一種培育抗黑腐病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種培育抗黑腐病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種培育抗黑腐病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的方法。技術(shù)背景甘藍(lán)類(lèi)蔬菜包括結(jié)球甘藍(lán)、花椰菜、綠菜花、球莖甘藍(lán)、芥藍(lán)、抱子甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)等，是我國(guó)的主要蔬菜類(lèi)群，在蔬菜周年供應(yīng)及外貿(mào)出口中占據(jù)重要地位。黑腐病是我國(guó)長(zhǎng)久以來(lái)危害甘蘭類(lèi)蔬菜生產(chǎn)的主要病害之一，其致病菌有6大類(lèi)生理小種，其中生理小種1及4是主要致病小種，但目前栽培種中普遍存在的是對(duì)生理小禾中3的抗性(Vicente,J.G.,Conway,Roberts,S丄,andTaylor,J.D.IdentificationandoriginofX"W/zoOTOwoyca，e欲/spvcperfWj1racesandrelatedpathovars.Phytopathology,2001，91:492-499;Vicente,JG.，TaylorJD,SharpeAG,ParkinIAP，LydiateDJ,KingGJ.Inheritanceofrace-specificresistanceto^im/Aomowaypv.ca附/e血、in5myw'cagenomes.Phytopathology,2002,92:1134-1141.)，缺乏對(duì)主要致病菌的抗原。緣于病原菌的多變性、多樣性，植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中也伴隨產(chǎn)生了不同的抗性基因。根據(jù)病原菌與寄主抗性的基因?qū)蚶碚?PuhlerA，ArlatM,BeckerA.Whatcanbacterialgenomeresearchteachusaboutbacteria-plantinteractions*Currentopinioninplantbiology,2004,7:137-147.)，存在于不同物種中的抗病性來(lái)自于不同的基因。因此實(shí)現(xiàn)不同物種間的抗性基因轉(zhuǎn)移，對(duì)于獲得新的抗病種質(zhì)，以及利用這些種質(zhì)培育新的抗病品種具有重要意義。在長(zhǎng)期自然選擇下，蕓薹屬作物一些近緣野生種有許多對(duì)病蟲(chóng)害具備高度抗性以至免疫力。要利用這些抗性基因，一個(gè)方法是克隆基因，并通過(guò)基因工程手段導(dǎo)入目標(biāo)材料中。但是許多抗病性是受多基因控制，僅分離、導(dǎo)入一個(gè)基因，轉(zhuǎn)基因材料獲得的抗病性常不理想。而且，對(duì)于抗性基因的分析、定位、克隆和轉(zhuǎn)化存在著技術(shù)難度大，周期長(zhǎng)，投資高，以及市場(chǎng)的準(zhǔn)入和接受程度等問(wèn)題。另一個(gè)方法可以通過(guò)有性雜交的手段，向栽培品種引入抗性基因，但是物種間的生殖隔離使常規(guī)的有性雜交非常困難甚至不可能。而借助細(xì)胞雜交手段卻可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣種間的核質(zhì)基因融合，達(dá)到向栽培種中引入野生優(yōu)異基因的目的，而且它在細(xì)胞質(zhì)基因控制性狀，多基因控制性狀的引入上還具有明顯優(yōu)勢(shì)。采用細(xì)胞雜交手段，已在多種作物的種質(zhì)創(chuàng)新上產(chǎn)生了眾多成果。如小麥上獲得了抗鹽以及具新的HMW麥谷蛋白亞基的高代體細(xì)胞雜種(于智勇，譚瀟軼，薛哲勇，夏光敏.高冰草與小麥體細(xì)胞雜種后代的耐鹽性和麥谷蛋白分析.高技術(shù)通訊，2006，16(5):511-516。)；獲得了抗軟腐病的馬鈴薯種間體細(xì)胞雜種(TekAL，StevensonWR，HelgesonJP，etal.Transferoftubersoftrotandearlyblightresistancesfrom5b7朋鵬力rew'ofe"51intocultivatedpotato.TheorApplGenet,2004，109:249-254.);在甘藍(lán)型油菜上獲得了新的抗病種質(zhì)(SjOdinCandGlimeliusK，1989b.Transferofresistanceagainstp力o鵬h."卵邁to^firassics"邵〃sbyasymmetricsomatichybridizationcombinedwithtoxinselection.Theor.Appl.Genet.78，513-520.LeliveltCLC，LeunissenEHM,FrederiksHJ"，HelsperJ"PFGandKrensFA.1993.Transferofresistacetothebeetcystnematode(HeteroderaschachtiiSchm.)from57朋/iss2ZsL(whitemustard)tothe■SrassJ.cs朋/wsLgenepoolbymeansofsexualandsomatichybridization.TheorApplGenet,85:688-696.)等等。