減輕植物非生物脅迫的方法

專利名稱：減輕植物非生物脅迫的方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域。具體來說，本發明涉及靶向線粒體
的紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase, PAP)減輕由鹽度和干旱以及 氧化脅迫引起的脅迫的用途。
背景技術：
植物可經歷種類繁多的脅迫狀況，這些脅迫狀況是由非生命媒介或 諸如干旱、鹽度增加、溫度脅迫等的環境引起的。在任一方面偏離標準， 都將構成非生物脅迫。可以理解，高鹽濃度和干旱通過活性氧分子 (reactive oxygen species, ROS)的累積引起氧化脅迫，且作為這些脅迫狀況 的結果，植物通常會發生代謝變化。在看起來是基于同一件申請的美國 專利公布2002-0160378和2004-0009476中，對受脅迫調節的基因進行了 綜合討論。
本發明人在2003年發表的一篇文章(Liao, H, " a/., G五A^ (2003) 318: 103-111)中，克隆了大豆中新的紫色酸性磷酸酶樣基因，并對其進行了測 序，該基因被命名為GmiM尸3，其受增加的鹽度誘導，但和許多PAP基 因不一樣，GmPAP3不受磷缺乏誘導。作者還指出，編碼這種蛋白的核 苷酸序列包括推定的線粒體輩巴向轉運肽(mitochondrion targeting transit peptide, MTTP),并推測該蛋白可能主要存在于線粒體中。
本申請已經證實，表達的GmPAP3蛋白位于線粒體內，并且賦予植 物或植物細胞對非生物脅迫狀況的耐受性。
發明概述
發明人已經證明，大豆的紫色酸性磷酸酶主要存在于植物細胞的線 粒體中，并能阻止活性氧分子(ROS)的累積。因此，靶向線粒體的PAP 蛋白能通過增加保持完整線粒體的細胞的百分比、減少死亡細胞的百分比以及降低ROS累積來對抗非生物脅迫。這對適應除草劑的應用誘導根 部更好的生長和較少的脂質過氧化也具有效果。
因此，本發明一方面涉及保護植物或植物細胞免遭非生物脅迫的方 法，其中所述方法包括修飾所述植物或植物細胞，以產生具有靶向線粒
體的紫色酸性磷酸酶(PAP)活性的酶。
本發明另一方面涉及重組表達系統，其包括用于修飾植物或植物細 胞以實施本發明方法的構建體。在本發明的實施方案中，所述構建體用
于表達具有靶向線粒體的PAP活性的酶。
本發明另 一方面涉及重組表達系統作為選擇標記的用途。
本發明另一方面涉及轉基因植物或植物細胞，其包含本發明的編碼 具有PAP活性的酶的核香酸序列或本發明的構建體。
本發明另一方面涉及具有靶向線粒體的PAP活性的酶在制備含有該 酶的構建體或植物或植物細胞中的用途。
本發明再一方面涉及具有靶向線粒體的PAP活性的酶在生產用于制 備含有該酶的構建體或植物或植物細胞的試劑或試劑盒中的用途。
本發明另 一方面涉及制備或產生抵抗非生物脅迫的植物或植物細胞 的方法，包括修飾植物或植物細胞，以產生具有靶向線粒體的PAP活性 的酶。因此，根據本發明的方法，獲得抵抗非生物脅迫的植物或植物細 胞。
附圖筒要i兌明


圖1A-1H顯示野生型煙草BY-2細胞(
圖1A、 1C、 1E和1G)與轉基 因煙草BY-2細胞(
圖1B、 1D、 1F以及1H)的比較，所述轉基因煙草BY-2 細胞已經被修飾，含有GmPAP3-T7融合蛋白的表達載體。
圖2A-2B顯示GmPAP3的免疫檢測結果。圖2A顯示了指示大豆 GmPAP3蛋白在Gm/MP3-r7轉基因BY-2細胞系的線粒體富集的蛋白部 分中存在的Western印跡。
圖2B顯示在兩個獨立的G附"尸3-77轉基因細胞系(1535-1， 1535-2) 中利用圖2A中使用的GmPAP3抗體的電子顯微鏡檢測結果。箭頭指示 主要在線粒體中發現的金粒的位置。比例尺-200nm。圖3A-3L顯示Gw/M尸3對轉基因BY-2細胞在鹽度和滲透脅迫下存 活能力的影響。
圖4A-4L顯示G附/M尸3對BY-2細胞系在鹽度或滲透脅迫的情況下 保持存活能力的影響。
圖5A-5L是線粒體靶向的Gm尸v4P3的表達對BY-2細胞中ROS累積 影響的代表性圖像。
圖6是圖5A-5L結果的圖示，表示線粒體靶向的GmJ^P3的表達對 BY-2細胞中ROS累積的影響。
圖7顯示GmiM尸3對鹽脅迫下的轉基因擬南芥04raZ^o戸&)根部生長 的影響。
圖8顯示Gmi^P3對滲透脅迫下的轉基因擬南芥的影響，通過根部 生長來測量。
圖9顯示在由除草劑百草枯(Paraquat)引起的氧化脅迫下，G/wiM尸3 對轉基因擬南芥根部生長的影響。
圖10是顯示Gm/M尸3對氧化處理下轉基因擬南芥的影響的圖表，所 述影響通過脂質過氧化來測量。
發明的詳細描述 定義
為易于解釋本發明，提出如下定義。
本文所用的術語"紫色酸性磷酸酶(PAPs)"，表示存在于某些細菌、 植物以及動物優選植物中的紫色酸性磷酸酶。這個家族的所有成員均含 有一組特征性的與金屬連接有關的7個氨基酸殘基。本發明的PAPs特別 是指具有過氧化物酶活性或可由包括高鹽度、干旱和氧化脅迫的脅迫誘 導的那些PAPs。此類PAPs的實例包括但不限于大豆GmPAP3 (Liao d a/., 2003 Gewe318: 103-111)、擬南芥(JraZ)/(io;^"/w!/zVma) AtACP5(del Pozo " a/" 1999尸/朋Z丄19 (5): 579-589)、番茄IAP (Bozzo ^ a/" 2004歷oc/zew J. 377: 419-428)、番茄SAP1和SAP2 (Bozzo d a/" 2002 5z'oc/zem 269:
6278-6286)。優選地，PAP是大豆GmPAP3。
