可將生物活性化合物遞送到反芻動物腸道的細菌的培養(yǎng)方法

專利名稱：可將生物活性化合物遞送到反芻動物腸道的細菌的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可用于將生物活性化合物遞送到反芻動物胃腸道的微生物的鑒別方法，該微生物對瘤胃內(nèi)的滅活作用天然耐受，本發(fā)明還涉及一種對瘤胃內(nèi)的滅活作用耐受性較差的有益菌的培養(yǎng)方法，以使其更能耐受對瘤胃內(nèi)的滅活作用。當通過口腔給反芻動物時，這些微生物能夠通過胃腸到遞送給反芻動物整個細胞及其所包含的營養(yǎng)成分和生物活性分子。本發(fā)明還包括培養(yǎng)的更能耐受瘤胃內(nèi)的滅活作用，可用于胃腸道遞送生物活性化合物給反芻動物的微生物，以及以其補充反芻動物飼料的方法。
背景技術：
基于雙岐桿菌(Bifidobacterium)、Propionibacerium和乳酸菌(Lactobacillus)的益生菌培養(yǎng)物越來越多地用于單胃家畜和人類以維護其腸道功能。據(jù)稱其益處包括促進消化、改善免疫功能和減輕胃腸道不適。雖然以酵母和真菌類以生菌為主的益生菌在反芻動物中也在使用，但是很難保證這些益生菌能過通過瘤胃，進入小腸和大腸，這就限制了腸道功能益生菌對反芻動物中的用處。
瘤胃是細菌進入反芻動物體內(nèi)的主要障礙，試驗表明飼料中添加的細菌培養(yǎng)物在離開瘤胃時只有不到10％能被攝取。原生動物對細菌的吞噬和消化作用是瘤胃內(nèi)細菌降解的主要原因。瘤胃原生動物降解細菌的第一步，也是限速步驟時是細胞壁的降解。以前的研究表明這種降解深受細胞壁成分和組成的影響，而實際上，在培養(yǎng)過程中如果存在持續(xù)的降解細胞壁的酶，溶菌酶的壓力，細胞壁就有可能“變硬”，從而更能耐受原生動物的吞噬作用。
在反芻動物，消化的飼料進入網(wǎng)-瘤胃——反芻動物擁有的多個胃是中的第一的。吞咽的飼料在網(wǎng)-瘤胃中預消化或被細菌發(fā)酵作用降解。大量的消化的蛋白在網(wǎng)-瘤胃中降解成可溶性的多肽和氨基酸。一部分多肽和氨基酸非常浪費地轉變成氨，不能再被反芻動物利用。剩余的部分被瘤胃內(nèi)的微生物利用并整合到其自身的生物體中。當瘤胃內(nèi)容物進入胃和腸時，瘤胃中部分微生物的生物量和殘余的瘤胃內(nèi)容物一起，從網(wǎng)-瘤胃中排出。這些微生物體隨后在小腸被消化，為反芻動物提供營養(yǎng)。然而，網(wǎng)-瘤胃中的相當大部分細菌被寄生在網(wǎng)-瘤胃中的原生動物消滅和消化。這對于宿主反芻動物來講是很浪費的過程，因為細菌細胞及其所含的營養(yǎng)沒有排出瘤胃，并且沒有貢獻為反芻動物的營養(yǎng)。
相似地，人們給動物飼喂細菌制劑，該制劑粘附在腸道上皮細胞因此可加快動物生長速度和飼料轉化(美國專利No.4,980,164和美國專利No.5,256,425)。然而，在反芻動物，細菌在通過瘤胃時存活率很低。為了克服口服制劑活性的丟失，Batich(美國專利No.6,242,230)描述了一種用凝膠基質(zhì)封裝細菌的方法，從而使細菌可以被遞送到動物的腸道。Batich的目的是防止宿主動物針對細菌產(chǎn)生的免疫反應而致的存活率低下。Batich的設計是為了克服宿主的免疫反應，而對原生動物消化沒有任何抵抗作用，因此瘤為中的水解環(huán)境可導致封裝基質(zhì)的降解。這也是一個昂貴的方法，并且使用了能降低某些微生物活性的化學物質(zhì)。
酵母比細菌大許多倍，因此對瘤胃中的原生動物吞噬作用不象細菌那樣敏感，但是，在瘤胃內(nèi)它們通常容易裂解。Shiozaki等(美國專利No.4,562,149)描述了一種培養(yǎng)絮凝酵母Saccharomyces cerevisiae的方法，能使細胞增加10～20％的S-腺苷甲硫氨酸。該發(fā)明是采用酵母，而不是細菌合成甲硫氨酸的一種嘗試。雖然很新穎，但是經(jīng)濟上并不可行，因為酵母合成該氨基酸的效率并不象細菌那樣高。另外，沒有證據(jù)表明這種方法能產(chǎn)生一種能抵抗瘤胃降解作用的產(chǎn)品。
相似地，Ohsumi等(Biosci.Biotech.Biochem.58，1302-1305(1994)描述了一種培養(yǎng)富含賴氨酸的酵母的方法，雖然常?？梢杂^察到野生酵母中賴氨酸的含量的增加，還不能認為該方法是能規(guī)避瘤胃的產(chǎn)生賴氨酸的經(jīng)濟的方法。Strauss等(Can.J.Anim.Sci.(2004))使用另外一種酵母——畢赤酵母(Pichia pastori)來表明如果該微生物是基因工程的，它可以用來將某些重組蛋白攜帶到反芻動物的小腸中。然而，Pichia pastoris被認為是不安全的，不能用于飼喂家畜。
Bolla等(美國專利6,737,262)描述了一種將基因工程轉化的真菌或者其它微生物整合到飼料中的方法，然而這些微生物只能產(chǎn)生多肽或至少兩個氨基酸，而不是單個的氨基酸。另外，發(fā)明人也說明為了保證多肽能夠規(guī)避瘤胃環(huán)境，可能還需要進一步的包裹。
在以上的例子中，都需要對酵母細胞進行大量的篩選活基因工程操作。典型的絮凝酵母(Saccharomyces cerevisiae)飼喂給家畜益能提供瘤喂可用的營養(yǎng)物質(zhì)，但不太適合產(chǎn)生大量的在小腸有活性的生物活性分子。雖然細菌在商業(yè)上可用于產(chǎn)生比較木范圍更大的生物活性化合物和營養(yǎng)成分，其目的是為了使化合物分泌出細胞外，從而使化合物更易分離。目前還沒有發(fā)明一種細菌制劑的培養(yǎng)方法，不管是通過大量的菌種篩選還是培養(yǎng)條件，能使細菌及其中的生物活性分子不受瘤胃的降解。
為了生產(chǎn)適合飼胃反芻動物的細菌制劑、營養(yǎng)成分和其它生物活性化合物，保護這些活形成分抵抗瘤胃中微生物降解是非常重要的。眾所周知，如果保護生長限制必需的氨基酸和其它生物活性化合物的來源不被瘤胃中的微生物降解作用影響，之后可以被動物在胃腸道中吸收，就可以提高肉、羊毛和/或牛奶的產(chǎn)率。
大量的發(fā)明通過采用化學基質(zhì)進行包裹、包衣或包埋的方法來穩(wěn)定生物活性化合物或營養(yǎng)物質(zhì)。美國專利No.3,959,493提供了一種含有生物活性化合物的在瘤胃內(nèi)穩(wěn)定的產(chǎn)品，該產(chǎn)品是用脂肪酸保護的。授予Grass等的美國專利No.3,655,864，講述了可允許瘤胃后遞送生物活性飼料添加劑的組合物，該組合物是用一種液態(tài)不飽和高級脂肪酸包埋在甘油三硬脂酸酯基質(zhì)中，或者用甘油三硬脂酸酯基質(zhì)包衣的。
