專利名稱：一種利用城市污泥制備的微生物滅蚊劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種滅蚊劑，具體地說，涉及一種利用城市污泥制備的微生物滅蚊劑及其制備方法。
背景技術：
城市污泥是污水處理過程中必然產生的沉淀物。目前，我國城市污泥年產生量約700萬噸干重，根據我國城市污水處理目標，預計到2010年污泥產生量將超過800萬噸干重。如何妥善處置這些數量日益龐大、高度集中的有機固體廢棄物，是城市污水處理廠最頭痛的問題之一。
在國際上，現行污泥的處置方式主要有填埋、土地利用、焚燒等，但它們都存在各自難以克服的缺陷，并且也不能滿足當前的實際需要。例如，污泥填埋占地面積大，合適的填埋場地正急劇減少，并且污泥中有害成分的滲漏會對地下水造成污染；污泥土地利用存在因污泥大量施用造成的重金屬、有機污染物與病原體等物質污染食物鏈與威脅人類健康的問題；而污泥焚燒的投資成本和操作費用高，處理成本是填埋法、土地利用的好幾倍，并且技術要求高，容易產生二噁英等二次污染物。
在我國，目前城市污泥的主要處置方式是隨意棄置與簡單填埋，這不僅極大地浪費了污泥中大量的有機質和氮、磷等植物養分，而且已成為水土環境的新隱患，嚴重干擾了污水處理廠的正常運行。缺乏穩定、環境安全與經濟有效的資源化技術是當前我國城市污泥所面臨的實際現狀。
蚊蟲是人類最主要的衛生害蟲之一，不僅吸血擾人，而且是多種嚴重疾病的傳播媒介。在世界范圍內，每年因蚊蟲的傳播致使24億人(約占全球總人口的40％)遭受瘧疾、絲蟲病、登革熱、黃熱病、乙型腦炎的威脅，每年由于感染上述五種蚊媒疾病而發病死亡的人數超過200萬。我國是蚊媒疾病流行國家之一，滅蚊控病任務十分緊迫，特別是近年來登革熱等蚊媒疾病在沿海等城市發病明顯上升。控制蚊蟲被認為是消除蚊蟲蚊媒疾病的有效途徑。20世紀50年代在世界衛生組織(WHO)的倡導下，人們開始采用六六六、DDT等化學滅蚊劑來控制成蚊密度。但是，隨著化學滅蚊劑長期大量使用所導致的蚊蟲抗藥性，以及環境污染和生態平衡破壞等問題的日益嚴重，迫切需要新的安全有效的蚊蟲綜合防治方法。微生物滅蚊策略越來越受重視。
目前，已相繼發現球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus，簡稱Bs)、蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis，簡稱Bti)、厭氧雙酶梭菌馬來西亞亞種(Clostridium bifermentans subsp.malaysia)與大鏈壺菌(Lagenidium giganteum)等對蚊幼蟲有特異性毒殺作用，它們對非靶生物包括人畜安全(可用于飲用積水)，同時也不破壞生態平衡和污染環境。在這些殺蚊微生物中，Bs與Bti兩種芽孢桿菌的殺蚊幼效果最好，應用最為廣泛。它們殺蚊的主要活性成分是代謝過程中產生的毒素蛋白，毒素蛋白被幼蟲吞食后在腸道堿性環境中溶解，被蛋白酶降解激活，攻擊蚊幼蟲中腸刷狀緣上皮細胞膜，殺傷這些細胞，最終導致幼蟲死亡。
Bti與Bs微生物滅蚊劑的主要生產工藝是液體深層發酵，以黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米粉蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等為主要原料，原料成本約占總生產成本的20-35％。目前，制約它們大規模應用的主要因素有兩個一是生產原料昂貴，造成產品使用價格較高，抵消了其作為生物滅蚊劑的優越性；二是發酵水平低。這兩種芽孢桿菌，尤其是Bs在發酵中往往不能同步成熟，發育同步性能差(普遍報道抗熱芽孢的形成率只有48-72％)，導致產品的殺蚊活性不高。