本文用于描述核苷酸序列之間相似程度的術語"基本上相同的"指，當比較和比對最大相似性時，具有至少約60%、優選至少約70%、更優 選至少約80%、更優選約90%至約99%、仍更優選約95%至約99%以及 最優選約99%的核香酸同一性的2條或更多條序列。最優選地，基本上 相同存在于包含全長編碼序列的核苷酸序列中。本文所用術語"全長" 指編碼功能性PAP多肽或蛋白或所述多肽或蛋白的氨基酸序列的完整可 讀框。優選地，本發明的核苷酸序列包含編碼酶的核苷酸序列或基本上 與其相同的序列，所述酶選自由大豆GmPAP3 (Liao， H, " a/., G五iVE (2003) 318: 103-111)、擬南芥AtACP5 (Accession No.: AJ133747)和番茄IAP組成 的組。
兩條核苷酸序列基本上相同的另一個標志是，所述兩個分子在嚴緊 條件下彼此特異性地或充分地雜交。
諸如Southern和Northern印跡分析的核酸雜交實驗環境下的"嚴緊 雜交條件，，和"嚴緊雜交洗滌條件"既是序列依賴性的又是環境依賴性 的。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。有關核酸雜交的詳細指導 見于Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes (生物化學和分子生物學實 驗技術-核酸探針雜交)，part I chapter 2, Elsevier, New York, N. Y.中。通常， 選擇的高度嚴緊雜交和洗滌條件比在確定的離子強度和pH下特定序列 的熱溶點(thermal melting point, Tm;K氐約5°C 。
術語"活性氧分子(ROS)"指氧部分還原或激活的衍生物，如單線態 氧、超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基。在低水平時，這些分子在細 胞信號傳遞過程中起作用。在較高水平時，這些分子是高活性和有毒的， 并能導致細胞的氧化破壞。
本文所用術語"非生物脅迫'，指對植物或植物細胞施加了不利影響 的非生命環境因子。在大多數情況下，根據植物存活、農作物產量、生 長(生物量累積)或與植物的全面生長有關的主要的同化作用過程(C02和 礦質吸收)來測量脅迫。非生物脅迫的實例包括但不限于高鹽度、干旱、 氧化脅迫以及^1端的寒冷或熱。特別是，"非生物脅迫"在本發明上下文 中指其不利影響是經由ROS產生的脅迫。 '
本文所用術語"啟動子"或"轉錄調控序列"或"轉錄調節序列"指距基因5'端一小段距離的調節區域，其作為RNA聚合酶的結合位點。 此類序列具有指導或者調節直接位于其下游的核酸序列轉錄的功能。存 在各種類型的啟動子，包括組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導啟 動子以及受特定生理條件如高水平的活性氧分子觸發的啟動子。可用于 本發明的啟動子的實例包括但不限于CaMV35S、Ubi、SAG12啟動子等。 更適宜的啟動子見于PlantProm凄U居庫(Shahmuradov d a/., 7Vwc/e/c爿czVfe i e化wcA, 2003, Vol. 31， No. 1 114-117)中。
本文所用術語"線粒體靶向轉運肽(MTTP)"，指遷移進入線粒體的信 號肽。通過其遷移，融合于其3'端的多肽也進入線粒體。線粒體靶向轉 運肽可見于在細胞質中合成的蛋白的N末端，隨后被轉運至線粒體中， 如ATP合成酶/5-亞單位的N末端。
本文用于描述表達構建體的術語"構建體"，指表達載體，還包含有 效插入所述載體的核苦酸序列，以便表達所述核苷酸序列。
本文所用術語"載體"，指核酸分子，優選來自例如質粒、細菌噬菌 體或植物病毒的DNA分子，核酸序列可插入或克隆于所述核酸分子中。 載體優選包含1個或多個獨特的限制位點，并且能在限定的宿主細胞包 括耙細胞或組織或其祖細胞或組織內自主復制，或可以與限定宿主的基 因組整合以便克隆的序列能復制。因此，所述載體可以是自主復制載體， 即，作為染色體外實體存在的載體，該載體的復制不依賴于染色體的復 制，例如，線性或閉環式質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色 體。所述載體可以包含確保自我復制的任何元件。可選地，載體可以是 這樣一個載體，即當導入細胞時，其整合于受體細胞的基因組，并與其 整合的染色體一起復制。載體系統可包含單個載體或質粒，2個或更多載 體或質粒，它們共同包含待導入宿主細胞基因組的總DNA，或包含轉座 子。載體的選擇通常取決于載體與待導入該載體的細胞的相容性。載體 還可以包4舌選"f奪標記，諸如用于選^^適宜的轉化體的抗生素抗性基因。 此類抗性基因的實例對本領域技術人員來說是熟知的。在本發明中，術 語"構建體"和"載體"可交換使用。
文本所用"異源核酸，，是指本質上彼此沒有可操作地連接或毗鄰的 核酸。通常，異源核酸指來自諸如不同物種的組織或DNA的不同來源的序列。例如，來自擬南芥的線粒體靶向肽，被認為與大豆的編碼結構域 是異源的。
本文所用術語"可操作地連接"指，以下述方式相對于編碼多肽的
多核苷酸定位轉錄和翻譯調節核酸在所述調節核酸的調控下轉錄所述 多核苷酸，并且任選地翻譯所述多肽。
本文所用短語"在植物細胞中可操作的"意指啟動子或調控序列能 在植物細胞中執行其正常功能，即指導和/或調節直接在其下游的編碼序 列的表達，其中所述植物細胞可以是活著的植物的 一部分或位于細胞培 養物中。
本文所用術語"選擇標記，，意指賦予表達標記基因的細胞獨特的表 型并由此使得此類轉化細胞不同于不具有所述標記的細胞的基因。選擇 標記基因可賦予基于對選擇Jf某介(如除草劑、抗生素、輻射、熱或破壞未 轉化的細胞的其他處理，包括非生物脅迫)的抗性而選^t奪的特性。可篩選 的標記基因(或報道基因)賦予可通過觀察或檢測即通過"篩選"而鑒定的 特性或表型(如未轉化的細胞中不存在的/3葡糖苷酸酶、熒光素酶或其他 酶活性)。
