurBiogeochemistry13:85—115.Wang,Y.、Ribot,C.、Rezzonico,E.和Poirier，Y.(2004)StructureandexpressionprofileoftheArabidopsisPHOlgenefamilyindicatesabroadroleininorganicphosphatehomeostasis.PlantPhysiol.135:400-11.Wingler，A.、Purdy,S.、MacLean，J.A.和Pourtau，N.(2006)Theroleofsugarsinintegratingenvironmentalsignalsduringtheregulationofleafsenescence.J.Exp.Bot.57:391-9.Zakhleniuk，O.V.、Raines,C.A.和Lloyd，J.C.(2001)pho3:aphosphorus-deficientmutantofArabidopsisthaliana(L.)Heynh.Planta212:529—534.權利要求1.調節植物細胞中特征的方法，其包括調節植物細胞中RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因的表達。2.根據權利要求l的方法，其中通過對所述細胞施用有效量的下述物質調節RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因的表達，所述物質能夠調節植物細胞中RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因的表達水平。3.根據權利要求1或2的方法，其中所述特征是農學性狀。4.根據權利要求3的方法，其中所述特征是受到氮、碳和/或硫代謝、脂質生物合成、營養物感受、營養適應、電子傳遞和/或膜相關能量守恒影響的特征。5.根據權利要求3的方法，其中所述特征選自以下一種或多種氮利用、產量、細胞生長、生殖、光合作用、氮同化作用、疾病抗性、分化、信號轉導、木質素生物合成、花色素苷生物合成、基因調控、非生物脅迫耐受和營養組成。6.根據權利要求5的方法，其中所述特征是氮利用。7.根據權利要求5的方法，其中所述特征是產量。8.根據權利要求5的方法，其中所述特征是木質素生物合成。9.根據權利要求5的方法，其中所述特征是花色素苷生物合成。10.根據權利要求1-9中任一項的方法，其中所述植物細胞是雙子葉植物、棵子植物或單子葉植物。11.根據權利要求10的方法，其中所述植物細胞是雙子葉植物。12.根據權利要求10的方法，其中所述單子葉植物選自玉米、小麥、大麥、燕麥、棵麥、粟、高粱、黑小麥、黑麥、單粒小麥、斯佩耳特小麥、雙粒小麥、畫眉草、蜀黍、亞麻、格蘭馬草、磨擦草屬物種和類蜀粟。13.根據權利要求ll的方法，其中所述雙子葉植物選自大豆、煙草或棉花。14.根據權利要求2-13中任一項的方法，其中所述物質增加植物細胞中RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因的表達水平。15.根據權利要求14的方法，其中被調節的特征是以下一種或多種的提高或改進氮利用、產量、細胞生長、生殖、光合作用、氮同化作用、花色素苷生物合成、疾病抗性、分化、信號轉導、基因調控、非生物脅迫耐受和營養組成。16.根據權利要求14或15的方法，其中增加植物細胞中RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因表達水平的物質包括編碼RING-樣遍在蛋白E3連接酶的核酸分子。17.根據權利要求16的方法，其中所述核酸分子包含序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9，或其功能性片段。18.根據權利要求16的方法，其中所述核酸分子包含在中等嚴格條件下與核苷酸序列SEQIDNO:l雜交的序列，或其功能性片段。19.根據權利要求16的方法，其中所述核酸分子包含來自核苷酸序列SEQII)NO:l、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9的核,列，并且所述核酸分子具有包含在植物中特異表達的密碼子的核苷酸序列。20.根據權利要求16的方法，其中所述核酸分子編碼SEQIDNO:2、SEQII)NO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示的多肽。21.根據權利要求2-16中任一項的方法，其中能夠調節植物細胞中RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因表達水平的所述物質包括(a)核苷^f列SEQIDNO:l，或其片段或結構域；(b)編碼多肽SEQIDNO:2的核苷酸序列，其片段或結構域；(c)與(a)或(b)具有基本相似性的核苷酸序列；(d)能夠與(a)、(b)或(c)雜交的核苷酸序列；(e)與(a)、(b)、(c)或(d)互補的核苷酸序列；或(f)是(a)、(b)、(c)或(d)的反向互補物的核苷酸序列。22.根據權利要求2-16中任一項的方法，其中能夠調節植物細胞中RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因表達水平的所述物質包括(a)SEQIDNO:2所示的多肽序列，其功能性片段、結構域、重復或嵌合體；(b)與(a)具有基^f目似性的多肽序列；(c)由下述核苷酸序列編碼的多肽序列，所述核苷酸序列與SEQID所示核苷,列或其功能性片段或結構域或與之互補的序列相同或具有基本的相似性；或(d)由下述核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在中等嚴格條件下能夠與SEQIDNO:l所示核苷酸序列或與之互補的序列雜交。23.根據權利要求16-22中任一項的方法，其中所述核酸序列在植物的特異位點或組織中表達。24.根據權利要求23的方法，其中所述位點或組織選自以下一種或多種種子、表皮、根、維管組織、分生組織、形成層、皮層、髓、葉和花。25.根據權利要求24的方法，其中所述位點或組織為種子。26.根據權利要求16-25中任一項的方法，其中增加植物細胞中RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因表達水平的所述物質包括用于調節植物細胞中特征的表達盒，所述表達盒包含與編碼RING-樣遍在蛋白E3連接酶的分離的核酸有效連接的啟動子序列。