專利名稱：天然多組分抗菌蛋白發酵液的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白液的制備方法。
背景技術：
土傳病害是我國農業生產中一種重要的病害，主要使用高毒、劇毒化學農藥或使用農用抗生素來進行防治。而化學農藥存在安全性差、污染環境、危害人體健康等問題；農用抗生素雖在一定程度上解決了化學農藥所存在的問題，但對土傳病害防效顯著的種類極少，且長期使用會導致病原菌抗藥性的產生，以及同類醫藥抗生素在人體失效，對人體健康形成潛在危害。微生物產生的抗菌蛋白制品在生物防治領域的應用已取得了一定的成效，但是由于現有的抗菌蛋白制品毒性大、抗菌譜窄、在實際應用中受到一定的限制。
發明內容
本發明的目的是為了解決目前農用抗生素對土傳病害防效顯著的種類極少，長期使用導致病原菌產生抗藥性及同類醫藥抗生素在人體失效和現有抗菌蛋白制品毒性大、抗菌譜窄的問題，而提供的一種天然多組分抗菌蛋白發酵液的制備方法。天然多組分抗菌蛋白發酵液按以下步驟制備(一)將側孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到斜面活化培養基上，在30±2℃的條件下活化培養24±0.5h；(二)按50mL液體種子培養基接種一滿環側孢芽孢桿菌菌株BL-21的比例將經過活化的側孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到液體種子培養基，然后再在30±2℃、180r/min的條件下培養18～24h；(三)將液體種子培養液與發酵培養基混合，液體種子培養液占混合液總體積的3％～4％，混合液在30±2℃、180r/min的條件下培養48～120h，即得到天然多組分抗菌蛋白發酵液；其中斜面活化培養基為牛肉膏蛋白胨固體培養基或葡萄糖蛋白胨固體培養基，液體種子培養基為牛肉膏蛋白胨液體培養基，發酵培養基按蛋白胨3～6g、牛肉膏1～4g、氯化鈉4～5g和水1000mL的比例制成，發酵培養基的pH值為7.0。本發明選用的側孢芽孢桿菌菌株BL-21(《生物技術》2005 Vol.15 No.3P.64-67)對環境和人體健康安全性高。本發明制備的天然多組分抗菌蛋白發酵液可直接使用，為綠色農產品，無毒無害，不污染環境，對人體無不良影響。本發明制備的天然多組分抗菌蛋白發酵液中含有多種抗菌蛋白，抑菌譜廣，對多種植物病原真菌、部分革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌都有抑制作用，適合用于防治多種作物、果疏的土傳病害。
圖1和圖2是天然多組分抗菌蛋白發酵液分成三組進行抑菌試驗的結果圖，圖1培養基上的病菌是辣椒根腐病菌，圖2培養基上的病菌是辣椒炭疽病菌。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式天然多組分抗菌蛋白發酵液按以下步驟制備(一)將側孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到斜面活化培養基上，在30±2℃的條件下活化培養24±0.5h；(二)按50mL液體種子培養基接種一滿環側孢芽孢桿菌菌株BL-21的比例將經過活化的側孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到液體種子培養基，然后再在30±2℃、180r/min的條件下培養18～24h；(三)將液體種子培養液與發酵培養基混合，液體種子培養液占混合液總體積的3％～4％，混合液在30±2℃、180r/min的條件下培養48～120h，即得到天然多組分抗菌蛋白發酵液；其中斜面活化培養基為牛肉膏蛋白胨固體培養基或葡萄糖蛋白胨固體培養基，液體種子培養基為牛肉膏蛋白胨液體培養基，發酵培養基按蛋白胨3～6g、牛肉膏1～4g、氯化鈉4～5g和水1000mL的比例制成，發酵培養基的pH值為7.0。
本實施方式制備的天然多組分抗菌蛋白發酵液經過胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶酶解后，抑菌活性明顯降低，甚至消失。說明產生抑菌活性的物質為蛋白質性質。將本實施方式制備的天然多組分抗菌蛋白發酵液進行了初步分析，結果表明在紫外反射光源254nm下，在展層后的綠色熒光薄板上可以看到四條明顯的暗藍色條帶，抑菌試驗結果表明，其中有三條條帶具有抗菌活性。在紫外透射光源下，也能看到四條明顯的亮藍色熒光條帶，但這四條亮藍色熒光條帶同反射光源254nm下觀察到的暗藍色條帶不完全一致，Rf值有差異，這說明發酵液中的組分較多，不同的組分其最大紫外吸收的波長不同。抑菌試驗結果表明，這四條紫外透射熒光條帶都具有抗菌活性，且抗菌活性各不相同其中第一個組分(Rf＝0)和第四個組分(Rf＝0.66)對蠟樣芽孢桿菌有較好的抗菌活性，對辣椒根腐病菌沒有抑菌效果，第二個組分(Rf＝0.31)雖然對蠟樣芽孢桿菌沒有活性，但對辣椒根腐病菌有較好的抑制作用，第三個組分(Rf＝0.50)則對蠟樣芽孢桿菌和辣椒根腐病菌都有較好的抗菌活性。這充分說明發酵液中含有多種(至少4種)活性組分，且各活性組分各不相同，因此具有較好的抑菌活性和較寬的抑菌譜。用茚三酮顯色法也能較好的觀察到該發酵液的各不同組分，同時也說明了該抗菌活性物質是蛋白類物質。