近20年來，有研究者嘗試采用廉價的農副產品或有機物含量豐富的有機廢棄物作為原料發酵生產微生物滅蚊劑。例如，Dharmsthiti等(1985)利用味精工業產生的有機廢液(經水解預處理)作為主要培養基發酵生產Bti滅蚊劑，發酵罐試驗表明，經過24-48h的通氣攪拌培養，發酵液中Bti菌數達2.5×109個細菌/mL，對埃及伊蚊幼蟲(Aedes aegypti)的LC50為0.063mg/L，顯著高于常規的合成培養基。Obeta等(1983)利用豬血、豆科植物種籽和礦質鹽制備的幾種培養基，發現在這些培養基中Bs 1593菌株都能良好的生長與產孢產毒，從而制備Bs滅蚊劑。然而，這些原料具有季節性和分散性，往往不能及時供給，并且通常需要繁瑣、昂貴的預處理(如水解、浸提與濃縮處理等)，因而并未得到大規模的實際應用。
城市污泥的產生具有日常性與集中性，并且含有大量可被微生物利用的碳、氮、磷以及微量元素等營養物質。W095/35365(1995)與CN 1772879A(2006)公開了以污泥作為發酵原料、以蘇云金桿菌作為發酵菌種生產蘇云金桿菌生物殺蟲劑。但它們所生產的生物殺蟲劑的防治對象是農作物害蟲，沒有涉及到衛生害蟲蚊類。經文獻與專利檢索，在現有技術中還未發現利用城市污泥制備生物滅蚊劑的報道。
發明內容
本發明的目的在于彌補現有技術中的不足，提供一種殺蚊效果好，對環境安全無害的微生物滅蚊劑。
本發明的另一個目的是提供上述微生物滅蚊劑的制備方法，在滅蚊劑制備過程中實現污泥的資源化處置。
為了實現上述目的，本發明采用液體深層發酵方法，包括如下步驟1)培養基調理調節城市污泥的含固率為2-5％，加入1-5g/L消泡劑，用酸或堿調pH為6.5-8.0，攪拌均勻后，在種子罐或發酵罐中經15磅壓力與121℃下滅菌30-60分鐘，冷卻至30-35℃備用。所用的消泡劑是指泡敵、聚丙二醇、豆油、花生油等，最好是泡敵。所用的酸是指磷酸、硫酸或鹽酸，其中最好是磷酸；所用的堿是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是KOH。
2)搖瓶培養從保藏正常的Bti或Bs斜面培養基上挑取一環接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養。條件為溫度28-32℃、轉速150-250轉/分，三角瓶裝液量20-40％，培養時間8-12小時。牛肉膏蛋白胨液體培養基的成分為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自來水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅壓力與121℃下滅菌30分鐘。所用Bti與Bs菌株是WHO推薦或廠家普遍使用的高毒力菌株，具體來說，Bti是指蘇云金芽孢桿菌H14血清型，主要是187與1897菌株；Bs包括2362、1593、2297等3種，上述菌株可在國內微生物保藏機構通過直接購得。
3)種子罐發酵將Bti或Bs搖瓶菌液移入種子罐，接種量為1-3％，進行發酵培養。條件為罐溫28-32℃、罐壓0.02-0.06MPa、通氣量1∶1.0-1.5(V/V/分)、攪拌速度200-260轉/分、發酵時間8-12小時。
4)發酵罐發酵按2-8％的接種量將Bti或Bs種子液移種到發酵罐。培養條件為罐溫28-32℃、罐壓0.02-0.06MPa、通氣量1∶1.0-1.5(V/V/分)、攪拌速度180-220轉/分、發酵時間30-42小時，其中Bs菌株的適宜發酵時間為30-36小時，Bti菌株的適宜發酵時間為36-42小時。
5)發酵液后處理發酵結束后，用無機酸將發酵液pH調為4.0-4.5，然后用高速離心法濃縮發酵液，濃縮倍數為1-5倍，濃縮液加入0.2-2g/L防腐劑，攪拌均勻，分裝，得到微生物滅蚊劑液體產品；所述的無機酸是指硫酸、鹽酸或硝酸，其中最好是鹽酸所述的防腐劑是指山梨酸鉀、苯甲酸鈉、二甲苯或尼泊金甲酯，其中最好是山梨酸鉀。
