專利名稱：：具有增強的農藝性狀的轉基因植物的制作方法
技術領域：
：言，本發明提供了具有用于在轉基因植物中提^增強的性狀的重組DNA的植物細胞，包括此類細胞的植物，來源于此類植物的種子和花粉，制備及使用此類細胞、植物、種子和花粉的方法。
背景技術：
：具有改良的農藝性狀例如產量、環境應激耐受性、害蟲抗性、除草劑耐受性、改良的種子組成等的轉基因植物是農民和消費者都需要的。盡管植物育種中的大量努力已提供了所需性狀的顯著收益，但將特定DNA導入植物基因組的能力為產生具有改良和/或獨特性狀的植物提供了進一步的機會。只將重組DNA導入植物基因組不總是產生具有增強的農藝性狀的轉基因植物。需要從群體中選擇個別轉基因事件的方法以鑒別其特征為增強的農藝特性的那些轉基因事件。發明概述本發明采用重組DNA用于表達對賦予轉基因植物增強的農藝特性有用的蛋白質。本發明中的重組DNA在包括啟動子的構建體中提供，所述啟動子在植物細胞中起作用并且與DNA可操作地連接，所述DNA編碼在序列中具有至少一個氨基酸結構域的蛋白質，所述氨基酸結構域對于與如表28鑒別的Pfam名稱組中由Pfam名稱鑒別的蛋白質結構域家族的氨基酸序列比對超過Pfam聚集截止值。在本發明更具體的實施方案中，在植物細胞中表達的蛋白質具有的氨基酸序列與共有氨基酸序列群中的共有氨基酸序列具有至少90%的同一性，所述共有氨基酸序列群由關于SEQIDNO:84構建的共有氨基酸序列和表2中列舉的其同源物，以及關于SEQIDNO:166構建的共有氨基酸序列和表2中列舉的其同源物組成。在本發明再更具體的實施方案中，植物細胞中表達的蛋白質是選自表1中鑒別的蛋白質群的蛋白質。本發明的其他方面具體涉及包括本發明的重組DNA的轉基因植物細胞、包括多個此類植物細胞的轉基因植物、來自此類植物的后代轉基因種子和轉基因花粉。通過在群體中篩選轉基因植物與不具有所述重組DNA的對照植物相比增強的性狀，從轉基因植物群體中選擇此類植物細胞，所述轉基因植物群體從用重組DNA轉化的植物細胞再生并表達蛋白，其中所述增強的性狀選自增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。在本發明的再一方面，植物細胞、植物、種子和花粉進一步包括表達蛋白質的DNA，所述蛋白質提供來自暴露于除草劑的耐受性，所述除草劑以對野生型所述植物細胞致死的水平應用。此類耐受性不僅在此類植物中作為有利性狀特別有用，還在本發明方法的選擇步驟中有用。在本發明的方面中此類除草劑的試劑是草甘膦、麥草畏或草銨膦化合物。本發明的再其他方面提供對于重組DNA純合的轉基因植物，和來自玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、苜蓿、小麥或稻植物的本發明的轉基因種子。在阿根廷用于實踐本發明的各種方面的其他重要實施方案中，重組DNA在來源于玉米系的植物細胞中提供，所述玉米系是并維持對MaldeRioCuarto病毒或高粱柄銹菌(尸wcc/w"sorg//)真菌或兩者的4氏抗力。本發明還提供了用于制備非天然的、轉基因種子的方法，所述轉基因種子可以用于生產一批具有增強的性狀的轉基因植物，所述增強的性狀由穩定整合的重組DNA表達產生，所述重組DNA表達在序列中具有至少一個氨基酸結構域的蛋白質，所述氨基酸結構域對于與表28鑒別的Pfam名稱組中由Pfam名稱鑒別的蛋白質結構域家族的氨基酸比對超過Pfam聚集截止值。更具體而言，該方法包括(a)在植物群體中篩選增強的性狀和重組DNA,其中在群體中的個體植物可以顯示的性狀水平低于、基本上等于或高于所述性狀在不表達所述重組DNA的對照植物中顯示的水平，(b)從群體中選出一種或多種植物，它們顯示的性狀水平大于所述性狀在對照植物中顯示的水平，(c)證實重組DNA穩定整合在所述選擇的植物中，(d)分析所選植物的組織以確定生產的蛋白質具有由SEQIDNO:1-83之一的序列中核苷酸編碼的蛋白質的功能；和(e)收集來自所選植物的種子。在本發明的一個方面，群體中的植物進一步包括表達蛋白質的DNA，所述蛋白質提供針對暴露于除草劑的耐受性，所述除草劑以對野生型植物細胞致死的水平應用，并且選擇通過用除草劑例如草甘膦、麥草畏或草銨膦化合物處理群體來實現。在本發明的另一方面，通過鑒別具有增強的性狀的植物來選擇植物。該方法對于制備玉米、大豆、棉花、苜蓿、小麥或稻種子特別有用。本發明的另一方面提供了生產雜交玉米種子的方法，其包括從除草劑耐受性玉米植物中獲得雜交玉米種子，所述玉米植物還具有穩定整合的重組DNA，所述重組DNA包括(a)在植物細胞中起作用并且(b)與DNA可^t乘作地連接的啟動子，所述DNA編碼在序列中具有至少一個氨基酸結構域的蛋白質，所述氨基酸結構域對于與表28鑒別的Pfam名稱組中由Pfam名稱鑒別的蛋白質結構域家族的氨基酸比對超過P化m聚集截止值。該方法進一步包括由所述雜交玉米種子生產玉米植物，其中由所述雜交玉米種子產生的植物的一部分對于所述重組DNA是純合的，由所述雜交玉米種子產生的植物的一部分對于所述重組DNA是半合子的，并且由所述雜交玉米種子產生的所述植物的一部分沒有一種所述重組DNA;通過用除草劑處理選擇對于所述重組DNA是純合和半合子的玉米植物；收集來自除草劑處理存活的玉米植物的種子并種植所述種子以產生進一步的后代玉米植物；將選擇和收集步驟重復至少一次以產生近交玉米系；并使近交玉米系與第二種玉米系雜交以生產雜交種子。本發明的另一方面提供了選擇包括本發明植物細胞的植物的方法，其通過使用免疫反應性抗體檢測重組DNA表達的蛋白質在種子或植物組織中的存在來實現。本發明的再一方面提供防偽的研磨種子，其具有作為來源指示的本發明的植物細胞。本發明的再其他方面涉及具有增強的水利用效率或增強的氮利用效率的轉基因植物。例如，本發明提供無需灌溉水培育玉米、棉花或大豆農作物的方法，其包括種植具有本發明的植物細胞的種子，所述種子根據增強的水利用效率進行選擇。可替代的方法包括在玉米農作物生產過程中應用減少的灌溉水，例如提供最高達300毫米的地下水。本發明還提供了無需添加氮肥料培育玉米、棉花或大豆農作物的方法，其包括種植具有本發明的植物細胞的種子，所述種子根據增強的氮利用效率進行選擇。發明詳述如本文所使用的，"植物細胞"指用穩定整合、非天然的重組DNA轉化的植物細胞，例如通過土壤桿菌屬(^gra^c化n'wm)介導的轉化或通過使用重組DNA包被的微粒轟擊或其他方法。本發明的植物細胞:或來源于后代轉i因植物口的種子或花粉，所述:代植物細胞再生為分化的組織，例如再生為具有穩定整合、非天然重組DNA的轉基因植物。如本文所使用的，"轉基因植物"指其基因組已通過重組DNA的穩定整合而改變的植物。轉基因植物包括由最初轉化的植物細胞再生的植物，和來自轉化植物的較后世代或雜交的后代轉基因植物。如本文所使用的，"重組DNA"指已基因工程改造并在細胞外構建的DNA，包括包含天然存在的DNA或cDNA的DNA或合成DNA。如本文所使用的，"共有序列"指在同源蛋白質氨基酸序列比對的保守區域中的人工氨基酸序列，例如，如由同源蛋白質的氨基酸序列的CLUSTALW比對確定的。如本文所使用的，"同源物"指執行相同生物學功能的蛋白質群中的蛋白質，例如屬于相同Pfam蛋白質家族并在本發明的轉基因植物中提供共同的增強的性狀的蛋白質。同源物由同源基因表達。同源基因包括天然存在的等位基因和人工生成的變體。遺傳密碼的簡并提供下列可能性不導致基因產生的多肽氨基酸序列的改變而用不同堿基置換該基因的蛋白質編碼序列的至少一個堿基。因此，在本發明中有用的多核普酸可以具有從SEQIDNO:1到SEQIDNO:83已根據遺傳密碼簡并置換進行改變的任何堿基序列。同源物是在最佳比對時在全長蛋白質上具有至少60%同一性的蛋白質，更優選約70%或更高，更優選至少80%并且甚至更優選至少90%的同一性，所述全長蛋白質被鑒定為與在植物細胞中表達時賦予增強的性狀相關聯。同源物包括氨基酸序列與本文公開的蛋白質和同源物的共有氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白質。通過氨基酸序列比較鑒別同源物，例如人工或通過使用基于計算機的工具，所述工具使用基于同源性的已知搜索算法，例如通常已知并稱為BLAST、FASTA和Smith-Waterman的那些。局部序列比對程序例如BLAST,可以用于搜索序列數據庫以找到相似序列，并且匯總的期望值(E值)用于測量序列堿基相似性。因為具有特定生物的最佳E值的蛋白質命中不必是直向同源物或唯一的直向同源物，所以在本發明中使用交互查詢以過濾對于直向同源物鑒別具有顯著E值的命中序列。交互查詢需要搜索針對來自基礎生物的氨基酸序列數據庫的顯著命中，它類似于查詢蛋白質的序列。當交互查詢的最佳命中是查詢蛋白質自身或由物種形成后的重復基因編碼的蛋白質時，命中的可能是直向同源物。本發明的進一步的方面包括功能性同源物蛋白質，作為保守氨基酸置換的結果它們在一個或多個氨基酸方面不同于公開的蛋白質的那些，例如在下列氨基酸中的置換酸性(帶負電荷的)氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸；堿性(帶正電荷的)氨基酸例如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；中性極性氨基酸例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；中性非極性(疏水)氨基酸例如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和曱硫氨酸；具有脂族側鏈的氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族-羥基側鏈的氨基酸例如絲氨酸和蘇氨酸；具有包含酰胺的側鏈的氨基酸例如天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側鏈的氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的氨基酸例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的氨基酸例如半胱氨酸和曱硫氨酸；天然保守的氨基酸例如纈氨酸-亮氨酸、纈氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。在本發明轉基因植物中有用的DNA編碼的同源物的進一步方面是作為在天然序列中一個或多個氨基酸缺失或插入的結果與公開的蛋白質不同的那些蛋白質。如本文所使用的，"百分比同一性"指2個最佳比對的DNA或蛋白質區段在組分例如核苷酸序列或氨基酸序列比對窗口自始自終不變的程度。關于測試序列和參考序列的比對區段的"同一性分數"是通過比對窗口由2個比對區段序列共有的相同組分的數目除以參考區段中序列組分的總數目，所述總數目是完整的測試序列或完整的參考序列中的較小者。"百分比同一性"("同一性％")是同一性分數乘100。如本文所使用的，"Pfam"指覆蓋許多共同蛋白質家族的多重序列比對和隱馬爾可夫模型的大集合，例如Pfam版本18.0(2005年8月)包含用于7973個蛋白質家族的比對和才莫型并且基于Swissprot47.0和SP-TrEMBL30.0蛋白質序列數據庫。參見S.R.Eddy，"ProfileHiddenMarkovModels",Bioinfo歸tics14:755-763，1998。Pfam目前由PfamConsortium維持和更新。比對代表對蛋白質功能有牽連的某些進化保守結構。由Pfam比對建立的分布型(Profile)隱馬爾可夫模型(分布型HMMs)對于自動識別屬于現有蛋白質家族的新蛋白質有用，即使通過比對的同源性看起來低。一旦一種DNA鑒別為編碼在轉基因植物中表達時賦予增強的性狀的蛋白質，就通過針對隱馬爾可夫模型查詢候選DNA編碼的蛋白質氨基酸序列鑒別在相同蛋白質家族中的其他DNA編碼蛋白質，所述才莫型使用HMMER軟件表征Pfam結構域，其通用版本在附加的計算機列表中提供。滿足特定Pfam比對的聚集截止值的候選蛋白質在蛋白質家族中，并且具有在構建用于本發明的植物細胞的重組DNA中有用的同源DNA。附加的計算機列表中還包括了伴隨HMMER軟件使用的隱馬爾可夫模型數據庫，用于鑒別在關于本發明的植物細胞中的重組DNA的共同Pfam中表達蛋白質的DNA。HMMER軟件和Pfam數據庫是版本18.0并用于鑒別對應于SEQIDNO:84-SEQIDNO:166氨基酸序列的蛋白質中的已知結構域。編碼通過本文公開的Pfam分析得分高于表27中公開的聚集截止值的蛋白質的所有DNA都可以在本發明植物細胞的重組DNA中使用，例如用于選擇具有增強的農藝性狀的轉基因植物。