實現本發明的實施方案
在本發明中，已經發現靶向線粒體的PAP活性可成功地賦予植物細 胞或植物對非生物脅迫因子以及特別是高鹽度、滲透和氧化脅迫的耐受 性，其中氧化脅迫可通過活性氧分子(ROS)的累積來展示且可以是對主要 脅迫因子的繼發反應。植物和植物細胞可根據包括本發明的表達系統或 構建體的轉基因修飾展示這種耐受性，所述表達系統或構建體導致將PAP 活性耙向線粒體的蛋白的產生。這在下文的煙草植物細胞和擬南芥植物 中進行了說明，但決不是限于這些實例。任何高等植物或高等植物的細 胞都是本發明方法和材料的適宜對象。
本發明的方法可應用于任何植物，優選屬于被子植物門 (Angiospermae)和凈果子才直物門(Gymnospemae)階元(class)的高等植物。雙子 葉植物綱(Dicotylodenae)和單子葉植物綱(Monocotyledonae)亞階元(subclass)的植物特別適宜。雙子葉植物屬于下列目木蘭目(Magniolales)、 八角目(Illiciales)、樟目(Laurales)、胡椒目(Piperales)、馬兜鈴目 (Aristolochiales)、 睡蓮目(Nymphaeales)、 毛復目(Ranunculales)、 II粟目 (Papaverales)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、 昆欄樹目(Trochodendrales)、金 繞梅目(Hamamelidales)、杜仲目(Eucommiales)、塞子木目(Leitneriales)、 楊對每目(Myricales)、殼斗目(Fagales)、木麻黃目(Casuarinales)、石竹目 (Caryophyllales)、 肉穗果目(Batales)、 蓼目(Polygonales)、藍雪目 (Plumbaginales)、五椏果目(Dilleniales)、茶目(Theales)、錦葵目(Maivales)、 蕁麻目(Urticales)、玉蕊目(Lecythidales)、堇菜目(Violales)、楊柳目 (Salicales)、 白花菜目(Capparales)、 杜鵑花目(Ericales)、 巖梅目 (Diapensiales)、神初于目(Ebenales)、才艮春花目(Primulales)、蕃蔽目(Rosales)、 豆目(Fabales)、川草目(Podostemales)、小二仙草目(Haloragales)、桃金4良 目(Myrtales)、山茱萸目(Comales)、山龍眼目(Proteales)、檀香目(Santales)、 大花草目(Rafflesiales)、衛矛目(Celastrales)、大戟目(Euphorbiales)、鼠李 目(Rhamnales)、無患子目(Sapindales)、胡桃目(Juglandales)、維牛兒苗目 (Geraniales)、遠志目(Polygalales)、傘形目(Umbellales)、龍膽目 (Gentianales)、 花蔥目(Polemoniales)、 唇形目(Lamiales)、 車前'目 (Plantaginales)、 玄參目(Scrophulariales)、桔梗目(Campanulales)、 萏草目 (Rubiales)、續斷目(Dipsacales)以及菊目(Asterales)。單子葉植物屬于下列 目澤瀉目(Alismatales)、天南星目(Arales)、椋櫚目(Arecales)、鳳梨目 (Bromeliales)、鴨跖草目(Commelinales)、巴拿馬草目(Cyclanthales)、莎草 目(Cyperales)、谷精草目(Eriocaulales)、水鳘目(Hydrocharitales)、燈心草 目(Juncales)、茨藻目(Najadales)、繩草目(Restionales)、禾草目(Poales)、 霉草目(Triuridales)、香蒲目(Typhales)、姜目(Zingiberales)、露兜樹目 (Pandanales)、百合目(Liliales)和蘭目(Orchidales)。屬于棵子植物門階元的 植物是蘇鐵目(Cycadales)、松目(Pinales)、銀杏目(Ginkgoales)和買麻藤目 (Gnetales)。
本發明的方法優選用于對農業、園藝、能源工業、生物量轉化和/或 森林重要或有利的植物。實例有煙草(tobacco)、油菜(oilseed rape)、甜菜 (sugar beet)、 馬鈴薯(potatoes)、 番癡(tomatoes)、黃瓜(cucumbers)、 胡椒(peppers)、豆類(beans)、豌豆(peas)、柑桔(citrus fruits)、金f梨(avocados)、 桃(peaches)、蘋果(apples)、梨(pears)、漿果(berries)、李子(plums)、瓜類 (melons)、 癡子(eggplants)、 棉花(cotton)、 大豆(soybean)、 向曰葵 (sunflowers) 、 3文3鬼(roses)、《星《星木(poinsettia)、么委牽牛(petunia) 、 4艮月交菊 (guayule)、甘藍(cabbages)、菠菜(spinach)、紫花苜蓿(alfalfa)、朝鮮薊 (artichokes)、谷物(corn)、小麥(wheat)、稻米(rice)、黑麥(rye)、大麥(barley)、 草(grasses)如柳枝稷(switch grass)或草坪草(turf grass)、粟(millet)、大麻 (hemp)、香蕉(bananas)、 白楊(poplars)、碎要氺對(eucalyptus trees)以及+>類 (conifers)。