實驗證明本實施方式制備的天然多組分抗菌蛋白發酵液在10～40℃環境中抑菌活性較穩定，在60℃的環境中抑菌活性減弱。天然多組分抗菌蛋白發酵液在pH5～pH9的范圍內，均具有抑菌活性。對辣椒炭疽病菌、水稻惡苗病菌、辣椒根腐病菌、黃瓜枯萎病菌、煙草赤星病原菌、小麥根腐病菌、小麥赤霉病菌、西瓜炭疽病菌、水稻惡苗病菌、立枯絲核病菌、大蔥紫斑病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌14種植物病原菌及大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌均有抑制作用。
具體實施方式
二本實施方式天然多組分抗菌蛋白發酵液按以下步驟制備(一)將側孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到斜面活化培養基上，在30℃的條件下活化培養24h；(二)按50mL液體種子培養基接種一滿環側孢芽孢桿菌菌株BL-21的比例將經過活化的側孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到液體種子培養基，然后再在30℃、180r/min的條件下培養20～22h；(三)將液體種子培養液與發酵培養基混合，液體種子培養液占混合液總體積的3.2％～3.8％，混合液在30℃、180r/min的條件下培養60～108h，即得到天然多組分抗菌蛋白發酵液；其中斜面活化培養基為牛肉膏蛋白胨固體培養基或葡萄糖蛋白胨固體培養基，液體種子培養基為牛肉膏蛋白胨液體培養基，發酵培養基按蛋白胨4～5g、牛肉膏2～3g、氯化鈉4.5g和水1000mL的比例制成，發酵培養基的pH值為7.0。
將本實施方式制備的天然多組分抗菌蛋白發酵液分成三組進行抑菌試驗，第一組抗菌蛋白液不做任何處理，第二組抗菌蛋白液熱處理(加熱至80～100℃)，第三組抗菌蛋白液酶處理(加入蛋白酶)。抑菌試驗結果如圖1和圖2所示，圖1辣椒根腐病菌和圖2辣椒炭疽病菌培養基上都只有第一組抗菌蛋白液1出現抑菌環，第2組抗菌蛋白液2和第2組抗菌蛋白液3未出現抑菌環，證明本實施方式制備的抗菌蛋白液對辣椒根腐病菌和辣椒炭疽病菌都具有抑菌作用，而且說明本實施方式制備的抗菌液中抑菌物質為蛋白類。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是斜面活化培養基為牛肉膏蛋白胨固體培養基，牛肉膏蛋白胨固體培養基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化鈉2g、瓊脂15～18g和水1000mL的比例制成，斜面活化培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是斜面活化培養基為葡萄糖蛋白胨固體培養基，葡萄糖蛋白胨固體培養基按蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO42g和水1000mL的比例制成，斜面活化培養基的pH值為7.0～7.2。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點是牛肉膏蛋白胨液體培養基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化鈉2g和水1000mL的比例制成，牛肉膏蛋白胨液體培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一的不同點是發酵培養基中還包括可溶性淀粉、FeSO4、MgSO4中的一種或幾種，每1000mL發酵培養基中加可溶性淀粉0.001～1g、FeSO40.001～0.02g和/或MgSO40.001～0.04g，發酵培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一的不同點是發酵培養基中還包括可溶性淀粉，每1000mL發酵培養基中加可溶性淀粉0.001～1g，發酵培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一的不同點是發酵培養基中還包括FeSO4，每1000mL發酵培養基中加FeSO40.001～0.02g，發酵培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一的不同點是發酵培養基中還包括MgSO4，每1000mL發酵培養基中加MgSO40.001～0.04g，發酵培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一的不同點是發酵培養基中還包括可溶性淀粉和FeSO4，每1000mL發酵培養基中加可溶性淀粉0.001～1g和FeSO40.001～0.02g，發酵培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