如下文更具體地公開的，在本發明中使用的相關Pfams是AAA、AP2、Aldoketred、a淀粉酶、Aminotran12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BROl、CBFDNFYBHMF、過氧化氫酶、CorA、Cpn60TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Dil9、E2FTDP、FAD結合7、FA去飽和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase2、Glycohydrol、乙二醛酶、Gotl、HATPasec、HSFDNA畫結合、HSP20、HisKA、同源異型框、Hpt、異淀粉酶N、K-框、內酰胺酶B、Metallophos、MtN3slv、NAF、NAM、NIF、OxidoredFMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶SIO、肽酶S41、光敏色素、Peinase、PkinaseTyr、吡。多醛deC、RIOl、RRM1、RTC、RTC插入片4殳、Ras、應答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突觸小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4，其數據庫包括在附加的計算機列表中。如本文所使用的"啟動子"指用于起始轉錄的調節DNA。"植物啟動子"是無論其起源是否是植物細胞都能夠在植物細胞中起始轉錄的啟動子，例如眾所周知的是土壤桿菌屬啟動子在植物細胞中起作用。因此，植物啟動子包括從植物、植物病毒和細菌例如土壤桿菌屬和慢生#^瘤菌屬(Sra^T/n'zo6/"m)纟田菌荻得的啟動子DNA。在發育控制下的啟動子的實例包括優先起始在特定組織例如葉、根或種子中的轉錄的啟動子。此類啟動子稱為"組織優選的"。只起始在特定組織中的轉錄的啟動子稱為"組織特異性的"。"細胞類型"特異性啟動子主要驅動在一種或多種器官的特定細胞類型，例如根或葉中的血管細胞中的表達。"誘導型，，或"阻抑型，，啟動子是在環境控制下的啟動子。可以影響通過誘導型啟動子的轉錄的環境條件的實例包括缺氧條件、或特定化學藥品、或光的存在。組織特異性的、組織優選的、細胞類型特異性、和誘導型啟動子構成"非組成型"啟動子類別。"組成型"啟動子是在大多數條件下有活性的啟動子。如本文所使用的，"可操作地連接"指在DNA構建體中結合2個或更多個DNA片段，從而使得一種例如編碼蛋白質的DNA的功能受另一種例如啟動子的控制。如本文所使用的，"表達"指產生，例如當其同源DNA轉錄為mRNA，mRNA翻譯成蛋白質時，蛋白質在植物細胞中表達。如本文所使用的，"對照植物"指不包含重組DNA的植物，所述重組DNA表達賦予增強的性狀的蛋白質。對照植物用于鑒別并選擇具有增強的性狀的轉基因植物。適當的對照植物可以是用于產生轉基因植物的親本系的非轉基因植物，即缺乏重組DNA。適當的對照植物在某些情況下是半合子轉基因植物系的后代，它不包含重組DNA,稱為陰性分離子。如本文所使用的，"增強的性狀"指轉基因植物的特征，它包括但不限于，特征為增強的植物形態學、生理學、生長和發育、產量、營養增強、疾病或害蟲抗性、或環境或化學藥品耐受性的增強的農藝性狀。在本發明的更具體的方面，增強的性狀選自增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。在本發明的重要方面，增強的性狀是增強的產量，包括在非應激條件下增加的產量和在環境應激條件下增加的產量。應激條件可以包括例如干旱、陰涼、真菌病、病毒病、細菌病、昆蟲侵擾、線蟲侵擾、冷溫度暴露、熱暴露、滲透性應激、減少的氮營養物利用率、減少的磷營養物利用率和高植物密度。"產量，，可以受許多性質影響，包括但不限于，植物高度、莢果數目、在植物上的結莢位置、節間數目、裂果(podshatter)發生率、粒度、結瘤和固氮作用的效率、營養物同化作用的效率、針對生物和非生物應激的抗性、碳同化作用、植物結構、抗倒伏性、種子發芽百分數、幼苗活力、和幼年性狀。產量還可受發芽效率(包括在應激條件下的發芽)、生長速率(包括在應激條件下的生長速率)、谷穗數目、每個谷穗的種子數目、種子大小、種子組成(淀粉、油、蛋白質)和種子充填的特征的影響。13本發明轉基因植物增加的產量可以以多種方法測量，包括測試重量、每抹植物的種子數目、種子重量、每單位面積的種子數目(即，每英畝的種子、或種子重量)、每英畝的蒲式耳、每英畝的公噸、每英畝的噸、每公項的公斤。例如，玉蜀黍產量可以根據每單位生產面積生產的玉米粒測量，例如每英畝的蒲式耳或每公項的公噸，通常在調整濕度的基礎上報告，例如在15.5百分數濕度上。增加的產量還可由關鍵生物化學化合物的改善利用產生，所述化合物例如氮、亞磷和碳水化合物，或者由環境應激的改善應答產生，所述環境應激例如冷、熱、干旱、鹽、和害蟲或病原體攻擊。在本發明中使用的重組DNA還可用于提供具有改善的生長和發育以及最終增加的產量的植物，作為植物生長調節劑的修飾的表達、或細胞周期或光合作用途徑的修飾的結果。有意義的還有產生轉基因植物，它就種子組分而言證實了增強的產量，所述種子組分可以對應或可以不對應總體植物產量的增加。此類性質包括種子油、種子分子例如生育酚、蛋白質和淀粉、或油特別是油組分的增強，如可以通過種子組分比率的改變證明的。本發明的核分子的子集包括公開的重組DNA的片段，其由至少15個、優選至少16或17、更優選至少18或19、并甚至更優選至少20個或更多個鄰接核苷酸的寡核苷酸組成。此類寡核苷酸是具有選自SEQIDNO:l-SEQIDNO:83的序列的較大分子的片段，并且可用作例如用于檢測本發明多核苷酸的探針和引物。在本發明的某些實施方案中，產生天然基因的顯性失活突變體以達到所需作用。如本文所使用的，"顯性失活突變體"指其基因產物不利地影響相同細胞中正常、野生型基因產物的突變基因，通常通過與其二聚化(組合)。在聚合分子例如膠原的情況下，顯性失活突變體通常比導致不產生基因產物的突變(無效突變或無效等位基因)更有害。SEQIDNO:6和SEQIDNO:7被構建為分別編碼缺失了K-框的aglll蛋白質和缺失了MAD框的MADs3蛋白質。類似于AGL11的MADS框蛋白質可以視為具有3個功能結構域。存在N末端DNA結合結構域(MADS框)、更遠端的二聚化結構域(K-框)和C末端結構域，它通常涉及與其他蛋白質的相互作用。在植物中，MADS框和K-框之間的區域已顯示在某些蛋白質中對于DNA結合是重要的并且通常稱為I-框(Fan等人，1997)。考慮了幾種不同類別的顯性失活構建體。DNA結合結構域的缺失或滅活可以產生蛋白質，它能夠與其天然全長配對物以及其他天然二聚化配對物二聚化。同樣地，c末端結構域的去除可以允許與天然蛋白質及其天然二聚化配對物二聚化。在2種情況下，這些類型的構建體使得靶蛋白以及能夠與K-框相互作用的任何其他蛋白質失去能力。在本發明的其他實施方案中，構建組成型活性突變以達到所需作用。SEQIDNO:3只編碼來自依鈣蛋白激酶(CDPK)的激酶結構域。CDPK1具有的結構域結構類似于其他依鈣蛋白激酶，其中蛋白激酶結構域通過42個氨基酸的"間隔區"區域與4個EF手型結構域分開。認為依鈣蛋白激酶由鈣誘導的構象變化激活，所述構象變化導致自身抑制性結構域從蛋白激酶活性位點移開(Yokokura等人，1995)。因此組成型活性蛋白質可以通過只超表達蛋白質激酶結構域來制備。DNA構建體使用本領域普通技術人員眾所周知的方法進行裝配，并且一般包括與DNA可操作地連接的啟動子，其表達提供增強的農藝性狀。其他構建體組分可以包括另外的調節元件，例如用于增強轉錄的5'前導序列(leasder)和內含子、3'非翻譯區(例如多腺苷酸化信號和位點)、用于轉運的DNA或信號肽。根癌土壤桿菌(爿gro^c&n'wm^me/ac/em)腫瘤誘導性質粒上攜帶的胭脂堿合酶(NOS)啟動子和章魚堿合酶(OCS)啟動子、花椰菜花葉病毒啟動子例如花椰菜花葉病毒。例如，參見美國專利號5,858,742和5,322,938，它公開了來源于花椰菜花葉病毒的組成型啟動子的版本(CaMV35S),美國專利5,641,876,它公開了稻肌動蛋白啟動子，美國專利申請公開2002/0192813Al，它公開了在有效的才直物表達載體設計中有用的5，、3'和內含子元件，美國專利申請序列號09/757,089，它公開了玉蜀黍葉綠體醛縮酶啟動子，美國專利申請序列號08/706,946，它公開了稻谷蛋白啟動子；美國專利申請序列號09/757,089，它公開了玉蜀黍醛縮酶(FDA)啟動子，以及美國專利申請序列號60/310,370，它公開了玉蜀黍nicotianamine合酶啟動子，所述專利全部引入本文作為參考。在植物細胞中起作用的這些以及眾多其他啟動子是本領域技術人員已知的并且可在本發明的重組多核苷酸中用于提供在轉基因植物細胞中表達所需基因。在本發明的某些方面，在植物種子組織中的充分表達是完成種子組成中的改良所需的。用于種子組成修飾的示例性啟動子包括來自種子基因例如油菜籽蛋白(美國專利5，420，034)、玉米醇溶蛋白Z27和谷蛋白1(Russell等人(1997)Tra似gem'cT^s.6(2):157-166)，和過氧化物氧還蛋白抗氧化劑(Perl)(Stacy等人(1996)P/朋/7kfo/腸/.31(6):1205-1216)、玉蜀黍L3油質蛋白(U.S.6,433,252)、球蛋白1(Belanger等人(1991)Genetics129:863-872)的啟動子。在本發明的其他方面，在植物綠色組織中的優先表達是所需的。用于此類用途的目的啟動子包括來自基因的那些，例如鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亞基(Fischhoff等人(1992)PlantMolBiol.20:81-93)、醛縮酶和丙酮酸正石粦酉臾二^效酵(PPDK)(Taniguchi等人(2000)P/c打fCe〃P/^Wo/.41(1):42-48)。此外，啟動子可以被改變以包含多重"增強子序列"以幫助提高基因表達。此類增強子是本領域已知的。通過在此類構建體中包含增強子序列，可以增強所選蛋白質的表達。這些增強子通常在真核細胞中起作用的啟動子的轉錄起始的5，發現，但通常可以插入編碼序列的上游(5，)或下游(3，)。在某些情況下，這些5'增強元件是內含子。作為增強子特別有用的是稻肌動蛋白1(參見美國專利5,641,876)和稻肌動蛋白2基因的5，內含子、玉蜀黍乙醇脫氫酶基因內含子、玉蜀黍熱休克蛋白70基因內含子(美國專利5,593,874)和玉蜀黍shrunken1基因。在本發明的其他方面，需要在植物種子組織中的充分表達以完成種子組成的改良。用于種子組成修飾的示例性啟動子包括來自種子基因的啟動子，例如油菜籽蛋白(U.S.5,420,034)、玉蜀黍L3油質蛋白(U.S.6,433,252)、玉米醇溶蛋白Z27(Russell等人(1997)7>,gem'c6(2):157-166)、球蛋白1(Belanger等人(1991)Genetics129:863-872)、谷蛋白1(Russell(1997)同上)、和過氧化物氧還蛋白抗氧化劑(Perl)(Stacy等人(1996)尸/"WMo/S/o/.31(6):1205-1216)。根據本發明制備的重組DNA構建體通常還將包括3'元件，它一般包含多腺苷酸化信號和位點。眾所周知的3，元件包括來自根癌土壤桿菌基因的那些，例如引入本文作為參考的U.S.6,090,627中公開的w^3'、fm/3'、fwr3'、_T、o"3'、^73';來自才4物基因例嘖口小麥(普通小麥(7W"cwm熱^f木克蛋白17(/^//73')、小麥遍在蛋白基因、小麥果糖-l,6-二磷酸酶基因、稻谷蛋白基因稻乳酸脫氬酶基因和稻p微管蛋白基因的3，元件，所有這些都在引入本文作為參考的美國公開專利申請2002/0192813Al中公開；和豌豆(尸&wwm"vww)核酮糖二磷酸羧化酶基因(r^3'),和來自宿主植物中的基因的3'元件。構建體和載體還可包括用于將基因靶靶向植物細胞器，特別是葉綠體、白色體或其他質體細胞器的轉運肽。關于葉綠體轉運肽使用的描述參見引入本文作為參考的美國專利5,188,642和美國專利號5,728,925。關于在本發明中有用的鼠耳芥EPSPS基因的轉運肽區域的描述，參見Klee,H丄等人(MGG(1987)210:437-442)。包括或來源于用重組DNA轉化的本發明植物細胞的轉基因植物可以進一步用堆積'性狀增強，例如農作物植物具有的由本文公開的DNA表達產生的增強的性狀，與除草劑和/或害蟲抗性性狀組合。例如，本發明的基因可以與其他農藝目的性狀堆積，例如提供除草劑抗性或昆蟲抗性的性狀，例如使用來自蘇云金芽孢桿菌(S"c/〃w^mn'"gera^)的基因以^是供針對鱗翅昆蟲、鞘翅昆蟲(coliopteran)、同翅昆蟲、半翅昆蟲(hemiopteran)和其他昆蟲的抗性。