為了提供所需的靶向PAP蛋白，修飾植物細胞或植物，以包含編碼 諸如PAP或MTTP-PAP的相關蛋白的核苷酸序列，所述核芬酸序列4壬選 地可操作地連接于在植物中可操作的調控序列或者整合于基因組，以便 在內源調控序歹'J的調控下得以表達。
在本發明的一個實施方案中，用本發明的核酸構建體或載體轉染或 轉化植物細胞或植物。優選地，核酸構建體可以包含在植物中可操作的 調控序列，該序列可操作地連接于MTTP-PAP編碼序列，其中可以選擇 所述調控序列，以產生組成型、組織特異性或非組織特異性或可誘導的 表達。種類繁多的此類調控序列可在本領域中獲得，并且基因修飾的適 當載體也是熟知的，當然也可以商購。
在本發明的一個實施方案中，來自農桿菌(v4gra6a"m》)Ti質粒的二 元系統特別適合本發明。二元系統通常包括不同大小的2種載體。較大 的載體是輔助載體(helpervector),其包含較小載體攜帶的T-DNA整合入 植物細胞基因組中所需的基因。較小的載體，通常稱為二元載體，攜帶 待插入或克隆的基因。通常，將輔助載體提前轉化到適宜的農桿菌屬 C4groZ^cten^m)菌抹。許多此類農桿菌屬菌抹在本領域內是熟知的，如 LBA4404、 GV3101、 EHA101、 EHA105、 ABI等(Plant Molecular Biology Manual(植物分子生物學手冊).S. B. Gelvin和R. A. Schilperoort編輯，第 二版，Springer, 1994)。同樣，有許多可用于實施本發明的二元載體，如 pBR322、 pUC系列、pBI系列、pMON系列、pCambia系列、pGreen 系列等。二元載體的選擇取決于待轉化的植物種類。有關選擇適宜載體的知識在本領域普通技術人員的能力范圍內，并且可見于例如Plant Molecular Biology Manual(^L物分子生物學手冊)(S. B. Gdvin和R. A. Schilperoort編輯，第二版，Springer, 1994)中。
同樣，目前實現植物細胞的基因修飾和重建完整植物的技術在本領 域內是熟知的。在此方面，有關本領域技術狀況的有用總結，包括構成 本發明主旨的植物和植物細胞類型的相當廣泛的名錄，見于上文提及的 于2004年1月14日出版的美國專利7>布2004-0009476中，所述美國專 利以參考的方式并入本文，其公布了有關植物基因操作的適當技術以及 適用這些技術的植物和植物細胞的范圍。
此外，因為本發明的修飾細胞和植物對由滲透、高鹽度和/或氧化脅 迫引起的脅迫有抗性，所以含有核苷酸序列的表達系統或構建體可用作 成功轉化細胞的選擇標記，所述核香酸序列編碼可操作地連接于在植物 中可操作的調控序列的MTTP-PAP融合物。成功的轉化體具有更高的抗 性，并且因為標記賦予其對施加的脅迫的耐受性而能幸免于此脅迫。因 此，可根據轉化體幸免于此類脅迫狀況的能力來鑒定成功的轉化體。
本發明的MTTP-PAP融合蛋白包含賦予PAP活性的氨基酸序列和影 響所述融合蛋白向線粒體轉運的序列，所述線粒體是以這樣的方式定位 的，即MTTP有效運輸融合蛋白。1種此類融合蛋白如上文所述天然存 在于大豆中，并一皮Liao, H.等(同上)稱為然而，其他來源的編 碼具有PAP活性的蛋白的核苷酸序列或基本上與其相同的核苷S臾序列， 或者來自大豆的其他PAP編碼序列，例如擬南芥AtACP5以及番茄IAP， 也可通過制備構建體而用于本發明，所述構建體包括與其可操作連接的 MTTP編碼序列。因此，本發明包括此類構建體。
MTTP-PAP融合賦予對高鹽度、滲透脅迫和/或諸如由除草劑百草枯 導致的氧化脅迫耐受性的能力表現為多個方面，包括ROS改善、完整線 粒體的保留、生存力的維持、各種植物部分生長的增加以及細胞健康的 總體改善。
下文的實施例和結果證實和說明了本發明的方法和構建體是成功的。
下述實驗方案產生了下文實施例1-6的數據。轉基因煙草細胞系和轉基因擬南芥的建立
在組成型花椰菜花葉病毒(Cauliflower Mosaic Virus)35S啟動子的調 控下，將包含Gm尸j尸3或Gm/MP3-r7的重組構建體克隆至二元載體 (Brears & a/，尸/a"Z尸A—/. (1993) 103: 1285-1290)，并導入農桿菌 G4gra^c,m'i/m)。利用共培養法(An, G.， Plant尸/y^'o/. (1985) 79:568-570) 或真空滲透方案(Bechtold and Pelletier, J. Martinez-Zapater, J. Salinas, eds, Arabidopsis Protocols (擬南芥方案).Humana Press Inc., Totowa(1993) pp 259-266)，將構建體分別轉化入57-2細胞(GmE4尸3和GmiM尸3-r7)或擬 南芥(GmiM尸3)中。在含有抗生素的培養基上選擇轉化體后，進行用基因 特異性引物的PCR篩選，來證實轉基因已成功地整合于基因組中；并進 行Northern印跡分析來證實轉基因在轉基因細胞和植物品系中的表達。 對于轉基因擬南芥，獲得具有單個插入片段的T3純系的種子，并用于隨 后的生理研究。
基因表達研究