尤其具有代表性的是將原來(lái)存在于蘿卜中的"0gura"型細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因，通過(guò)體細(xì)胞雜交手段轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜等中(PelletierG.1986.Plantorganellegeneticsthroughsomatichybridization.Oxfordsurveysofplantmolecularandcellbiology,3，97-121.),并且經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的非對(duì)稱(chēng)融合中，供體和受體細(xì)胞器的重組，在后代中獲得了在低溫下葉片保持正常綠色以及抗除草劑(triazine)的Ogucms胞質(zhì)雄性不育育種材料，該材料在各國(guó)的育種工作中已得到廣泛應(yīng)用。黑芥是十字花科蕓薹屬的一個(gè)野生種，有研究表明黑芥基因組中存在對(duì)黑腐病主要致病小種1及4的高抗性(Vicente,JG.，TaylorJD，SharpeAG，ParkinIAP，LydiateDJ，KingGJ.Inheritanceofrace-specificresistancetoiknf力o/K^3sca;zpestrispv.ca/wpestrj'sinSrassicsgenomes.Phytopathology,2002，92:1134-1141.)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種培育抗黑腐病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的方法。本發(fā)明所提供的培育抗黑腐病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的方法，包括以下步驟1)將對(duì)黑腐病具有抗性的黑芥(^^sw'c3/^^^)和甘藍(lán)類(lèi)蔬菜進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得雜種細(xì)胞；2)離體培養(yǎng)所述雜種細(xì)胞，獲得再生植株，得到對(duì)黑腐病具有抗性的甘藍(lán)類(lèi)蔬菜雜種。所述抗黑腐病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜具體可為花椰菜。所述方法中，用于進(jìn)行細(xì)胞融合的黑芥("rssw'ca/^^<3)的供體可為葉肉原生質(zhì)體。當(dāng)所述甘藍(lán)類(lèi)蔬菜為花椰菜時(shí)，用于進(jìn)行細(xì)胞融合的所述花椰菜的受體可為下胚軸原生質(zhì)體。所述花椰菜具體可為花椰菜(Ao/eraceavar./otJT"s)，在北京市農(nóng)林科學(xué)院北京蔬菜研究中心的編號(hào)為0307。所述細(xì)胞融合可通過(guò)聚乙二醇介導(dǎo)，如PEG-1450。所述步驟2)中，所述雜種細(xì)胞在原生質(zhì)體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到細(xì)胞進(jìn)入l一2次分裂時(shí)，轉(zhuǎn)入愈傷組織培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至愈傷組織大小為l-5mm時(shí)，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)至幼苗的真葉形成時(shí)，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得再生植株。所述原生質(zhì)體培養(yǎng)基具體可為B5基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和有機(jī)成分，并附加水解酪蛋白140-160mgL—'、二水合氯化鈣865-885mg!/1、山梨糖醇45500mgL—\甘露醇45500mgL—1、葡萄糖2500mgL_1、2-脫氧-核糖115-135mgL—'、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6mgL_1、萘乙酸0.15-0.25mgL—'和6-節(jié)氨基嘌呤0.15-0.25mgL—'的pH5.8-6.0的液體培養(yǎng)基；所述愈傷組織培養(yǎng)基具體可為B5基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和有機(jī)成分，并附加水解酪蛋白140-160mgL—'、蔗糖25000-35000mgL-'、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6mgL-'、萘乙酸O.15-0.25mgL-1和6-芐氨基嘌呤0.15-0.25mgL—1的pH5.8-6.0的固體培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基具體可為MS基本培養(yǎng)基的大量元素和微量元素，B5基本培養(yǎng)基的有機(jī)成分，并附加水解酪蛋白130-170mgL-1、蔗糖25000-35000mgL-\萘乙酸O.15-0.25mgL-1和6-芐氨基嘌呤2.0-3.0mgL—1的pH5.8-6.0的固體培養(yǎng)基；所述生根培養(yǎng)基具體可為固體MS基本培養(yǎng)基。