其轉基因植物耐受性已證實以及可以應用本發明方法的除草劑包括，但不限于，草甘膦、麥草畏、草銨膦、磺酰脲類、溴苯腈和達草滅除草劑。編碼涉及除草劑耐受性的蛋白質的多核苷酸分子是本領域眾所周知的，并且包括，但不限于，美國專利5,094,945;5,627,061;5,633,435和6，040,497中公開的、賦予草甘膦耐受性的編碼5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核香酸分子；美國專利5,463,175中公開的編碼草甘膦氧化還原酶(GOX)的多核苷酸分子，和美國專利申請公開2003/0083480Al中公開的、同樣賦予草甘膦耐受性的草甘膦-N-乙酰轉移酶(GAT);美國專利申請公開2003/0135879Al中公開的、賦予麥草畏耐受性的麥草畏單加氧酶；美國專利4,810,648中公開的、賦予溴苯腈耐受性的編碼溴苯腈腈水解酶(Sx/7)的多核苷酸分200580048534.0)尸/朋f丄4:833-840和Misawa等人，(1994)尸/a^汄6:481-489中描述的、關于達草滅耐受性的編碼八氫番茄紅素去飽和酶(cW/)的多核香酸分子；Sathasiivan等人(1990)7Vmc/.力c/A18:2188-2193中描述的、賦予對磺酰脲類除草劑耐受性的編碼乙酰羥酸合酶(AHAS,ALS)的多核普酸分子；DeBlock，等人(1987)EMS(9丄6:2513-2519中公開的、賦予草銨膦和雙丙氨酰膦耐受性的稱為6w基因的多核苷酸分子；美國專利申請公開2003/010609Al中公開的、賦予N氨基曱基膦酸耐受性的多核苷酸分子；美國專利6,107,549中公開的、賦予吡啶除草劑抗性的多核苷酸分子；賦予多重除草劑例如草甘膦、莠去津、ALS抑制劑、isoxoflutole和草銨膦除草劑耐受性的分子和方法公開于美國專利6,376,754和美國專利申請公開2002/0112260中，所有所述美國專利和專利申請公開都引入本文作為參考。賦予昆蟲/線蟲/病毒抗性的分子和方法公開于美國專利5，250，515;5,880,275;6,506,599;5，986，175和美國專利申請7>開2003/0150017Al中，所有所述專利引入本文作為參考。在具體實施方案中，本發明人預期了與本文公開的蛋白質結合的單克隆或多克隆抗體的用途。制備和表征抗體的方法是本領域眾所周知的(參見，例如Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988;引入本文作為參考)。產生單克隆抗體(mAbs)的方法一般根據與制備多克隆抗體的那些相同的路線開始。簡言之，多克隆抗體通過用依照本發明的免疫原性組合物免疫動物并收集來自免疫動物的抗血清來制備。廣泛范圍的動物物種可以用于生產抗血清。一般地，用于生產抗血清的動物是兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或山羊。因為兔的血量相對較大，所以兔是生產多克隆抗體的優選選擇。如本領域眾所周知的，給定組合物在其免疫原性方面可以不同。因此通常必須加強宿主的免疫系統，如可以通過將肽或多肽免疫原與載體偶聯來完成。示例性和優選的載體是匙孔血藍蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)。其他清蛋白例如卵清蛋白、小鼠血清清蛋白或兔血清清蛋白也可用作載體。使多肽與載體蛋白綴合的方法是本領域眾所周知的并且包括使用戊二醛、間-馬來酰亞胺苯曱酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯、石炭二亞胺和bis-biazotized耳關苯胺。18如本領域眾所周知的，特定免疫原組合物的免疫原性可以通過使用稱為佐劑的非特異性免疫應答刺激物增強。示例性和優選的佐劑包括完全弗氏佐劑(包含殺死的結核分枝桿菌(A^yco^cfeWww/^ercw/a^)的非特異性免疫應答刺激物)、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。用于生產多克隆抗體的免疫原組合物的量依免疫原的性質以及用于免疫接種的動物而變。多種途徑可以用于施用免疫原(皮下、肌內、皮內、靜脈內和腹膜內)。多克隆抗體的生產可以通過免疫動物在免疫接種后各個點上的抽樣血液來監控。還可以給予第二次加強注射。重復加強和滴定過程直至達到合適滴度。當獲得所需免疫原性水平時，可以對免疫的動物抽血并分離且貯存血清，和/或動物可以用于生產mAbs。通過使用眾所周知的技術可以容易地制備mAbs，例如引入本文作為參考的美國專利號4,196,265中例示的那些。一般地，這項技術涉及用所選免疫原組合物，例如純化或部分純化的抗真菌蛋白、多肽或肽免疫合適的動物。免疫組合物以有效刺激抗體生產性細胞的方式施用。嚙齒類動物例如小鼠和大鼠是優選的動物，然而，兔、羊或青蛙細胞的使用也是可能的。大鼠的使用可以提供一定的優點(Goding,1986，第60-61頁)，但小鼠是優選的，BALB/c小鼠是最優選的，因為這是最常規使用的并且一般給出更高百分比的穩定融合物。免疫接種后，選擇具有生產抗體潛力的體細胞，特別是B淋巴細胞(B細胞)在mAb生產方案中使用。這些細胞從活組織檢查的脾、扁桃體或淋巴結，或從外周血樣品中獲得。優選脾細胞和外周血細胞，前者是因為它們是成漿細胞分裂階段中的抗體生產性細胞的豐富來源，并且后者是因為外周血易于獲得。通常，一組動物將是已免疫的并且將取出具有最高抗體滴度的動物脾，并通過用注射器使脾勻漿來獲得脾淋巴細胞。一般地，來自免疫的小鼠的脾包含大約5xl07-2xl08的淋巴細胞。來自免疫的動物的抗體生產性B淋巴細胞隨后與無限增殖骨髓瘤細胞的細胞融合，所述無限增殖骨髓瘤細胞一般是與被免疫的動物相同物種的。適合用于雜交瘤生產性融合操作的骨髓瘤細胞系優選是非抗體生產性的，具有高融合效率，并且具有致使它們不能在特定選擇性培養基上生長的酶缺陷，所述選擇性培養基只支持所需融合細胞(雜交瘤)生長。眾多骨髓瘤細胞中的任何一種都可使用，如本領域技術人員已知的(Goding,1986，第65-66頁；Campbell,1984,第75-83頁)。例如，當免疫的動物是小鼠時，人們可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/l.Ag41、Sp210匿Ag14、FO、NSO/U、MPC-ll、MPCll-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul;對于大鼠，人們可以使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210;并且U-266、GM1500畫GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均在人細胞融合方面有用。一種優選的鼠類骨髓瘤細胞是NS-1骨髓瘤細胞系(也稱為P3-NS-1-Ag4-1),它通過要求細胞系保藏號GM3573從NIGMSHumanGeneticMutantCellRepository容易獲得。可以使用的另一種小鼠骨髓瘤細胞系是8-氮鳥嘌呤抗性小鼠鼠類骨髓瘤SP2/0非生產者細胞系。用于產生抗體生產性脾或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞的雜交體的方法通常包括使體細胞與骨髓瘤細胞以2:1的比率混合，盡管在促進細胞膜融合的一種或多種試劑(化學或電)的存在下，比率可以分別為約20:1到約1:1。使用Spend病毒的融合方法(Kohler和Milstein，1975;1976)，以及使用聚乙二醇(PEG)，例如37%(v/v)PEG的那些(Gefter等人，1977)已得到描述。使用電誘導的融合方法也是適當的(Goding，1986,第71-74頁)。融合方法通常以低頻率產生能存活的雜交體，約lxlO-6-lxl(T8。然而，這不造成問題，因為通過在選擇性培養基中培養可以將能存活的、融合的雜交體與親本、未融合的細胞(特別是未融合的骨髓瘤細胞，它將通常繼續無限地分裂)區分開。選擇性培養基一般是包含阻斷組織培養基中核苷酸從頭合成的試劑。示例'性和優選試劑是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和氨曱蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸只阻斷噪呤合成。當使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤時，培養基補加了次黃。票呤和胸普作為核苷酸來源(HAT培養基)。當使用重氮絲氨酸時，培養基補加了次黃嘌呤。優選的選擇性培養基是HAT。只有能夠操作核苷酸補救途徑的細胞能夠在HAT培養基中存活。骨髓瘤細胞在補救途徑的關鍵酶例如次黃嘌呤轉磷酸核糖基酶(HPRT)上有缺陷，并且它們不能存活。B20細胞可以操作這個途徑，但它們在培養中具有有限的壽命并且一般在約2周內死亡。因此可以在選擇性培養基中存活的唯一細胞是由骨髓瘤和B細胞形成的那些雜交體。這種培養提供雜交瘤群體，從中可以選擇特定的雜交瘤。一般地，雜交瘤的選擇如下進行通過在微量滴定板中單個克隆稀釋培養細胞，隨后測試個別克隆上清液(約2-3周后)的所需反應性。測定應該是靈敏、簡單且快速的，例如放射免疫測定、酶免疫測定、細胞毒性測定、噬菌斑測定、免疫酶斑測定等。選擇的雜交瘤隨后可以系列稀釋并克隆到個別的抗體生產性細胞系中，其克隆可以隨后無限地繁殖以提供mAbs。可以采用細胞系以2種基本方式生產mAb。雜交瘤的樣品可以注射(通常注射到腹膜腔內)到組織相容性動物類型中，所述動物用于提供最初融合的體細胞和骨髓瘤細胞。注射的動物發展出分泌特定單克隆抗體的腫瘤，所述抗體由融合的細胞雜交體產生。隨后可以抽耳又動物的體液，例如血清或腹水，以提供高濃度的mAbs。個別細胞系還可在體外培養，其中mAbs天然分泌到培養基中，從中它們可以容易地以高濃度獲得。如果需要，通過任一方法產生的mAbs可以使用過濾、離心和各種色鐠法例如HPLC或親和色譜進一步純化。才直物細力包轉化方法用重組DNA轉化植物細胞的眾多方法是本領域已知的并且可以在本發明中使用。用于植物轉化的2種常用方法是土壤桿菌屬介導的轉化和微粒轟擊。微粒轟擊方法在美國專利5,015,580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5,914,451(大豆)；6,160,208(玉米)；6,399,861(玉米)和6,153,812(小麥)中說明，并且土壤桿菌屬介導的轉化在美國專利5,159,135(棉花);5,824,877(大豆);5,591,616(玉米)；和6,384,301(大豆)中描述，所有專利都引入本文作為參考。對于基于根癌土壤桿菌的植物轉化系統，在轉化構建體上存在的另外元件將包括T-DNA左和右邊界序列以促進重組多核苷酸整合到植物基因組中。一般而言，在耙植物系的基因組中隨機即在非特異性位置導入重組DNA是有用的。在特殊情況下，靶向重組DNA插入片段可以是有用的，以實現位點特異性整合，例如代替基因組中的現有基因，使用植物基因組中現有的啟動子，或在已知對于基因表達有活性的預定位點插入重組多核苷酸。現有的已知對植入物起作用的幾種位點特異性重組系統包括如美國專利4,959,317中公開的cre-lox,以及如美國專利5,527,695中^>開的FLP-FRT,兩個所述專利都引入本文作為參考。本發明的轉化方法優選在培養基上和控制環境中的組織培養中實踐。"培養基，，指眾多營養物混合物，它們用于體外培養細胞，即在完整活生物之外。受體細胞靶包括，但不限于，分生組織細胞，愈傷組織，未成熟胚和配子細胞例如小孢子、花粉、精子和卵細胞。預期的是由其可以再生能育植物的任何細胞用作受體細胞。愈傷組織可以從組織來源開始，包括，但不限于，未成熟胚、幼苗頂端分生組織、小孢子等。能夠作為愈傷組織增殖的細胞也是用于遺傳轉化的受體細胞。用于制備本發明轉基因植物的實際轉化方法和材料，例如各種培養基和受體靶細胞，未成熟胚細胞的轉化和后續能育的轉基因植物的再生公開于美國專利6,194,636和6,232,526中，它們引入本文作為參#。口、、、、、、'、、培育本發明的轉化植物的后代，包括用于選擇具有增強的性狀的植物的雜交植物系。除了用重組DNA直接轉化植物外，通過使具有重組DNA的第一種植物與缺乏DNA的第二種植物雜交可以制備轉基因植物。例如，重組DNA可以導入順應轉化以生產轉基因^t物的第一種植物系中，所述第一種植物系可以與第二種植物系雜交以使重組DNA基因漸滲到第二種植物系中。具有提供增強的性狀例如增強的產量的重組DNA的轉基因植物可以與具有賦予另一種性狀例如除草劑抗性或害蟲抗性的其他重組DNA的轉基因植物系雜交，以生產具有賦予2種性狀的重組DNA的后代植物。