為了研究在NaCl和PEG處理下GmE4尸3的基因表達模式，首先， 將表面滅菌的大豆(Glycine max L. Merr. cv. Union)種子在含有改良的霍 格蘭溶液(Hoagland's solution: 4.5mMKN03、 3.6 mM Ca(N03)2、 1.2 mM NH4N03、 3.0mMMgSO4、 1.2 mM (NH4)2S04、 0.25 mM KH2P04、 4.5 MnS04、 4.5/iM ZnS04、 1.5jLiMCuS04、 0.4/xM (NH4)6Mo7024、 0.09 mM Fe-EDTA以及1.5 jiiMH3B03)的濾紙上萌發。萌發后，將統一生長階4爻的 一周齡的種苗轉移至含有相同培養基的液體培養系統中。在最初的三葉 打開之后，分別用補充了 125mMNaCl和5o/。PEG的改良的霍格蘭溶液 處理種苗。48小時后，收集經處理的植物的最嫩的完全展開的三葉，用 于提取總RNA。為了研究在PQ處理下Gm化尸3的基因表達模式，將表 面滅菌的種子在含有一半霍格蘭溶液的石英砂上萌發。萌發后，將統一 生長階段的10日齡的種苗轉移至含有相同培養基的液體培養系統中。在 將種苗平衡24日后，將10mMPQ溶液噴灑于三葉的兩面，并在4小時 后，收集葉子樣品。
進行Northern印跡分析，以地高辛(Digoxygenin, DIG) (Roche, Mannheim, Germany)標記的反義單鏈DNA探針作為探針。因為已將Gm/M尸3克隆入pBluescript II KS (+)載體中，所以使用 T3-(5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-S') 和 T7-(5
'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-S')啟動子引物合成PCR探針。 線粒體完整性分析
在用10 /xg/ml若丹明123 (Rhl23) (R302, Molecular Probes)染色前， 將細胞用200 mM NaCl處理1小時或用2 % PEG處理1小時。Rhl23的 信號通過綠色HeNe激光在543nm處激發。使用HQ590/70過濾裝置，并 通過Bio-Rad Radiance 2100系統收集共焦圖像。對于每個樣品，計數10-25 個細胞用于統計分析。
細胞生存力分析
在用0.4。/。的臺盼藍(T8154， Sigma)染色前，將細胞用200 mM NaCl 或2。/。PEG處理24小時。在光學顯微鏡下觀察染色的細胞。對于每個樣 品，計數約200個細胞。
ROS才全測
化學探針H2DCFDA作為細胞內ROS非侵入性的體內測量手段，已 經被廣泛使用(Allan, & a/.，Ce〃 (1997) 9: 1559-1572; D.R Maxwell " a/,A^/. v4c^/. t/M (1999) 96: 8271-8276)。在用200 mM NaCl處 理1小時或用2 % PEG處理1小時前，先用二氯雙氫熒光素二乙酸酯 (dichlorodihydrofluorescein diacetate, H2DCFDA)將細胞預染色30分鐘。 H2DCFDA信號通過488 nm氬激光激發，并使用HQ 515/30過濾裝置。 對于每個分析的細胞，使用相同水平的激光激發、光圈(Iris)和增益(Gain)。 H2DCFDA的熒光強度通過使用在美國國立衛生研究院網站 http:/7rsb.info.nih.gov/ii/上描述的程序進行評估。通過追蹤完整細胞(利用 選4奪工具)進行定量分析，并測量總熒光強度。隨后用細胞區域面積除以 該熒光強度測量值(以像素表示)，以獲得平均像素熒光強度。另外，測量 同一一見野的背景熒光強度，并將之減去。對于每個樣品，分析10-20個細 胞進行統計分析。
GmPAP3的亞細力包定位
使用GmPAP3-T7融合蛋白，研究GmPAP3的亞細胞定位。通過用 FITC的二抗進行的免疫標記使T7標簽的位置可視化。根據Jiang andRogers, J.Cell Biol. (1998) 143:1183-1199中的描述，同時作了微小更改后， 進行BY-2細胞固定和共焦免疫熒光檢驗。在固定和免疫標記前，先將細 胞用線粒體標記物橙色線粒體示蹤劑TM (MitoTracker OrangeTM) (M7510, Molecular Probes)預染色。橙色線粒體示蹤劑的信號通過543 nm綠色 HeNe激光激發，并使用HQ 590/70過濾裝置。FITC的信號通過488 nm氬 激光激發，并使用HQ 515/30過濾裝置。所有的共焦圖像均由Bio-Rad Radiance 2100系統釆集。
為了對FITC和橙色線粒體示蹤劑TM信號的共定位進行量化，綠色 (TITC)和紅紫色(橙色線粒體示蹤劑TM)圖像的疊加在綠色和紅紫色信號 重疊的地方產生了黃色。使用Image J1.34n程序(Sukumvanich " a/.,同 上)，計算由綠色像素面積分割的黃色像素面積。分析來自雙標記實驗的 至少10個不同細胞的圖像，以計算FITC和橙色線粒體示蹤劑TM信號的 共定位。
線粒體蛋白的提取
利用更改的Douce等(Douce, R.， d a/. MeZ/ o^s五"矽mo/. (1987) 148: 403-415)描述的差速離心法，提取線粒體蛋白。將植物材料在2體積冰冷 的提取培養基(0.25M蔗糖、5mMEDTA、 1 mM EGTA、 1 mM 二硫赤鮮 醇、0.1% BSA、含0.6% PVPP pH 7.4的10mM HEPES-TRIS)中輕輕地均 質化。經MiraclothTM過濾勻漿液，并以10,000 g離心10分鐘，將線粒體 直接從細胞質部分中分離。將所得的粗線粒體沉淀重懸浮于培養基I (含 0.25 M蔗糖、5mMEDTA、 1 mM EGTA、 0.1% BSA的pH 7.4的10 mM HEPES-TRIS)中，并以600g離心5分鐘，除去細胞核和重細胞碎片。重 復這種洗滌步驟2次。將經洗滌的線粒體重懸浮于培養基II(含0.25 M蔗 糖，30]LtMEGTA的pH7.4的lOmMHEPES-TRIS)中，并保存于冰上。
轉基因擬南芥在鹽處理下的根部生長分析