所述方法中還可包括對(duì)所述再生植株進(jìn)行靶標(biāo)病害抗性鑒定、和/或分子標(biāo)記鑒定、和/或基因組大小鑒定、和/或染色體數(shù)目鑒定、禾口/或形態(tài)鑒定的步驟。本發(fā)明利用細(xì)胞雜交技術(shù)，克服常規(guī)育種中的種間雜交障礙，將存在于十字花科野生材料黑芥中的多種抗病基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)類(lèi)蔬菜基因組，培育得到抗病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜，如具有黑腐病抗性的花椰菜。圖1為花椰菜0307下胚軸原生質(zhì)體與黑芥(iSra"ica/^gra)葉肉原生質(zhì)體的融合及培養(yǎng)照片圖2為融合后細(xì)胞培養(yǎng)形成的愈傷組織照片圖3為自愈傷組織上形成的再生植株照片圖4為花椰菜0307、黑芥(萬(wàn)rasw'ca/^gra)及其雜種再生植株的SRAP分析圖譜圖5為流式細(xì)胞儀分析雜種細(xì)胞核DNA含量結(jié)果圖6為根尖染色體計(jì)數(shù)分析照片圖7為雜種及親本葉型比較照片圖8為黑芥(7ras^c3^>ra)、花椰菜0307及其體細(xì)胞雜種的形態(tài)學(xué)比較及黑腐病抗性鑒定具體實(shí)施方式以培育抗黑腐病的花椰菜為例，闡述本發(fā)明的培育抗黑腐病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的方法。本發(fā)明的培育抗黑腐病花椰菜的方法，具體包括以下步驟-1、對(duì)花椰菜及黑芥進(jìn)行黑腐病原菌的人工接種抗性鑒定，明確其抗感特性；2、以具有良好原生質(zhì)體培養(yǎng)能力的花椰菜下胚軸原生質(zhì)體為受體，以抗病黑芥的無(wú)菌苗葉肉原生質(zhì)體為供體，通過(guò)聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的體細(xì)胞雜交獲得黑芥與花椰菜的雜種細(xì)胞；3、通過(guò)雜種細(xì)胞的離體培養(yǎng)，獲得再生植株；4、采用染色體計(jì)數(shù)、基因組大小分析、同工酶譜分析、分子標(biāo)記等手段在再生植株中篩選鑒定出黑芥-花椰菜的雜種；5、對(duì)雜種通過(guò)組培擴(kuò)繁后，構(gòu)建抗病鑒定群體，進(jìn)行人工接種抗病性鑒定，篩選出對(duì)黑腐病具有高抗性的花椰菜-黑芥雜種材料。下面通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)闡明本發(fā)明的技術(shù)方案。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、培育抗黑腐病的花椰菜一、黑芥、花椰菜黑腐病抗性的鑒定所用黑芥(^rassj'c3^'^ra)(ZhuJS，DStruss，GR(3bbelen，1993.StudiesonresistancetoJi/3《柳in^rassica"apwrjSra5^.ca"i^raadditionlines.PlantBreeding111,192-197)。所用花椰菜((丑Weraceavar,6"2y"s)為北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心收集的種質(zhì)資源，編號(hào)0307(姚星偉，劉凡，云興福，趙私，RyschkaU,SchumannG.非對(duì)稱(chēng)體細(xì)胞融合獲得花椰菜與i5rassic3印i/7esce/2s的種間雜種。園藝學(xué)報(bào)，2005，32(6):1039-1044)，以下簡(jiǎn)稱(chēng)花椰菜0307。黑腐病菌生理小種1和4的混合菌株分離自北京地區(qū)高度發(fā)病的甘蘭類(lèi)蔬菜。其分離方法及植物的抗病性鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)采用下述文獻(xiàn)中描述的方法和標(biāo)準(zhǔn)(張恩慧,程永安，許忠民，王妍妮，馬青山.甘藍(lán)3種病害抗源篩選及抗病品種選育研究.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，29(6):30-33)。黑腐病菌生理小種1和4的鑒定方法按照下述文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行Vicente,J.G.，Conway,Roberts，S丄，andTaylor,J.D.IdentificationandoriginofJfa"決o,wosc/^她pvcam/7e5f〃、racesandrelatedpathovars.Phytopathology,2001,91:492-499.先將菌液濃度調(diào)整到107108CFU/mL，對(duì)4-5真葉期苗采用醫(yī)用噴霧器進(jìn)行人工葉面接種。接種前后植株分別保濕24h。黑芥(i5rasw'caw>r3)和花椰菜0307各接種30株。在20-3(TC環(huán)境中培養(yǎng)，常規(guī)管理。接種后14天調(diào)査發(fā)病情況，黑芥(Arasw'cam^ra)和花椰菜0307每株各調(diào)査3葉，共調(diào)査了180片葉。病情依病斑擴(kuò)展深度劃分為0-9級(jí)。病情指數(shù)為0-2的為高抗，2-15的為抗，15-30的為中抗，30-50的為感病。