一般地，在關于組合性狀的此類育種中，供給另外性狀的轉基因植物是雄性系，并且攜帶基礎性狀的轉基因植物是雌性系。將分離這種雜交的后代，從而使得某些植物將攜帶關于2種親本性狀的DNA，并且某些將攜帶關于一種親本性狀的DNA;此類才直物可以通過與親本重組DNA結合的標記鑒別，例如通過分析重組DNA的標記鑒別，或在其中選擇標記連接至重組體的情況下，通過應用選擇試劑，例如與除草劑耐受性標記一起使用的除草劑，或通過選擇增強的性狀。攜帶2種親本性狀的DNA的后代植物可以與雌性親本系多次回交，例如通常為6-8代，以產生具有與一種最初轉基因親本系基本上相同的基因型但具有另一種轉基因親本系的重組DNA的后代^i物。在轉化實踐中，在任何一個轉化實驗中DNA—般只導入小百分比的靶植物細胞。標記基因用于提供鑒別那些細胞的有效系統，所述細胞通過在其基因組中接受和整合轉基因DNA構建體穩定轉化。優選的標記基因提供選擇標記，所述選擇標記賦予針對選擇試劑，例如抗生素或除草劑的抗性。本發明植物對其可以是抗性的任何除草劑是選擇標記的有用試劑。潛在轉化的細胞暴露于選擇劑。在存活細胞群體中的將是其中抗性賦予基因一般以足夠水平整合并表達以允許細胞存活的那些細胞。可以測試細胞以進一步證實外源DNA的穩定整生素例如卡那霉素和巴龍霉素("/f//)、潮霉素B("p/z/F)和慶大霉素(aad和aacCA)，或針對除草劑例如草銨膦(或/W)和草甘膦(或EPSPS)的抗性。此類選擇的實例在美國專利5,550,318;5,633,435;5,780,708和6,118,047中說明,所有專利引入本文作為參考。提供視覺鑒別轉化體的能力的選擇標記也可以采用，例如表達有色或熒光蛋白質例如螢光素酶或綠色焚光蛋白(GFP)的基因，或表達|3葡糖醛酸糖香酶的基因或其各種顯色底物是已知的m/必基因(gus)。暴露于選擇劑存活的植物細胞或在篩選測定法中已評分為陽性的植物細胞，可以在再生培養基中培養并允許成熟為植物。由轉化的植物細胞再生的發展中的小植物可以轉移至植物生長混合物，并在轉移至用于成熟的溫室或生長室之前使其受冷而變得耐寒，例如在約85%相對濕度、600ppmC02和25-250微愛因斯坦(microeinsteins)n^s"光的環境控制的室中。取決于最初組織，在鑒別出轉化體后約6周-10個月再生出植物。可以使用本領域技術人員已知的常規植物育種方法給植物授粉并且產生種子，例如自花傳粉通常對轉基因玉米使用。可以測試再生的轉化植物或其后代種子或植物的重組DNA表達并選擇增強的農藝性狀的存在。轉基因植物和種子將來源于本發明植物細胞的轉基因植物培育至產生與對照植物相比具有增強的性狀的轉基因植物，并產生本發明的轉基因種子和單倍體花粉。通過在轉化的植物或后代種子中選擇增強的性狀來鑒別具有增強的性狀的此類植物。關于效率，設計選擇方法以評估包括重組DNA的多重轉基因植物(事件)，例如來自2-20個或更多轉基因事件的多重植物。從本文提供的轉基因種子培育的轉基因植物證實有助于增加產量的改良的農藝性狀，或提供增加的植物價值，包括例如改良的種子質量的其他性狀。特別感興趣的是具有增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油的植物。表1提供了編碼蛋白質的DNA("基因")列表，它用作生產具有增強的農藝性狀的轉基因植物的重組DNA，表1的元件通過參考下列來描述"PEPSEQ"鑒別SEQIDNO:84-166的氨基酸序列。"NUCSEQ"鑒別SEQIDNO:l—83的DNA序列。"基礎載體"鑒別用于轉化重組DNA的基礎質粒。"蛋白質名稱"是由重組DNA編碼的蛋白質的俗名。"增強的性狀"鑒別由蛋白質在轉基因農作物植物中表達賦予的增強的性狀。"質粒ID"鑒別關于植物轉化質粒的任意名稱，包括用于在植物細胞中表達重組DNA的重組DNA。表1PEPNU基礎栽體蛋白質名稱增強的性狀質粒IDSECQSEQIDIDNONO84)pMON65I54乳酰谷胱苦肽裂合酶增強的種子蛋白質pMON69462852pMON72472rab7c增強的耐寒性pMON69456863pMON65154CDPK激酶結構域增強的水利用效率pMON6775424<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>具有增強的農藝性狀的轉基因植物的選擇方法在用重組DNA轉化的植物細胞再生的轉基因植物群體中，比產生種子和后代植物的能育的轉基因植物活得長的許多植物將不顯示增強的農藝特性。從群體選擇必需鑒別一種或多種轉基因植物細胞，它們可以提供具有增強的性狀的植物。具有增強的性狀的轉基因植物選自再生或來源于如本文所述轉化的植物細胞的植物群體，這通過在多種測定中評估植物以檢測增強的性狀，例如增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。這些測定還可以采取多種形式，包括，但不限于，在溫室或田間試驗中直接篩選性狀或通過篩選替代性狀。此類分析可以涉及檢測植物化學組成、生物量、生理性質、形態學中的改變。化學組成中例如谷粒的營養組成的改變可以通過分析種子組成和蛋白質含量、游離氨基酸、油、游離脂肪酸、淀粉或生育酚來檢測。生物量特征中的改變可以對溫室或田間生長植物進行，并且可以包括植物高度、莖直徑、根和枝條干重；和，對于玉米植物，谷穗長度和直徑。生理性質中的改變可以通過評估針對應激條件的應答來鑒定，例如使用施加的應激條件例如水分虧缺、缺氮、寒冷生長條件、病原體或昆蟲攻擊或光缺乏、或增加的植物密度的測定。形態學中的改變可以通過目視觀察具有增強的農藝性狀的轉化植物看起來也是正常植物，與朝向叢狀分枝、更高、更厚、更狹窄的葉、有條紋的葉、具節的性狀、缺綠癥、白化、花色素苷產生、或改變的雄花穗、谷穗或根的改變比較的趨勢。其他選擇性質包括花粉釋放的天數、抽絲的天數、葉伸展速率、葉綠素含量、葉溫度、直立、幼苗活力、節間長度、植物高度、葉數目、葉面積、分蘗、支柱根、保持綠色(staygreen)、莖倒伏、根倒伏、植物健康狀況、不育/多育、綠色植物突然折斷(greensnap)和害蟲抗性。另外，可以評估收獲的谷粒的表型特征，包括谷穗上每行的谷粒數目、谷穗上谷粒的行數、谷粒敗育、谷粒重量、谷粒大小、谷粒密度和物理谷粒質量。盡管本發明的植物細胞和方法可以應用于任何植物細胞、植物、種子或花粉，例如任何果實、蔬菜、草、樹或觀賞植物，但本發明的各個方面優選應用于玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、苜蓿、小麥和稻植物。在許多情況下，本發明應用于對來自MaldeRioCuarto病毒或高粱柄銹菌真菌或兩者的疾病有固有抗性的玉米植物。包括下列實施例以證實本發明的方面，根據本公開內容，本領域技術人員應當理解，在不背離本發明的精神和范圍的情況下，可在公開的具體方面進行許多改變并且仍獲得相同或相似結果。實施例1.植物表達構建體A.用于玉米轉化的植物表達構建體這個實施例說明了用于將重組DNA轉化到植物細胞中的質粒的構建，所述植物細胞能夠再生為本發明的轉基因植物。在編碼序列的起始和終止密碼子處或附近設計用于PCR擴增重組DNA的蛋白質編碼核苷酸的引物，以消除大部分5，和3'非翻譯區。編碼表l中鑒別的蛋白質的每種重組DNA在插入如表1中參考的基礎載體之一的插入位點中之前通過PCR進行擴增。使用GATEWAYDestination植物表達載體系統(從InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA獲得)建造基礎植物轉化載體pMON65154用于制備轉化到玉米組織中的重組DNA。參考下表3中<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>是稻肌動蛋白啟動子和稻肌動蛋白內含子，(b)加入來自土壤桿菌屬的左和右T-DNA邊界序列，右邊界序列位于稻肌動蛋白1啟動子的5',并且左邊界序列位于35S啟動子的3，，和(c)加入DNA以促進質粒在大腸桿菌和根癌土壤桿菌中的復制。在T-DNA邊界序列外加入質粒的DNA包括在土壤桿菌屬中起作用的on'V廣泛宿主范圍的DNA復制起點，在大腸桿菌中起作用的pBR322復制起點，和在大腸桿菌和土壤桿菌屬中用于選擇的壯觀霉素/鏈霉素抗性基因。使用本領域已知的技術裝配表4中舉例說明的另一基礎載體pMON82060(SEQIDNO:10026)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>B.用于大豆轉化的植物表達載體還制備了在大豆轉化中使用的質粒。下表5中顯示了示例性共同表達載體質粒pMON74532(SEQIDNO:10027)的元件。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>密碼子處或附近設計用于PCR擴增的引物，以消除大部分5，和3，非翻譯區。實施例2.玉米轉化這個實施例說明了在生產本發明的轉基因玉米植物細胞、植物、種子和花粉中有用的植物細胞轉化方法，以及具有增強的性狀的轉基因玉米植物和種子的生產和鑒別，所述增強的性狀即增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。通過將表1中鑒別的DNA克隆到鑒別的基礎載體中制備質粒載體，以用于玉米植物細胞的玉米轉化中以生產轉基因玉米植物和后代植物、種子和花粉。對于土壤桿菌屬介導的玉米胚細胞轉化，將容易轉化的玉米植物系(命名為LH59)在溫室中培育，并且當胚長度為1.5-2.0mm時收獲谷穗。通過噴霧或將谷穗浸泡在80%乙醇中，隨后風干來表面滅菌谷穗。從表面滅菌的谷穗上的個別谷粒分離出未成熟胚。在接種玉蜀黍細胞前，土壤桿菌屬細胞在室溫下生長過夜。未成熟的玉蜀黍胚細胞在切割后很快用土壤桿菌屬接種，并在室溫下與土壤桿菌屬一起溫育5-20分鐘。未成熟胚植物細胞隨后與土壤桿菌屬在23。C在黑暗中共培養1-3天。將共培養的胚轉移至選擇培養基并培養大約2周，以允許胚發生愈傷組織發育。胚發生愈傷組織轉移至包含100mg/L巴龍霉素的培養基中并在約2周的時間間隔進行傳代培養。在選擇開始后6-8周回收轉化的植物細胞。對于土壤桿菌屬介導的玉蜀黍愈傷組織的轉化，未成熟胚在切割后培養大約8-21天以允許愈傷組織發育。愈傷組織隨后在室溫下與土壤桿菌屬懸浮液一起溫育約30分鐘，隨后通過抽吸去除液體。愈傷組織和土壤桿菌屬不加選擇地共培養3-6天，隨后通過對巴龍霉素選擇大約6周，每兩周一次轉移至新鮮培養基，并且巴龍霉素抗性愈傷組織鑒別為在表達盒中包含重組DNA。對于通過微粒轟擊的轉化，在轟擊前3-4天分離并培養未成熟的玉蜀黍胚。在微粒轟擊前，制備金顆粒懸浮液，在其上沉淀所需重組DNA表達盒。如美國專利5,550,318和6,399,861中所述，使用放電粒子加速基因遞送裝置將DNA導入玉蜀黍細胞中。在微粒轟擊后，組織在黑暗中在27°C培養。用于制備本發明轉基因植物的另外的轉化36方法和材料，例如，各種培養基和受體靶細胞、未成熟胚的轉化和后續能育的轉基因植物的再生公開于美國專利6,194,636和6，232，526以及美國專利申請序列號09/757,089中，其引入本文作為參考。為了再生轉基因玉米植物，由轉化產生的轉基因植物細胞的愈傷組織置于培養基上以起始小植物的枝條發育，所述小植物轉移至盆栽土壤以在生長室中在26。C起始生長，隨后為噴霧苗床，之后移植至5英寸罐中，在其中植物生長至成熟。再生的植物自體受精并收獲種子以用于在一種或多種方法中選擇種子、幼苗或后代第二代轉基因植物(R2植物)或雜交體，例如通過與對照植物比較選擇顯示增強的性狀的轉基因植物。轉基因玉米植物細胞用來自表1中鑒別的每種基因的重組DNA轉化。如實施例5中報告的，篩選后代轉基因植物和轉化的植物細胞的種子的增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。實施例3.大豆轉化物轉化，^及具有下列特性的轉基因大豆^轉基因種子的生產和鑒別增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。對于土壤桿菌屬介導的轉化，大豆種子發芽過夜并切下分生組織外植體。分生組織和外植體置于創傷容器中。大豆外植體和誘導的土壤桿菌屬細胞在種子發芽開始后不遲于14小時混合，并且使用超聲處理進行創傷，所述土壤桿菌屬細胞來自包含具有目的基因盒和植物選擇標記盒的質粒DNA的菌林。創傷后，外植體置于共培養中2-5天，在這個點上它們轉移至選擇培養基6-8周，以允許選擇和培育轉基因枝條。大約6-8周收獲性狀陽性枝條并置于選擇性生根培養基中2-3周。生根的枝條轉移至溫室并在土壤中進行盆載。對選擇保持健康但不產生根的枝條轉移至非選擇性生根培養基另外2周。對來自中止選擇產生根的任何枝條的根測試植物選擇標記的表達，之后將它們轉移至溫室并土壤中進行盆載。另外，如引入本文作為參考的美國專利5,015,580中所述，DNA構建體可以通過粒子轟擊轉移至大豆細胞基因組中，并且細胞再生為能育的大豆植物。