生產膠原的植物及其生成和使用方法

專利名稱：生產膠原的植物及其生成和使用方法
技術領域：
和背景本發明涉及生產膠原的植物及其生成和使用方法。更具體而言，本發明涉及用于生成能夠生產高水平羥基化膠原鏈的植物的新方法，所述膠原鏈能夠形成天然的三股螺旋I型膠原纖維。
膠原是負責脊椎動物和許多其他多細胞生物的結構完整性的主要結構蛋白。I型膠原代表原型的纖維膠原，并且是大多數組織中的主要膠原類型。
I型膠原是骨和腱中占優勢的膠原組分，并且大量發現于皮膚、主動脈和肺中。I型膠原纖維提供極大的抗張強度和有限的伸長性。I型膠原的最豐富的分子形式是由2種不同的α鏈[α1(I)]2和α2(I)組成的異源三聚體(Inkinen，2003)。所有纖維膠原分子都包含由重復的Gly-X-Y三聯體構建的3種多肽鏈，其中X和Y可以是任何氨基酸，但通常是亞氨基酸脯氨酸和羥脯氨酸。
形成原纖維的膠原作為包含球狀N-和C-末端延伸前肽的前體前膠原而合成。前膠原的生物合成是牽涉多種不同的翻譯后修飾的復雜過程，所述翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸羥基化、N-連接的和O-連接的糖基化以及鏈內和鏈間二硫鍵的形成。執行這些修飾的酶以協同的方式起作用以確保正確排列和熱穩定的三股螺旋分子的折疊和裝配。
每種前膠原分子由3種多肽鏈組成成分在粗面內質網內裝配。因為多肽鏈共翻譯地穿過內質網膜移位(translocate)，所以脯氨酸和賴氨酸殘基的羥基化發生在Gly-X-Y重復區域內。一旦多肽鏈完全移位到內質網腔內，C-前肽就折疊。3種前-α鏈隨后經由其C-前肽結合以形成三聚體分子，從而允許Gly-X-Y重復區域在其C-末端形成成核點，確保鏈的正確排列。Gly-X-Y區域隨后在C-至-N方向折疊以形成三股螺旋。
多肽鏈修飾和三股螺旋形成之間的時間關系是關鍵的，因為脯氨酸殘基的羥基化是確保三股螺旋在體溫下的穩定性必需的，一旦形成，三股螺旋就不再充當羥基化酶的底物。C-前肽(以及較少程度上的N-前肽)在前膠原通過細胞的過程中保持前膠原可溶(Bulleid等人，2000)。在前膠原分子分泌進入細胞外基質后或在這個過程中，通過前膠原N-和C-蛋白酶去除前肽，從而觸發膠原分子自發地自身裝配為原纖維(Hulmes，2002)。通過前膠原N-和C-蛋白酶去除前肽使前膠原的溶解性降低了＞10000倍，并且是發動膠原自身裝配成纖維所必需和充分的。對這個裝配過程關鍵的是在三股螺旋結構域末端被稱為端肽的短的非三股螺旋肽，它確保原纖維結構內的膠原分子的正確記錄，并降低自身裝配的臨界濃度(Bulleid等人，2000)。在自然中，膠原的三股螺旋結構的穩定性需要由脯氨酰-4-羥化酶(P4H)對脯氨酸的羥基化，以在膠原鏈內形成羥脯氨酸殘基。
表達膠原鏈的植物是本領域已知的，參見例如，美國專利號6,617,431和(Merle等人，2002，Ruggiero等人，2000)。盡管植物能夠合成包含羥脯氨酸的蛋白質，但與哺乳動物P4H相比，負責在植物細胞中合成羥脯氨酸的脯氨酰羥化酶顯示出相對寬松的底物序列特異性，并因此只在Gly-X-Y三聯體的Y位置包含羥脯氨酸的膠原生產需要植物共表達膠原和P4H基因(Olsen等人，2003)。
生產依賴于植物中天然存在的羥基化機制的人膠原的嘗試得到了在脯氨酸羥基化方面弱的膠原(Merle等人，2002)。這種膠原在低于30℃的溫度下熔解或失去其三股螺旋結構。膠原和脯氨酰-羥化酶的共表達產生穩定羥基化的膠原，它在生物學上與體溫時的應用相關(Merle等人，2002)。
賴氨酰羥化酶(LH，EC 1.14.11.4)、半乳糖基轉移酶(EC2.4.1.50)和葡糖基轉移酶(EC 2.4.1.66)是在膠原翻譯后修飾中牽涉的酶。它們序貫地將特定位置中的賴氨酰殘基修飾為羥賴氨酰、半乳糖基羥賴氨酰和葡糖基半乳糖基羥賴氨酰殘基。這些結構是膠原特有的并且是其功能活性必需的(Wang等人，2002)。單獨的人的酶，賴氨酰羥化酶3(LH3)可以催化羥賴氨酸連接的碳水化合物形成中的所有3個連續步驟(Wang等人，2002)。
煙草中表達的人膠原的羥賴氨酸形成少于2％的在牛膠原中發現的羥賴氨酸(0.04％殘基/1.88％殘基)。這提示植物內源性的賴氨酰羥化酶不能充分地使膠原中的賴氨酸羥基化。
在將本發明變為實踐的同時，本發明人揭示了膠原鏈的有效羥基化依賴于膠原鏈連同能夠正確修飾這種多肽的酶的隔離。
發明概述根據本發明的一個方面，提供了在植物或被分離的植物細胞中生產膠原的方法，其包括在植物或被分離的植物細胞中，以能夠使至少一種類型的膠原α鏈和外源性P4H積聚在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中的方式，表達至少一種類型的膠原α鏈和外源性P4H，從而在植物中生產膠原。
根據本發明的一個另外的方面，提供了根據下文描述的本發明的優選實施方案中進一步的特征，該方法進一步包括在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中表達外源性LH3。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈缺乏ER靶向序列或保留序列。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈表達于包含DNA的植物細胞器中。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H表達于包含DNA的植物細胞器中。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈是α1鏈。