其中，病情調(diào)查以葉片為單位進(jìn)行普査，病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下0級(jí)無(wú)病斑；l級(jí)接種葉片出現(xiàn)褪綠斑，擴(kuò)展深度卜3mm;3級(jí)V型壞死斑擴(kuò)展深度4-6mra;5級(jí)V型壞死斑擴(kuò)展深度7-lOmm;7級(jí)V型壞死斑擴(kuò)展深度11-15mm;9級(jí)V型壞死斑擴(kuò)展深度16mm以上；病情指數(shù)=(E(各級(jí)病葉數(shù)X相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(調(diào)査總?cè)~數(shù)X9))X100。結(jié)果表明黑芥(^^5W'ca/7^rs)的病情指數(shù)為l.11,即對(duì)接種黑腐菌表現(xiàn)高度抗性?；ㄒ?307的病情指數(shù)為31.77，為感病類(lèi)型(圖8)。二、黑芥與花椰菜原生質(zhì)體的融合、培養(yǎng)及再生株誘導(dǎo)1、黑芥及花椰菜原生質(zhì)體的分離、純化及融合花椰菜0307種子常規(guī)消毒后，在MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)，24。C暗培養(yǎng)6d后，取下胚軸用于原生質(zhì)體制備。黑芥(&^sWca;n'^^)無(wú)菌苗培養(yǎng)在MS基本培養(yǎng)基中，每30天繼代一次，實(shí)驗(yàn)中每次取3-5片幼葉用于葉肉原生質(zhì)體制備。按照本實(shí)驗(yàn)室建立的蕓苔屬植物下胚軸及葉肉原生質(zhì)體的分離純化方法獲得純凈原生質(zhì)體(1)花椰菜原生質(zhì)體的制備取在暗培養(yǎng)箱發(fā)芽56d的下胚軸5080個(gè)，放入加有4mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基〔B5基本培養(yǎng)基(Gamborgetal,Planttissueculturemedia.Invitro，1976，12:473-478)的大量元素、微量元素和有機(jī)成分，附加水解酪蛋白150mgL;1、二水合氯化鈣875mgL—'、山梨醇45500mgL一1、甘露醇45500mgL—1、葡萄糖2500mgL—'、2-脫氧-核糖125mgL—'、2,4-二氯苯氧乙酸0,5mgL-'、萘乙酸0.2mg1/'和6-芐氨基嘌呤0.2mgL—、PH5.86.0;過(guò)濾滅菌)的09cm培養(yǎng)皿中，橫切成O.10.5mm小段后，將培養(yǎng)基吸出，再加入5mL質(zhì)壁分離液(54.6gL—1Sorbitol,7.4gL—'CaCL2H20，pH5,6-5.8,121X:滅菌20min)，用封口膜將培養(yǎng)皿封住，放入24'C暗培養(yǎng)箱中靜置1h。1h后，去掉質(zhì)壁分離液，加入68mL酶解液V(1.0%CellulaseR-IO，0.1%MacerozymR-10，溶解在含585mg'L—1MES，100mg*L—1NaH2P04，1g'L—1CaCl2.2H20，63.7g'L-1mannitol，63.7g*L—1sorbitol的溶液中，pH6.0,過(guò)濾滅菌)，置搖床中25°C、30rpm，酶解1216h。然后用孔徑5080ixm的尼龍網(wǎng)將濾液過(guò)濾至無(wú)菌離心管中，沿管壁緩慢加入24mL清洗液W5(18.4gL—taCL2H20，9.0gL—'NaCl，0.8gL—to，1.OgL—'Glucose，pH5.6-5.8，121。C滅菌20min)至10mL，1200rpm離心10min。收集酶液與清洗液W5溶液界面之間的原生質(zhì)體于一個(gè)新的離心管中，用W5溶液洗滌兩次，每次1000rpra離心5min。原生質(zhì)體洗滌完畢后，用原生質(zhì)體培養(yǎng)基調(diào)濃度至2Xl()6個(gè)/ml，用于原生質(zhì)體融合。原生質(zhì)體培養(yǎng)濃度為1X105個(gè)/ml。(2)黑芥(5ra^ica/n'gra)葉肉原生質(zhì)體的制備取1520d繼代一次的黑芥(i5rasw'ca/2^T3)無(wú)菌組培苗完全伸展的幼葉56片，將其放入加有5mL上述原生質(zhì)體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，切成0.5lmm寬的細(xì)條，培養(yǎng)皿用封口膜封住，放入暗培養(yǎng)箱中，24。C質(zhì)壁分離5h。5h后加入23mL的酶解液I(2%CellulaseR-10，0.5%Driselase,0.5%Hemicellulase，1.0%Pectinase，溶解在含585mgL—1MES，100mgL—1NaH2P04，lgL—1CaCl2.2H20，63.7gL—1mannitol，63.7gL_1sorbitol的溶液中，p朋.0，過(guò)濾滅菌)，置搖床中25""C、30rpm，酶解1216h。然后用孔徑為5080um的尼龍網(wǎng)將濾液過(guò)濾至無(wú)菌的離心管中，1000rpm離心5min。倒掉上清液，用0.6M的蔗糖8mL重新懸浮細(xì)胞，再緩慢加入清洗液W52mL，形成梯度液層，1200rpm離心10min。收集兩溶液界面間的原生質(zhì)體于一個(gè)新的離心管中，用清洗液W5溶液洗滌2次，每次1000rpm離心5min。原生質(zhì)體洗滌完畢后，可以用于原生質(zhì)體融合。