對鞘翅目害蟲高效的蘇云金芽孢桿菌cry8H基因、蛋白及其應用的制作方法

專利名稱：：對鞘翅目害蟲高效的蘇云金芽孢桿菌cry8H基因、蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物防治
技術領域：
，本發明涉及對鞘翅目害蟲高毒力的cry8H基因的核苷酸序列，涉及對鞘翅目害蟲高毒力的蛋白質的氨基酸序列，涉及，人工設計合成的可以在植物中表達的cry8H基因的核苷酸序列，涉及該人工設計的cry8H基因的核苷酸序列編碼的蛋白質氨基酸序列，涉及含有cry8H基因的重組菌株，涉及使用該基因構建表達載體，還涉及利用上述基因序列進行植物轉化的方法。技術背景金龜子屬于鞘翅目金龜總科(Scarabaeidae)，其幼蟲(俗稱蠐螬，本發明以下也簡稱為"蠐螬")是一類重要的世界性分布地下害蟲，可危害糧食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料作物、煙草、牧草、花卉、草坪草、果樹等多種植物。大量調査表明，蠐螬在地下害蟲中的危害居首位，其中主要以鰓金龜科和麗金龜科幼蟲為主，占總地下害蟲量的70-80%以上。據統計每年全國蠐螬發生面積約1億畝，嚴重年份曾達3億2千萬畝，產量損失高達20%以上，有些地塊甚至絕產。近年發生面積最大、發生量最多的為黃淮海地區，主要危害糧食、油料等作物；其它地區的危害情況也很嚴重，如危害甘蔗的蠐螬，在廣東、廣西、云南、四川、福建等地普遍發生在西藏、青海、甘肅、新疆等西部地區，蠐螬的發生也很嚴重(魏鴻鈞等，《中國地下害蟲》，上海上海科學技術出版社，1989，1-41;王永祥等，"冀中平原區蠐螬種類及綜合防治技術"，《河北師范大學學報》(自然科學版)，1998，22(2):268-270)。以在我國油料作物中種植面積僅次于油菜居第二位的花生為例。我國的花生產量占世界花生總產量的35%左右，居世界首位，年出口收入達207億美元，2001年全國花生面積(500萬公頃)和總產(1450萬噸)均達到歷史最高水平。但鱭螬對花生的危害十分嚴重。為控制蠐螬的危害，一般采用農業、化學、物理等綜合防治策略，這雖有一定成效，卻難以達到持續控制的效果。因此，尋找新的有效防治方法，已成為當務之急。在獲得對蠐螬高毒力Bt基因的基礎上，培育殺蠐螬的轉基因植物是一條值得探索的新的防治途徑。蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis,簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細菌。它在形成芽抱的同時，能產生蛋白性質的伴孢晶體(parasporalcrystal)，對鱗翅目(L印idoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hy國optera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動物具有特異性的殺蟲活性(Schn印f，E.N.etal，Microbiol.AndMolecularBiologyReview,1998,62:3775-806)。這種殺蟲晶體蛋白(InsecticidalCrystalProteins,ICPs)又稱S-內毒素(delta-endotoxin)，對人畜無害，不污染環境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了最廣泛的應用。目前人們已經克隆了近400種編碼殺蟲晶體蛋白的Bt殺蟲基因，它們分屬157種模式基因。近年國際上cry8類基因的研究動向引人矚目。研究表明，這類基因對金龜子科、象甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有殺蟲作用。1992年，Ohba等在世界上首次從Bt菌株中篩選出對金龜子幼蟲具有特異殺蟲活性的新菌株(B.t.subsp.JaponensisBuiBui)(0hba，M.etal.，AuniqueisolateofBacillusthuringiensisserovarjaponensiswithahighlarvicidalactivityspecificforscarabaeidbeetles,LettersinAppliedMicrobiology,1992.14:54-57)，1994年Sato等從中克隆出一種新的殺蟲基因cry8C(Sato，R.etal,Cloning,heterologousexpression,andlocalizationofanovelcrystalproteingenefromBacillusthuringiensisserovarjaponensisstrainbuibuitoxictoscarabaeidinsects,Curr.Microbiol,1994.28:15-19.4)。目前已發現11種cry8類基因，編碼的蛋白由1160-1210個氨基酸組成，分子量在128-137kDa之間。詳細的信息見表1(Asano，S.，Yamanaka,S,andTakeuchi,K.,Proteinhavinginsecticidalactivity,DNAencodingtheprotein,andcontrollingagentandcontrollingmethodofnoxiousorganisms,2002,JP2002045186-AandJP2002045186-A/2))。其中美國Mycogen公司分離的Cry8Aal和Cry8Bal對金龜科的多種害蟲具有明顯的殺蟲活性(TracyE.Michaels,etal.，Bacillusthuringiensistoxinsactiveagainstscarabpests,1994,USP5554534)。美國從Bt菌株中分離了兩種基因cry8Bbl和cry8Bcl基因，發現對西方玉米根葉甲(Westerncornrootworm)具有顯著的殺蟲效果并已用于轉基因抗蟲玉米的丌發(Abad,Andre,R.,DuckNicholas,B.，Feng,Xiang,FlannaganRonald,D.,Kahn,Theodore,W.，Sims,Lynne，E.Genesencodingnovelproteinswithpesticidalactivityagainstcoleopterans,2002,W002/34774A2)。在我國，河北省農業科學院植物保護研究所和河北農業大學近年來先后篩選獲得多株對黃褐麗金龜(Anomalaexoleta)和銅綠麗金龜(A.corpulenta)幼蟲具有特異殺蟲活性的Bt菌株，室內生測死亡率均達100%(馮書亮等，"一株對金龜子類幼蟲具有殺蟲活性的蘇云金桿菌新分離株"，《中國生物防治》，2000，16(2):74-78)。表1蘇云金芽孢桿菌Cry8類殺蟲晶體蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>
