專利名稱：：一種以大豆子葉節再生植株的方法
技術領域：
：本發明屬于農業生產
技術領域：
。是一種以大豆子葉節為外植體進行大豆器官發生和植株再生的方法。
背景技術：
：大豆植株再生系統是實現大豆基因遺傳轉化的先決條件。良好的大豆植株再生系統應該具有高效的種子消毒技術、適宜的種子萌發培養基和叢生芽誘導培養基、伸長培養基、生根培養基以及必要的無菌苗馴化培養技術等。從20世紀80年代初，人們選擇了幼胚、幼胚子葉或胚軸為外植體，用異常高濃度的植物生長調節物質，建立了大豆的體細胞胚胎發生和器官發生再生系統。隨后用成熟胚子葉、子葉節、初生葉和初生葉節等相繼獲得了較高頻率的源于不定芽的再生植株，80年代末期原生質體培養獲得突破。研究表明，不同的外植體再生頻率差異較大，其中以子葉節的再生頻率較高，是進行大豆植株再生培養最有效的途徑和方法。目前，已有很多關于大豆子葉節再生植株的報道(Owens,1985;Mauto，1995;Trick，1997,1998;蘇彥輝，1999;周思軍，2000)。雖然大豆植株再生系統中外植體的來源已比較明確，但是在組織培養過程對種子消毒、器官發生過程中各種培養基的應用還比較混亂，對植株再生頻率也產生了很大的影響。無菌苗的獲得離不開有效的種子消毒方法，常用的消毒劑有次氯酸鈉、過氧化氫和升汞等，在大豆組織培養中以應用升汞和次氯酸鈉居多。在組織培養過程中，尤其重要的是培養基的選擇及其激素的添加，這對外植體叢生芽誘導、伸長和生根都有重要的影響，是決定外植體器官發生和植株再生的關鍵環節。在萌發培養基中，一般要添加6-BA以提高無菌苗的質量。在叢生芽誘導培養基中要添加適宜配比的6-BA和GA3，以促進子葉節不定芽誘導分化和伸長。在伸長培養基中要添加6-BA、Glu、GA3和ZT以提高叢生芽的伸長率。而在生根培養基中也要添加IBA或NAA，以提高叢生芽的生根能力。所有這些激素添加與否以及劑量的大小對無菌苗的生長和叢生芽誘導、伸長和生根產生重要的調節作用。因此，要建立完善的子葉節器官發生途徑再生系統，必須在相應培養基中添加必要的生長激素，并確定合理添加濃度。為此，我們針對上述問題，對大豆子葉節器官發生途徑再生系統進行完善和優化，研究出本發明。
發明內容本發明從以上技術背景出發，以大豆子葉節作為外植體進行大豆器官發生和植株再生研究，包括無菌苗的獲得、子葉的獲得、叢生芽的誘導、伸長、生根和馴化，直至植株結莢成熟的整個過程。具體操作程序如下a.無菌苗的獲得取表面潔凈的大豆種子用自來水沖洗15min后，放入70%乙醇溶液中處理50s，0.P/。HgCl2溶液中處理5min，然后取出用無菌水洗4-5次，接到萌發培養基屮。萌發培養基為B5-A鹽、B5-B鹽、MS-C鹽、B5有機物、3%蔗糖、0.8%瓊脂粉、2.0mg/L6-BA，pH值為5.8。培養條件為溫度25士rC，光周期16/8h。b.子葉節的獲得取萌發5-7d子葉鮮綠、子葉節處膨大的大豆無菌苗，在子葉節下3-4mm處切去下胚軸，縱向切開子葉，去頂芽、側芽和種子根，每株無菌苗可獲得來兩個子葉節外植體。c.叢生芽的誘導將子葉按近軸面朝上插入添加l.7mg/L6-BA和0.2mg/LGA3的誘導培養基中培養。誘導培養基的基本成分為MS無機物、B5有機物和500mg/L谷氨酰胺。培養條件為溫度25士rC，光周期16/8h。d.叢生芽的伸長待叢生芽可見時，將外植體轉入芽伸長培養基，轉接時切去子葉及下胚軸基部的老化組織，每10d繼帶一次。培養條件為溫度25士rC，光周期16/8h。芽伸長的培養基為B5鹽、MS-C、B5-D、0.lmg/LIAA、10mg/L硝酸銀、3%蔗糖、0.8%瓊脂粉，0.34mg/L6-BA、50mg/LGlu、0.5mg/LAG3、0.5mg/LZT,pH值為5.8。e.叢生芽的生根與馴化帶叢生芽長到3-4cm時，切下轉入生根培養基進行培養，待叢生芽根生出并達到了3-4cm后，洗凈根部的培養基，將生根的小植株移入液體生根培養基中煉苗3-5d，并打開瓶口，使無菌苗適應有菌的外界環境。然后將小植株取出移至營養缽的土壤中(蛭石草炭土細土=1:2:2)培養馴化，套袋以保濕，然后逐漸降低濕度、增強光照。待小苗成活后，轉入正常土壤中栽培，保持溫、濕度和正常的光照直至結莢成熟。叢生芽生根培養基為1/2MSB、0.37mg/LNAA、2%蔗糖和0.8%瓊脂粉，pH值為5.8。