用來自表1中鑒別的每種基因的重組DNA轉化轉基因大豆植物細胞。如實施例5中報告的，篩選后代轉基因植物和轉化的植物細胞種子的增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。實施例4.同源物鑒別這個實施例說明了表1中鑒別的DNA編碼的蛋白質同源物的鑒別，它用于提供具有增強的農藝性狀的轉基因種子和植物。從來自同源物的序列中，可以鑒別同源DNA序列以用于制備本發明的具有增強的農藝性狀的另外的轉基因種子和植物。使用有所有權的序列數據庫和國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(NCBI)非冗余氨基酸數據庫(nr.aa)構建已知蛋白質序列的"所有蛋白質數據庫"。對于從中獲得本文提供的多核苷酸序列的每種生物，構建生物的已知蛋白質序列的"生物蛋白質數據庫"；它是基于生物的NCBI分類學ID的所有蛋白質數據庫的子集。使用NCBI"blastp"程序，E值截止值le-8，使用本文提供的氨基酸序列如SEQIDNO:84-SEQIDNO:166查詢所有蛋白質數據庫。記錄最高達1000的最高命中并通過生物名稱分開。對于除查詢序列的生物以外的每種生物，記錄來自查詢生物自身的命中列表，其具有比生物的最佳命中更顯著的E值。列表包含本文提供的多核苷酸的可能的重復基因，并稱為核心列表。另一列表記錄來自每種生物的所有命中，通過E值分選，并稱為命中列表。使用NCBI"blastp"程序，E值截止值le-4，使用本文提供的多肽序列如SEQIDNO:84-SEQIDNO:166查詢生物蛋白質數據庫。記錄最高達1000的最高命中。基于這些命中構建BLAST可檢索數據庫，并稱為"SubDB"。使用NCBI"blastp"程序，E值截止值le-8,使用命中列表中的每種序列查詢SubDB。具有最佳E值的命中與來自相應生物的核心列表比較。如果命中屬于核心列表，則認為它是可能的直向同源物，否則就認為它不是可能的直向同源物，并且不在相同生物的命中列表中進一步檢索序列。通過SEQIDNO:167-SEQIDNO:10023的氨基酸序列鑒別并報告來自大量不同生物的同源物。在表2中鑒別了SEQIDNO:84-166的蛋白質以及SEQIDNO:167_1002338的同源物之間的這些關系。對于每種同源物的來源生物見序列表。表2PEPSEQIDNO:同源物SEQIDNOs84:427440077537147224651788187385382486210120903705513726462804902262488201614590782472717"4755591631727865666687211690181922002515032263146458628112857292422645432496990314785545383775124844954769558216271333944385421561232158766877345228"34972097425774497281370845132001"259319413366862146969810362026129255661816951979424392621520287880811392195099994392'21217824236751026717154194"70515294096602826685:1163395495655913809613103871301929261456277044612570509979463，96651600727073126531"788803892049176067635269022025251642139"6謂354042213431137249926959938357278396190370174787064038714954131538809494677385752072753299365886:2511251370677055564796089399"20986745642527776923233476509205252584504536338473297133175132438135476755582719617761616180160630665"77254747-286839533995921882451471105046029環5705104387:73382565137261988197803721692638478728620518010462925698521765960816080272719445731761681988166631295862010780146944265392899251675609957251040593327041356356859370153351904551059655387459512184792194763408709512149077321170507106478835343093771588:900484503918372151685068664345863652464156443227760367375472603814617557919454243622784913245396512319365967846403600417111561807576566192992354823323869454945388371238697178746538825813711609312034378825715856231313733561373691823941575805147881862824612543663396867662768376627664527852608016255825662530951559218962389271746793表2(續)693669388284522593232932493253286697660251099625187674357758171966269].340955563491981886,3609790774277452584877680048626690875751936618959522548155192105540614017978199558231125459444087823431911804631925865466993498866588'1894577.'124453323952981827009827695871673762925935044434496832048580107752759915"749160165327011637535052991843417810018704028942821562468093707560457321"68136722368967213373890266568928846213369106695622031962216118416271719683387040948343834221330<563358822248238061766'2692903838490089007384320407982900190024781606徹74852559515091018810087516816934789:9376798779948028800897327256725866056606728031399607743967119237923665851956198219797291729012008901729372957315729772796624660166226584658363877341961226428431637321732439476330662066006598667539224296375348996243425341288555206998313105607360746.0757571915731577568807175655977"6772441849782072353250600010586372938173694775410960999989373657965596561206872《11664317186357103812162427066806925"752226840863943783059626293382659814566469005429464576451807580933747355874767"5"73171709655837"32806580184590:"643384342973241697256725872606605660672809607313131486585438839401"7243729172901200123112076265729572937315729772797792778866246601662265836584689172537277726272727271732473216598662066009922762366759831206931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389918229779439078892477014825002134120645313647767117295638848997235.9967431784738500407766468807920050614796915889499519830015873081887110622037474514534857691531541699236723773"624332506579186384691717"72372236862691846714,5205827681979098157941958865768120415003392386751745725692377315725342538494655979563126841087778075864216286576244314782"5917909976925210884976.91917247603925867769282707258658572797277412817665613,8477288330598093表2(續)2767774677491321600777247373737635587476173217341740173821220067147317731816891709655877163764435797179686580847654571346實施例5.具有增強的農藝性狀的轉基因植物的選擇這個實施例說明了通過篩選衍生的植物和種子的增強的性狀鑒別本發明的植物細胞。具有表1中鑒別的重組DNA的轉基因玉米種子和植物通過用DNA轉化的植物細胞制備，所述DNA穩定整合到玉米細胞的基因組中。使用測量方法選擇轉基因種子、小植物和后代植物。轉基因玉米植物細胞用來自表1中鑒別的每種基因的重組DNA轉化。與對照植物比較篩選轉化的植物細胞的后代轉基因植物和種子的增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。A.增強的氮利用效率的選擇可以在高通量氮(N)選擇方法中測試轉基因玉米植物(作為雜交體測試)的生理效率的氮利用效率(NUE)性狀。使用統計學模型比較收集的數據與來自野生型對照的測量結果，以確定改變是否歸因于轉基因。使用SAS軟件分析原始數據。本文顯示的結果是轉基因植物相對于野生型對照的比較。(1)用于設置NUE方案的培養基制備使用的種植培養基是MetroMix200(廠商Hummert)Cat.#10-0325，ScottsMicroMaxNutrients(廠商Hummert)Cat.#07-6330,OS41/3"x37/8"罐(廠商:Hummert)Cat.#16-1415,OS盤(廠商:Hummert)Cat.#16-1515,Hoagland氏大量營養物溶液，Plastic5"樁(廠商Hummert)黃色Cat.#49-1569,白色Cat.弁49-1505,具有說明材料的編號的標簽包含在罐中。用MetroMix200裝填500個罐至邊緣，重量為140g/罐。通過使用平衡器均一地裝填罐。向每個罐中加入0.4gMicroMax營養物。用刮4產4覺拌成分至3英寸深，同時防止材料損失。(2)在溫室中設置NUE選擇(a)種子發芽-使用逆向滲透的純化水給每個罐輕微地澆水277次。安排第一次澆水緊在種植之前發生；并且第二次澆水在種子已種植到罐中之后。種植每次入組的IO粒種子(每罐1粒種子)以選擇8個健康狀態均一的幼苗。種植另外的野生型對照用作邊界行。可替代地，種植每次入組的15粒種子(每罐1粒種子)以選擇12個健康狀態均一的幼苗(這個較大的種植數目用于第二次或證實種植)。將罐在Conviron生長室中的12個架子的每一個上放置7天。這樣做是為了允許更均一的發芽和早期的幼苗生長。隨后的生長室設定為25°C/曰和22。C/夜，14小時光照和10小時黑暗，濕度~80%,以及光強度350|imol/m2/s(在罐的水平上)。經由類似于溫室工作臺的毛細管墊子在每天3次10分鐘的持續時間內進行澆水。(b)幼苗轉移-7天后，分別選擇第一次或證實途徑運行的最佳的8或12個幼苗，并轉移至溫室工作臺。