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈是α2鏈。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈包括C-末端和/或N-末端前肽。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，植物選自煙草、玉米、苜蓿、稻、馬鈴薯、大豆、番茄、小麥、大麥、低芥酸菜子(Canola)和棉花。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈或外源性P4H只在植物的部分中表達。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，植物的部分是葉、種子、根、塊莖或莖。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H能夠使至少一種類型的膠原α鏈的Gly-X-Y三聯體的Y位置特異性羥基化。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H是人P4H。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，對植物實施應激條件。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，應激條件選自干旱、鹽度、損傷、寒冷和噴射應激誘導化合物。
根據本發明的另一方面，提供了基因修飾植物或被分離的植物細胞，其能夠積聚具有羥基化模式的膠原α鏈，所述羥基化模式與當膠原α鏈表達于人細胞中時產生的模式相同。
根據本發明的再一方面，提供了基因修飾植物或被分離的植物細胞，其能夠在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中積聚膠原α鏈。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，基因修飾植物進一步包括外源性P4H。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈缺乏ER靶向序列或保留序列。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，至少一種類型的膠原α鏈表達于包含DNA的植物細胞器中。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H表達于包含DNA的植物細胞器中。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，膠原α鏈是α1鏈。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，膠原α鏈是α2鏈。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，膠原α鏈包括C-末端和/或N-末端前肽。
根據本發明的再一方面，提供了植物系統，其包括能夠積聚膠原α1鏈的第一種基因修飾植物，和能夠積聚膠原α2鏈的第二種基因修飾植物。
根據本發明的再一方面，提供了植物系統，其包括能夠積聚膠原α1鏈和膠原α2鏈的第一種基因修飾植物，以及能夠積聚P4H的第二種基因修飾植物。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，第一種基因修飾植物和第二種基因修飾植物中的至少一種進一步包括外源性P4H。
根據本發明的再一方面，提供了生產纖維膠原的方法，其包括(a)在第一種植物中表達膠原α1鏈；(b)在第二種植物中表達膠原α2鏈；其中在第一種植物和第二種植物中的表達被這樣設置，從而使得膠原α1鏈和膠原α2鏈各自能夠在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中積聚；和(c)使第一種植物與第二種植物雜交，并選擇表達膠原α1鏈和膠原α2鏈的后代，從而生產纖維膠原。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，該方法進一步包括在第一種植物和第二種植物的每一種中表達外源性P4H。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，膠原α1鏈和膠原α2鏈中的每一種包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，膠原α1鏈和膠原α2鏈中的每一種缺乏ER靶向序列或保留序列。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，步驟(a)和(b)經由在包含DNA的植物細胞器中的表達來實現。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H表達于包含DNA的植物細胞器中。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，膠原α1鏈和膠原α2鏈中的每一種包括C-末端和/或N-末端前肽。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H能夠使至少一種類型的膠原α鏈的Gly-X-Y三聯體的Y位置特異性羥基化。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，外源性P4H是人P4H。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，對第一種植物和第二種植物實施應激條件。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，應激條件選自干旱、鹽度、損傷、重金屬毒性和寒冷應激。