(3)原生質(zhì)體融合采用PEG融合法，步驟如下用預(yù)融合液(0.15MSorbitol,0.03MCaCl2.2H20，0.075MKC1，0,05MTris-HC1，pH7，2，過(guò)濾滅菌)分別調(diào)整黑芥(v5ra5^'c諸.,)、花椰菜0307原生質(zhì)體濃度至2X106個(gè)mL—'，按1:1的比例均勻混合供體、受體的原生質(zhì)體。在直徑為6cm的無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿中均勻分布7滴混合原生質(zhì)體溶液，每滴40uL，靜止放置10min使原生質(zhì)體沉積在培養(yǎng)皿底部，然后在每滴兩側(cè)加60iiL含40X聚乙二醇(PEG1450)的融合液(40XPEG1450，0.3MGlucose,50mMCaCl2.2H20，pH7.0,過(guò)濾滅菌)。靜止5min后，稍微傾斜培養(yǎng)皿去掉培養(yǎng)皿中的混合液，隨即小心加入2mLPEG清洗液I(13%的PEG1450,0.1MGlucose,0.067MSorbitol,0.067MCaCl2.2H20，pH7.0，過(guò)濾滅菌)，靜止5min后吸去。再小心加入2mLPEG清洗液II(6.7%的PEG1450，0.05MGlucose,0.083MSorbitol,0.083MCaCl2.2H20，pH7.0，過(guò)濾滅菌)，靜止5min后去掉。用原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)皿兩次，再加入2mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基，于24'C暗培養(yǎng)。2.雜種細(xì)胞培養(yǎng)及再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)3-7天后，當(dāng)觀察到較多量的細(xì)胞進(jìn)入一次分裂時(shí)，向每培養(yǎng)皿中加入400uL細(xì)胞培養(yǎng)基(B5基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和有機(jī)成分，附加水解酪蛋白150mgL—'、葡萄糖2500mgL—'、2-脫氧-核糖125mgL—'、蔗糖20000mgL—'、2，4-二氯苯氧乙酸0.5mgL—'、萘乙酸0.2mgL-'和6-芐氨基嘌呤0,2mgL、pH5.8-6.0;過(guò)濾滅菌)，此后每3d加入1次該培養(yǎng)基，大約15天以后有細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)時(shí)，轉(zhuǎn)移到愈傷組織培養(yǎng)基(B5基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和有機(jī)成分，附加水解酪蛋白150mgL-'、蔗糖30000mgL-'、2，4-二氯苯氧乙酸0.5ragL—'、萘乙酸0.2mgL—'、6-節(jié)氨基嘌呤0.2mgL—'和瓊脂10000mgL—';pH5.8-6.0;高壓滅菌)中促使愈傷組織形成，同時(shí)轉(zhuǎn)為正常光照培養(yǎng)。當(dāng)愈傷組織長(zhǎng)到約5隱時(shí)，轉(zhuǎn)移愈傷組織到分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基的大量元素和微量元素，B5基本培養(yǎng)基的有機(jī)成分，附加水解酪蛋白150mg*L—'、蔗糖30000mg'lA萘乙酸0.2mgL—'、6-芐氨基嘌吟2.0mgLln瓊脂1000mgL-、pH5.8-6.0;高壓滅菌)中，誘導(dǎo)不定芽形成。當(dāng)幼苗的真葉形成時(shí)，轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基中使再生植株正常生長(zhǎng)并生根。上述培養(yǎng)過(guò)程的培養(yǎng)溫度均為24T:。由于葉肉原生質(zhì)體具有綠色的葉綠體，而來(lái)源于暗培養(yǎng)的下胚軸原生質(zhì)體為近白色，因此融合的細(xì)胞中有明顯的葉綠體及白色細(xì)胞質(zhì)存在。此特征可以作為早期鑒別雜種細(xì)胞的標(biāo)志。據(jù)此計(jì)算，本融合處理?xiàng)l件下，原生質(zhì)體的異源融合率(顯微鏡視野下雜種細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野里總的細(xì)胞數(shù)，5個(gè)視野取其平均值)為16%。培養(yǎng)4天后，觀察到細(xì)胞進(jìn)入1一2次分裂，12天后看到大的細(xì)胞團(tuán)，18天左右有星狀細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)，此時(shí)轉(zhuǎn)入愈傷組織培養(yǎng)基。40-50天后愈傷組織約1-5mm大小，將它們轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽的形成。在幼苗的真葉形成后，及時(shí)轉(zhuǎn)到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基中可獲得生長(zhǎng)正常的植株。此技術(shù)條件下自原生質(zhì)體獲得再生植株的頻率(再生植株數(shù)/培養(yǎng)原生質(zhì)體數(shù))為1.5X10—5。