使用毛細管墊子上印刷的間隔圖案使罐相隔8英寸(中心與中心)并置于工作臺上。Vattex墊子產生384位網格，其中所有列、行組合隨機化。另外的對照罐沿著實驗區組外放置以減少邊界作用。允許植物在低N運行下生長28天或在高N運行下生長23天。大量營養物以大量營養物溶液(參見下文的組合物)的形式分配，所述溶液包含精確量的添加的N(對于限制性N選擇為2mMNH4N03并且對于高N選擇運行為20mMNH4NO3)。每個罐分別在高N和低N運行種植后8和10天時開始隔日人工分配100ml營養物溶液，一周3次。在營養物應用的當天，跳過05:00和13:00時的2次20分鐘澆水。每第3次運行應當更換Vatter墊子以避免N積聚和根物質的累積。表7顯示對于低或高氮選擇的營養物溶液中營養物的量。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>注用HC1或KOH將pH調整至5.6(c)收獲測量結果和數據收集-植物在低N運行下生長28天和植物在高N運行下生長23天后，進行下列測量(括號中為phenocodes):通過Sartorius電子天平測量的總枝條新鮮質量(g)(SFM)，通過MinoltaSPAD計測量的V6葉葉綠素(相對單位XLC),通過Li-Cor葉面積計測量的V6葉面積(cm2)(LA)，通過Sartorius電子天平測量的V6葉新鮮質量(g)(LFM)，以及通過Sartorius電子天平測量的V6葉干質量(g)(LDM)。通過SAS軟件分析原始數據。顯示的結果是轉基因植物相對于野生型對照的比較。為了進行葉讀取，從V6葉上切下樣品。因為玉米葉的葉綠素計閱讀受到葉的部分和葉在取樣的植物上的位置影響，所以SPAD計閱讀在植物的第6片葉上進行。每片葉進行3次測量，其中第一次閱讀取自在葉尖和環之間一半距離，以及從葉緣到中脈的一半的點，而2次向葉尖獲取。測量限制在葉總長度的1/2-3/4(從底部)的區域，它們之間的間隔大約相等。從SPAD機器獲取3次測量結果的平均值。記錄切下的V6葉的葉新鮮質量，將葉置于紙袋中。包含葉的紙袋隨后置于強制空氣烘箱中在80。C進行3天。3天后，從烘箱中取出紙袋并進行葉干質量測量。由收集的數據進行2次衍生測量(1)葉葉綠素面積(LCA),這是V6相對葉綠素含量與其葉面積(相對單位)的乘積。葉葉綠素面積=葉葉綠素x葉面積。這個參數給出了葉綠素在整個葉面積上的展開的指示；(2)比葉面積(LSA)計算為V6葉面積與其干質量的比(cmVg干質量)，這個參數還識別為NUE的測量。數據顯示于表8中。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>表8(續)<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表8(續)<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>氮使用田間效率測定源。轉基因植物和對照植i通過i因型和構建體分群，其;對照隨i安排在基因型區組中。每種類型的轉基因植物通過3次重復并橫過5個位置進行測試。通過收集來自0-24"和24-48"土壤層的30個樣品土壤核心在4月初的預先種植中分析田間的氮水平。分析土壤樣品的硝酸鹽-氮、磷(P)、鉀(K)、有機物質和pH以提供基線值。基于土壤測試建議應用P、K和微量營養物。水平II.將本發明提供的轉基因植物種植在應用3種氮(N)肥料水平的田間，即低水平(0N)、中等水平(80磅/英畝(lb/ac))和高水平(180磅/英畝)。液體28%或32%UAN(尿素，銨態氮)用作N源并通過散播吊桿應用，且合并在與預期的農作物行相同的方向具有后翻滾籃(rearrollingbasket)的田地中耕機。盡管對于ON處理沒有應用N，但土壤仍應當以與處理的區域相同的方式擾動。轉基因植物和對照植物通過基因型和構建體分群，其中對照隨機安排在基因型區組中。每種類型的轉基因植物通過3次重復并橫過4個位置進行測試。通過收集來自0-24"和24-48"土壤層的30個樣品土壤核心在4月初的預先種植中分析田間的氮水平。分析土壤樣品的硝酸鹽-氮、磷(P)、鉀(K)、有機物質和pH以提供基線值。基于土壤測試建議應用P、K和微量營養物。表9.基因在不同氮水平的轉基因植物中增加種子產量。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>B.對于增加的產量的選擇本發明的多種轉基因植物與對照植物比較顯示出改善的產量。改善的產量可以由增強的種子庫潛力(sinkpotential)，即胚乳細胞或谷粒的數目和大小和/或增強的庫強(sinkstrength),即淀粉生物合成的速率引起。庫潛力可以在谷粒發展過程的非常早期確定，因為胚乳細胞數目和大小在4受^^分后最初幾天內測定。在過去幾十年中玉米產量的許多增加由種植密度的增加產生。在那個時期，玉米產量以2.1蒲式耳/英畝/年的速率增加，而種植密度已以250林植物/英畝/年的速率增加。現代雜交玉米的特征是這些變種以高密度種植的能力。許多研究已顯示高于目前的種植密度應當導致更多生物量產生，但目前的種質在這些更高的密度上執行得不好。在高密度種植中增加產量的一個方法是增加收獲指數(HI)，這是與總生物量比較分配給谷粒的生物量的比例。增強的所得轉基因玉米事件的有效產量選擇使用在多個位置的轉基因事件的雜交后代，其中植物在最佳生產管理實踐和最大害蟲控制下生長。對于改善的產量有用的靶是，與來自對照植物種子培育的植物產生的產量比較，產量增加5%-10%。選擇方法可以在多個和不同的地理位置中應用，例如最高達16或更多個位置，經過一個或多個種植季節，例如至少2個種植季節，以統計學區分產量改進與天然環境作用。在標準地塊中種植多重轉基因植物、陽性和陰性對照植物、以及授粉者植物，例如2排地塊，20英尺長5英尺寬，排間距為30英寸，并且行之間有3英尺小徑。轉基因事件可以通過重組DNA構建體分群，群隨機置于田間。當使用雄性不育轉基因事件時，每2塊地塊種植高質量玉米系的授粉者地塊以允許自由傳粉。有用的種植密度是約30,0004朱植物/英畝。高種植密度大于30,0004朱植物/英畝，優選約40,000株植物/英畝，更優選約42,000株植物/英畝，最優選約45,000株植物/英畝。關于產量改善的替代指示包括源容量(生物量)、源輸出(蔗糖和光合作用)、庫組分(谷粒大小、谷穗大小、種子中的淀粉)、發育(光應答、高度、密度耐受性)、成熟度、早期開花性狀和對高密度種植的生理學應答，例如45,000抹植物/英畝，例如如表10和11中說明的。87表10<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>表11時間選4奪評價描述V8-V12葉綠素V12漏VT谷穗、葉面積V15-15DAPChl焚光V15-15DAPCER15-25DAP碳水化合物蔗糖、淀粉收獲前第一個節間的直徑收獲前底部第三個節間的直徑收獲前谷穗節間的直徑成熟谷穗性狀直徑、長度、谷粒數目、谷粒重量電子傳遞速率(ETR)和C02交換速率(CER):使用Li6400LCF(Licor，Lincoln,NE)在約V9-R1階段測量ETR和CER。葉葉綠素熒光是監控來源活性的快速方法并且報告與在各種條件下的C02同化作用高度關聯(PhotosynResearch,37:89-102)。用光化性光1500(具有10%的藍光)微摩爾m—2s_1,28°C,C02水平450ppm測量最年幼的完全伸展的葉或耳穗葉上方的2片葉。在每個事件中測量10抹植物。對于每林植物進行2次閱讀。手提式葉綠素計SPAD-502(Minolta-日本)用于測量在活轉基因植物和野生型配對物上的總葉綠素水平。分析來自每抹植物的3個三小葉，并且每個三小葉分析3次。隨后將9個數據點平均以獲得葉綠素水平。每種基因型分析的植物數目為5-8。<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>當選擇產量改善時，有用的統計學測量方法包括3個組分，即模擬對于每個位置分開的測試田間的空間自相關，調整對于每個位置的空間依賴性的重組DNA事件的性狀，和進行交叉位置分析。模擬空間自相關的第一個步驟是估計半變異函數(semivariogram)的協方差參數。假定球形協方差模型以模擬空間自相關。由于試驗的大小和性質，空間自相關可能可以改變。因此，連同球形協方差結構一起也假定各向異性。下列方程式組描述了各向異性球形協方差模型的統計學形式。其中s產(x,,力)是一個位置的空間坐標并且s尸(x2，力)是第二個位置的空間坐標。共有5個相等協方差各向異性橢圓的協方差參數，6=(V,CT2，/)，Q>，C^),其中是V是塊金效應，"2是偏基臺值，/是由北順時針方向旋轉的度數，c^是對于短軸的定標參數并且a是對于長軸的定標參數。限定空間趨勢的5個協方差參數隨后將通過使用來自大量重復授粉者地塊的數據經由限制的最大似然方法估計。在多位置田間試驗中，對于每個位置分開模擬空間趨勢。在獲得模型的方差參數后，產生方差-協方差結構用于要分析的數據集。這個方差-協方差結構包含調整空間依賴性的產量數據所需的空間信息。在這種情況下，最佳代表本研究的處理和實驗設計的嵌套模型連同方差-協方差結構一起使用以調整產量數據。在這個過程中，還可模擬并估計苗圃或種子批次作用，以關于由種子批次差異引起的任何產量相等調整產量。來自不同位置的空間調整的數據產生后，組合并分析所有調整的數據，其中假定位置作為復制。在這次分析中，組合位置內和位置間的方差以估計來自轉基因植物和對照植物的產量標準誤。相對平均數比較用于指示統計學顯著的產量改善。其中/()是指示物函數，"V"少2，且i-[cos(/;r/180)(;^—x2)-sin(/;r/180)(乂一少2)]/",少-[sin(p;r/180)(a:,—jc2)+cos(/cw/180)Cy,-_y2)]/w表14<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>于每個枝條使用式[RWC。/。=(SWM-SDM)/(STM-SDM)*100]計算含水量(RWC)。這個年齡的充分澆水的玉米植物為約98%RWC。通過根據上述標準方法的選擇方法選擇本發明提供的轉基因植物，并且這些轉基因植物的性能顯示于下表16中。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>在Satanta,IL和DixonCA使用中等干旱條件在田間測試用pMON67754轉化的轉基因植物，所述pMON67754包括如SEQIDNO:3中列出的重組DNA。與對照植物比較，在中等干旱應激下葉上的SPAD讀數顯示轉基因植物中的葉綠素水平顯著增加。2個事件顯示葉綠素水平的SPAD讀數顯著增加，從而表明干旱耐受性的改善。在重復的田間試驗中，6個測試的事件中的2個事件(ZM—M16396和ZM—M16401)顯示2個不同位置中顯著(p<0.1)改善的葉SPAD讀數，從而表明干旱耐受性的改善。D.在冷應激下生長的選擇(1)冷發芽測定-對于本測定使用3組種子。第一組由陽性轉基因事件(Fl雜交)組成，其中本發明的基因在種子中表達。第二個種子組是非轉基因的、野生型陰性對照，由與轉基因事件相同的基因型制備而成。第三組由2個耐寒性和1個冷敏感性玉米商業對照系組成。所有種子都用殺真菌劑"克菌丹"(MAESTRO80DFFungicide,ArvestaCorporation,SanFrancisco,CA,USA)處理。通過將其充分混合并在實驗前干燥殺真菌劑，對每45g玉米種子應用0.43mL克菌丹。玉米谷粒胚側向下置于發芽盤(54x36cm)的個別單元(8.9x8.9cm)中的吸墨紙上。來自一個事件的10粒種子置于發芽盤的一個單元中。每個盤可以容納21個轉基因事件和3份重復的野生型(LH244SDms+LH59),這在完全區組設計中隨機化。對于每個事件，有5次重復(5個盤)。將盤置于Convrion生長室(ConvironModelPGV36,ControlledEnvironments,Winnipeg,加拿大)內在9.7。C下24天(無光)。將250毫升去離子水加入每個發芽盤。發芽計數在實驗開始日后的第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第17天、第19天、第21天和第24天進行。如果出現的胚根大小為lcm,那么種子視為發芽的。從發芽計數計算發芽指數。發芽指數根據下式計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage98</formula>其中T為其中進行發芽測定的總天數。n定義種植后的天數。"i"表明已計數發芽的次數，包括當天。P是在任何給定等級中發芽種子的百分比。計算轉基因事件和野生型對照之間的統計學差異。