6)產品質量檢驗產品中抗熱性芽孢的測定方法采用無菌操作，將液體產品進行梯度稀釋，取適宜稀釋度的菌液于80℃水浴處理15min，然后進行涂布培養計數，每平板菌落數30-300個有效。產品生物毒力效價測定方法按照WHO標準程序進行，試蟲為淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)或白紋伊蚊(Aedesalbopictus)二齡末至三齡初的健康幼蟲。合格產品中抗熱芽孢數≥109個/毫升，生物測定毒力效價≥100ITU/mg。
g/L是指每1L培養基液體中加入目標物的克數；％是指每百份質量的培養基液體中接入接種物的質量份數；V/V/分是指每分鐘向1份體積的培養基中通入空氣的體積份數。
本發明的技術原理是以城市污泥所含的碳水化合物與蛋白質、磷以及微量元素為主要營養物質，在維持適宜pH、溫度與通氣量的條件下，Bti或Bs菌株得以生長與增殖，形成抗熱性芽孢與毒素蛋白等殺蟲活性物質，發酵液經濃縮制成微生物滅蚊劑產品。所制備的滅蚊制劑為液體劑型，可有效殺滅庫蚊與伊蚊的幼蟲，并且對環境安全無害。所述液體劑型中抗熱性芽孢含量不低于109個/毫升，對淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)或白紋伊蚊(Aedes albopictus)2-3齡幼蟲的生物毒效不低于100ITU/mg。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)為城市污泥提供了一條嶄新資源化處置途徑，同時降低了微生物滅蚊劑的生產成本。
(2)與現有污泥處置技術相比，本方法不僅處置了污泥，而且可獲得附加值較高的滅蚊劑產品，從而降低了污泥處理處置成本。
(3)現有微生物滅蚊劑的生產原料主要是黃豆餅粉、花生餅粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等，原料價格過高是其難于普及的主要限制因素。本發明中Bti或Bs菌株主要依靠城市污泥中自身的可利用成分(糖分、蛋白質與礦質鹽等)生長與增殖，添加的成分較少，大大降低了微生物滅蚊劑的生產成本，從而促進環境友好型生物滅蚊劑的推廣應用。
(4)現有微生物滅蚊劑發酵生產中一個技術瓶頸是抗熱芽孢形成率低(48-72％)。也就是說細菌發育同步性能差，從而導致產品的殺蚊活性不高。以城市污泥替代黃豆餅粉等常規原料，可以提高Bti與Bs的發育同步性，倒罐時(30-42小時)抗熱芽孢形成率可達到85％以上。
圖1為本發明的制備流程圖。
具體實施例方式
實施例1 生產Bti生物滅蚊劑(1)城市污泥樣品取廣東省廣州市某污水處理廠的濃縮污泥，該污泥的基本性質見表1。
表1.供試污泥基本性質
(2)污泥調理用自來水調節污泥含固率為4.0％，加入2.0g/L的消泡劑泡敵。用磷酸調pH至6.80，分別在種子罐與發酵罐中經15磅壓力與121℃溫度滅菌60分鐘，冷卻至35℃備用，滅后pH約為7.19。
(其它消泡劑，如聚丙二醇、豆油、花生油等，分別代替泡敵，其效果相同。)(3)搖瓶培養從Bti 187菌株斜面培養基上挑取一環接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養。培養條件為溫度30℃、轉速200轉/分，500mL三角瓶裝液200mL培養基，培養時間10小時。牛肉膏蛋白胨液體培養基的成分為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自來水1000mL；pH7.2-7.5，15磅壓力與121℃下滅菌30分鐘。
(4)種子罐發酵接種2.0％的上述搖瓶菌液，發酵培養。培養條件為罐溫30℃、罐壓0.03MPa、通氣量1∶1.0(V/V/分)、攪拌速度200轉/分、發酵時間8小時。