授予Drake等的美國專利No.4,473,545，敘述了動物飼料添加劑，它含有由相對不溶的粘合劑，一種可溶顆粒物質(zhì)和活性物質(zhì)組成的組合物。該顆粒物質(zhì)在特定的pH條件下易溶，該顆粒物質(zhì)的溶解可以增加粘合劑的透水性從而使放活性物質(zhì)。
美國專利No.4,533,557講述了一種反芻動物的飼料添加劑，它包含一種片劑或者顆粒劑形式的混合物，由至少一種生物活性成分、殼聚糖和保護性的長鏈脂肪酸組成。美國專利No.6,238,727和美國專利No.5,885,610描述了一種不溶性的必需氨基酸的礦物質(zhì)的鹽的生產(chǎn)，因其在瘤胃內(nèi)不溶所以不會被微生物降解，從而之后可以在小腸被吸收。
Klose(美國專利No.6,013,286)描述了一種物質(zhì)的組合物和給反芻動物飼喂生物活性化合物的方法，該方法能使化合物不直接進入瘤胃，而是完整無損地進入小腸。本方法需要一種比重為0.3～2.0的很特殊的物質(zhì)，并且該顆粒包括一個用疏水膜完全包裹的活性物質(zhì)的核心。另外，在疏水膜表面還需要一種表面活性劑以保證顆粒不會在瘤胃內(nèi)漂浮。
以上所有發(fā)明的生物活性化合物都被包裹或包埋在基質(zhì)中以保護其不被瘤胃降解，需要首先由微生物發(fā)酵或者化學合成得到該化合物，然后純化并包封。這種多步驟的方法不僅昂貴，而且不能生產(chǎn)出在瘤胃中得到保護的生物活性化合物。在每一步驟回收的時候都有產(chǎn)品或者生物活性的損失。
L-賴氨酸是由產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)發(fā)酵產(chǎn)生的。谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)菌株的產(chǎn)量可以通過菌株篩選、發(fā)酵工程(例如攪拌、供氧、培養(yǎng)基組分)的改善來提高。同時，利用重組DNA技術來增加單個生物合成基因的數(shù)量也用來提高L-賴氨酸的產(chǎn)量。通過這種方式，通過增加表達某一物質(zhì)的DNA片斷的數(shù)量，例如表達抗氨乙基半胱氨酸(EP88166)，表達反饋抑制天冬氨酸激酶(EP387527)，二氫吡啶二羧酸合成酶(EP197335)，天冬氨酸氨基轉移酶(EP219027)，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EP143195 and EP358940)，天門冬氨酸半醛脫氫酶(EP219027)和丙酮酸脫羧酶(DE19831609)，已經(jīng)獲得了L-賴氨酸產(chǎn)量的增加。
在L-賴氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)中，需要從菌體中分離出L-賴氨酸已增加細菌合成L-賴氨酸的效率。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基因LysE負責將L-賴氨酸輸出到谷氨酸棒狀桿菌菌株的胞漿外并進入到基質(zhì)中，這對于有效的L-賴氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)使非常關鍵的(Tryfona et al.，Process Biochem(2004))。增加LysE L-賴氨酸輸出載體的活性也能增加L-賴氨酸的產(chǎn)量(DE19548222)。
目前存在的問題是缺少一種能保護細菌和其它微生物不被瘤胃降解，從而能夠完整地遞送到小腸的措施。同樣，它們產(chǎn)生的活性化合物也必須分泌到也必須從細菌細胞分泌出來才能被純化，一旦純化后，生物活性化合物由必須通過包裹或者包埋技術保護來防止瘤胃的降解作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了可用于為反芻動物通過胃腸道遞送生物活性化合物的耐受瘤胃滅活作用的革蘭氏陽性細菌(G+細菌)菌株鑒別方法。還發(fā)現(xiàn)了提高可用于為反芻動物通過胃腸道遞送生物活性化合物的耐受瘤胃滅活作用的細菌菌株耐受瘤胃滅活作用的方法，無論該菌株對瘤胃滅活作用的天然耐受性如何。
因此，本發(fā)明的一個方面，是提供了一種評估細菌菌株耐受瘤胃體內(nèi)滅活作用的體外方法，該方法包括如下步驟在含有天然瘤胃液或合成瘤胃液的營養(yǎng)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)一種可用于為反芻動物通過胃腸道遞送生物活性化合物的G+細菌菌株；和測定隨著時間變化細菌培養(yǎng)物中蛋白降解的情況。
選擇瘤胃液是為了模擬細菌菌株在被喂食時所遇到的瘤胃環(huán)境。天然瘤胃液取自喂食24小時后健康反芻動物的瘤胃內(nèi)容物。合成瘤胃液是一種為了模擬瘤胃環(huán)境所選擇的物質(zhì)的混合物，包括一種或幾種能夠在瘤胃內(nèi)殺滅微生物的攝食原生動物。本領域的普通技術人員很容易找到這樣的攝食原生動物。
本發(fā)明的方法優(yōu)選地，是按照Wallace等的方法(Br.J.Nutr.，58，313-323(1987))測定C14標記的亮氨酸釋放來估計蛋白降解情況，該內(nèi)容包括在此處作為參考文獻。其結果用速率表示為每小時降解的細菌占當前殘余細菌的％。本發(fā)明來說，每小時降解速率小于8％的細菌菌株被定義為耐受瘤胃滅活作用。優(yōu)選每小時降解速率小于6％的細菌菌株給反芻動物遞送生物活性化合物，更優(yōu)選每小時降解速率小于4％的菌株。
因此，耐受瘤胃滅活的菌株中，每天將有20％以上給動物的喂養(yǎng)量的完好地通過網(wǎng)瘤胃。優(yōu)選的菌株每天將有50％以上給動物的喂養(yǎng)量完好地通過網(wǎng)瘤胃；更優(yōu)選菌株每天將有80％以上給動物的喂養(yǎng)量完好地通過網(wǎng)胃。
因此，本發(fā)明這一方面的一個實施方式進一步包括根據(jù)Wallace等的方法測定C14標記的亮氨酸釋放來估計細菌菌株降解速率，每小時小于8％作為耐受瘤胃滅活作用的鑒別步驟。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的另一個實施方式，本發(fā)明中有益細菌菌株是一種產(chǎn)賴氨酸的細菌菌株，優(yōu)選一種谷氨酸棒狀桿菌(Cornyebacterium glutamicum)菌株，更優(yōu)一種賴氨酸生產(chǎn)過剩的谷氨酸棒狀桿菌菌株，包括遺傳改造的賴氨酸生產(chǎn)過剩的谷氨酸棒狀桿菌菌株。然而，實際上本方法可用于任何需要評價對瘤胃滅活作用耐受的給反芻動物通過腸胃遞送生物活性化合物的菌種。