統計學分析后，顯示相對于野生型對照統計學顯著性為p水平小于0.的事件將進行第二次冷選擇。第二次冷篩選以第一次選擇相同的方式進行，只將重復數目增至10。進行來自第二次選擇數據的統計學分析以鑒別顯示相對于野生型對照統計學顯著性為p水平小于0.05的事件。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>實本發明基因的表達。對于表達分析，隨機收獲來自每次選擇的6個VI葉尖。淺苗床移至設定為5。C的生長室。所有其他條件例如濕度、曰/夜周期和光強度在生長室中保持不變。在移至冷溫度后淺苗床每天進行地下灌溉。在第4天測量葉綠素熒光。在冷休克處理6天后將植物轉移至正常生長條件并允許其在接下來的3天恢復。在這個恢復時間段期間，在第1天和第3天測量V3葉的長度。在恢復2天后，通過估計綠色V2葉的百分數視覺測定V2葉損害。在休克前和冷休克過程中V3葉生長、V2葉壞死和熒光的統計學差異可以用于估計冷休克對玉米植物的損害。(3)早期幼苗生長測定-對于本實驗使用3組種子。第一組由陽性轉基因事件(Fl雜交)組成，其中本發明的基因在種子中表達。第二個種子組是非轉基因的、野生型陰性對照，由與轉基因事件相同的基因型制備而成。第三個種子組由2個耐寒性和2個冷敏感性玉米商業對照系組成。所有種子用殺真菌劑"克菌丹"(3a，4，7,a-四氫-2-[(三氯曱基)硫代]-lH-異吲咮-l,3(2H)-二酮，DrexChemicalCo.Memphis,TN)處理。通過將其充分混合并在實驗前干燥殺真菌劑，對每45g玉米種子應用克菌丹(0.43mL)。種子在發芽紙中生長以用于早期幼苗生長測定。對于測試中的每次入組使用3張12"xl8"發芽紙(AnchorPaper#SD7606)(每個轉基因事件重復3次)。紙在0.5。/oKNO;3和0.1%Thyram的溶液中濕潤。對于每張紙，在沿著紙長度均勻隔開的線上放置15粒種子。將15粒種子定位在紙上，從而使得胚根(radical)將向下生長，例如與紙的邊緣更長的距離。濕紙從短末端之一開始巻起來。紙均勻且足夠緊地巻起以使種子維持在一定位置。紙巻用2個大紙夾固定在一定位置，一個紙夾在頂端并且一個在底部。在適當容器中的隨機化的完全區組設計中紙巻在生長室于23。C溫育3天。室設定為65%的濕度，沒有光周期。對于冷應激處理，紙巻隨后在生長室中于12。C溫育12天。室設定為65%的濕度，沒有光周期。冷處理后，將發芽紙打開并丟棄不發芽的種子。通過自動化成像程序測量每個種子的胚根和胚芽鞘的長度，所述程序自動收集并處理圖像。成像程序自動測量每一個單獨幼苗的枝條長度、根長度和整個幼苗長度并隨后計算每個紙巻的平均數。統計學分析后，顯示相對于野生型對照統計學顯著性為p水平小于0.1的事件將進行第二次冷選擇。第二次冷篩選以與第一次選擇相同的方式進行，只將重復數目增至5。進行來自第二次選擇數據的統計學分析以鑒別顯示相對于野生型對照統計學顯著性為p水平小于0.05的事件。<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>4.冷田間效力試驗種和模擬I無耕種環境中在早春田^間種植條下所述構建體給予發芽時增強的冷活力和早期幼苗生長。在當地農民開始種植玉米前大約2周將種子種植到地里，從而使得對農作物施加顯著的冷應激，命名為冷處理。種子還在當地最佳種植條件下種植，從而使得農作物只有很少或沒有暴露于冷條件，命名為正常處理。冷田間效力試驗在5個i也點進4亍，包4舌GlyndonMN、MasonMI、MonmouthIL、DaytonIA、MysticCT。在每個地點，種子在冷和正常條件下種植，每個處理重復3次，每行20個谷粒，并且每地塊單行。種子種植到土壤中1.5-2英寸深，以避免多泥條件。在每個地點安置2個溫度監視器以每天監控空氣和土壤溫度。種子突出(emergence)定義為生長中的枝條刺破土壤表面時的時刻。從最早的地塊開始突出那天開始每天計數每地塊中突出的幼苗數目直至突出發生沒有顯著變化。此外，對于每個種植日期，還記錄所有地塊中突出為0時的最遲日期。還在玉米植物平均高度達到10英寸前的V3-V4階段評價幼苗活力，其中1=極佳的早期生長，5=平均生長和9=生長差。使用SAS軟件對于每個地點中或跨越所有地點的數據計算50%突出的天數、最大百分比突出和幼苗活力。下列表列出了基于上文說明的方法收集并分析的數據。跨越所有地點分析的數據只包括來自GlyndonMN、MasonMI和MysticCT的那些。<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>E.具有增加的蛋白質和/或油水平的轉基因植物種子的篩選這個實施例闡述了使用Infratec1200系列谷粒分析儀鑒別在種子組成中具有改善的植物種子的高通量選擇，所述谷粒分析儀是近紅外透射率分光計，用于測定大批種子樣品的組成。近紅外分析是無破壞性、高通量的方法，它可以分析單一樣品掃描中的多重性狀。目的分析物的NIR校準用于預測未知樣品的值。使用復合化學計量軟件包獲得樣品的NIR光譜并與校準值比較，所述軟件包提供預測值以及關于樣品在校準中擬合得如何好的信息。FossNorthAmerica具有轉運模塊的InfratecModel1221、1225或1227與比色杯，條目#1000-4033，FossNorthAmerica—起使用，或對于小樣品與小單元比色杯，由LeonGirardCo.修改的Foss標準比色杯，一起使用。維持在對照單元比色杯中各種組成的玉米和大豆對照樣品由LeonGirardCo.供應。NIT收集庫欠件由MaximumConsultingInc.Software提供。通過軟件自動進行計算。種子樣品在具有來自消費者的條形碼標簽的包裝或容器中收到。在收到時將種子傾倒入比色杯中并進行分析。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>表21.<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>在100%干物質基礎上報告的谷粒蛋白質A關于2003和2004的對照是輪回親本__b關于2005年實驗的對照是pMON69462的授豐分者以及pMON83769和pMON80868的輪回親本<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>植物用于增強的性狀的篩選。種子發芽和幼苗發育選擇5個事件連同其他轉基因材料一起分析在黑暗條件下對種子發芽和幼苗發育的表型作用。每個野生型和轉基因玉蜀黍事件的12天。測量每個幼;的中胚軸、胚芽鞘和根的長度。與非'轉基因對照比較，鑒別顯示中胚軸和展開的胚芽鞘極大延長生長的轉基因玉蜀黍幼苗，所述生長由表達PHYA蛋白質的重組DNA賦予。密度研究轉基因植物以3個密度在田間生長高密度為42,000抹植物/英畝；中等密度為35,000株植物/英畝；和低密度為28,000株植物/英畝。選擇來自表達PHYA的3個植物細胞事件的植物用于研究針對不同密度的生理學和產量應答。來自密度試驗YI130的生理學數據概括于下文顯示的表23中。在高種植密度下事件ZM—S83483顯示植物高度、谷穗高度和節間長度顯著減少并且葉綠素含量具有顯著增加。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>谷粒性狀分析如表24中所示，事件ZM—S83444、ZM—S83446、ZM—S83473、ZM—S83480、ZM—S83483和ZM—S83907顯示單谷粒重量顯著增加。事件ZM—S83452顯示單谷粒重量和總谷粒重量顯著增加。篩選數據顯示具有穩定整合、非天然、表達光敏色素A蛋白的重組DNA的植物細胞可以再生為與對照植物比較顯示增加的產量的植物。<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>實施例7這個實施例說明了轉基因植物細胞的制備，其包含表達大豆MADS框轉錄因子蛋白質的重組DNA(SEQIDNO:77)，并鑒別為G1760。編碼大豆MADS框轉錄因子的DNA從大豆文庫中克隆，并插入重組DNA構建體中，所述構建體包括與編碼轉錄因子的DNA可操作地連接的CaMV35S啟動子，隨后為終止子。重組DNA構建體插入轉化載體質粒中，以產生如SEQIDNO:10029中所列出的質粒pMON74470，它用于土壤桿菌屬介導的大豆植物細胞轉化。使用MON74470用表達MADS框轉錄因子的重組DNA轉化大豆植物細胞并用于再生轉基因植物群體。將轉基因大豆植物再生并選擇用于篩選增強的性狀。轉基因大豆植物顯示具有高度擴大的萼片和纏繞莖的花。主莖顯示減少的側出分枝和增加的總狀花序形成。與對照植物比較，在短白晝(10小時)和長白晝(14小時)條件下，開花時間減少約2-4天。當置于非誘導的20小時光時，轉基因植物還開花5周；野生型對照植物在此類條件下不開花。在轉基因植物中花和莢果的脫離極大地減少，從而導致每抹植物的莢果數目增加。野生型對照植物產生100個莢果左右，特定的轉基因植物產生至少125個莢果/植物，并且由一個轉基因事件的植物細胞再生的植物產生大于200個莢果/植物。成熟期也有所延遲，從來自單一拷貝事件A29204的植物顯示的l周到來自多拷貝事件A28877的植物顯示的l個月。來自事件A29204的轉基因植物上超過95%的莢果在一個時間段內成熟；但來自事件A28877的轉基因植物上只有50%的莢果在相同時間段內成熟。來自轉基因植物的種子小于來自對照植物的種子，并且在數目上大于來自對照植物的種子，例如約多1800粒種子/磅。轉基因植物還顯示具有增強的水利用效率。在測試大豆的干旱耐受性時，將4.5"罐用Metromix200制備并將罐調整至相同重量。罐用水飽和。R2或R3純合種子置于罐的土壤中，每個事件15個罐，每個構建體3-6個事件。植物在600|iEM-2S"的光強度；溫度28°C;相對濕度(RH):60%下生長。使用基因檢查條(TraitRURLateralFlow50觀'H式,來自StrategicDiagnostics,Inc.)對選擇的植物進行關于CP4基因存在的基因檢查。丟棄不需要的陰性植物。當植物達到VI階段時，通過徹底灌溉用水飽和罐。拍攝在水飽和罐中的植物的照片。排出過量的水并停止進一步的澆水直至對于良好澆水的對照和干旱處理的植物分別為50%的罐含水量和10%的持水量(通過每3-5天測量土壤濕度或罐重量監控含水量)。在大約10%的飽和水重量時，植物開始顯示萎蔫表型的起始。每l-2天繼續限制澆水以將罐含水量維持在50或10%。接下來的14天測定干旱傷害表型(參見測量結果表)。在干旱處理開始后14天的每一天進行植物的拍照和生理學測定。這些包括，但不限于，植物高度、葉相對含水量、葉水勢、葉綠素含量和葉綠素熒光。在14天后罐用營養物溶液飽和并重新開始規律澆水時間表。表25測量結果方案農藝學測量結果突出，早季節活力，高度(cm)視覺干旱得分分數為1-4:1.健康植物，與對照植物沒有差異；2.看見萎罵，葉變得萎蔫；3.植物萎蔦，仍為綠色并可恢復；4.嚴重萎蔫，萎黃病并且不可恢復如表25中描述對轉基因大豆植物進行的干旱測定法測量結果顯示，來自事件GM29204的轉基因植物細胞的轉基因大豆植物呈現增強的水利用效率。與150粒種子/植物的平均數比較，從來自41個轉基因植物細胞事件中的一個轉基因植物細胞事件(28877)再生的RO植物產生大數目的莢果/節和種子/植物-531Rl種子/植物，即產量增加。實施例6.共有序列這個實施例說明了對于DNA編碼的蛋白質和同源物的共有氨基酸序列的鑒別，所述DNA用于制備本發明的具有增強的農藝性狀的轉基因種子和植物。選擇ClustalW程序用于SEQIDNO:136的氨基酸序列及其9個同源物，以及SEQIDNO:151及其11個同源物的多重序列比對。顯著影響序列比對的3個主要因素是(1)蛋白質權重矩陣；(2)缺口開放罰分；(3)缺口延伸罰分。對于ClustalW程序可用的蛋白質權重矩陣包括Blosum、Pam和Gonnet系列。廣泛地測試具有缺口開放罰分和缺口延伸罰分的那些參數。在測試結果的基礎上，對于多重序列比對選擇Blosum權重矩陣、缺口開放罰分IO和缺口延伸罰分1。圖2顯示SEQIDNO:136、其同源物和結尾的共有序列(SEQIDNO:10031)的序列。圖3顯示SEQIDNO:151、其同源物和結尾的共有序列(SEQIDNO:10032)的序列。關于共有序列的符號是(1)大寫字母為多重序列比對輸出的所有位置中100%的同一性；(2)小寫字母為>=70%的同一性；符號；(3)"X"指示<70%的同一性；(4)破折號"-，，指缺口在>=70%的序列中。共有氨基酸序列可以用于鑒別對應本發明完全范圍的DNA，所述DNA在提供轉基因植物例如具有增強的農藝性狀的玉米和大豆植物中有用，所述增強的農藝性狀例如改善的氮利用效率、增加的產量、改善的水利用效率和/或在冷應激下改善的生長，這是由于編碼的氨基酸序列等同于共有氨基酸序列的蛋白質的DNA在植物中的表達。