具體實施例方式本發明在中國科學院東北地理與農業生態研究所的"大豆高維生素E合成基因遺傳轉化"課題中得到了應用。在課題實施過程中采用本發明對生產上應用較多的黑農35、合豐35、合豐25和綏農14等品種進行了高維生素E合成基因遺傳轉化研究，對于本課題的完成和高維生素E大豆育種都起到了有效的技術支撐。下面列出了大豆子葉節基因型篩選結果大豆子葉節基因型篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根據大豆子葉節基因型篩選結果可以看出，合豐25的叢生芽分化率最高，為94.20%，其次是黑農35，叢生芽分化率為92.65%，合豐35、綏農IO、東生1號和綏農14叢生芽分化率分別為85.48%、83.08%、80.95%和68.33%。每個外植體的叢生芽數以合豐35最多，為4.85個，合豐25和綏農14次之，分別為3.86和3.80個，黑農35、東生l號和綏農10分別為3.19、2.12和0.57。從總體上看，應用此發明所有基因型的分化率均在60%以上，每個外植體的叢生芽數也在2-5之間，因此可以斷定除了綏農10以外，其它4個品種應用子葉節作為外植體進行器官發生和植株再生是比較理想的，這與文獻報道的基本上是一致的，可見本方法不僅是可行的，而且對大豆遺傳改良上具有重要的推動作用。權利要求1.一種以大豆子葉節為外植體進行大豆器官發生和植株再生的方法，其特征在于采用了以下的方法與程序a.無菌苗的獲得取表面潔凈的大豆種子用自來水沖洗15min后，放入70％乙醇溶液中處理50s，0.1％HgCl2溶液中處理5min，然后取出用無菌水洗4-5次，接到萌發培養基中，萌發培養基為B5-A鹽、B5-B鹽、M5-C鹽、B5有機物、3％蔗糖、0.8％瓊脂粉、2.0mg/L6-BA，pH值為5.8，培養條件為溫度25±1℃，光周期16/8h；b.子葉節的獲得取萌發5-7d子葉鮮綠、子葉節處膨大的大豆無菌苗，在子葉節下3-4mm處切去下胚軸，縱向切開子葉，去頂芽、側芽和種子根，每株無菌苗可獲得來兩個子葉節外植體；c.叢生芽的誘導將子葉按近軸面朝上插入添加1.7mg/L6-BA和0.2mg/LGA3的誘導培養基中培養，誘導培養基的基本成分為MS無機物、B5有機物和500mg/L谷氨酰胺，培養條件為溫度25±1℃，光周期16/8h；d.叢生芽的伸長待叢生芽可見時，將外植體轉入芽伸長培養基，轉接時切去子葉及下胚軸基部的老化組織，每10d繼帶一次，培養條件為溫度25±1℃，光周期16/8h，芽伸長的培養基為B5鹽、MS-C、B5-D、0.1mg/LIAA、10mg/L硝酸銀、3％蔗糖、0.8％瓊脂粉，0.34mg/L6-BA、50mg/LGlu、0.5mg/LAG3、0.5mg/LZT，pH值為5.8；e.叢生芽的生根與馴化帶叢生芽長到3-4cm時，切下轉入生根培養基進行培養，待叢生芽根生出并達到了3-4cm后，洗凈根部的培養基，將生根的小植株移入液體生根培養基中煉苗3-5d，并打開瓶口，使無菌苗適應有菌的外界環境，然后將小植株取出移至營養缽的土壤中(蛭石∶草炭土∶細土＝1∶2∶2)培養馴化，套袋以保濕，然后逐漸降低濕度、增強光照。待小苗成活后，轉入正常土壤中栽培，保持溫、濕度和正常的光照直至結莢成熟，叢生芽生根培養基為1/2MSB、0.37mg/LNAA、2％蔗糖和0.8％瓊脂粉，pH值為5.8。全文摘要本發明屬于農業生產
技術領域：
。是一種以大豆子葉節為外植體進行大豆器官發生和植株再生的方法。本發明在傳統組織培養的基礎上，以大豆子葉節為外植體進行器官發生途徑再生系統的完善，在篩選有效的大豆種子消毒技術的基礎上，突出了各種培養基成分的改進與優化，通過常規大豆品種的組織培養驗證，可有效促進叢生芽的誘導、伸長和生根，提高無菌苗的質量和叢生芽的分化率，能夠很好實現多數品種子葉節器官發生和植株再生過程，為大豆遺傳轉化和分子改良提供了堅實的技術支撐，對我國大豆高效育種和健康生產將具有重要的現實意義。文檔編號A01H4/00GK101176427SQ200710056390公開日2008年5月14日申請日期2007年12月6日優先權日2007年12月6日發明者張鳳蕓,張秋英,李艷華,潘相文,王國棟,邢海軍申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所