(5)發酵罐發酵接種2.0％的種子液到發酵罐。培養條件為罐溫30℃、罐壓0.03MPa、通氣量1∶1.0(V/V/分)、攪拌速度180轉/分、發酵時間40小時。放罐時發酵液中Bti 187菌株的活菌數為4.6×108個/mL，抗熱性芽孢數4.1×108個/mL，芽孢形成率91％，均顯著高于常規牛肉膏蛋白胨液體培養基(表2)。
表2.Bti 187菌株在污泥培養40小時的發酵參數及其與常規培養基的比較
(6)發酵液后處理發酵結束后，用稀硫酸將發酵液pH調為4.0，經高速離心濃縮5倍，加入0.3g/L的防腐劑山梨酸鉀，攪拌均勻，分裝。
(其它防腐劑是指苯甲酸鈉、二甲苯、尼泊金甲酯，代替山梨酸鉀，效果相同。)(7)產品質量檢驗經檢驗所制備的Bti生物滅蚊劑液體劑型中抗熱性芽孢數為1.89×109個/毫升，生物測定表明產品對白紋伊蚊2-3齡幼蟲的毒力效價為120ITU/mg。
制備流程圖見圖1。
實施例2 生產Bti生物滅蚊劑(1)城市污泥樣品城市污泥樣品性質與表1相同。
(2)污泥調理用自來水調節污泥含固率為3.0％，加入1.5g/L的消泡劑聚丙二醇。用磷酸調pH至6.92，分別在種子罐與發酵罐中經15磅壓力與121℃溫度滅菌60分鐘，冷卻至35℃備用，滅后pH約為7.55。
(3)搖瓶培養菌株由Bti 187菌株換成Bti 1897菌株，其余同實施例1。
(4)種子罐發酵接種1.0％的上述搖瓶菌液，發酵培養。培養條件為罐溫28℃、罐壓0.03MPa、通氣量1∶1.0(V/V/分)、攪拌速度240轉份、發酵時間12小時。
(5)發酵罐發酵接種5.0％的種子液到發酵罐。培養條件為罐溫28℃、罐壓0.03MPa、通氣量1∶1.2(V/V/分)、攪拌速度200轉/分、發酵時間36小時。放罐時發酵液中活菌數為5.5×108個/mL，抗熱性芽孢數4.9×108個/mL，芽孢形成率89％。
(6)發酵液后處理發酵結束后，用稀鹽酸將發酵液pH調為4.5，經高速離心濃縮5倍，加入0.2g/L的防腐劑苯甲酸鈉，攪拌均勻，分裝。
(其它防腐劑是指山梨酸鉀、二甲苯、尼泊金甲酯，代替苯甲酸鈉，效果相同。)(7)產品質量檢驗經檢驗所制備的Bti生物滅蚊劑液體劑型中抗熱性芽孢數為2.24×109個/毫升，生物測定表明產品對白紋伊蚊2-3齡幼蟲的毒力效價為102ITU/mg。
實施例3 生產Bs生物滅蚊劑(1)城市污泥樣品取廣東省深圳市某污水處理廠的濃縮污泥，該污泥的基本性質見表3。
表3.供試污泥基本性質
(2)污泥調理用自來水調節城市污泥含固率為2.0％，加入5g/L的花生油。用KOH調pH至7.0，分別在種子罐與發酵罐中經15磅壓力與121℃溫度滅菌60分鐘，冷卻至35℃備用，滅后pH約為7.61。
(3)搖瓶培養從Bs 2362菌株斜面培養基上挑取-環接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養。培養條件為溫度30℃、轉速200轉/分，500ml三角瓶裝液150mL培養基，培養時間8小時。牛肉膏蛋白胨液體培養基的成分為牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自來水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅壓力與121℃下滅菌30分鐘。
(4)種子罐發酵接種1.5％的上述搖瓶菌液，發酵培養。培養條件為罐溫30℃、罐壓0.03MPa、通氣量1∶1.2(V/V/分)、攪拌速度250轉/分、發酵時間8小時。
(5)發酵罐發酵接種3.0％的種子液到發酵罐。培養條件為罐溫30℃、罐壓0.03MPa、通氣量1∶1.2(V/V/分)、攪拌速度180轉/分、發酵時間32小時。放罐時發酵液中Bs 2362菌株的活菌數為5.1×108個/mL，抗熱性芽孢數5.0×108個/mL，芽孢形成率98％，均顯著高于常規牛肉膏蛋白胨液體培養基(表4)。