圖l示花椰菜0307下胚軸原生質(zhì)體與黑芥(i&^sw'Cs/w>i^)葉肉原生質(zhì)體的融合及培養(yǎng)，圖中，"一"示花椰菜0307下胚軸原生質(zhì)體，"一"示黑芥(5rssw'c3;n'^a)葉肉原生質(zhì)體，"》"示融合細(xì)胞分裂。圖2示融合后細(xì)胞培養(yǎng)形成的愈傷組織，左側(cè)圖片為愈傷組織早期照片，右側(cè)圖片為愈傷組織晚期照片。圖3示自愈傷組織上形成的再生植株，左側(cè)為形成的不定芽照片；右側(cè)形成的完整植株照片。三、花椰菜一黑芥雜種植株的鑒定1、分子標(biāo)記鑒定首先對(duì)再生植株的雜種特性進(jìn)行DNA水平鑒定。研究表明，SRAP分子標(biāo)記由于是采用一對(duì)能反映植物基因組外顯子與內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，它的擴(kuò)增結(jié)果比RAPD分子標(biāo)記結(jié)果具有更高的穩(wěn)定性、可靠性，反映的信息量更豐富，多態(tài)性更強(qiáng)，因此本研究采用SRAP分子標(biāo)記對(duì)花椰菜一黑芥雜種植株迸行鑒定。植物基因組DNA提取采用常規(guī)CTAB法。DNA濃度用分光光度計(jì)檢測(cè)后，稀釋到50ng叱—t備用。PCR反應(yīng)體系為總反應(yīng)體積為IO叱，其中IOX反應(yīng)緩沖液1.0化，10mMdNTPs0.25PL，2.5UTag酶(購(gòu)自TianGen公司)0.6|^L，模板DNA100ng，正向和反向引物各50ng，ddH203.4PL。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C5min;94°Clmin，35°Clmin，72°Clroin，5個(gè)循環(huán)；94°Clmin，50°Clmin，72°Clmin，35個(gè)循環(huán)；72。C10min，4"C保存。PCR產(chǎn)物采用6V變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，^20)3銀染法染色顯影，在X膠片觀察燈上觀察分析條帶。本研究設(shè)計(jì)了多對(duì)SRAP擴(kuò)增引物，篩選出5對(duì)引物，在黑芥(5rasw'ca/7^rs)與花椰菜0307基因組中表現(xiàn)出很好的擴(kuò)增多態(tài)性，獲得了花椰菜0307及黑芥(萬(wàn)i^sWca/^^^)各自基因組的特異擴(kuò)增帶(表l)，可以有效地用于黑芥一花椰菜雜種植株的分子標(biāo)記鑒定。它們的序列分別是第一對(duì)正向序列TGAGTCCAAACCGGAAT，反向序列GACTGCGTACGAATTAAC;第二對(duì)正向序列TGAGTCCAAACCGGAAG，反向序列GACTGCGTACGAATTAAC;第三對(duì)正向序列TGAGTCCAAACCGGTTG，反向序列GACTGCGTACGAATTAGC;第四對(duì)正向序列TGAGTCCAAACCGGTTG，反向序列GACTGCGTACGAATTAAC;第五對(duì)正向序列TGAGTCCAAACCGGAAT，反向序列GACTGCGTACGAATTAGC。采用在雙親中表現(xiàn)擴(kuò)增差異的上述五對(duì)引物進(jìn)行再生植株雜種特性的SRAP分析，能夠獲得準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。如采用第四對(duì)引物組合對(duì)再生植株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，樣本17，19，2023，28和29號(hào)再生株都具有雙親的特征條帶，證實(shí)為雜種，而樣本18，25:，32，47和66號(hào)不具有黑芥("rasw'caw'gra)的特征條帶，只具有花椰菜0307的特征條帶，證明再生植株來(lái)自花椰菜0307下胚軸原生質(zhì)體，而非來(lái)自異緣融合細(xì)胞，不是雜種(圖4)。由于SMP擴(kuò)增條帶遠(yuǎn)較RAPD中多，因此本試驗(yàn)體系具有更高的雜種檢出效率。圖4中，C:花椰菜0307;N:黑芥(5r^w'ca/7^T3);17、19、2023、28、29號(hào)為雜種再生植株；18、25、32、47、66號(hào)為非雜種再生株(來(lái)自花椰菜0307原生質(zhì)體)。+示意黑芥(5rasw'caw>ra)特征帶。表1五對(duì)SRAP引物在黑芥(^5ras幻'caw'^ra)與花椰菜0307基因組中的特異擴(kuò)增帶<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2、流式細(xì)胞儀進(jìn)行基因組大小鑒定采用流式細(xì)胞儀可以對(duì)植物的基因組大小進(jìn)行鑒定。由于體細(xì)胞雜種應(yīng)具有雙親的基因組構(gòu)成，因此對(duì)再生植株用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量測(cè)定，就可以初步判斷其來(lái)源。取再生植株和黑芥Brassicanigra)、花椰菜0307葉片各0.2g，分別加入2mL細(xì)胞裂解液(363mgTris，148.9mgNa2EDTA，20.2mgSpermine,1.193gKCl，233.8mgNaCl，200ulTritonX-100,以去離子水定容至200mL，pH7.5)，以鋒利刀片切碎組織，過(guò)濾、離心后用碘化丙碇(PI)染液(BDTACSCalibur)進(jìn)行細(xì)胞核染色。