將轉基因系(Gm/M尸3和空載體)及它們未轉化的親本哥倫比亞-0 (Columbia-0， Col-0)的種子播種于包含3 %蔗糖和0.9 % (w/v)瓊脂的直 立MS平板上。將種苗(萌發后7天)轉移至對照MS瓊脂平板或補充了 150 mM NaCl的MS瓊脂平板上。記錄處理前和處理后7天每顆種苗的根部 長度并計算根部生長的百分比。轉基因擬南芥在PEG處理下的才艮部生長分析
將轉基因系(Gm/M尸3和空載體)及它們未轉化的親本哥倫比亞-0 (Col-0)的種子播種于包含3 %蔗糖和0.9 % (w/v)瓊脂的MS平板上。將 種苗(萌發后7天)轉移至對照MS瓊脂平板或補充了 15%聚乙二醇6000 (PEG)的MS瓊脂平板上。記錄處理前和處理后7天每顆種苗的根部長度 并計算根部生長的百分比。
由于PEG在倒入平板前不能溶解于瓊脂中(PEG會阻止瓊脂聚合)， 因此通過使用PEG浸漬的瓊脂平板實現PEG處理。按Verslues(Verslues, P. E.， a/， 77zeJowma/ (2006) 47: 776-787)的描述，且稍加改善后， 制備PEG浸漬的瓊脂平板。為MS瓊脂培養基和所需平板數目的PEG覆 蓋物(PEG overlay)制備適量的MS，將其pH調整為5.7。將9 g/L瓊脂加 入到制備瓊脂平板所用的溶液中。未向用于PEG覆蓋物的溶液中加入瓊 脂，但改為直接高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌后，將20mlMS培養基倒 入100 mm2的平板上。對于MS培養基(無瓊脂)，加入15% PEG。 MS瓊 脂平板凝固后，在每個平板上加入30 ml的PEG覆蓋物。將平板浸漬在 PEG覆蓋物中，并允許其平衡至少16小時。只在使用前，才倒掉PEG 覆蓋物，并直接使用PEG浸漬的平板。
轉基因擬南芥在百草枯處理下的根部生長分析
將轉基因系(G附E4尸3和空載體)及它們未轉化的親本Col-0的種子播 種于包含3 %蔗糖和0.9 % (w/v)瓊脂的直立MS平板上。將種苗(萌發 后7天)轉移至對照MS瓊脂平板或補充了 1 /xm PQ的MS瓊脂平板上。 記錄處理前和處理后7天每顆種苗的根部長度并計算根部生長的百分比。
脂質過氧化物檢測
如Sattler等(Sattler " a/.,尸/朋f Ce〃 (2004) 16: 1419-1432)所述，用 FOX分析測定脂質過氧化物。用400 /iL含有0.05%丁基羥基曱苯的曱醇: 二氯曱烷(l:l [v/v])和50/iL的150mM乙酸提取12顆種苗。通過加入300 /iL水，渦旋并以3,750 g離心，使脂質進入有機相。在室溫下用FOX溶 液孵育脂質提取物30分鐘。孵育后，用微板讀數儀直接在595 nm處測 量吸光率。按制造商實驗方案中所建議的，使用過氧化氬繪制標準曲線。 18:2衍生的脂質氫過氧化物與FOX試劑的反應性幾乎與過氧化氫相同(DeLong & 《/，爿gn.c. Fo^/. C7ze附.(2002) 50: 248-254)。 統計分析
使用SPSS(版本12.0)統計包，分析數據。顯示展示了顯著差異(pO.Ol)
的才羊品。
實施例1
Gm/M尸j在線粒體中的定位
將Liao等(Liao, H. e^/. (2003) 318:103-111,同上)所述的編碼大 豆Gm/M尸3的核苦S臾序列克隆入與煙草細胞兼容的表達載體中，作為上 文所述的與T7的融合蛋白。這種表達載體用于轉化煙草BY-2細胞。
用共焦免疫熒光定位研究GmPAP3的亞細胞定位。用FITC偶聯的 二抗標記BY-2細胞中產生的GmiM尸J-T7標簽融合蛋白。用橙色線粒體 示蹤劑TM(MitoTracker-OrangeTM)熒光染料特異性標記線粒體。FITC和橙
色線粒體示蹤劑TM信號共定位的百分比表示為與橙色線粒體示蹤劑TM信
號共定位的FITC的量。對于分析的細胞數目而言，共定位百分比表示為 平均值士標準偏差(SD),如下表所示。
Gm/MP3轉基因細胞系共定位的百分比 (平均值士SD)被分析的細胞數
1535-166.11±5.56%29
1535-264.84±4.16%31
1535-367.20±4.69%27
1535-462.33±3.33%17
野生型和1535-2的結果也顯示于
圖1中。
實施例2
GmPAP3在線粒體中共定位的選擇性測量
培養實施例1中提供的轉基因BY-2細胞，以產生GmPAP3。提取線 粒體蛋白，用GmPAP3特異性抗體進行免疫檢測。結果顯示于圖2A中。 其中，WT表示來自野生型BY-2細胞系的線粒體蛋白部分；9111和9112表示從Gm/M尸3轉基因細胞系提取的線粒體蛋白；J23表示從大豆栽培變 種J23屮提取的線粒體蛋白。正如所觀察的，GmPAP3位于線粒體部分。 圖2B顯示GmPAP3在線粒體中定位的電子顯微鏡觀察結果，其是 圖2A中結果的可選擇性證實。按Tse等(Tse YC, & fl/" Dynamic response of prevacuolar compartments to Brefeldin A in Plant Cells (植物纟田胞中的液 泡前體對布雷菲德菌素A的動態反應).P/朋,(2006)142: 1442-1459)所述的方法，并稍加改善后，進行包埋和電鏡觀察。將樣品在 含有溶于50 mM pH 7.4磷酸緩沖液的0.25% (v/v)戊二醛和1.5% (v/w) 多聚曱醛的初級固定溶液中于室溫下固定15分鐘，而后在4。C孵育16 小時。室溫下用磷酸緩沖液洗滌后，將細胞在梯度乙醇中脫水，隨后包 埋于Lowicryl (HM20)樹脂中。而后使用Ultra Cut S (Leica, Wetzlar， Germany),用這些包埋塊制備超薄切片。使用GmPAP3特異性抗體作為 一抗，隨后用金偶聯的抗兔二抗檢測。接著用4%的乙酸鈾酰將免疫標記 的切片進行后染色(post-stained),并用透射電子顯微鏡(JEM-1200EXI1, JEOL， Tokyo, Japan)才企測。