一的不同點是發酵培養基中還包括可溶性淀粉和MgSO4，每1000mL發酵培養基中加可溶性淀粉0.001～1g和MgSO40.001～0.04g，發酵培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
十二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是發酵培養基中還包括FeSO4和MgSO4，每1000mL發酵培養基中加FeSO40.001～0.02g和MgSO40.001～0.04g，發酵培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
十三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是發酵培養基中還包括可溶性淀粉、FeSO4和MgSO4，每1000mL發酵培養基中加可溶性淀粉0.001～1g、FeSO40.001～0.02g和MgSO40.001～0.04g，發酵培養基的pH值為7.0。其它與實施方式一相同。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(三)中將液體種子培養液與發酵培養基混合，液體種子培養液占混合液總體積的3.3％～3.7％，混合液在30℃、180r/min的條件下培養72h。其它步驟與實施方式一相同。
權利要求
1.天然多組分抗菌蛋白發酵液的制備方法，其特征在于天然多組分抗菌蛋白發酵液按以下步驟制備(一)將側孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到斜面活化培養基上，在30±2℃的條件下活化培養24±0.5h；(二)按50mL液體種子培養基接種一滿環側孢芽孢桿菌菌株BL-21的比例將經過活化的側孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到液體種子培養基，然后再在30±2℃、180r/min的條件下培養18～24h；(三)將液體種子培養液與發酵培養基混合，液體種子培養液占混合液總體積的3％～4％，混合液在30±2℃、180r/min的條件下培養48～120h，即得到天然多組分抗菌蛋白發酵液；其中斜面活化培養基為牛肉膏蛋白胨固體培養基或葡萄糖蛋白胨固體培養基，液體種子培養基為牛肉膏蛋白胨液體培養基，發酵培養基按蛋白胨3～6g、牛肉膏1～4g、氯化鈉4～5g和水1000mL的比例制成，發酵培養基的pH值為7.0。
2.根據權利要求1所述的天然多組分抗菌蛋白發酵液的制備方法，其特征在于斜面活化培養基為牛肉膏蛋白胨固體培養基，牛肉膏蛋白胨固體培養基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化鈉2g、瓊脂15～18g和水1000mL的比例制成，斜面活化培養基的pH值為7.0。
3.根據權利要求1所述的天然多組分抗菌蛋白發酵液的制備方法，其特征在于斜面活化培養基為葡萄糖蛋白胨固體培養基，葡萄糖蛋白胨固體培養基按蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO42g和水1000mL的比例制成，斜面活化培養基的pH值為7.0～7.2。
4.根據權利要求1所述的天然多組分抗菌蛋白發酵液的制備方法，其特征在于牛肉膏蛋白胨液體培養基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化鈉2g和水1000mL的比例制成，牛肉膏蛋白胨液體培養基的pH值為7.0。
5.根據權利要求1所述的天然多組分抗菌蛋白發酵液的制備方法，其特征在于發酵培養基中還包括可溶性淀粉、FeSO4、MgSO4中的一種或幾種，每1000mL發酵培養基中加可溶性淀粉0.001～1g、FeSO40.001～0.02g和/或MgSO40.001～0.04g，發酵培養基的pH值為7.0。
全文摘要
天然多組分抗菌蛋白發酵液的制備方法，它涉及一種蛋白液的制備方法。它解決了目前農用抗生素對土傳病害防效顯著的種類極少，長期使用導致病原菌產生抗藥性和現有抗菌蛋白制品毒性大、抗菌譜窄的問題。天然多組分抗菌蛋白發酵液按以下步驟制備(一)將側孢芽孢桿菌菌株BL－21接種到斜面活化培養基上培養；(二)將經過活化的側孢芽孢桿菌菌株BL－21接種到液體種子培養基上培養；(三)將液體種子培養液與發酵培養基混合后培養，即得到天然多組分抗菌蛋白發酵液。本發明選用的菌株對環境和人體健康安全性高。本發明制備的天然多組分抗菌蛋白發酵液中含有多種抗菌蛋白，抑菌譜廣，對多種植物病原真菌、部分革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌都有抑制作用。
文檔編號A01P3/00GK1928109SQ200610010429
公開日2007年3月14日 申請日期2006年8月23日 優先權日2006年8月23日
發明者平文祥, 杜春梅, 葛菁萍, 王葳, 宋剛, 凌宏志 申請人:黑龍江大學