30min后，以供體黑芥(Brassicanigra)和受體花椰菜0307為對(duì)照，采用流式細(xì)胞儀(BDFACSCalibur)進(jìn)行再生株細(xì)胞基因組大小的測(cè)定。再生植株細(xì)胞的流式圖分析表明，黑芥(5rssWcsW^rs)細(xì)胞的DNA含量為0.98pg/細(xì)胞核，花椰菜0307細(xì)胞的DNA含量為1.19pg/細(xì)胞核，17，19，2023，28和29號(hào)再生株細(xì)胞的DNA含量為花椰菜0307與黑芥(^i^sw'ca/i^ra)細(xì)胞DNA含量之和(2.17pg/細(xì)胞，如圖5)，說(shuō)明本原生質(zhì)體融合再生系統(tǒng)中異源細(xì)胞的融合再生率是較高的。也印證了分子標(biāo)記鑒定結(jié)果。圖5中，I、n分別為黑芥(&m^^細(xì)胞周期的G,和G2期；III、IV分別為花椰菜0307細(xì)胞周期的G,和G2期；V、VI分別為雜種細(xì)胞周期的G,和G2期。3、染色體計(jì)數(shù)取黑芥(^asw'cs/2^rs)、花椰菜0307，以及再生植株的根尖，飽和對(duì)二氯苯預(yù)處理2-3h后，卡諾(冰醋酸乙醇=1:3)固定4h，lMHC160。C解離5min，卡寶品紅染色后常規(guī)壓片顯微鏡檢。黑芥(A2^sw'MW>rs)和花椰菜0307的染色體數(shù)分別為2rp46和2n-18，顯微觀察顯示，17，19，2023，28和29號(hào)再生植株的染色體為34條，即為兩親本染色體之和(如圖6)。再一次從染色體數(shù)目上證實(shí)其雜種特性。圖6中，A，花椰菜0307，2n=18;B，黑芥(5r^&'ca力&ra)2n=16;C，雜種2『34。4、雜種與親本材料的形態(tài)學(xué)比較將經(jīng)上述分子標(biāo)記鑒定、基因組大小鑒定和染色體計(jì)數(shù)鑒定后的雜種再生植株移栽入溫室，在苗期及花期進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較鑒定?；ㄒ?307的葉片呈橢圓形，藍(lán)綠色，葉緣鋸齒狀，無(wú)葉耳，葉面光滑無(wú)毛；黑芥(^SraSW'c3/7/^t3)葉片卵圓形，綠色，淺裂，有葉耳，葉面被毛。雜種植株植物學(xué)特征基本呈花椰菜0307與黑芥(萬(wàn)msw'c3/n'^ra)中間形態(tài)類(lèi)型，但不同單株在葉片形態(tài)、顏色、葉毛的有無(wú)等上呈現(xiàn)多樣性分布。有的植株有葉毛，有的無(wú)被毛，葉裂的程度也不盡相同(如圖7)。圖7中，最左側(cè)的是花椰菜0307葉片，最右側(cè)的為黑芥(^^s^ca/^ra)葉片，中間的兩個(gè)是雜種植株的葉片。5、黑腐病抗性鑒定保存在培養(yǎng)瓶中的雜種植株各切取莖段，接種在MS基本培養(yǎng)基附加0.lmg/L6-BA的培養(yǎng)基上，25'C，16h光照/8h黑暗培養(yǎng)，進(jìn)行體外組織培養(yǎng)擴(kuò)繁。45d后，將擴(kuò)繁株分離，并轉(zhuǎn)接入MS基本培養(yǎng)基中生根，15天后株系17，19，20，28和29號(hào)各株系至少移栽出15株進(jìn)入抗病鑒定溫室，待恢復(fù)正常生長(zhǎng)后，采用人工接菌法進(jìn)行雜種的黑腐病抗性鑒定，所接種的菌株仍為黑腐病菌生理小種1和4的混合菌株，黑腐病抗性鑒定方法同上述黑芥(^^sWcaw>ra)、花椰菜0307黑腐病抗性鑒定。同時(shí)對(duì)30株黑芥(5rasw'ca、30株花椰菜0307進(jìn)行相同處理作為對(duì)照。所用受體花椰菜0307為一感病品種，因此來(lái)自黑芥(v5ra"ics7^gra)的抗病性能有效地在花椰菜一黑芥雜種中反應(yīng)出來(lái)。由于所用花椰菜0307的黑腐病鑒定病情指數(shù)為31.77，黑芥(萬(wàn)rassicaw>r<3)的黑腐病病情指數(shù)為1.11，而受試的幾個(gè)株系的花椰菜—黑芥雜種群體的病情指數(shù)均分布在2-8之間(表2)，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受試花椰菜一黑芥雜種群體具有對(duì)黑腐病的高度抗性。表2中，PFCN17、19、20、28和29分別為代表17，19，20，28和29號(hào)花椰菜一黑芥雜種株系?；?花椰菜一黑芥體細(xì)胞雜種的黑腐病抗性鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>圖8為黑芥(^rasw'csw'gra)、花椰菜0307及其體細(xì)胞雜種的形態(tài)學(xué)比較及黑腐病抗性照片。權(quán)利要求1、一種培育抗黑腐病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的方法，包括以下步驟1)將對(duì)黑腐病具有抗性的黑芥(Brassicanigra)和甘藍(lán)類(lèi)蔬菜進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得雜種細(xì)胞；2)離體培養(yǎng)所述雜種細(xì)胞，獲得再生植株，得到對(duì)黑腐病具有抗性的甘藍(lán)類(lèi)蔬菜雜種。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述甘藍(lán)類(lèi)蔬菜為花椰菜。