發明內容本發明提供一種對大黑鰓金龜等鞘翅目重要害蟲具有高毒力的蘇云金芽孢桿菌cry8H模式基因序列，以應用于轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。蘇云金芽孢桿菌菌株BT-SU4，其保藏號為CGMCC2071。對鞘翅目害蟲高效的蘇云金芽孢桿菌cry8Hal基因，其核苷酸序列如SEQIDN01所示。一種工程菌菌株BioT8H，其特征在于含有cry8Hal基因。對鞘翅目害蟲高效的蘇云金芽孢桿菌cry8Hal蛋白，由上述cry8Hal基因所編碼，其氨基酸序列如SEQIDN02所示。cry8Hal蛋白在制備殺害鞘翅目害蟲藥劑中的應用。一種蛋白，具有上述蛋白相同的功能，其氨基酸序列如SEQIDN04所示.一種人工改造合成的mcry8Hal基因，其編碼上述的蛋白，其核苷酸序列如SEQIDN03所示。一種植物表達載體p3300U8H，其特征是該植物表達載體由mcry8Hal基因序列、組成型表達啟動子或根特異性啟動子、終止子和一種能在大腸桿菌和根癌農桿菌中穿梭的雙元載體所構建。mcry8Hal基因在植物抗鞘翅目害蟲中的應用。所述應用為將含有mcry8Hal基因的植物表達載體p3300U8H轉化植物或微生物，使之產生抗鞘翅目害蟲的毒性。所述植物是草坪草。所述應用為將mcry8Hal基因表達的蛋白制備成藥劑，用于殺滅鞘翅目害蟲。本發明從河北土壤分離得到菌株BT-SU4，其保藏編號為CGMCC2071，其生物學特性為在生長周期中可以產生芽胞，并且同時產生有毒殺作用的伴胞晶體。根據cry8類基因保守區設計了一對通用引物SN5un85—-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3、SN3un85'-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3、PCR擴增鑒定BT-SU4菌株，擴增結果(見附圖l)，其顯示條帶與己知cry8類基因(見表3)均不同，表明菌株BT-SU4中可能含有新的cry8殺蟲基因。設計一對全長基因引物cry8H5/cry8H3用來擴增全長基因。并且引入BamHI/Sail用于克隆與表達，弓l物對cry8H5/cry8H3的序列如下cry8H5:ggaattcgatgagtccgaataatcagaatcry8H3:cgcgtcgacttacatttcttctacaatcaattc以菌株BT-SU4的總DNA為模板，用pfuDNA聚合酶，進行PCR擴增，結果(見附圖2)顯示擴增出約3.5Kb的條帶，與載體pET21b連接轉化大腸桿菌JMllO，得到重組質粒pSASSU4(附圖2)。對插入片斷進行測序分析，得到序列SEQIDNO1為pSASSU4中BamHI/Sail雙酶切片段，序列全長3672bps，分析表明其含有開放閱讀框，0RF1的位置是1-3672，GC含量為38.%，編碼1223個氨基酸組成的蛋白。經測定，其氨基酸序列為SEQIDNO2所示。同源分析表明該蛋白與Cry8類蛋白具有較高同源性，表4為其同源性數據。由于與已知的Cry8類蛋白氨基酸同源性均低于7鄉，最高只有58.2鬼(Cry8Bbl)，被Bt殺蟲晶體蛋白命名委員會命名為Cry8Hal。引物cry8H5/cry8H3分別引入BamHI和Sail位點，以菌株BT-SU4質粒DNA為模板，擴增得到全長基因，插入Bt表達載體pSTK中得到重組質粒pSK08H(見附圖3)，轉化大腸桿菌SCSllO，提取質粒，電擊轉化Bt無晶體突變株HD-73-中(該突變株來源于中國農業科學院植物保護研究所生物技術實驗室，可以向公眾提供，見李海濤等，農業生物技術學報2005Vol.13No.6P,787-791)，得到工程菌BioT8H。將上述工程菌BioT8H于30'C于牛肉膏培養基(蛋白胨5克，牛肉膏3克，葡萄糖10克，水1000mL，12rC，20分鐘高壓蒸汽滅菌)中培養，提取蛋白進行SDS-PAGE電泳分析(方法參見Sambrook,J.etal，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.1989)，結果(見附圖4)。結果表明工程菌BioT8H中的cry8Hal基因獲得了表達，表達物的分子量為130kDa左右。Cry8Hal蛋白的活性測定表明，表達的Cry8Hal具有殺華北大黑鰓金龜和暗黑鰓金龜幼蟲的活性。根據微生物和植物對密碼子偏好的不同，對cry8Hal基因的l-2010bp的序列進行了優化。本發明按照cry8Hal基因的人工改造序列進行了全基因合成，新基因見SEQIDNO3所示的核苷酸序列，對應蛋白序列見SEQIDNO4。cry8Hal基因與mcry8Hal(modifiedcry8Hal)基因的核苷酸序列同源性只有86.88%，G+C含量也由原來cry8Hal的37.6%提高為50.1%。調整了Cry8Hal蛋白的氨基酸密碼子使用頻率，使mCry8Hal蛋白的氨基酸密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近，將cry8Ha基因的人工改造序列兩端引入BamHI和Sacl位點(見SEQIDNO3),連至pUC57載體(該載體為常用載體，GenBank登錄號為Y14837)，重組質粒命名為pUC57-tncry8H。用BamHI和Sacl酶切質粒pUC57-mcry8H(中國農業科學院植物保護研究所生物技術組保存)回收2.0kb片段，用同樣的內切酶酶切質粒pCAMBIA3300(該載體為常用載體，中國農業科學院植物保護研究所生物技術組保存，見張曉國等武漢植物學研究，2000Vol.18No.1P.15-20)，回收10kb片段，將兩個片段連接，轉化大腸桿菌DH5a，得到陽性轉化子，把此新構建質粒命名為p3300U8H。該質粒含有組成型表達的啟動子Ubiquitin(即一段DNA序列，可以驅動所連接的基因片段進行轉錄，進而翻譯成蛋白質，組成型表達的啟動子可以調控基因在生長發育的任何階段和任何組織都有表達)、mcry8Ha基因和N0S終止子(一段DNA序列，含有基因表達的終止信號)。質粒構建圖見附圖5,該質粒可以轉化植物，獲得轉基因植物。。