表4.Bs 2362菌株在污泥培養40小時的發酵參數及其與常規培養基的比較
(6)發酵液后處理發酵結束后，用稀硫酸將發酵液pH調為4.3，經高速離心濃縮4倍，加入0.4g/L的防腐劑二甲苯，攪拌均勻，分裝。
(其它防腐劑是指山梨酸鉀、苯甲酸鈉、尼泊金甲酯，代替二甲苯，效果相同。)(7)產品質量檢驗經檢驗所制備的Bs生物滅蚊劑液體劑型中抗熱性芽孢數為1.67×109個/毫升，生物測定表明產品對淡色庫蚊2-3齡幼蟲的毒力效價為180ITU/mg。
權利要求
1.一種利用城市污泥制備微生物滅蚊劑的方法，其特性在于包括如下步驟(1)污泥調理將城市污泥的含固率調至2-5％，加入1-5g/L消泡劑，用酸或堿調pH為6.5-8.0，攪拌均勻后，滅菌，冷卻至30-35℃備用；(2)搖瓶培養將Bti或Bs接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養基的瓶中，進行搖瓶培養，培養條件為溫度28-32℃、轉速150-250轉/分，瓶裝液量20-40％，培養時間8-12小時；(3)種子罐發酵將Bti或Bs搖瓶菌液移入種子罐，接種量為1-3％，進行發酵培養，培養條件為罐溫28-32℃、罐壓0.02-0.06MPa、每分鐘的通氣體積量為培養基體積的1.0-1.5倍、攪拌速度200-260轉/分、發酵時間8-12小時；(4)發酵罐發酵按2-8％的接種量將Bti或Bs種子液移種到發酵罐，培養條件為罐溫28-32℃、罐壓0.02-0.06MPa、每分鐘的通氣體積量為培養基體積的1.0-1.5倍、攪拌速度180-220轉/分、發酵時間30-42小時，其中Bs菌株的發酵時間為30-36小時，Bti菌株的發酵時間為36-42小時；(5)發酵液后處理發酵結束后，用無機酸將發酵液pH調為4.0-4.5，然后用高速離心法濃縮發酵液，濃縮倍數為1-5倍，濃縮液加入0.2-2g/L防腐劑，攪拌均勻，分裝，得到微生物滅蚊劑液體產品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的消泡劑為泡敵、聚丙二醇、豆油或花生油。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的酸是指磷酸、硫酸或鹽酸。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的堿是指KOH、NaOH或Ca(OH)2。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述滅菌是指在種子罐或發酵罐中經15磅壓力與121℃下滅菌30-60分鐘。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的無機酸是指硫酸、鹽酸或硝酸。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的防腐劑是山梨酸鉀、苯甲酸鈉、二甲苯或尼泊金甲酯。
8.利用權利要求1～7任一項所述方法得到的微生物滅蚊劑。
全文摘要
本發明公開了一種利用城市污泥制備的微生物滅蚊劑及其制備方法。本發明的制備方法包括污泥調理、搖瓶培養、種子罐發酵、發酵罐發酵、發酵液后處理與產品質量檢驗。本發明為污泥提供一條新型高附加值的資源化處置途徑，具有處置污泥與生產微生物滅蚊劑的雙重功效。同時本發明可以降低微生物滅蚊劑的生產成本，有利于促進環境友好型生物滅蚊劑的推廣應用。
文檔編號A01P7/04GK1919002SQ200610037548
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月7日 優先權日2006年9月7日
發明者周順桂, 雷發懋, 王躍強 申請人:廣東省生態環境與土壤研究所