實施例3
鹽度和干旱脅迫下G^B4PJ對線粒體膜完整性的影響 培養實施例1中制備的轉基因BY-2細胞系，以表達GmPAP3蛋白， 并將其用上文所述的氯化鈉或聚乙二醇(PEG，滲透脅迫)處理，結果如圖 3A-3L所示。將線粒體完整性的結果與存在抗壞血酸時的影響進行比較。 結果顯示于下文的表中，該表概括了圖3A-3L的數據。該數據是計數10-25 個細胞以及重復2次的實驗的結果。百分比表示為3次實驗的平均值土 SD，其中，^表示基于單因素方差分析(one-wayANOVA)及隨后的Tukey 4企-驗(Tukey test),在相同處理條件下與野生型BY-2細胞的統計學差異 (pO.Ol)。細胞系_具有完整線粒體的細胞的百分比(％)
對照NaClPEG
野生型BY-2100%45.27 ± 6.347.98 ±3.1
野生型BY-2 +100%86.20 ±3.3**82.16 ±3.7峙
10mM抗壞血酸
GVwiM尸3轉基因細胞系20100%81.36 ±3.9峙81.32 ±5.6**
Gw/M尸3轉基因細月包系29100%80.40 ± 4.7**79.5 ±6.9**
將未補充抗壞血酸的野生型(wild type, WT)Sy-2細胞(圖3A-3C)和 Gm/M尸3轉基因S7-2細胞系#20和#29(分別為圖3G-31 & 3J-3L),以及補 充了 10mM抗壞血酸(+Asc)的野生型5y-2細胞(圖3D-3F)，在沒有脅迫 的細胞培養基(圖3A、 3D、 3G和3 J)中、在含200 mM NaCl的細胞培養 基(圖3B、 3E、 3H和3K)中或在含2。/。PEG的細胞培養基(圖3C、 3F、 31 和3L)中預處理1小時，然后再用10 /ig/mL RM23染色1小時。使用共 焦激光掃描顯微鏡，觀察Rhl23的信號(參見材料和方法)。對于每個細胞 系，計數10-25個細胞。比例尺50/mi。
實施例4
脅迫對GmPAP3提供的生存力保護的影響
進行實施例3的實驗，但使用生存力而不是線粒體完整性來評估。 生存力通過用臺盼藍染色評估。在用臺盼藍染色前，將細胞用200 mM NaCl或2 % PEG處理24小時。如下文表中所示，將百分比表示為約200 個細胞的平均值士SD，其中**表示基于單因素方差分析及隨后的Tukey 檢驗，在相同處理條件下與野生型BY-2細胞的統計學差異(p0.01)。指
數a和b表示兩組獨立的實驗。
細胞系存活細胞的百分比(％)
未處理200 mM NaCl2% PEG
野生型BY-2a98.70±2.548.30±8.866.81±8.2
野生型BY-2+97.52±5.992,68±8.0**94.87土9.2**
10mM抗壞血酸a
野生型BY-2b93.41±10.642.14土6.960.63±13.2
Gm尸j尸3轉基因細胞系20b94.61±6.079.70士16.7**95.96土6.1**
Gm/M尸3轉基因細胞系29b98.14±2.685.97±18.1**91.76士12.6"使用圖4A-4L所示的組織學評估，獲得了相似的結果。將未補充抗 壞血酸的野生型(WT)SK2細胞(圖4A-4C)和Gm/M尸3轉基因"r-2細胞系 #20和#29(分別為圖G-I & J-L),以及補充有10 mM抗壞血酸(+Asc)的野 生型5K2細胞(圖4D4F)，在沒有脅迫的細胞培養基(圖4A、 4D、 4G和 4J)中、在含有200mMNaCl的細胞培養基(圖4B、 4E、 4H和4K)中或在 含有2%PEG的細胞培養基(圖4C、 4F、 41、 4L)中預處理24小時。用0.4% 的臺盼藍對處理過的細胞進行染色。非存活細胞被染成了藍色。對于每 個細胞系，計數約200個細胞。比例尺二50/mi。
實施例5
GmiM尸J對ROS的影響
如圖5A-5L所示，Gmi^P3可降低遭受鹽和滲透脅迫的BY-2細胞中 ROS的累積。將未補充抗壞血酸的野生型(WT)^7-2細胞(圖5A-5C)和 Gmi^4i^轉基因5r-2細胞系#20和#29(分別為圖5G-5I和圖5J-5L)，以及 補充了 10 mM抗壞血酸(+Asc)的野生型J5K2細胞(圖5D-5F),用 H2DCFDA預染色30分鐘，然后將上述細胞置于無脅迫的細胞培養基(圖 5A、 5D、 5G、 5J)中、含有200 mM NaCl的細胞培養基(圖5B、 5E、 5H、 5K)中或含有2。/。PEG的細胞培養基中1小時(圖5C、 5F、 51、 5L)。使用 共焦激光掃描顯微鏡，觀察H2DCFDA的信號。對于每個細胞系，計數 10-20個細力包。比例尺=50 jitm。
這些結果也以圖形的方式進行了顯示，如圖6所示。 熒光強度通過ImageJ計算，并通過單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)檢驗分析獲得的數據，在此情況下，每個細胞系之間 的顯著差異通過Tukey檢驗測定。**表示均值差異(與野生型相比)在 p<0.01的水平是顯著的。
實施例6
Gw/M尸j對擬南芥中脅迫應答的影響
在這些實驗中，使用已經被修飾以產生上文所述的Gm/M尸3的擬南 齊品系F42和C25。首先，研究了鹽脅迫對擬南芥根部生長的影響。將來自野生型親本(ColO)、空載體轉基因對照(V7)以及兩種獨立的GwtR4尸3 轉基因品系(F42和C25)的種子，播種于MS瓊脂平板上。將幼小種苗轉 移至對照MS瓊脂平板(CT)或補充了 150 mM NaCl的MS瓊脂平板上。 評估根部生長的百分比，并顯示于圖7中。誤差棒(errorbar):標準誤差。 N=48。通過單因素方差分析(ANOVA)檢驗分析獲得的數據，在此情況下， 單個品系之間的顯著差異通過Tukey檢驗測定。**表示均值差異(與野生 型相比)在p<0.01的水平下是顯著的。