對本發(fā)明而言，“胃腸道遞送”定義為包括通過反芻動物的皺胃、小腸和大腸遞送。確切地說，生物活性化合物的遞送位置在于所需遞送的生物活性化合物的性質(zhì)，這一點，對于一個尋求使用該化合物的本技術領域的普通技術人員來講是可以理解的。本發(fā)明沒有改變遞送的位置，而是保護生物活性化合物在遞送時不被瘤胃滅活。
本發(fā)明這一方面還提供了一種方法，能夠篩選瘤胃降解性降低的細菌菌株，該菌株可用于為反芻動物胃腸道遞送某一細菌和包含在之內(nèi)的生物活性化合物，其中的細菌細胞壁可以提供瘤胃規(guī)避保護細胞內(nèi)容物。篩選到的細菌菌株可能足以耐受瘤胃降解，不需要進一步改造就可以把這些有益菌飼喂給反芻動物。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的足以耐受瘤胃的改變作用，不需要進一步改造就可以將其細胞內(nèi)容物喂食給反芻動物的細菌菌株包括谷氨酸棒狀桿菌ATCC13058菌株、13825菌株、14066菌株、14067菌株、14068菌株、21127菌株和700239菌株。因此，本發(fā)明另一方面提供了一種瘤胃規(guī)避飼料添加劑，含有含賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株生物體，菌株選自谷氨酸棒狀桿菌ATCC13058菌株，13825菌株，14066菌株，14067菌株，14068菌株，21127菌株和700239菌株。
本發(fā)明還提供了一種可以增強細菌菌株對瘤胃滅活作用耐受性的方法。本發(fā)明這一方面的方法，既可以用于經(jīng)鑒定耐受瘤胃滅活作用的菌株，又可以用于經(jīng)鑒定不能耐受瘤胃滅活作用的菌株。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種提高培養(yǎng)的菌株瘤胃滅活作用耐受性的方法，其中的菌株是在營養(yǎng)上對反芻動物有益的G+細菌，該方法包括如下步驟通過至少一次傳代，在含有一定量的能有效誘導對原生動物攝食耐受的細菌細胞壁生長的溶菌酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌株；和從含溶菌酶的培養(yǎng)基中回收菌株。
根據(jù)本發(fā)明這一個方面的一個實施方式，溶菌酶在培養(yǎng)基中的濃度大約為0.01～100μg/ml。根據(jù)本發(fā)明這一個方面的另一個實施方式，采用多次傳代培養(yǎng)，優(yōu)選的傳代次數(shù)是大約2～20次。
根據(jù)本發(fā)明這一個方面的另外一個實施方式，回收步驟是在最后一次傳代之后，在此情況下回收該生物量，該細菌的細胞壁耐受瘤胃的降解。然后生物量優(yōu)選脫水并濃縮按照傳統(tǒng)的方法飼喂反芻動物。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的另外一個實施方式，菌株是一種產(chǎn)賴氨酸的菌株，優(yōu)選地，是Cornye-bacterium glutamicum菌株，更優(yōu)選地，是已知能夠過量產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌菌株。然而，實際上本方法同樣地適用于任何需增加對瘤胃的耐受性的、可以用來為反芻動物胃腸遞送生物活性化合物的菌種。
本發(fā)明還包括瘤胃規(guī)避飼料添加劑，該添加劑含有細菌生物量，可用于為反芻動物胃腸遞送生物活性化合物，對瘤胃滅活作用耐受，可由本發(fā)明的任一方法獲得；以及使用瘤胃規(guī)避飼料添加劑添加到反芻動物飼料中的方法。當包含在動物飼料中提供給反芻動物時，細菌作為為反芻動物胃腸遞送生物活性化合物的系統(tǒng)。
下面闡述的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，結合附圖，使本發(fā)明前述的和其它的目的、特征和優(yōu)勢更加明顯。


圖1兩個未經(jīng)溶菌酶培養(yǎng)的谷氨酸棒狀桿菌菌株和反芻月形單胞菌(S.ruminantium)Z1081菌株降解率的比較圖2同樣的兩個經(jīng)溶菌酶培養(yǎng)的谷氨酸棒狀桿菌菌株和反芻月形單胞菌Z1081菌株降解率的比較圖3經(jīng)溶菌酶培養(yǎng)的菌株C.gluta-micum ATCC 13869、700239、31269和菌株S.bovisES1在瘤胃液中的降解量的比較圖4未經(jīng)溶菌酶培養(yǎng)和經(jīng)過溶菌酶培養(yǎng)的同樣兩個菌株谷氨酸棒狀桿菌和菌株S.bovisES1在瘤胃液中的降解率的比較圖5未經(jīng)溶菌酶培養(yǎng)和經(jīng)過溶菌酶培養(yǎng)的菌株Bifidobacter.Longum、Propionibacteriumfreudenreichii、Lactobacillus raffinolactis、Lacto.fermentum Lactobacillus lactis、Lactobacillus pentosus、Propionibacter.acidipropionici和菌株S.bovis ES1在牛瘤胃液中的降解的比較具體實施方式
為了賦予有益菌對瘤胃降解作用的耐受性，在溶菌酶存在的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)有益菌，優(yōu)選地，在發(fā)酵條件下培養(yǎng)，發(fā)酵是培養(yǎng)商業(yè)用量的特定生物和優(yōu)化目標生物活性化合物合成的理想方法。適合的營養(yǎng)培養(yǎng)基的例子包括Lennox培養(yǎng)基(Kumagai et.al.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，69，2051-2056(2005))，CGXII培養(yǎng)基(Keilhauer et al.1993.JBacteriol1755595-5603)，Luria Bertani肉湯培養(yǎng)基(Lennox，E.S.1955.Virology 1190-206)以及Broer和Kramer所描述的復合培養(yǎng)基(J.Bacteriol.1990，172，7241-7248)。
溶菌酶按照能夠有效地增強對瘤胃裂解耐受性的濃度加入營養(yǎng)培養(yǎng)基中。溶菌酶的濃度不應該太低，以防在瘤胃中降解表現(xiàn)的改善不能觀察到統(tǒng)計上的和商業(yè)上顯著性的；溶菌酶的濃度也不應該太高，以至于對細菌的生長抑制到令人難以接受的程度。因此，優(yōu)選地，溶菌酶的濃度為大約0.1～100μg/ml，更優(yōu)選為大約1～10μg/ml。
優(yōu)選的方法采用在含有溶菌酶的培養(yǎng)基中系列多次傳代。更優(yōu)選的方法是采用系列傳代大約2～10。優(yōu)選地，每次傳代細菌培養(yǎng)的時間為大約12～48小時，并且在溶菌酶存在時總培養(yǎng)時間為大約1～20天。
細菌細胞通過過濾和/或離心收獲，濃縮和/或干燥并以商業(yè)可接受的方式包裝。
本發(fā)明使用溶菌酶賦予對瘤胃滅活作用耐受性的方法，可適用于任何為反芻動物通過胃腸道遞送生物活性化合物的菌種。這些菌種的例子包括但不限于雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)，羅伊氏乳桿菌(Lacto-bacillus reuteri)，成人型的雙叉桿菌(Bifidobacteriumlongum)，右旋糖酐系蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，嗜熱雙岐桿菌(Bifidobacterium thermophilum)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，緩慢芽胞桿菌(Bacillus lentus)，嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)，有害片球菌(Pediococc.cerevis.(damnosus))，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)，費氏丙酸桿菌(Propionibacter.freudenreichii)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)，嗜淀粉擬桿菌(Bacteroides amylophilus)，纖維二糖乳桿菌(Lactobacillus cellobiosus)，多毛擬桿菌(Bacteroides capillosus)，彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)，乳油鏈球菌(Streptococcus cremoirs)，瘤胃細菌(Bacteriodes ruminicola)，delbrueckii乳酸菌(Lactobacillus delbrueckii)，丁二酮乳鏈球菌(Streptococcus diacetilactis)，豬擬桿菌(Bacteroides suis)，發(fā)酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)，糞鏈球菌(Streptococcusfaecium)，青春型雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)，菌株瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveti-cus)，中間鏈球菌(Streptococcus intermedius)，動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)，乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)，乳鏈球菌(Streptococcus lactis)，兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。
得到的飼料添加劑對單胃動物包括人類也是有益的，即使他們并不需要瘤胃規(guī)避的特性。
本發(fā)明特別適用于G+細菌，因為其有厚厚的肽聚糖細胞壁。G+細的例子包括但不限于分枝桿菌(mycobacteria)，諾卡氏菌(nocardia)，乳酸桿菌(lactobacillus)，鏈球菌(streptococcus)，桿菌(Bacillus)和棒狀桿菌(Corynebacteria)。已經(jīng)建立的許多商業(yè)上有用的產(chǎn)賴氨酸的菌株如谷氨酸棒狀桿菌菌株，非常適用于本發(fā)明，例如谷氨酸棒狀桿菌菌株ATCC13058、13825、14066、14067、14068、21127和700239。優(yōu)選能合成高濃度的L-賴氨酸的Corynebacteria glutamicum菌株，如菌株ATCC strains 21127和700239。還優(yōu)選外輸因子基因LysE缺如的菌株。
可以通過在溶菌酶存在條件下培養(yǎng)獲得的菌株來遞送的生物活性化合物包括營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸及其衍生物、氨基酸的羥化同源體、蛋白、碳水化合物、脂類、維生素和動物藥物，可以是一種，也可以是兩種或兩種以上的結合。
生物活性化合物的例子包括氨基酸如賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、蘇氨酸等；氨基酸衍生物如N-?；被?、N-羥甲基甲硫氨酸鈣鹽、鹽酸賴氨酸等；氨基酸的羥化同源體例如2-羥基-4-甲硫基-丁酸及其鹽等；碳水化合物如淀粉、蔗糖和葡萄糖等；脂類如ω-3脂肪酸，ω-6脂肪酸，反式脂肪酸等；維生素和有類似維生素功能的物質(zhì)如維生素A、乙酰維生素A、棕櫚酸維生素A，B族維生素如硫胺、鹽酸硫胺、核黃素、煙酸、煙堿，泛酸酯鈣、泛酸酯膽堿、維生素B6、鹽酸維生素B6、氯化膽堿、維生素B12、生物素、葉酸等；p-氨基苯酸、維生素D2、D3、維生素E等。
除了營養(yǎng)物質(zhì)外，生物活性化合物還可以包括治療性的化合物包括激素如雌激素、己烯雌酚、己雌酚，甲狀蛋白、甲狀腺激素、生長激素等；生物活性化合物還包括治療性的蛋白和多肽，包括酶如淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、果膠酶、纖維素酶、乳糖酶和脂酶等；激素類的蛋白如生長激素等；殺菌結合碳水化合物如甘露聚糖和呋喃-寡聚糖和抗菌肽化合物如細菌素。