將人工合成改造的基因mcry8Hal農桿菌轉化，制備得到陽性克隆，再轉化草坪草，轉基因草坪草的生物活性檢測表明，轉基因植株表現出了良好的抗華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)性能。轉基因草坪草的抗華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)性能是因為在植物體中有啟動子啟動人工改造的mcry8Hal基因的轉錄，表達了Cry8H蛋白，雙元載體中的表達盒——組成型啟動子、人工改造的mcry8Hal和終止子只有整合到草坪草的基因組中才能表達外源基因，所以可以用此雙元載體轉化任何已建立農桿菌轉化方法的植物，獲得的轉基因植物都具有抗華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiapamllela)性能。生物保藏信息微生物名稱(屬、種的學名)芽孢桿菌屬蘇云金芽孢桿菌^Jc/7A/5^力"r/z^/e/75"is保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏日期2007年6月1R保藏編號CGMCC2071圖1:菌株BT-SU4的PCR-RFLP圖譜。其中M.DNA分子量標準1.PCR產物2.PCR產物酶切圖2:重組質粒pSASSU4酶切圖譜。其中M.DNA分子量標準1.PCR產物BamHI/Sa11酶切2.載體pET21bBamHI/SalI酶切3.重組質粒pSASSU4BamHI/Sa11酶切圖譜圖3:重組質粒pSK08H酶切圖譜。其中M.DNA分子量標準1.PCR產物B咖HI/Sa11酶切2.重組質粒pSK08HBamHI/Sa11酶切圖譜3.載體pSTKBamHI/SalI酶切圖4:cry8Hal基因在Bt無晶體突變株中的表達。其中M.蛋白質分子量標準1.HD-73-2.BioT8H3.BT-SU4圖5:p3300U8H質粒構建圖圖6:轉化草坪草的分子檢測，其中M.DNA分子量標準1至5.為部分陽性轉基因植株檢測結果具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一歩的詳細說明。實施例11.1菌株BT-SU4中cry基因鑒定根據cry8類基因保守區設計了一對通用引物SN5un8-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3'SN3un85'-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3'表2是這些基因與引物的同源序列，表3是用這對引物預測的cry8基因擴增產物酶切片段大小，通過這種PCR-RFLP方法可以分別鑒定出將這些基因。表2引物與cry8各基因的保守區配對情況及配對區在基因上的位置<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>用下列PCR反應體系(5(^L)鑒定了Bt菌株185:10xPCRbuffer5pLMgCL(20mM)6pLdNTP(10mM)1jiL引物對(10mM)lpL/個模板luLTaq聚合酶(5U/VU0.5pL超純水補至50faL，混勻離心，加石蠟油30nL。擴增循環94'C變性1分鐘，54。C退火1分鐘，72'C延伸4分鐘，25個循環，最后72'C延伸IO分鐘。對PCR產物利用Kpnl和Dral酶切分析，結果(附圖1)顯示條帶是2058bp,106bp，與已知cry8類基因的圖譜(表3)不同，表明菌株BT-SU4中可能含有新的cry8殺蟲基因.1.2菌株BT-SU4中cry8H基因的克隆設計了一對全長基因引物cry8H5/cry8H3用來擴增全長基因。并且引入BamHI/Sail用于克隆與表達，引物對cry8H5/cry8H3的序列如—hcry8H5:ggaattcgatgagtccgaataatcagaatcry8H3:cgcgtcgacttacatttcttctacaatcaattc以菌株BT-SU4的總DNA為模板，用pfuDNA聚合酶，用如下體系進行PCR擴增。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>超純水補至50)aL，混勻離心，加石蠟油30pL。擴增循環94t:變性1分鐘，54。C退火1分鐘，72'C延伸4分鐘，25個循環，最后72r延伸10分鐘。結果(見附圖2)顯示擴增出3.5Kb的條帶，與載體pET21b連接轉化大腸桿菌JMllO，得到陽性轉化子pSASSU4。對插入片斷進行測序分析，得到序列SEQIDNO1為pSASSU4中BamHI/Sail雙酶切片段，序列全長3472bps,分析表明其含有開放閱讀框，0RF1的位置是1-3472，GC含量為38J，編碼1157個氨基酸組成的蛋白。經測定，其氨基酸序列為SEQIDNO2所示。同源分析表明該蛋白與Cry8類蛋白具有較高同源性，表4為其同源性數據。由于與已知的Cry8類蛋白氨基酸同源性均低于78°/。，最高只有58.2%(Cry8Bbl)，被Bt殺蟲晶體蛋白命名委員會命名為Cry8Hal。表4Cry8Hal與Cry8蛋白同源比較數據Cry8AalCry8BalCry8CalCry8DalCry犯alCry8FalCry8GalCry8Hal53524855564948本發明進一步分析了Cry8Hal蛋白的氨基酸組成(見表6),得知其分子量為131.56kDa，等電點為pH4.735(見表5)，分析了蛋白的生化指標(見表5)表5Cry8Hal蛋白的生化特性分析內容數據蛋白全長1223a3分子量137502.97m.w.1毫克蛋白摩爾數7.273pMolesl摩爾蛋白消旋系數187500lodA，的蛋白濃度0.73mg/ml1mg/mlA卿吸收值1.36AU等電點5.06pH7時帶電荷值-30.91_表6Cry8Hal蛋白的氨基酸組成_MHil質量百分頻率百分數數1.3cry8H基因的表達32732.0813712.0110510.8342235.2039231.20784.3650.38715.92666.09505.18864.05141.36615.02363.30867.07242.24907.45433.10706.41697.53915.991007.47997.27182.30667.4916113.3813612.50Charged(RKHYCDE)Acidic(DE)Basic(KR)Polar(NCQSTY)Hydrophobic(AILFWV)AAlaCCysDAspEGluFPheGGlyHHis'suetsnoIn93rirrp'r5XX409158110934943662244897062213311UKLMNPQRSTVWYBZ引物cry8H5/cry8H3分別引入BamHI和Sail位點，以含全長cry8Hal的菌株BT-SU4質粒DNA為模板，擴增得到全長基因，插入Bt表達載體pSTK(見附圖3)中，轉化大腸桿菌SCSllO，提取質粒，電擊轉化Bt無晶體突變株HD-73-中，得到工程菌BioT8H。