27.根據權利要求2-13中任一項的方法，其中所述物質抑制或降低植物細胞中RING-樣遍在蛋白E3連接酶基因的表達水平。28.根據權利要求27的方法，其中所述被調節的特征是以下一種或多種的降低氮利用、產量、細胞生長、生殖、光合作用、氮同化作用、花色素苷生物合成、疾病抗性、分化、信號轉導、基因調控、非生物脅迫耐受和營養組成。29.根據權利要求27的方法，其中所述被調節的特征是木質素生物合成的增力口。30.根據權利要求27-29中任一項的方法，其中所述物質抑制SEQIDNO:l、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9所示RING-樣遍在蛋白E3連接酶的表達。31.根據權利要求30的方法，其中所述物質是反義寡核苷酸或雙鏈RNA分子。32.表達盒，其包含與根據SEQIDNO:l、3、5、7或9任一的分離的核酸分子或其片段或變體有效連接的啟動子序列。33.載體，其包含根據SEQIDNO:l、3、5、7或9任一的核酸分子或其片段或變體。34.植物細胞，其由根據SEQIDNO:l、3、5、7或9任一的核酸或其片段或變體轉化。35.制備轉基因植物的方法，其包括(1)提供根據SEQIDNO:l、3、5、7或9任一的分離的核酸，或其片段或變體；和(2)將所述核酸分子引入植物，其中所述核酸分子在植物中表達。36.根據權利要求35的方法，其中所述核酸為SEQIDNO:l且植物展示以下一種或多種的提高或改進氮利用、產量、細胞生長、生殖、光合作用、氮同化作用、疾病抗性、分化、花色素苷生物合成、信號轉導、基因調控、非生物脅迫耐受和營養組成。37.權利要求35或36的方法，其中使用選自以下的方法將核酸引入植物中微粒轟擊、農桿菌介導的轉化和頸須介導的轉化。38.植物，其使用權利要求35-37中任一項的方法制備。39.權利要求38的植物的種子。40.斥又利要求39的植物的植物細胞。41.包含至少IO個堿基的核苷酸序列的核酸分子的用途，所述序列與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9的任一區域或其功能性片段相同、互補或基本相似，且其中所述用途選自苷酸定位的用途；(ii)作為RFLP分析標記物的用途；(m)作為定量性狀關聯育種的標記物的用途;(iv)作為標記物-輔助育種的標記物的用途；(V)作為釣餌序列在雙雜交體系中用于鑒定編碼多肽的序列的用途，所述多肽與釣飾序列編碼的多肽相互作用；(vi)作為對個體或個體群進行基因分型或鑒定的診斷指示物的用途；和(vii)用于鑒定基因或外顯子邊界的遺傳分析的用途。42.包含至少IO個堿基的核苷酸序列的核酸分子的用途，所述序列與SEQIDNO:3的區域或其功能性片段相同、互補或基本相似，且其中所述用途選自(i)作為低氮限制適應性標記物的用途；(ii)作為提高的木質素生物合成標記物的用途；或(m)作為低產量標記物的用途。43.針對分離的多肽產生的抗體，其包含(a)多肽序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10，或其片段、結構域、重復或嵌合體；(b)與(a)具有基本相似性的多肽序列；(c)由下述核苷酸序列編碼的多肽序列，所述核苷酸序列與SEQIDN():l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9所示核苷酸序列或其片段或結構域或與之互補的序列相同或具有基本的相似性；(d)由下述核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在中等嚴格條件下能夠與SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9所示核苷酸序列或與之互補的序列雜交；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的功能性片段。44.根據權利要求43的抗體，其中所述多肽包含序列SEQIDNO:2、SEQII)NO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10,或序列SEQIl)NO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQII)N():IO具有保守M酸修飾的變體。45.免疫測定試劑盒，其包含權利要求43或44的抗體及其使用說明。46.根據SEQIDNO:l、3、5、7或9中任一個的核酸分子、其片段或變體用于調節植物細胞中特征的用途。47.根據權利要求46的用途，其中所述特征選自以下一種或多種氮利用、產量、細胞生長、生殖、光合作用、氮同化作用、疾病抗性、分化、信號轉導、木質素生物合成、花色素苷生物合成、基因調控、非生物脅迫耐受和營養組成。48.根據權利要求47的用途，其中所述特征是氮利用。49.根據權利要求47的用途，其中所述特征是木質素生物合成。50.根據權利要求47的用途，其中所述特征是花色素苷生物合成。51.根據權利要求47的用途，其中所述特征是產量。52.根據權利要求46-51中任一項的用途，其中所述植物細胞是雙子葉植物、棵子植物或單子葉植物。53.根據權利要求52的用途，其中所述植物細胞是雙子葉植物。54.根據權利要求52的用途，其中所述單子葉植物選自玉米、小麥、大麥、燕麥、棵麥、粟、高粱、黑小麥、黑麥、單粒小麥、斯佩耳特小麥、雙粒小麥、畫眉草、蜀黍、亞麻、格蘭馬草、磨擦草屬物種和類蜀栗。55.根據權利要求52或53的用途，其中所述雙子葉植物選自大豆、煙草或棉花。56.根據權利要求46-55中任一項的用途，其中所述核酸是SEQIDN():l或其片段，且被調節的特征是以下一種或多種的提高或改進氮利用、產量、細月包生長、生殖、光合作用、氮同化作用、疾病抗性、分化、信號轉導、基因調控、花色素苷生物合成、非生物脅迫耐受和營養組成。全文摘要本發明涉及糖感應所需的由氮調節的RING樣遍在蛋白E3連接酶基因，和調節該基因的表達以調節植物的特征。本發明的RING樣遍在蛋白E3連接酶參與介導植物中的氮限制適應性應答，且其表達受氮狀態的影響。該基因或基本類似的基因提高的表達能夠產生下述植物，其具有改進的氮利用和提高的產量。文檔編號A01H5/10GK101501195SQ200780030037公開日2009年8月5日申請日期2007年6月13日優先權日2006年6月13日發明者M·彭,S·羅斯坦,Y-m·畢申請人:圭爾夫大學