因此，本發(fā)明的方法，除了對天然存在的菌株和通過大量篩選得到的菌株適用外，也可適用于重組菌株。故而能產(chǎn)生目標治療性多肽或蛋白的基因工程重組菌株，也能通過本發(fā)明的方法安全規(guī)避瘤胃，通過胃腸道遞送多肽或蛋白。
細菌細胞表面的化合物也可通過胃腸道遞送，因此，細菌細胞本身也具有價值。另外，在本發(fā)明中，那些不具有營養(yǎng)價值但可以競爭腸道的病原的細胞(即競爭排除)也包括在“生物活性化合物”的范疇。
本發(fā)明還提供了一種獨立的體外鑒別方法，以識別對瘤胃滅活不敏感菌株或者通過在含有溶菌酶的培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得對瘤胃滅活作用耐受性的菌株。該評估耐受瘤胃滅活作用的菌株的方法可適用于上述提到的有益菌株。本方法既適用于鑒別那些對瘤胃滅活作用天然耐受的菌株，也適用于那些其耐受瘤胃滅活作用的能力是在含有溶菌酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而獲得的菌株。
該體外方法在含有天然或合成的瘤胃液中的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能用于胃腸到遞送生物活性化合物的G+菌株，并且測定蛋白隨時間降解的速度。培養(yǎng)基中含有大約80～99％(體積百分比)的營養(yǎng)培養(yǎng)基和大約1～20％(體積百分比)瘤胃液。適合的培養(yǎng)基包括Dehority氏培養(yǎng)基(Scott and Dehority，J.Bacteriol.，89，1169.1175(1965))、Hobson氏M2培養(yǎng)基(Hobson，Methods Microbiol.，3B，133-149(1969))和CRT培養(yǎng)基(Wallace et.al.，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，53，965-970(2003))。Hungate(Hungate RE 1966.The rumen and its microbes.Academic Press，New York，NY)和Hobson&Stewart(The Rumen Microbial Ecosystem，Chapman and Hall，London)的書中所描述的許多其它培養(yǎng)基也適用。
選用瘤胃液使為了接近瘤胃環(huán)境。天然瘤胃液是從健康反芻動物瘤胃內(nèi)容物中獲得的。例如，瘤胃液可以從瘤胃造瘺的反芻動物取得。瘤胃液優(yōu)選從同種反芻動物獲得，優(yōu)選從喂食后24hr內(nèi)獲得，更優(yōu)選在清晨喂食飼胃后大約1～3hr獲得。瘤胃液應注意出去不需要的顆粒物。
合成瘤胃液是模仿進入瘤胃可能遇到的環(huán)境中的物質(zhì)制備的。該液體含有一種或幾種能殺滅微生物的攝食原生動物，以及細菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)包括糖類、磷酸鹽、碳酸氫鹽緩沖液、礦物鹽、揮發(fā)性脂肪酸和維生素。合成瘤胃液的例子Hobson&Stewart有詳盡的描述(The Rumen Microbial Ecosystem，Chapman and Hall，London).可致微生物降解的瘤胃原生動物的例子包括前毛屬(Epidinium)，Eudiplodinium，均毛中屬(Isotricha)密毛蟲屬(Dasytricha)，內(nèi)毛屬(Entodinium)和多甲亞屬(Polyplastro)n(Ivan et.al.2000aJ Anim Sci78，750-759；Ivan et.al.2000b.J Dairy Sci 83，776-787)。
被評估的有益菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，溫度為在瘤胃可能遇到的溫度環(huán)境，即大約36～40℃。孵育的時間可根據(jù)菌株在瘤胃中可能停留的時間選擇，一般是1～48hr。為了獲取更多的數(shù)據(jù)，也可以采用更長的時間，例如12～48hr。根據(jù)該數(shù)據(jù)，按照菌株在瘤胃中實際停留的時間，可以推斷出蛋白降解的量。
菌株蛋白降解情況用隨時間產(chǎn)生的降解產(chǎn)物的重量表示。本發(fā)明中優(yōu)選的方法是按照Wallace等的方法(Wallace et al.，Br.J.Nutr.，58，313-323(1987))測定C14標記的亮氨酸，以此來計算蛋白的降解，其內(nèi)容作為文獻納入本文。其結果用速率表示為每小時降解的細菌占當前殘余細菌的％。本發(fā)明來說，每小時降解速率小于8％的細菌菌株被定義為耐受瘤胃滅活作用。優(yōu)選每小時降解速率小于6％的細菌菌株給反芻動物遞送生物活性化合物，更優(yōu)選每小時降解速率小于4％的菌株。
評價后認為對瘤胃降解不耐受的菌株，即降解速率每小時大于8％的菌株，可以在溶菌酶存在的條件下培養(yǎng)以增強其對瘤胃降解的耐受性。其耐受性的改善情況可在溶菌酶培養(yǎng)后再評價。再評價使用天然瘤胃液或者合成瘤胃液，采用本發(fā)明的體外評價方法進行。改善的程度可以用同樣單位時間內(nèi)降解速率減少的百分率來表示。然而，和達到本發(fā)明定義的的耐受瘤胃滅活作用的閾值相比，改善的程度并沒有那么重要。也就說，耐受大幅度的增加并不一定夠，而少量的增加也許就足夠了。
鑒定為對瘤胃降解作用耐受的有益菌，或在溶菌酶培養(yǎng)后瘤胃降解作用耐受的有益菌，也可以繼續(xù)培養(yǎng)(必要使為了增強對瘤胃降解的耐受可加溶菌酶)。用商業(yè)發(fā)酵設備包括批式培養(yǎng)設備、流加式培養(yǎng)設備和連續(xù)培養(yǎng)設備獲得商業(yè)用量的生物量。生物量可以選擇性地用可接受的填充劑、粘合劑和調(diào)味劑或類似物混合，成為瘤胃規(guī)避飼料添加劑?；蛘呱锪勘旧砑纯勺鳛轱暳咸砑觿?，可加入反芻動物的飼料中使用。另外，生物量和其它添加劑也可以溶解或者懸浮于液體介質(zhì)中，作為飼料添加劑噴于飼料。制成何種形式，對于本領域的技術人員來講實際上是很常規(guī)的，眾所周知。其它的反芻動物營養(yǎng)物質(zhì)也可以加于任何一種形式的瘤胃規(guī)避飼料添加劑中。