如圖7所示，盡管鹽的存在消弱了野生型的生長，但卻提高了轉化 林根部的生長。
接下來研究了 PEG脅迫對擬南芥根部生長的影響。將來自野生型親 本(ColO)、空載體轉基因對照(V7)以及兩種獨立的Gm/M尸3轉基因品系 (F42和C25)的種子，播種于MS瓊脂平板上。將幼小種苗轉移至對照 MS瓊脂平板(CT)或補充了 15% PEG的MS瓊脂平板上。評估根部生長 的百分比，并顯示于圖8中。誤差棒標準誤差。N=48。通過單因素方 差分析(ANOVA)檢驗分析獲得的數據，在此情況下，單個品系之間的顯 著差異通過Tukey斥企驗測定。**表示均值差異(與野生型相比)在p<0.01 的水平下是顯著的。
研究了氧化脅迫對擬南芥根部生長的影響。將來自野生型親本 (Co10)、空載體轉基因對照(V7)以及兩種獨立的GmE4尸3轉基因品系(F42 和C25)的種子，播種于MS瓊脂平板上。將幼小種苗轉移至對照MS瓊 脂平板(CT)或補充了 1 百草枯的MS瓊脂平板上。根部生長的百分比 顯示于圖9中。誤差棒標準誤差。N=48。通過單因素方差分析(ANOVA) 檢驗分析獲得的數據，在此情況下，單個品系之間的顯著差異通過Tukey 檢驗測定。輯表示均值差異(與野生型相比)在pO.Ol的水平下是顯著的。
研究了 GmiM尸3轉基因擬南芥在氧化處理情況下的脂質過氧化。如 上文所述，培養種苗并用百草枯處理。通過FOX分析測量脂質過氧化， 并將結果顯示于
圖10中。將18:2衍生的脂質氫過氧化物(LOOHs)水平的 反應性表示為摩爾LOOHs/g鮮重(fresh weight, FW)。誤差棒標準誤差。 N=4 (對于每個數據點，4組12顆種苗)。通過單因素方差分析(ANOVA) 檢驗分析獲得的數據，在此情況下，單個品系之間的顯著差異通過Tukey檢驗測定。**表示均值差異(與野生型相比)在p<0.01的水平是顯著的, 空心條形和實心條形分別表示未處理的對照和處理的樣品。
權利要求
1.保護植物或植物細胞免遭非生物脅迫的方法，包括修飾所述植物或植物細胞以產生具有靶向線粒體的紫色酸性磷酸酶(PAP)活性的酶。
2. 如權利要求l所述的方法，其中所述非生物脅迫是選自鹽度增 加、滲透脅迫和氧化脅迫中的一種或多種狀況。
3. 如權利要求l所述的方法，其中所述植物或植物細胞已被修飾 以包含異源核酸，所述異源核酸包含編碼與線粒體靶向轉運肽(MTTP) 融合的、具有PAP活性的酶的核苷酸序列或基本上與其相同的核苷酸 序列。
4. 如權利要求3所述的方法，其中所述具有PAP活性的酶是大豆 GmPAP3。
5. 如權利要求3所述的方法，其中所述編碼MTTP的核苷酸序列 部分與所述編碼具有PAP活性的酶的核苷酸序列部分是異源的。
6. 轉基因植物細胞，其包含異源核酸，所述異源核酸包含編碼與 線粒體耙向轉運肽融合的、具有PAP活性的酶的核苷酸序列或基本上 與其相同的核苷酸序列。
7. 重組核酸構建體，其包含編碼與MTTP融合的、具有PAP活 性的酶的核苷酸序列或基本上與其相同的核苷酸序列，所述序列與在 植物細胞中可操作的調控序列可操作地連接。
8. 如權利要求7所述的核酸構建體，其中所述編碼具有PAP活性 的酶的核苷酸序列部分與編碼MTTP的核苷酸序列部分是異源的。
9. 如權利要求7或8所述的核酸構建體，其中所述調控序列與編 碼具有PAP活性的酶以及融合的MTTP的核苷酸序列是異源的。
10. 如權利要求9所述的核酸構建體，其中所述編碼具有PAP活 性的酶的核苷酸序列部分是大豆Gm/M尸3。
11. 權利要求7所述的核酸構建體還包括第二核苷酸序列，其編 碼與在植物中可操作的調控序列可操作地連接的目的蛋白。
12. 選擇轉化的細胞或植物的方法，其中所述方法包括向經作為 選才奪標記的重組構建體轉化的細胞或植物施加非生物脅迫，由此選擇 對所述非生物脅迫有抗性的細力包或才直物，所述重組構建體包含編碼與 MTTP融合的、具有PAP活性的酶的核苷酸序列或基本上與其相同的 核苷酸序列。
13. 如權利要求12所述的方法，其中所述非生物脅迫是高鹽度、 滲透脅迫和/或氧化脅迫。
14. 如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述保護導致完 整線粒體的維持和/或減少ROS和/或維持生存力。
15. 轉基因植物細胞，其包含權利要求7-11中任一項所述的核酸 構建體。
16. 如權利要求6所述的轉基因植物細胞，其中所述具有PAP活 性的酶是大豆GmPAP3 。
17. 制備抵抗非生物脅迫的植物或植物細胞的方法，其包括修飾 植物或植物細胞，以產生具有靶向線粒體的紫色酸性磷酸酶(PAP)活性的酶。
18. 如權利要求17所述的方法，其中所述非生物脅迫是選自鹽度 增加、滲透脅迫和氧化脅迫中的一種或多種狀況。
19. 如權利要求17所述的方法，其中所述植物或植物細胞已被修飾以包含異源核酸，所述異源核酸包含編碼與線粒體靶向轉運肽(MTTP)融合的、具有PAP活性的酶的核苷酸序列或基本上與其相同的 核苷酸序列。
20. 如權利要求19所述的方法，其中所述具有PAP活性的酶是大 豆GmPAP3。
21. 如4又利要求19所述的方法，其中所述編碼MTTP的核苷酸序 列部分與所述編碼具有PAP活性的酶的核普酸序列部分是異源的。
全文摘要
本發明公開了保護植物或植物細胞免遭由鹽度和干旱以及氧化脅迫引起的非生物脅迫的方法，包括修飾所述植物或植物細胞，以產生具有靶向線粒體的紫色酸性磷酸酶(PAP)活性的酶。具體來說，將諸如GmPAP3的編碼大豆紫色酸性磷酸酶的核苷酸序列或與所述核苷酸序列基本相同的序列用于本發明的方法或構建體中。
文檔編號A01H1/00GK101541165SQ200780030028
公開日2009年9月23日 申請日期2007年8月20日 優先權日2006年8月18日
發明者林漢明, 辛世文, 邵桂花 申請人:香港中文大學