分別將上述兩株工程菌3(TC于牛肉膏培養基中培養30小時，取500j_iL菌液至Eppendorf管中，超聲波破碎30秒鐘(B.BraunULabsonic，230V,T間隔=0.5秒);取lOO^L加入25pL新配0.5NNa0H，25。C作用5分鐘；加入65HL3X樣品緩沖液(925pL上樣緩沖液+75pLp-巰基乙醇)，100'C煮沸5分鐘。離心除去沉淀。上樣10uL進行SDS-PAGE電泳分析結果。結果(附圖4)表明，工程菌BioT8H中的cry8Hal基因均獲得了表達，表達物的分子量為130kDa左右。1.4Cry8H蛋白的活性測定將Bt工程菌株接種在普通細菌瓊脂克氏瓶培養基上培養3天。將野生菌株HD-73-接種在普通細菌瓊脂克氏瓶培養基上培養4天。將培養物洗下，2倍梯度濃度稀釋，將40ml菌懸液加入到200g有均勻粗細土豆絲的細土(紫外線滅菌)中，混勻，使土壤含水量保持在18%-20%。接入金龜子齡幼蟲20頭，以加入清水的處理為空白對照，28t:感染詞養，14天檢査死蟲數，計算死亡率。結果(見表7)表明工程菌株對華北大黑鰓金龜(Holotrich;iaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)具有極高的毒殺活性。其表達的Cry8H蛋白具有殺華北大黑鰓金龜、銅綠麗金龜和暗黑鰓金龜蟲的活性。表7Bt工程菌和BT-SU4菌株對華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)幼蟲殺蟲活性測定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例22.1人工設計合成的可以在植物中表達的cry8H基因的核苷酸序列根據微生物和植物對密碼子偏好的不同，對cry8Hal基因的1-2010bp的序列進行了優化。本發明按照cry8Hal基因的人工改造序列進行了全基因合成，新基因見SEQIDNO3所示的核苷酸序列。cry8Hal基因與mcry8Hal(modifiedcry8Hal)基因的核苷酸序列同源性只有87.08%,G+C含量也由原來cry8Hal的37.6%提高為50.1%(表8)。調整了Cry8Hal蛋白的氨基酸密碼子使用頻率，使mCry8Hal蛋白的氨基酸密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近說明書第11/17頁(表9)。將cry8Ha基因的人工改造序列兩端引入BamHI和Kpnl位點，連至pUC57載體，重組質粒命名為pUC57-mcry8H。表8cry8Hal基因與mcry8HalG+C含量比較與聚腺苷酸化的信號序列情況加/7<^7優化結果1堿基數百分率堿基堿基數百分率GC含量備注A67532.14C33115.76G45821.81T63630.29A52625.05C55726.52G49623.62T52124.81古去除10個聚腺^SS'^苷酸化的信號達到50.1%序列表9植物、Cry8Hal及mCry8Hal中蛋白的氨基酸密碼子使用頻率氨基酸密碼子植物使用頻率Cry8Ha使用個數使用頻率mCry8Ha使用個數使用頻率AlaGCA25%2649%1325%AlaGCC27%713%2242%AlaGCG6%713%00%AlaGCT42%1325%1834%ArgAGA30%2356%1127%ArgAGG25%25%1434%ArgCGA8%4腦00%ArgCGC11%12%512%ArgCGG5%410%00%ArgCCT21%717%1127%AsnAAC55%614%2763%AsnAAT45%3786%1637%AspGAC42%822%2465%AspGAT58%2978%1335%CysTGC56%00%1100%CysTGT44%1100%00%GinCAA59%2370%1958%GinCAG41%1030%1442%GluGAA49%1864%1346%GluGAG51%1036%1554%GlyGGA38%2341%1527%GlyGGC16%24%1425%GlyGGG12%814%713%GlyGGT34%2341%2036%HisCAC46%110%10100%HisCAT54%990%00%lieATA18%1438%38%lieATC37%38%1951%lieATT45%2054%1541%LeuCTA8%714%00%LeuCTC9%12%816%LeuCTG19%00%918%l>euCTT28%1224%1122%LeuTTA10%2347%5腦LeuTTG26%612%1633%LysAAA39%1365%420%lysAAG61%735%1680%MetATG100%14100%14100%PheTTC55%719%2467%PheTTT45%2981%1233%ProCCA42%1554%1450%ProCCC17%14%725%ProCCG9%518%00%ProCCT32%725%725%SerAGC18%35%1323%SerAGT14%1730%712%SerTCA190/o916%916%SerTCC18%35%1425%SerTCG6%59%00%SerTCT25%2035%1425%ThrACA27%3056%00%Thr八CC30%12%3565%ThrACG8%47%00%ThrACT35%1935%1935%TrpTGG100%11100%11100%TyrTAC57%411%36100%TyrTAT43%3289%00%ValGTA12%2748%00%ValGTC20%47%1120%ValGTG29%611%2138%Va]GTT39%1934%2443%EndTAA48%1100%1100%EndTAG19%00一EndTGA18%0一0一2.2植物表達載體的構建用BamHI和Sacl酶切質粒pUC57-mcry8H(中國農業科學院植物保護研究所生物技術組保存)回收2.0kb片段，用同樣的內切酶酶切質粒pCAMBIA3300(該載體為常用載體，中國農業科學院植物保護研究所生物技術組保存，見張曉國等武漢植物學研究，2000Vol.18No.1P.15-20)，回收lOkb片段，將兩個片段連接，轉化DH5a，得到陽性轉化子，把此新構建質粒命名為p3300U8H。