收獲的耐受瘤胃降解的細菌細胞可以添加于傳統(tǒng)的反芻動物飼料中喂養(yǎng)反芻動物，該飼料常常是反芻動物可食的植物性物質(zhì)，例如豆類干草、雜草干草、玉米飼料、雜草飼料、玉米、豆類、燕麥、大麥、谷類提取物、啤酒糟、豆粕和棉籽粕，用量按照畜牧營養(yǎng)師推薦的量即可，通常不超過飼料干重的5％。
對于瘤胃保護性的賴氨酸飼料添加劑，例如含有谷氨酸棒狀桿菌生物量的飼料添加劑，加入到固體飼料干重的添加劑的量應該是能有效提供每天每kg體重反芻動物的代謝需求的賴氨酸，平均為5～150mg。優(yōu)選每kg體重反芻動物為15～75g代謝需求的賴氨酸，代謝需求的賴氨酸可用測定瘤胃體外模擬系統(tǒng)的賴氨酸流量計算。也可以用安裝胃(或腸)插管的動物，測定賴氨酸到小腸的流量計算，和/或采用代謝需求賴氨酸缺乏的飼料喂養(yǎng)的雌性反芻動物，根據(jù)奶中蛋白增加的百分率來計算。大量的本領域技術人員知悉的方法都可用來確定代謝需求的賴氨酸的量。
本發(fā)明的瘤胃規(guī)避飼料添加劑可以給予任何需要營養(yǎng)添加劑的反芻動物，包括家畜、實驗動物、動物園和其它野生展覽動物，例如，耕牛、公牛、綿羊和山羊。瘤胃規(guī)避飼料添加劑可用于喂養(yǎng)產(chǎn)肉、產(chǎn)奶、產(chǎn)皮毛的家畜或者勞力動物。
以下列舉非限制性的實施例來闡釋本發(fā)明。除另有說明外，所有含量和百分比都是重量或者重量百分比，所有溫度均為攝氏度。
實施例實施例1.谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)菌株對原生動物攝食造成的瘤胃降解的敏感性根據(jù)Wallace等(Br.J.Nutr.，58，313-323(1987))描述的方法確定瘤胃液中谷氨酸棒狀桿菌和反芻月形單胞菌(S.ruminantium)(代表“一般的”瘤胃細菌)的降解。
在好氧Wallace和McPherson培養(yǎng)基中生長谷氨酸棒狀桿菌菌株(ATCC 13761和ATCC13869)。在厭氧Wallace和McPherson培養(yǎng)基中生長反芻月形單胞菌Z108。上述Wallace等人的雜志文獻中公開了Wallace和McPherson培養(yǎng)基及其制備方法。培養(yǎng)物在39℃下生長過夜。通過在室溫下1000g×10分鐘離心收集細胞。將細胞重懸于含5mMC14L-亮氨酸的厭氧Coleman緩沖液中，溫育過夜(OD＝1.0)，以標記細菌蛋白。取出樣品(1ml)，置于0.25ml25％TCA中進行蛋白測定。將兩個50μl的等分試樣置于閃液(scintillation fluid)中以測定增加的放射性的量。
從三只喂食2小時后的綿羊中取出瘤胃液，用紗布過濾。加入未標記的L-亮氨酸(5mM)，使過濾后的瘤胃液(SRF)保持溫暖。將樣品(ImL)加入1mL的4％福爾馬林中，以進行原生動物計數(shù)。
將4.5ml的SRF或緩沖液加入標記后的細菌細胞懸液(0.5ml)，在39℃下培養(yǎng)。分別在0、1、2、3小時取出樣品(0.5ml)，置于0.125ml TCA中。在14000rpm下離心樣品3分鐘，對200μl上清液進行計數(shù)，以測定釋放的放射性，其代表被原生動物降解的細菌蛋白。
基于代表被原生動物降解的細菌蛋白的放射性的釋放，在每個時間點測定降解百分數(shù)。用以下等式對數(shù)據(jù)進行擬合(Mehrez和Orskov，1987)Y＝a+(c-a)*1-(exp[-kd*x])；其中Y＝在特定時間x(小時)的降解；a＝起始降解；c＝最大降解；kd＝降解速率(hr-1)；根據(jù)以下等式確定選定的瘤胃傳代速率的有效降解性Y＝a+(c*kd)/(Kd+Kp)其中Kp＝瘤胃周轉率(turnover rate)結果顯示在圖1.中。與反芻月形單胞菌Z108相比，谷氨酸棒狀桿菌的兩個菌株都顯示了快速降解。與反芻月形單胞菌Z108的21.9％相比，經(jīng)過3小時溫育后菌株10336和13869分別消失71.2和83.1％。菌株13761和13869在瘤胃周轉率0.07hr-1下的有效降解性分別為71.2和53.8％。
實施例2.谷氨酸棒狀桿菌在低溶菌酶水平下的生長制備Wallace和McPherson非C14培養(yǎng)基(24×7ml)。向四組試管中的每一個中加入過濾滅菌的溶菌酶(0.1；1.0；10；100；或1000μg/ml)。對最后一組的四支試管，加入0.5ml的Coleman’s D培養(yǎng)基(對照)。用谷氨酸棒狀桿菌菌株ATCC 13761培養(yǎng)物接種試管，在39℃下溫育48小時，在24和48小時對各生物體測定OD值(650nm)。
菌株13761在最低的兩個溶菌酶水平(0.1和1μg/ml)下生長良好。在100μg/ml生長減半，在1000μg/ml下生長被完全抑制。
實施例3.在存在溶菌酶的條件下谷氨酸棒狀桿菌的生長對原生動物攝食易感性的影響方法與實驗1的基本上相同，只是谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13761和ATCC 13869如實驗1中生長，或在溶菌酶的存在下生長(0.5ml的0.25μg/ml溶菌酶；16.7μg/ml終濃度)。和實驗1一樣，反芻月形單胞菌Z108被用作對照。
結果如圖2所示。對所有生物體而言，此實驗中的降解都低于實驗1中的。當菌株在不存在溶菌酶的(天然)條件下生長時，與反芻月形單胞菌Z108的13.3％相比，經(jīng)過3小時溫育后菌株13761和13869分別消失37.9和42.8％。然而，當在存在溶菌酶的條件下生長時，對菌株13869而言3小時降解減少至15.2％，但對菌株13761沒有影響(36.3％)。當不在存在溶菌酶的條件下生長時，菌株13761和13869在瘤胃周轉率0.07hr-1下的有效降解性分別為53.8和64.7％；當在存在溶菌酶的條件下生長時，有效降解性分別為36.1和24.5％。
實施例4-6.在存在溶菌酶的條件下谷氨酸棒狀桿菌菌株13869、700239和31269的生長對原生動物攝食易感性的影響從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得谷氨酸棒狀桿菌菌株13869、700239和31269。根據(jù)ATCC的說明，在營養(yǎng)瓊脂上使培養(yǎng)物復活，轉移到營養(yǎng)肉湯(broth)中。當觀察到健康生長時(在營養(yǎng)肉湯中在39℃下經(jīng)過3×24h傳代)，在營養(yǎng)肉湯加或不加(plus orminus)20μg/ml雞卵白溶菌酶中在39℃下使培養(yǎng)物進行生長3×24h。預先從綿羊的瘤胃中分離牛鏈球菌ES1，在威爾士Wales大學農(nóng)業(yè)科學研究所(Institute of Rural Sciences，University of Wales，Aberystwyth)培養(yǎng)物保藏中心保存。
