專利名稱：具有殺線蟲功能的異形隔指孢菌劑及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲功能的異形隔指孢(Dactylella varietas)菌劑及應用，屬生物農(nóng)藥技術領域。
背景技術：
植物寄生線蟲是一種世界范圍內普遍發(fā)生的植物病害，僅根結線蟲已知種類達70多種，危害3000多種植物，每年造成損失巨大。據(jù)估計全球每年由植物寄生線蟲所造成的作物損失達780億美元(Barker，1998)。2001年我國作物因受線蟲危害造成的損失高達233億元。松材線蟲被稱為無煙森林火災，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺灣、香港等部份地區(qū)嚴重發(fā)生，有向全國漫延的趨勢。更嚴重的是由于根結線蟲侵染后造成作物傷口，致使作物根部病害嚴重發(fā)生。
目前對線蟲防治仍以化學殺線蟲劑為主。發(fā)明于上個世紀40年代的化學殺線蟲劑，長期以來在保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，防治線蟲病中發(fā)揮了重要作用。但隨著科學技術的進步，發(fā)現(xiàn)許多化學殺線蟲劑均有副作用，不僅產(chǎn)生抗藥性，更造成環(huán)境污染，危害人體健康，相繼有不少被禁用或即將禁用。如美國已經(jīng)禁止使用溴甲烷，二溴甲烷只能使用到2005年。化學殺線蟲劑在防治線蟲危害，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的同時，給人類健康和環(huán)境帶來了嚴重的負面影響，開發(fā)高效低毒殺線蟲劑和生物殺線蟲劑已經(jīng)迫在眉睫。
隔指孢是一類非常重要的生防真菌資源，其中很多都是非常重要的昆蟲和線蟲的病原真菌，能有效的用于防治多種有害昆蟲和線蟲，在植物的病原昆蟲和線蟲的生物防治中起著非常重要的作用。目前，關于植物寄生線蟲生物防治的報道日益增多，然而沒有任何關于異形隔指孢殺昆蟲和線蟲的報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是通過對一株產(chǎn)生胞外酶并能夠有效分解線蟲體壁結構的異形隔指孢的研究，開發(fā)生物殺線蟲制劑。
本發(fā)明篩選到的一株對植物寄生線蟲具有很好毒殺作用的異形隔指孢(Dactylellavarietas)，YMF1.00118。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日期2005年10月31目；保藏登記入冊的編號CGMCC No.1521。
異形隔指孢(Dactylella varietas，YMF1.00118)系本實驗室從土壤樣品中分離的一個食線蟲真菌，主要形態(tài)特征為
該菌株在PDA和CMA平板上生長比較慢，半個月菌落直徑只有2-3cm，菌絲無色，沒有分隔，分枝，不容易產(chǎn)孢，孢子梗直立有分隔，有些有分枝，頂端著生單個分生孢子(偶爾見兩個)，孢子形狀為典型的紡錘形(6-10μm-40-60μm)，分隔變化較大(2-8個)，5-8個分隔居多，在營養(yǎng)貧乏的時候菌絲特化形成三維菌網(wǎng)和套索狀的菌絲圈。
本發(fā)明按常規(guī)方法制備。即將異形隔指孢擴大培養(yǎng)后，提取殺線蟲有效成分，測定其對全齒復活線蟲(Panagrellus redivivus)和秀麗隱桿線蟲線蟲(Caenorhabditiselegans)的殺蟲效果。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的YMF1.00118菌株培養(yǎng)方法1.試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為改良型PDA培養(yǎng)基1％葡萄糖；1000ml土豆汁(100g土豆加水1200ml煮沸過濾)，1.8-2％瓊脂。將YMF1.00118菌絲體接種到培養(yǎng)基上，20-25℃下培養(yǎng)7～10天，獲得試管種。
2.培養(yǎng)皿擴大培養(yǎng)采用前述1改良型PDA培養(yǎng)基，直徑為9厘米培養(yǎng)皿，接種YMF1.00118后，用封口膜封口后于20-25℃下培養(yǎng)7～10天，獲得用于液體擴大培養(yǎng)的菌種。
3.液體擴大培養(yǎng)(產(chǎn)酶培養(yǎng))產(chǎn)酶培養(yǎng)基(PL-4)組成如下0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，0.001％硫酸亞鐵，1000ml土豆汁(100g土豆加水1200ml煮沸過濾)，pH 6.5。每個250ml三角瓶分裝60ml培養(yǎng)液，并加入少量的線蟲作為誘導物，121℃滅菌20分鐘，接入菌塊，26℃搖床(200rpm)培養(yǎng)6天.