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，用于進(jìn)行細(xì)胞融合的黑芥(^gr3sw'ca"fgTa)的供體是葉肉原生質(zhì)體。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于用于進(jìn)行細(xì)胞融合的所述花椰菜的受體是下胚軸原生質(zhì)體。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述花椰菜為花椰菜((Avar.6ot/y"s)，在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心的編號(hào)為0307。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞融合通過(guò)聚乙二醇介導(dǎo)；所述聚乙二醇優(yōu)選為PEG-1450。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述雜種細(xì)胞在原生質(zhì)體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到細(xì)胞進(jìn)入1一2次分裂時(shí)，轉(zhuǎn)入愈傷組織培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至愈傷組織大小為卜5mm時(shí)，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)至幼苗的真葉形成時(shí)，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得再生植株。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述原生質(zhì)體培養(yǎng)基為B5基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和有機(jī)成分，并附加水解酪蛋白140-160ragL—'、二水合氯化f丐865-885mgL-\山梨糖醇45500mgL-\甘露醇45500mgL-'、葡萄糖2500mgL—'、2-脫氧-核糖115-135mg!/1、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6ragL/'、萘乙酸0.15-0.25mgf和6-節(jié)氨基嘌呤0.15-0.25mgL—i的液體培養(yǎng)基;所述愈傷組織培養(yǎng)基為B5基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和有機(jī)成分，并附加水解酪蛋白140-160mgL—1、蔗糖25000-35000mgL-1、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6mgL-'、萘乙酸0.15-0.25mgL—'和6-芐氨基嘌呤O.15-0.25ragL—'的固體培養(yǎng)基;所述分化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基的大量元素和微量元素，B5基本培養(yǎng)基的有機(jī)成分，并附加水解酪蛋白130-170mgL—'、蔗糖25000-35000mgL—'、萘乙酸0.15-0.25mgL—，6-芐氨基嘌呤2.0-3.0ragI/1的固體培養(yǎng)基；所述生根培養(yǎng)基為固體MS基本培養(yǎng)基。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的pH值均為5.8-6.0。10、根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中還包括對(duì)所述再生植株進(jìn)行靶標(biāo)病害抗性鑒定、和/或分子標(biāo)記鑒定、和/或基因組大小鑒定、和/或染色體數(shù)目鑒定、和/或形態(tài)鑒定的步驟。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種培育抗黑腐病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜的方法。該方法包括以下步驟1)將對(duì)黑腐病具有抗性的黑芥(Brassicanigra)和甘藍(lán)類(lèi)蔬菜進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得雜種細(xì)胞；2)離體培養(yǎng)所述雜種細(xì)胞，獲得再生植株，得到對(duì)黑腐病具有抗性的甘藍(lán)類(lèi)蔬菜雜種。該方法利用細(xì)胞雜交技術(shù)，克服常規(guī)育種中的種間雜交障礙，將存在于十字花科野生材料黑芥中的抗病基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)類(lèi)蔬菜基因組，培育得到抗病甘藍(lán)類(lèi)蔬菜，如具有黑腐病抗性的花椰菜。文檔編號(hào)A01H4/00GK101126087SQ20071011853公開(kāi)日2008年2月20日申請(qǐng)日期2007年7月9日優(yōu)先權(quán)日2007年7月9日發(fā)明者紅嚴(yán),凡劉,麗張,張?jiān)略?泓趙申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院