通過在含瘤胃液(rumen fluid)的Wallace和McPherson培養(yǎng)基中在39℃下使培養(yǎng)物生長24小時來標記細菌，所述培養(yǎng)基以氨半胱氨酸和L-[U-14C]亮氨酸作為唯一添加的氮源，并且先在溶菌酶存在下生長培養(yǎng)物，然后添加20μg/ml雞卵白溶菌酶(hens egg whitelysozyme)。通過離心收集細胞，用Coleman鹽溶液D(Coleman，1978)清洗一次，再用過濾后的瘤胃液溫育。瘤胃液是在早晨喂食后2小時從三只接受青貯草配給(grass silage basedration)的瘤胃造瘺的(rumen-fistulated)牛中抽取的。用四層紗布過濾瘤胃液。
通過在3小時溫育過程中釋放到三氯乙酸可溶物質(zhì)中的[14C]測定表觀(apparent)蛋白降解。所有培養(yǎng)中均使用終濃度為5mmol/L非標記的L-亮氨酸。
在三小時溫育過程中不同細菌在瘤胃液中的破壞(breakdown)示于圖3。細菌破壞速率(％/h)的初始比較顯示谷氨酸棒狀桿菌菌株700239的破壞比其他谷氨酸棒狀桿菌菌株或瘤胃細菌(牛鏈球菌)明顯緩慢(谷氨酸棒狀桿菌13869，700239和31269，以及牛鏈球菌ES1分別為5.63，2.58，8.27，6.88％/h SED 1.287，圖4)。當單獨研究谷氨酸棒狀桿菌菌株的數(shù)據(jù)時，雖然所用菌株之間的破壞速率顯著不同，但對這些菌株而言，用溶菌酶預溫育顯然沒有帶來改進(表1)。
Table 1-在存在和不存在溶菌酶的條件下的生長對瘤胃液中谷氨酸棒狀桿菌菌株13869，700239和31269的破壞的影響


本文所用測試基于Wallace等的描述，其中在存在過量的未標記亮氨酸的瘤胃液中細菌釋放的C14亮氨酸被用于測定瘤胃中細菌的破壞。對三種細菌菌株而言，使培養(yǎng)物在溶菌酶中生長對瘤胃液中的破壞速率沒有顯著的影響，只是數(shù)值減少約16％。缺乏影響的兩種可能的理由如下所述培養(yǎng)時間在目前的實驗中，谷氨酸棒狀桿菌與溶菌酶總共溫育96小時(在20μg/ml營養(yǎng)肉湯中三次24小時傳代，加上一次在Wallace和McPherson培養(yǎng)基中傳代以標記細胞)?？赡懿粔驎r間使培養(yǎng)物針對溶菌酶改變它們的細胞結構。
在不存在溶菌酶的條件下培養(yǎng)物的低降解性在目前的實驗中，在不存在溶菌酶的條件下生長的谷氨酸棒狀桿菌菌株的降解性從9至3％/h變化。這比先前記錄的其他谷氨酸棒狀桿菌菌株的數(shù)值要低(菌株10334和10337為12和14％/h)，而比B.fibrisolvens的數(shù)值(約30％/h)低得多，其中初次觀察到溶菌酶可減少降解。相反，本文中牛鏈球菌的數(shù)據(jù)與先前觀察到的非常接近。溶菌酶保護作用很小的原因可能是細胞已對原生動物攻擊產(chǎn)生相關抗性。
值得注意的是，當谷氨酸棒狀桿菌700239在存在溶菌酶的條件下生長時，降解速率約為2％/h。假設加入瘤胃的谷氨酸棒狀桿菌700239在液相中以相對適度的10％/h的降解速率離開瘤胃，則24小時后約77％的谷氨酸棒狀桿菌700239會通過(bypass)瘤胃，低于15％被降解。以更實際的15％/h液體周轉計算，超過85％會通過瘤胃，低于12％會被降解。
在目前的實驗中，在存在溶菌酶的條件下的生長不能明顯地保護被研究的谷氨酸棒狀桿菌菌株免于在瘤胃中降解。然而，谷氨酸棒狀桿菌菌株700239對在瘤胃中降解有很大的抗性，預期可以提供一種合適的載體，用于使氨基酸(例如賴氨酸)通過瘤胃。
實施例7-13.在存在溶菌酶的條件下，對長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、費氏丙酸桿菌(Propionibacerium freudenreichii)、Lactobacillus raffinolactis、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳桿菌(Lacto-bacillus lactis)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、戊糖乳桿菌和產(chǎn)酸丙酸桿菌(Propionibaceriumacidipropionici)菌株的生長對原生動物攝食的影響通過在存在溶菌酶的條件下，體外生長除谷氨酸棒狀桿菌之外的七種不同的可能的益生菌(probiotic organisms)，研究對它們在瘤胃液中破壞的影響。如實施例1-6中那樣，用典型的瘤胃細菌-牛鏈球菌作為對照。
從國家工業(yè)和海洋細菌保藏中心(NCIMB)和國家食品細菌保藏中心(Aberdeen)獲得長雙歧桿菌、費氏丙酸桿菌和產(chǎn)酸丙酸桿菌。從Kevin Hillman博士(Gutbugs，UK)那里獲得Lactobacillus raffinolactis、發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳桿菌和戊糖乳桿菌。
如實施例4-6所述生長并標記細菌(包括牛鏈球菌ES1)，測定表觀蛋白破壞。圖5顯示了不同細菌在瘤胃液中溫育3小時后的破壞情況。在存在溶菌酶的條件下的生長使牛鏈球菌、費氏丙酸桿菌和L.raffinolactis的破壞降低了超過70％。戊糖乳桿菌、長雙歧桿菌和發(fā)酵乳桿菌的破壞降低了40至50％，而對乳酸乳桿菌或產(chǎn)酸丙酸桿菌(表2)的破壞沒有影響。
表2-在存在和不存在溶菌酶的條件下的生長對瘤胃液中的前生命期生物體的影響

前述實施例和對優(yōu)選的實施方式的描述，應認為是對由權利要求定義的本發(fā)明的解釋，而不是限制?？梢允褂蒙衔慕o出的特征的大量組合，而不背離有權利要求給出的本發(fā)明。這些變化不應被認為背離了本發(fā)明的精神和范圍，所有的這些變化被認為包括在權利要求的范圍之中。
權利要求