實施例7.通過Pfam分析鑒別氨基酸結構域使用附加的計算機列表中的HMMER軟件，針對多重序列比對的目前Pfam集合和隱馬爾可夫模型分析Pfam蛋白質家族中顯示與增強的性狀結合的表達蛋白質的氨基酸序列。表26中顯示了SEQIDNO:84-166的蛋白質的Pfam蛋白質家族。附加的計算機列表中還有關于鑒別的專利家族的隱馬爾可夫模型數據庫，其允許鑒別其他同源蛋白質及其同源編碼DNA，以使得本領域普通技術人員能夠充分外延本發明。通過單個Pfam結構域鑒別特定蛋白質，并且通過多個Pfam結構域鑒別其他的蛋白質。例如，具有SEQIDNO:91的氨基酸的蛋白質的特征為2個Pfam結構域，即SRF-TF和K-框；并且具有SEQIDNO:165的氨基酸的蛋白質的特征為6個Pfam結構域，即GAF、光敏色素、PAS、重復的PAS、HisKA和HATPase。<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>表27<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>123<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>實施例8.具有增強的農藝性狀的轉基因植物的選擇這個實施例說明了通過選擇來源于本發明轉基因植物細胞的轉基因種子和植物的制備和鑒別，其中通過篩選由蛋白質表達賦予的增強的農藝性狀來鑒別植物和種子，所述蛋白質選自實施例4中鑒別的同源蛋白質，SEQIDNO:121、128、152-160、162和164。用重組DNA轉化玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、小麥和稻的轉基因植物細胞，以表達實施例4中鑒別的每種同源物。由轉化的植物細胞再生植物并將其用于生產后代植物和種子，篩選所述后代植物和種子的增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。通過同源蛋白質的表達鑒別顯示賦予的增強的性狀的植物。權利要求1.一種具有穩定整合的重組DNA的植物細胞，其包括在植物細胞中起作用并且與來自植物、細菌或酵母的DNA可操作地連接的啟動子，所述DNA編碼在序列中具有至少一個氨基酸結構域的蛋白質，所述氨基酸結構域對于與Pfam名稱組中由Pfam名稱鑒別的蛋白質結構域家族的氨基酸序列比對超過Pfam聚集截止值，所述蛋白質結構域家族由AAA、AP2、Aldoketred、α淀粉酶、Aminotran12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BRO1、CBFDNFYBHMF、過氧化氫酶、CorA、Cpn60TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Di19、E2FTDP、FAD結合7、FA去飽和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase2、Glycohydro1、乙二醛酶、Got1、HATPasec、HSFDNA-結合、HSP20、HisKA、同源異型框、Hpt、異淀粉酶N、K-框、內酰胺酶B、Metallophos、MtN3slv、NAF、NAM、NIF、OxidoredFMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶S10、肽酶S41、光敏色素、Peinase、PkinaseTyr、吡哆醛deC、RIO1、RRM1、RTC、RTC插入片段、Ras、應答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突觸小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4組成；其中關于所述蛋白質結構域家族的Pfam聚集截止值在表28中說明；其中通過篩選由所述群體中的植物細胞再生并表達所述蛋白質的植物與不具有所述重組DNA的對照植物相比增強的性狀，從具有所述重組DNA的植物細胞群體選擇所述植物細胞；并且其中所述增強的性狀選自增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。2.權利要求1的植物細胞，其中所述蛋白質具有的氨基酸序列與共有氨基酸序列群中的共有氨基酸序列具有至少90%的同一性，所述共有氨基酸序列群由關于SEQIDNO:84構建的共有氨基酸序列和表2中列舉的其同源物，以及關于SEQIDNO:166構建的共有氨基酸序列和表2中列舉的其同源物組成。3.權利要求1的植物細胞，其中所述蛋白質選自表1中鑒別的蛋白質群。4.權利要求1的植物細胞，其進一步包括表達蛋白質的DNA,所述蛋白質提供來自暴露于除草劑的耐受性，所述除草劑以對野生型所述植物細胞致死的水平應用。5.權利要求4的植物細胞，其中所述此類除草劑的試劑是草甘膦、麥草畏或草銨膦化合物。6.—種轉基因植物，其包括許多權利要求1的植物細胞。7.權利要求6的轉基因植物，其對于所述重組DNA是純合的。8.—種轉基因種子，其包括許多權利要求1的植物細胞。9.權利要求8的轉基因種子，其來自玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、苜蓿、小麥或稻植物。10.權利要求9的非天然、轉基因玉米種子，其中所述種子可以產生對來自MaldeRioCuarto病毒或高粱柄銹菌真菌或兩者的疾病有^氐抗力的玉米一直物。11.一種轉基因花粉粒，其包括權利要求1的植物細胞的單倍體布亍生物。12.—種用于制備非天然、轉基因種子的方法，所述種子可以用于生產一批具有增強的性狀的轉基因植物，所述增強的性狀由穩定整合的重組DNA表達產生，所述重組DNA包括(a)在植物細胞中起作用并且(b)與來自植物、細菌或酵母的DNA可操作地連接的啟動子，所述DNA編碼在序列中具有至少一個氨基酸結構域的蛋白質，所述氨基酸結構域對于與Pfam名稱組中由Pfam名稱鑒別的蛋白質結構域家族的氨基酸序列比對超過Pfam聚集截止值，所述蛋白質結構域家族由AAA、AP2、Aldoketred、a淀4分酶、Aminotmn12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BROl、CBFDNFYBHMF、過氧化氫酶、CorA、Cpn60TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Dil9、E2FTDP、FAD結合7、FA去々包和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase2、Glycohydrol、乙二醛酶、Gotl、HATPasec、HSFDNA-結合、HSP20、HisKA、同源異型框、Hpt、異淀粉酶N、K-框、內酰胺酶B、Metallophos、MtN3slv、NAF、NAM、NIF、OxidoredFMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶SIO、肽酶S41、光l文色素、Peinase、PkinaseTyr、吡,醛deC、RIOl、RRM1、RTC、RTC插入片段、Ras、應答reg、SPC25、SPX、SRF畫TF、小突觸小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4組成；其中關于所述蛋白質結構域家族的Pfam聚集截止值在表28中說明；并且其中所述增強的性狀選自增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油，用于制備所述種子的所述方法包括(a)在植物群體中篩選所述增強的性狀和所述重組DNA,其中在所述群體中的個體植物可以顯示的所述性狀水平低于、基本上等于或高于所述性狀在不表達所述重組DNA的對照植物中顯示的水平，(b)從所述群體中選擇一種或多種植物，它們顯示的性狀水平大于所述性狀在對照植物中顯示的水平，(c)證實所述重組DNA穩定整合在所述選擇的植物中，(d)分析所選植物的組織以確定生產的蛋白質具有由SEQIDNO:1-83之一序列中的核普酸編碼的蛋白質的功能；和(e)收集來自所選植物的種子。13.權利要求12的方法，其中所述群體的植物進一步包括表達蛋白質的DNA,所述蛋白質提供針對暴露于除草劑的耐受性，所述除草劑以對野生型植物細胞致死的水平應用，并且其中所述選擇通過用所述除草劑處理所述群體來實現。14.權利要求13的方法，其中所述除草劑包括草甘膦、麥草畏或草銨膦化合物。15.權利要求12的方法，其中所述選擇通過鑒別具有所述增強的性狀的植物來實現。16.權利要求12的方法，其中所述種子是玉米、大豆、棉花、苜蓿、小麥或稻種子。17.—種生產雜交玉米種子的方法，其包括(a)從除草劑耐受性玉米植物獲得雜交玉米種子，所述玉米植物還具有穩定整合的重組DNA，所述重組DNA包括(a)在植物細胞中起作用并且(b)與DNA可操作地連接的啟動子，所述DNA編碼在序列中具有至少一個氨基酸結構域的蛋白質，所述氨基酸結構域對于與Pfam名稱組中由Pfam名稱鑒別的蛋白質結構域家族的氨基酸序列比對超過Pfam聚集截止值，所述蛋白質結構域家族由AAA、AP2、Aldoketred、a淀粉酶、Aminot體12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BROl、CBFDNFYBHMF、過氧化氫酶、CorA、Cpn60TCPl、半胱氨酸蛋白酵4中制劑、DNA光解酵、DSPc、DUF1685、DUF296、Dil9、E2FTDP、FAD結合7、FA去飽和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase2、Glycohydrol、乙二醛酶、Gotl、HATPasec、HSFDNA-結合、HSP20、HisKA、同源異型框、Hpt、異淀粉酶N、K-框、內酰胺酵B、Metallophos、MtN3slv、NAF、NAM、NIF、OxidoredFMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶SIO、肽酶S41、光敏色素、Peinase、PkinaseTyr、吡,醛deC、RIOl、RRM1、RTC、RTC插入片l殳、Ras、應答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突觸小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4組成；其中關于所述蛋白質結構域家族的Pfam聚集截止值在表28中說明；(b)由所述雜交玉米種子生產玉米植物，其中由所述雜交玉米種子產生的所述植物的一部分對于所述重組DNA是純合的，由所述雜交玉米種子產生的所述植物的一部分對于所述重組DNA是半合子的，并且由所述雜交玉米種子產生的所述植物的一部分沒有一種所述重組DNA;(c)通過用除草劑處理選擇對于所述重組DNA是純合和半合子的玉米植物；(d)收集來自除草劑處理存活的玉米植物的種子并種植所述種子以產生進一步的后代玉米植物；(e)將步驟(c)和(d)重復至少一次以產生近交玉米系；(f)使所述近交玉米系與第二種玉米系雜交以生產雜交種子。18.選擇包括權利要求1的細胞的植物的方法，其中使用免疫反應性抗體檢測所述蛋白質在種子或植物組織中的存在。19.防偽的研磨種子，其具有作為來源指示的權利要求1的植物細胞。20.—種無需灌溉水培育玉米、棉花或大豆農作物的方法，其包括種植具有權利要求1的植物細胞的種子，所述種子根據增強的水利用效率進行選擇。21.權利要求20的方法，其包括在所述農作物生產過程中提供最高達300毫米的地下水。22.—種無需添加氮肥料培育玉米、棉花或大豆農作物的方法，其包括種植具有權利要求1的植物細胞的種子，所述種子根據增強的氮利用效率進行選擇。全文摘要本發明提供了具有重組DNA用于表達蛋白質的轉基因植物細胞，所述蛋白質對于賦予轉基因農作物植物增強的農藝性狀有用。本發明還提供包括轉基因植物細胞的轉基因植物和后代種子，其中植物根據具有增強的性狀進行選擇，所述性狀選自增強的水利用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮利用效率、增強的種子蛋白質和增強的種子油。還公開了用于制備具有增強的性狀的轉基因種子和植物的方法。文檔編號A01H1/00GK101442902SQ200580048534公開日2009年5月27日申請日期2005年12月19日優先權日2004年12月21日發明者M·阿巴德申請人:孟山都技術有限公司