該質粒含有組成型表達的啟動子Uhiquitin(即一段DNA序列，可以驅動所連接的基因片段進行轉錄，進而翻譯成蛋白質，組成型表達的啟動子可以調控基因在生長發育的任何階段和任何組織都有表達)、mcry8Ha基因和N0S終止子(一段DNA序列，含有基因表達的終止信號)。質粒構建圖見附圖5，該質粒可以在植物中表達外源基因。2.3農桿菌轉化取一管200y1農桿菌LBA4404的感受態細胞，加入1ugp3300U8H質粒DNA，液氮中速凍1分鐘，37t:恢復培養5分鐘，加入lralLB液體培養基，28。C慢速振蕩(〈100rpm)6小時，4，000rpm離心5分種，棄上清，加入100y1LB液體培養基重懸細胞，涂布于含有卡那霉素lOOng/ml、利福平層yg/ml和鏈霉素100yg/ml的LB培養基的平板上，28。C培養48小時。將LB抗性培養基平板上的克隆，搖菌，提取質粒，應用PCR方法檢測陽性克隆。2.4草評草轉化將含有p3300U8H質粒的農桿菌克隆接種于含有卡那霉素100ug/ml、利福平100ng/ml和鏈霉素100ug/ml的LB液體培養基中，28'C振蕩培養至0D600為0.6-0.8，1/100接種于含有卡那霉素100ug/ml、利福平100ug/ml和鏈霉素100ng/ml的LB液體培養基中，28'C振蕩培養至OD600為0.6-0.8，；將草坪草愈傷浸于菌液中，農桿菌侵染15分鐘；取出草坪草愈傷，用滅菌濾紙吸干菌液，放置到共培養培養基(MS培養基+OOymol/m;i乙酰丁香酮+3mg/l2,4-D)中，28'C暗培養2天，2天后將草坪草愈傷轉移至MS篩選分化培養基(MS培養基+150ug/1草丁磷+500ug/ml羧芐霉素+3mg/12，4-D)，28。C,光/暗=16小時/8小時，2周后，愈傷點分化成小植株，將小植株切下移至生根培養基(MS培養基+700wg/ml草丁磷+500^§/1111羧芐霉素)生根，根部發育健壯后，移至花盆在土中繼續生長(普通土營養土蛭石=2:1:1)。2.5轉化草坪草的分子檢測提取轉化草坪草的基因組DNA，取1yg基因組DNA做模板，引物序列如下8HF1:5'-TGGACACCAAGGGCATTAAGAG8HR1:5'-AGTAGCCTGAGTGGCGTAAAGAPCR擴增的反應條件為94°C，IO分鐘，l個循環；94°C,1分鐘，54°C,1分鐘，72°C，l分鐘，30個循環。把產物電泳。如圖6所示，陽性轉化株擴增出大小為600bp的片段。2.6轉基因草坪草的生物活性檢測從田間采集華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)3種在我國北方危害比較嚴重的金龜子成蟲群體，帶回室內，分別放入40X40X50cm的飼養盒中，盒底放5-8cm厚的潮濕過篩細土，飼喂新鮮榆樹葉片，26-28'C飼養。待其產卵后，將卵挑出，放在潮濕土中使孵化。將剛孵化的幼蟲挑出，每個小飼養盒(08cm，H5cm)放幼蟲5頭，飼喂土豆塊和新鮮的玉米嫩根，待幼蟲長到一定齡期后供生測用。采用群體種植和群體接蟲的方法，進行生物測定。在大田土中采用分別種植及混合種植轉基因植株和未轉化植株的種植方法，每個處理12株。按照建立的危害程度分級標準，暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)幼蟲對供試轉基因植物的危害程度、危害指數統計如下，見表IO。表10.轉基因植株與非轉基因株的危害統計。株系p3300U8H株j7非轉基因植株危害等級~~SS1~~危害指數"~危害等級~~植株數~~危害指數<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從表10統計結果看，轉p3300U8H植株的危害率為62.5%，危害指數為22.9;非轉基因植株危害率100%,危害指數為72.9。轉p3300U8H植株表現出了良好的抗暗黑鰓金龜(〃。7ofr/c力iapa2-a^7e/a)的特性。華北大黑鰓金龜0foA^/7'c力/s幼蟲對供試轉基因植物的危害程度統計如下。轉p3300U8H植株危害率為75%，危害指數為28.4，低于非轉基因植株危害率為100%，未轉化植株危害指數75.0。可見轉p3300U8H植株表現出了良好的抗華北大黑鰓金龜(〃Wotric^'aoWita)特性。銅綠麗金龜"/ww^sfor/w&"ta)幼蟲對供試轉基因植物的危害程度統計如下。轉p3300U8H植株危害率為45%,危害指數為16.5，低于非轉基因植株危害率為100%，未轉化植株危害指數75.0。可見轉p3300U8H植株表現出了良好的抗銅綠麗金龜(力/w/za7aco/p^e^a)的特性。根據以上信息，利用可以在根部特異轉錄基因的啟動子，可以使該基因在植物根部得到表達，從而只在植物根部獲得對目標害蟲華北大黑鰓金龜(〃Wo^i'c/u'ao力7Wa)、銅綠麗金龜(力/o鵬7aco/';wJe/7fa)和暗黑鰓金龜(〃aotn'c/j'apara^e2a)的抗性。附本發明所涉及的DNA序列和蛋白質序列SEQIDNO1(c/r5fe7基因的核苷酸,序列)1^ATAAGAAAGGGAGGAAGAAAAATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGG61GATCCGAATTCGATGAGTCCGAATAATCAGAATGAATATGAAATTATAGATACACCATCT121CGTACGTCTGTATCCAATGATTCTGTCAGATATCCTTTCGCAAGCGATCCAACAACTGAT181TTAAACAATATGAATTATAAAGATTTCCTTAMACAGTAAATGGTTACAATACTGGAGAT241CTTTCTGGATCTGAGGCATTTATCAGTCAAACTGCAATTAATACTGCAGGTAAAGCTGTA301GGTACAGTACTCGGTTTATTGGGTGTTCCATTAGCCGGAGCAGTTGGCCCCTTAATATCC361TTCTATGGTGCCGTTGCCCTATTATTTTGGGGGCCGGGAGATCCATGGCAAGCTTTTATG421ACCCAAGTAGAGGCATTAGTTAACCAAAAAATAGCAGATTATGCAAGAAATAAAGCAATT481GCAGAATTACAAGGGTTAAGGAATATTCTTGATTTATATCGTTTAGCACTTATAGAATGG541GAAGAGAACCCAACAAGAACAAGATCACTAACAAATATCCGTCTTMATTTGAAGATGTT601AATCAGTTTTTCGAATATCAAATGCCATCTTTTGCAGTAGGAGGTTATGAGGTTCCATTA661TTAGCAGTATATGCACAGGCAGCAAATCTTCATTTGTCAGTATTAAGAGATGCCGCGATA721TTCGGAGAACAGTGGGGAATGTCTCAAACTGCTATTMTAACATATATGACCTTCAGCAG781AGAAGAACTGCTGAGTATATTAATCATTGTGTGAAATGGTATAATAATGGTTTAGATAAA841TTAAGAGGTTCGAATGCTGGGCAATGGGTTAATTTTAATCGCTACCGTAGAGAGATGACA901CTAATGGTATTGGATATTGTAGCGATATTTCCAAACTATGATACACGTACGTATCCMGT961GGAATTGGAACTAGTGTCCAACTTACAAGAGAAGTATATACGGATCCTATTGGTCCGACA贈TCAACACMGGTGGCGTTTCTTGGTATGACGACGCACCTTCTTTTACAGCTATTGAMGT醒TCCGTGGTTCGACCACTTCACTTATTTGATTTACTAACAGGGGTTACAGTCTATGCCGCT1141AGTAGTTCTTGGGATTCAAGTCATTATTTTAGATTTTGGAATGGGCATAAAGTAGACACA1201AAGGGAATTAAGAGTTCTGTTCAATATAGTAATGTATATGGTTCTACTAGTAATGCGGTT1261AGTACAACTATTATACCATTTTCGGGTTTTGACGTTTATAGAGTCTTTTCGCTAGCTGGT1321GTACTATTTGCTTGGACAACAAGATACTTTGGAGCCCCTGAAGTTTATTTTC嵐GAGTA1381GACCATAATTCTGGGATTGATGTTGGATACGATATAGCGTTTAGCGAAAGGTATGCAGGG1441ATTGGAGAACAACAMAGGATTCACTTGATGAATTACCTTTACAAACAGAAGGGCCGGCA1501TATAGATCTTATAGTCATAGATTGAATCATATTTCAATGGTTCCACAAACTGTACGAACA1561CGGAATGTACCTGTATTTTCTTGGTCGCATCGGAGTGCGGATATTGACAATAGAATTTTT腿CAGGATAGAATTAATCAAATTCCGGTAGTAAAGGGACATACATTAGGTCCAGGTGCTTCT腿GTTATGGCAGGTCCTGGATTTACAGGAGGAAATATAGTGACTAGAACAAGTCCAGGTGTA1741GTAGTTTTTTCTGGAGTTACTATAAAGAATGCATTATCACAACGATATCGTGTGAGAATA1801CGGTATGCTTCTACTACTGACTTCCGATTTTTCTCTACACTTTCAGGAACTCGTCTTTAT1861GCCACTCAGGCTACTMAACTATGAATAMGGACAACAATTAACATATGAATCATTTCAG簡TATGCAACAATTGGTTCTACATTTACATTTGAGAATGTAAATGATAGTTTGACAATAGGT1981GCAGATCMTTTCTAAGTGGTGAGCAAGTATATGTAGATAGATATGAAGTAATCCCAGTG2041GATGCAACGTTTGAAGCGGAGAACGATTTAGAGGTGGCAA歸AAGCAGTMATAATTTG2101TTTACGAATGCAAAAGATGCCTTACAGACGGATGTTACAGATTATCAAGTAAATCAAGCA2161GCTAATTTAGTAGAATGCCTATCAAGTGAGTTATATCCAAATGAAAAACGTTTGTTATTT2221GATGCGGTGAAAGAGGCAAAACGACTGGATCAAGCACGTAACTTACTTCAAGATACACAG2281TTTMTGAGATGAATGGAGAAAACGGATGGAATGGGAGCACAGGTGTTGAGATTGTTGAA2341GATGATGTCTTCTTTAAGGACCGCTCAATTCGATTATCTAGCGCGCGAGAAGCGGGGACA2401GAAMCTCCCCAACGTATCTGTACCAAAAAATAGATGAATCTCGCTTAAAACCATACACT2461AGATATAGTCTGAGAGGGTTTGTAAGAAGTAGTCAAAATTTAGAGATATATGTCACTCGT2521TACCAAACACAGCGAGTGGTCAAAAATATAGTAGACAATTTCTTACCAGATATGTATGCT2581GTTMCGCCTGCGGAGGAATTGATAGATGCGGAGMCAAAAGCATGTGAATACTATGTTA2641GGATTAG磁ATAATGTACCAAATGGAAATACAGTGTCTGACTCTCATGAGTTTTCAATT2701CCTGTAGATACAGGGGAGCTGAATTATAATGAGGATACGGGTATTTGGGTTGTATTTAAA2761ATCACAACCACGGATGGATACGCAACACTTGGAAATCTTGAATTGGTAGAAGAGGGACCG2821TTATCTGGAGAAACATTAGAACGTGTGAAAAATCAAGGAAAGCAGTGGCAGGACCAMTG2881GCAAGAAGACGTGCGGAAACAGATACAAGATACGGGACAGCAAAACAAGCCATTGATCGT2941TTATTTGTAGACTATCAGGATCAACAATTATCTCCTAGTATAGAAATATCAGATTTGACT3001GCGGCACAAAATCTGGTACAGTCCATCCCTTACGTATATAATGATACGTTACCAGAAATA3061CCGGGGATGAACTATACAAGTGTTACAGAGTTAACAAACAGACTCCAACAAGCATGGAAT3121TTGTATGACTTGAGMATAGCATACAA證GGTGATTTCCGMATGATGTAAGTAATTGG3181AATGTTACACCTGGAGTCAATATTCAACAAATGAATCATACGTCTGTTCTTGTGATTCCA3241AATTGGGATTCACAAGCGTCACAACAAATTACCGTTCAACC磁TCGAAGATATGTGTTA3301CGTGTTACCGCAAGAAAAGAAGGA虹GGAGATGGATACGTMCCATCCGTGATGGAGCA3361AAATATACAGAAACGCTGACATTTAATACATGTGATTATAATGGAAGTAGTGTATATCAG3421GAGCMGCATTGTATACAAATGATGTATACAATACGCAATCCGTTAACATACAGGGTTCG3481AATAGTGCGTATCATACACAAGCAACCAATACCGATAGATATAATATGAATGGTATGTAT3541AATGATCAAACTAGCTATGTTACAAAAACAGTAGAATTTATTCCGTATACGGAGCAAGTC3601TGGATTGAGATGAGCGAAACCGAGGGCGTATTCTATATAGAGAGTGTAGAATTGATTGTA3661GAAGAAATGTAASEQIDNO2(Cry8Hal蛋ft的氨基酸序列)1證K(;GK腿SMTGGQQMGRDPNSMSPNNQNEYEIIDTPSRTSVSNDSVRYPFASDPTTD61LN畫NYKDFLKTVNGYNTGDLSGSEAFISQTAINTAGKAVGTVLGLLGVPLAGAVGPLIS121FYGAVALLFWGPGDPWQAFMTQVEALVNQKIADYARNKAIAELQGLRNILDLYRLALIEW181EENPTRTRSLT,LKFEDVNQFFEYQMPSFAVGGYEVPLLAVYAQAANLHLSVL腿AI241FGEQ腦SQTA雇IYDLQQRR丁AEYINHCV認NNGLDKLRGSNAGQWVNFNRYRREMT301LMVLDIVAIFPNYDTRTYPSGIGTSVQLTREVYTDPIGATSTQGGVSWYDDAPSFTAIES361SVVRPLHLFDLLTGVTVYAASSSWDSSHYFRFWNGHKVDTKGIKSSVQYSNVYGSTSNAV421STTIIPFSGFDVYRVFSLAGVLFAWTTRYFGAPEVYFQRVDHNSGIDVGYDIAFSERYAG481IGEQQKDSLDELPLQTEGPAYRSYSHRLNHISMVPQTVRTRNVPVFSWSHRSADTDNRIF541QDRINQIPVVKGHTLGPGASVMAGPGFTGGNIVTRTSPGVVVFSGVTIKNALSQRY跳I601RYASTTDFRFFSTLSGTRLYATQATKT廳KGQQLTYESFQYATIGSTFTFENVNDSLTIG661ADQFLSGEQVYVDRYEVIPVDATFEAENDLEVAKKAV亂FTNAKDALQTDVTDYQVNQA721ANLVECLSSELYPNE亂LFDAVKEAKRLDQARNLLQDTQFNEMNGENGWNGSTGVEIVE781DDVFFKDRSIRLSSAREAGTENSPTYLYQKIDESRLKPYTRYSLRGFVRSSQNLEIYVTR841YQTQRV糊IVDNFLPDMYA麗CGG皿CGEQ服麵LGLE麗PNGNTVSDSHEFSI901PVDTGELNYNEDTGIWVVFKITTTDGYATLGNLELVEEGPLSGETLE跳NQGKQWQDQM961A,AETDTRYGTAKQA皿LFVDYQDQQLSPSIEISDLTAAQNLVQSIPYVYNDTLPEI1021PGMNYTSVTELTNRLQQAWNLYDLRNSIQNGDFRNDVSIWNVTPGVNIQQMNHTSVLVIP1081麗DSQASQQITVQPNRRYVLRVTARKEGSGDGYVTIRDGAKYTETLTFNTCDYNGSSVYQ1141EQALYT隨YNTQSVNIQGS歸YHTQATNTDRYNMNGMYNDQTSYVTKTVEFIPYTEQV體WIEMSETEGVFYIESVELIVEEM*SEQIDNO3(人工設計基因的核苷酸序列)1GGATCCATGATCAGAMGGGCGGCAGGAAGATGGCCAGCATGACTGGTGGACAGCAGATG61GGTCGTGATCCCAACTCCATGAGCCCCAACAACCAGAATGAGTACG磁TCATCGACACC121CCATCTCGTACCTCTGTGTCCAACGACTCTGTCAGATACCCTTTCGCCAGCGATCCAACC181ACTGACTTGAACAACATGAACTACAAGGATTTCCTTAAGACCGTTAACGGTTACAACACT241GGAGACCTTTCTGGATCTGAGGCATTCATCAGCCAAACTGCCATTAACACTGCAGGTAAG301GCTGTCGGGACCGTTCTCGGTTTGTTGGGTGTTCCATTGGCCGGCGCCGTTGGCCCCCTG361ATCTCCTTCTACGGTGCCGTTGCCCTCTTGTTCTGGGGCCCCGGAGATCCCTGGCAGGCC421TTCATGACCCAAGTGGAGGCACTGGTTAACCAGAAAATCGCCGACTACGCAAGGAACAAG481GCCATTGCAGAGTTACAAGGGTTGAGGAACATACTGGATTTGTACCGTCTGGCCCTTATC541GAATGGGAAGAGAACCCAACCAGAACCAGGTCACTCACCAACATCCGTCTTAAATTCGAG601GACGTTAACCAGTTTTTCGAATACCAAATGCCATCTTTCGCAGTCGGAGGTTACGAGGTT661CCACTGTTAGCCGTTTACGCACAGGCCGCAAACCTTCACTTGTCAGTGTTGAGAGATGCC721GCTATCTTCGGCGAACAGTGGGGAATGTCCCAAACTGCTATTAACAACATCTACGACCTT781CAGCAGAGGAGAACTGCTGAGTACATCAACCACTGCGTGAAGTGGTACAACAACGGTCTG841GACMGTTAAGGGGTTCCAATGCTGGCCAATGGGTTAACTTCAATCGCTACCGTAGAGAG901ATGACCCTCATGGTGTTGGATATTGTGGCTATCTTCCCAAACTACGACACCCGTACCTAC961CCAAGCGGAATTGGCACTAGTGTCCAACTTACCAGGGAAGTTTACACCGATCCTATAGGC簡GCTACCTCAACCCAAGGTGGCGTTTCTTGGTACGACGACG'CCCCTTCTTTTACCGCTATT藤GAGTCCTCCGTGGTTCGCCCACTTCACTTGTTCGACCTGCTCACCGGGGTTACCGTCTAC1141GCCGCTAGTAGCTCCTGGGATTCAAGTCACTACTTTAGATTCTGGAATGGGCACAAGGTG1201GACACCAAGGGCATTAAGAGTTCTGTTCAGTACAGTAATGTGTACGGCTCTACTAGCAAT1261GCTGTTAGTACCACTATTATCCCATTTTCCGGTTTCGACGTTTACAGGGTCTTTTCCCTC1321GCTGGTGTGCTCTTCGCTTGGACCACCAGATACTTTGGAGCCCCTGAAGTTTACTTCCAA1381AGGGTGGACCACAATTCCGGGATTGACGTTGGATACGACATCGCTTTTAGCGMAGGTAC1441GCAGGGATTGGAGAACAACAAAAGGACTCACTTGATGAATTACCTTTGCAAACCGAGGGG1501CCCGCCTACAGGTCTTACAGCCACAGGTTGAATCACATTTCAATGGTTCCACAAACTGTT1561CGCACCCGTAATGTCCCTGTGTTCTCTTGGTCCCACCGTAGTGCTGACATAGACAATAGA1621ATTTTTCAGGATAGGATTAACCAGATTCCCGTGGTCAAGGGCCACACCCTGGGTCCAGGT1681GCTTCCGTTATGGCAGGTCCTGGATTCACCGGAGGCAATATCGTGACTAGAACCAGCCCA1741GGTGTGGTCGTTTTTTCTGGAGTTACTATCAAGAATGCCTTATCACAACGCTACCGTGTG醒AGGATTCGTTACGCTTCTACTACTGACTTCCGCTTCTTCTCCACCCTTTCAGGAACTCGT1861CTTTACGCCACTCAGGCTACTAAAACTATGAATAAGGGACAACAATTGACCTACGAATCA1921TTTCAGTACGCAACCATCGGTTCCACCTTCACCTTTGAGAATGTGAATGACAGTTTGACC1981ATCGGTGCCGATCAATTCCTCAGCGGTGAGCAAGTGTACGTCGACAGATACGAAGTGATC2041CCAGTGGATGCAACCTTTGAAGCTGAGAACGACCTGGAGGTGGCCAAGAAAGCAGTCAAT2101AACTTGGAGCTCSEQIDNO4(人工設計基因mCry8Hal蛋白的氨基酸序列)1MIRKGGR藤SMTGGQQMGRDPNSMSPNNQNEYEIIDTPSRTSVSNDSVRYPFASDPTTD61LNNMNYKDFLKTVNGYNTGDLSGSEAFISQTAINTAG譜GTVLGLLGVPLAGAVGPLIS121FYGAVALLFWGPGDPWQAFMTQVEALVNQKIADYARNKAIAELQGLRNILDLYRLALIEW181EENPTRTRSLTNIRLKFEDVNQFFEYQMPSFAVGGYEVPLLAVYAQAANLHLSVL歸AI241FGEQWGMSQTAINNIYDLQQRRTAEYINHCVKWYNNGLDKLRGSNAGQWVNFNRYRREMT301LMVLDIVAIF而DTRTYPSGIGTSVQLTREVYTDPIGATSTQGGVSWYDDAPSFTAIES361SVVRPLHLFDLLTGVTVYAASSSWDSSHYFRF麗GHKVDTKGIKSSVQYSNVYGSTSNAV421STTIIPFSGFDVYRVFSLAGVLFAWTTRYFGAPEVYFQRVDHNSGIDVGYDIAFSERYAG481IGEQQKDSLDELPLQTEGPAYRSYS服LNHISMVPQTVRTRNVPVFSWSHRSADIDNRIF541QDRINQIPVVKGHTLGPGASVMAGPGFTGGNIVTRTSPGVVVFSGVTIKNALSQRYRVRI601RYASTTDFRFFSTLSGTRLYATQATKTMNKGQQLTYESFQYATIGSTFTFENVNDSLTIG661A叫FLSGEQVYVDRYEVIPVDATFEAENDLEVAKKAVNNL權利要求1.蘇云金芽孢桿菌菌株BT-SU4，其保藏號為CGMCC2071。2.對鞘翅目害蟲高效的蘇云金芽孢桿菌c/r《〃a7基因，其核苷酸序列如SEQIDN01所示。3.—種工程菌菌株BioT8H，其特征在于含有權利要求2所述的c/y《/fe7基因。4.對鞘翅目害蟲高效的蘇云金芽孢桿菌c/76^a/蛋白，由權利要求2所述的cr/Sfe7基因所編碼，其氨基酸序列如SEQIDN02所示。5.權利要求4所述的c/y6^a7蛋白在制備殺害鞘翅目害蟲藥劑中的應用。6.—種蛋白，具有權利要求4所述的蛋白相同的功能，其氨基酸序列如SEQIDN04所示.7.—種人工改造合成的歷c/y^/fe7基因，其編碼權利要求6所述的蛋白，其核苷酸序列如SEQIDN03所示。8.—種植物表達載體p3300U8H，其特征是該植物表達載體由權利要求7所述的歷"7《fe7基因序列、組成型表達啟動子或根特異性啟動子、終止子和一種能在大腸桿菌和根癌農桿菌中穿梭的雙元載體所構建。9.根據權利要求7所述的基因在植物抗鞘翅目害蟲中的應用。10.權利要求9所述的應用，其特征是將含有權利要求7所述的歷c/yS^7基因的植物表達載體p3300U8H轉化植物或微生物，使之產生抗鞘翅目害蟲的毒性。11.權利要求10所述的應用，所述植物是草坪草。12.權利要求9所述的應用，其特征是將權利要求7所述的歷c/yS/fe7基因表達的蛋白制備成藥劑，用于殺滅鞘翅目害蟲。全文摘要本發明涉及“對鞘翅目害蟲高效的蘇云金芽孢桿菌cry8H基因、蛋白及其應用”屬于生物防治
技術領域：
。本發明對鞘翅目害蟲高毒力的cry8H基因的核苷酸序列，如SEQIDNO1所示，人工設計合成的可以在植物中表達的cry8H基因的核苷酸序列如SEQIDNO3所示。該人工設計的cry8H基因轉化植物，獲得的轉基因植物都具有抗華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)和暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)性能。文檔編號A01N63/02GK101130762SQ200710120020公開日2008年2月27日申請日期2007年8月7日優先權日2007年8月7日發明者馮書亮,宋福平,杰張,束長龍,王容燕,郎志宏,黃大昉申請人:中國農業科學院植物保護研究所