1.一種提高產(chǎn)賴氨酸革蘭氏陽性細菌菌株的瘤胃滅活抗性的方法，該方法包括以下步驟在生長培養(yǎng)基中使細菌菌株培養(yǎng)物生長至少傳代一次，所述培養(yǎng)基包含溶菌酶，溶菌酶的含量可以有效地誘導抵抗原生動物攝食的細菌細胞壁的生長；并且從含溶菌酶的培養(yǎng)基中回收細菌菌株。
2.權利要求1的方法，其中所述細菌菌株是谷氨酸棒狀桿菌的菌株。
3.權利要求2的方法，其中所述谷氨酸棒狀桿菌菌株是選自13058、13825、14066、14067、14068、21127和700239的ATCC菌株。
4.權利要求2的方法，其中所述谷氨酸棒狀桿菌菌株過量產(chǎn)生賴氨酸。
5.權利要求4的方法，其中所述谷氨酸棒狀桿菌菌株經(jīng)過遺傳修飾以過量產(chǎn)生賴氨酸。
6.權利要求1的方法，其中所述生長培養(yǎng)基中溶菌酶濃度為約0.01至約100μg/ml。
7.權利要求6的方法，其中所述溶菌酶濃度為約0.1至10μg/ml。
8.權利要求1的方法，其中在含有溶菌酶的生長培養(yǎng)基中進行多次傳代。
9.權利要求8的方法，其中在含有溶菌酶的生長培養(yǎng)基中進行約2至約10次傳代。
10.一種抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑，其包含用權利要求1的方法培養(yǎng)的產(chǎn)賴氨酸細菌菌株。
11.權利要求10的抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑，其中所述細菌菌株是谷氨酸棒狀桿菌的菌株。
12.權利要求11的抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑，其中所述谷氨酸棒狀桿菌菌株過量產(chǎn)生賴氨酸。
13.權利要求12的抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑，其中所述谷氨酸棒狀桿菌菌株經(jīng)過遺傳修飾以過量產(chǎn)生賴氨酸。
14.權利要求10的抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑，其中所述細菌菌株的瘤胃降解速率低于每小時約8％，所述速率是根據(jù)Wallace等的方法，通過C14標記的亮氨酸的釋放而測定的。
15.權利要求14的抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑，其中所述降解速率低于每小時約6％。
16.一種抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑，其包含產(chǎn)賴氨酸細菌菌株，所述細菌菌株的瘤胃降解速率低于每小時約8％，所述速率是根據(jù)Wallace等的方法，通過C14標記的亮氨酸的釋放而測定的。
17.權利要求14或16的抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑，其中瘤胃的降解速率使得每天給反芻動物喂食的細菌劑量中超過20％被完好地遞送通過網(wǎng)胃-瘤胃(reticulo-rumen)。
18.權利要求14或16的抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑，其中所述細菌菌株是選自13058、13825、14066、14067、14068、21127和700239的谷氨酸棒狀桿菌ATCC菌株。
19.一種提高反芻動物飼料配給(ration)的代謝可利用賴氨酸含量的方法，其包括向所述飼料配給中添加有效量的權利要求10或16的抗瘤胃的賴氨酸飼料添加劑。
20.權利要求19的方法，其中所述飼料添加劑被添加到所述飼料配給中，其添加量可以有效地為每公斤反芻動物體重提供約5至150mg的代謝可利用賴氨酸。
21.權利要求19的方法，其中所述反芻動物是奶牛。
22.一種評估產(chǎn)賴氨酸細菌菌株對體內(nèi)瘤胃滅活的體外方法，該方法包括以下步驟在營養(yǎng)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)革蘭氏陽性產(chǎn)賴氨酸細菌菌株，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基含有天然或合成的瘤胃液；并且測定細菌培養(yǎng)物中蛋白降解，作為時間的函數(shù)。
23.權利要求22的方法，其中所述細菌菌株是谷氨酸棒狀桿菌的菌株。
24.權利要求23的方法，其中所述谷氨酸棒狀桿菌菌株是選自13058、13825、14066、14067、14068、21127和700239的ATCC菌株。
25.權利要求23的方法，其中所述谷氨酸棒狀桿菌菌株過量產(chǎn)生賴氨酸。
26.權利要求25的方法，其中所述谷氨酸棒狀桿菌菌株經(jīng)過遺傳修飾以過量產(chǎn)生賴氨酸。
27.權利要求22的方法，其中所述測定蛋白降解步驟包括根據(jù)Wallace等的方法測定C14標記的亮氨酸的釋放。
28.權利要求22的方法，其中所述方法進一步包括鑒別抵抗瘤胃滅活的細菌菌株的步驟，所述菌株具有每小時低于8％的降解速率。
29.權利要求22的方法，其中所述瘤胃液是天然瘤胃液。
30.權利要求22的方法，其中所述瘤胃液是合成的瘤胃液。
31.權利要求28的方法，其中所述方法進一步包括鑒別抵抗瘤胃滅活的細菌菌株的步驟，所述菌株所具有的瘤胃降解速率使得每天給反芻動物喂食的細菌劑量的超過20％可以完好地被遞送通過網(wǎng)胃-瘤胃。
32.權利要求31的方法，其中被鑒別的菌株所具有的降解速率使得超過50％的所述劑量完好地遞送。
全文摘要
提高培養(yǎng)的革蘭氏陽性細菌菌株對瘤胃滅活的抗性的方法，用于向反芻動物胃腸道遞送生物活性化合物，該方法包括在生長培養(yǎng)基中使細菌菌株培養(yǎng)物至少傳代一次，所述生長培養(yǎng)基包含一定量的溶菌酶，能有效誘導細菌細胞壁的生長，抵抗原生動物攝食；所述方法還包括從含有溶菌酶的培養(yǎng)基中回收細菌菌株。本發(fā)明還公開了由獨創(chuàng)的方法產(chǎn)生的通過瘤胃飼料補充劑，以及用所述通過瘤胃飼料補充劑為反芻動物補充飲食的方法，以及評估革蘭氏陽性細菌菌株對體內(nèi)瘤胃滅活的抗性的體外方法。
文檔編號A23K1/16GK101072864SQ200580041808
公開日2007年11月14日 申請日期2005年12月6日 優(yōu)先權日2004年12月6日
發(fā)明者萊爾·M·羅得, 詹姆士·C·紐勃得 申請人:賽格生物科學有限公司