殺線蟲活性成分的提取異形隔指孢菌絲接種PDA培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)10天，挑取菌絲塊接種滅菌的PL-4培養(yǎng)基，26℃，200rpm搖床培養(yǎng)6天。收集上清液(2升)，加入硫酸銨(85％的飽和度)進行沉淀，沉淀溶解于適量的磷酸鹽緩沖液。粗酶液經(jīng)過透析除鹽處理以后用陽離子交換柱進行純化，分別收集穿透峰和洗脫峰，生物活性測定表明大部分蛋白酶活性在洗脫峰，收集洗脫峰并用蒸餾水透析處理，電泳分析已達到電泳純。冷凍干燥把樣品凍干并溶解于2ml的蒸餾水中，-20C保存。經(jīng)過超濾膜濃縮以后的樣品即可做為殺蟲藥液用。
殺線蟲活性試驗1、制備試驗用藥劑和對照用藥劑1)按前述液體擴大培養(yǎng)方法培養(yǎng)YMF1.00118菌株，按前述提取殺線蟲活性成份的方法制備試驗用藥劑。
2)制備對照用藥劑對照1前述1制備試驗用藥劑方法制備對照用藥劑，將制備供試藥劑加熱煮沸20分鐘后作為對照；對照2為了證明殺線蟲有效成份是蛋白，將制備供試藥劑用蛋白酶抑制劑處理后作為對照。
2、制備試驗用線蟲將全齒復活線蟲(P.redivivus)和秀麗隱桿線蟲線蟲(C.elegans)分別接種于滅菌的燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6-10天，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3、試驗方法1)藥效試驗方法取實驗用藥劑200ul于1.5ml離心管中，加入活線蟲60條，離心管平放，置于25℃，分別于12小時和24小時在顯微鏡下進行觀察，并分別計算全齒復活線蟲和秀麗隱桿線蟲線蟲的死亡率。鑒定線蟲死亡的方法為在離心管中加入1-5滴5％NaCl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
分別用2種對照藥劑進行對照實驗。
試驗設三個平行，兩次重復。
2)純化樣品的殺線蟲作用和對線蟲體壁的分解實驗方法同上，用光學顯微鏡觀察純化的樣品對線蟲體壁的分解作用。
4、試驗結果表1YMF1.00118對全齒復活線蟲(Panagrellus redivivus)的殺蟲效果
表2YMF1.00118對秀麗隱桿線蟲線蟲(C.elegans)的殺蟲效果
結果表明，從YMF1.00118菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取的試驗用藥劑對全齒復活線蟲和秀麗隱桿線蟲線蟲均具較好的殺線蟲效果。用10倍濃縮的粗酶樣品和純化的蛋白酶作為藥液處理線蟲，24小時后全齒復活線蟲和秀麗隱桿線蟲線蟲100％死亡，并且大部分線蟲完全被分解(表1和表2)，同時實驗結果表明純化的樣品的殺線蟲活性低于粗的濃縮樣品，說明有多種成分參與了殺線蟲的過程，所以殺蟲藥液選用粗濃縮樣品。
從處理線蟲的變化來看，經(jīng)歷了從部份體壁分解(附圖以示)到蟲體全部降解的過程，說明活性成份主要為分解線蟲的酶類。而將同批提取的試驗用藥劑經(jīng)過煮沸和抑制劑處理，導致蛋白質變性后，其殺線蟲活性非常小，且線蟲體壁不出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，這也證明了異形隔指孢對線蟲的活性成份主要為酶類。
本發(fā)明異形隔指孢YMF1.00118是一種食線蟲真菌，在本發(fā)明所用的培養(yǎng)基中分泌的胞外酶主要作用成份是蛋白酶，對全齒復活線蟲和秀麗隱桿線蟲線蟲都有良好的殺蟲效果，具備了良好的應用開發(fā)前景。
附圖顯示異形隔指孢的胞外蛋白酶對全齒復活線蟲體壁的降解作用。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內容并不局限于此。
實施例一將YMF1.00118菌株接種到改良PDA斜面上，培養(yǎng)基配方為1％葡萄糖；100g土豆煮成汁，1.8-2％瓊脂；pH自然。將YMF1.00118菌絲體接種到培養(yǎng)基上，20-25℃下培養(yǎng)7～10天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中(每瓶裝60ml)，液體培養(yǎng)基配方為0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，用水補充體積至1L，pH 6.5。每個250ml三角瓶分裝60ml培養(yǎng)液，并加入少量的線蟲作為誘導物，121℃滅菌20分鐘，接入菌塊，26℃搖床(200rpm)培養(yǎng)6天.
異形隔指孢菌絲接種PDA培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)10天，挑取菌絲塊接種滅菌的PL-4培養(yǎng)基，26℃，200rpm搖床培養(yǎng)6天。收集上清液(2升)，加入硫酸銨(85％的飽和度)進行沉淀，沉淀溶解于適量的磷酸鹽緩沖液。粗酶液經(jīng)過透析除鹽處理以后用陽離子交換柱進行純化，分別收集穿透峰和洗脫峰，生物活性測定表明大部分蛋白酶活性在洗脫峰，收集洗脫峰并用蒸餾水透析處理，電泳分析已達到電泳純。冷凍干燥把樣品凍干并溶解于2ml的蒸餾水中，-20℃保存。經(jīng)過超濾膜濃縮以后的樣品即可做為殺蟲藥液用。
實施例二基本同實施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，0.1％蛋白胨，用水補充體積至1L，pH 6.5。
權利要求
1.一種具有殺線蟲功能的異形隔指孢菌劑，通過常規(guī)方法得到，其特征在于該制劑的生產(chǎn)菌株為Dactylella varietas YMF1.00118，保藏號為CGMCC No.1521。
2.權利要求1所述的異形隔指孢菌劑的應用，其特征在于該菌劑作為植物寄生線蟲的生防制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲功能的異形隔指孢菌劑及應用，屬微生物農(nóng)藥技術領域。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株為Dactylell avarietas YMF1.00118，采用常規(guī)方法制備，其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，0.001％硫酸亞鐵，1000ml土豆汁，pH 6.5。從液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取殺線蟲有效成分的方法是，將發(fā)酵培養(yǎng)物進行過濾處理，上清液用硫酸銨進行濃縮處理即可做為殺線蟲的藥液。本發(fā)明菌株通過液體發(fā)酵后，從代謝產(chǎn)物中提取殺線蟲有效成分，制備為生物殺線劑。本發(fā)明產(chǎn)品對全齒復活線蟲和秀麗隱桿線蟲具有毒力高的突出優(yōu)點，具有較好的潛在應用前景。
文檔編號A01N63/04GK1837353SQ200610010850
公開日2006年9月27日 申請日期2006年4月26日 優(yōu)先權日2006年4月26日
發(fā)明者楊金奎, 梁連銘, 李娟 , 張克勤 申請人:云南大學