根據本發明的再一方面，提供了生產纖維膠原的方法，其包括(a)在第一種植物中表達膠原α1鏈和膠原α2鏈，其中在第一種植物中的表達被這樣設置，從而使得膠原α1鏈和膠原α2鏈各自能夠在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中積聚；(b)在第二種植物中表達外源性P4H，其能夠在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中積聚；和(c)使第一種植物與第二種植物雜交，并選擇表達膠原α1鏈、膠原α2鏈和P4H的后代，從而生產纖維膠原。
根據本發明的再一方面，提供了核酸構建體，其包括置于在植物細胞中起作用的啟動子的轉錄控制下、編碼人P4H的多核苷酸。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，啟動子選自CaMV 35S啟動子、遍在蛋白啟動子、rbcS啟動子和SVBV啟動子。
根據本發明的再一方面，提供了基因修飾植物或被分離的植物細胞，其能夠表達膠原α1鏈、膠原α2鏈、P4H、LH3和蛋白酶C和/或蛋白酶N。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，膠原α1鏈和膠原α2鏈各自能夠在缺乏內源性植物P4H活性的亞細胞區室中積聚。
根據本發明的再一方面，提供了基因修飾植物或被分離的植物細胞，其能夠積聚具有溫度穩定性特征的膠原，所述溫度穩定性特征與哺乳動物膠原的特征相同。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，膠原是I型膠原。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，哺乳動物膠原是人膠原。
根據本發明的再一方面，提供了對于在植物中的表達進行最優化的膠原編碼序列。
根據所述優選實施方案中再進一步的特征，膠原編碼序列為由SEQ ID NO1所闡明的。
本發明通過提供能夠表達正確羥基化的膠原鏈成功地解決了目前已知構造的缺點，所述膠原鏈能夠裝配為具有與人膠原類似特性的膠原。
除非另外定義，本文所使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。盡管與本文所述那些相似或等同的方法和材料可以用于本發明的實踐或測試中，但下文還是描述了適當的方法和材料。在沖突的情況下，以本專利說明書包括定義為準。此外，材料、方法和實施例僅是舉例說明的，并不預期是限制性的。
附圖簡述本發明在此處僅通過例子參考附圖進行描述。現在特別詳細地參考附圖，要強調的是所顯示的細節通過例子來進行并且僅用于本發明優選實施方案的舉例說明性討論的目的，并且為了提供被認為是本發明的原理和概念方面最有用和易于理解的描述而呈現。在這點上，不試圖顯示比基本理解本發明所需細節更多的本發明的結構細節，附圖采用的描述使得本發明的幾種形式如何能夠在實踐中體現對于本領域技術人員是顯而易見的。
在附圖中


圖1a-d舉例說明了用于轉化測試植物的各種表達盒和載體的構建。作為本研究的部分合成的所有編碼序列對于煙草中的表達是最優化的。
圖2舉例說明了各種共轉化方法。每種表達盒由編碼序列的短名表示。編碼序列在表1中詳細說明。每個共轉化通過2個pBINPLUS二元載體來進行。每個長方形表示攜帶1、2或3個表達盒的單個pBINPLUS載體。啟動子和終止子在實施例1中詳細說明。
圖3是轉化體的多重PCR篩選，顯示出對于膠原α1鏈(324bp片段)或膠原α2鏈(537bp片段)或二者陽性的植物。
圖4是由共轉化2、3和4產生的轉基因植物的蛋白質印跡分析。從煙草共轉化體#2、#3和#4中提取總可溶性蛋白，并用抗-膠原I抗體(來自Chemicon Inc.的#AB745)進行檢測。大小標記是來自Fermentas Inc.的#SM0671。W.T.是野生型煙草。陽性膠原條帶在對于I型膠原α1或α2或二者為PCR陽性的植物中可見。來自人胎盤的500ng I型膠原(來自Chemicon Inc.的#CC050，通過胃蛋白酶消化從人胎盤中提取)的陽性對照條帶代表來自轉基因植物的樣品中的約0.3％總可溶性蛋白(約150μg)。如通過I型膠原抗體的抗羧基末端前肽(來自Chemicon Inc.的#MAB1913)所檢測的，在人膠原樣品中約140kDa的較大條帶是含有其C-前肽的前膠原。在人膠原樣品中約120kDa的較小條帶是不含前肽的膠原。由于其罕見的組成，富含脯氨酸的蛋白質(包括膠原)作為具有高于預期的分子量的條帶在聚丙烯酰胺凝膠上一致遷移。因此，分子量約95kDa、不含前肽的膠原鏈作為約120kDa的條帶遷移。
圖5是由共轉化#8(攜帶與膠原鏈翻譯地融合的質外體(appoplast)信號)產生的轉基因植物的蛋白質印跡分析。從轉基因煙草葉中提取總可溶性蛋白，并用抗-膠原I抗體(來自Chemicon Inc.的#AB745)進行檢測。陽性膠原α2條帶在植物8-141中可見。來自人胎盤的I型膠原(來自Chemicon Inc.的#CC050)充當對照。
圖6a-b舉例說明根據熱處理和胰蛋白酶或胃蛋白酶消化證實的膠原三股螺旋裝配和熱穩定性，在圖6a中-對來自煙草2-9(只表達膠原α1且不表達P4H)和3-5(表達膠原α1+2以及人P4Hα和β亞基)的總可溶性蛋白實施熱處理(38℃或43℃15分鐘)，隨后為胰蛋白酶消化(室溫20分鐘)，并用抗-膠原I抗體在蛋白質印跡方法中進行檢測。陽性對照是500ng人膠原I樣品+野生型煙草的總可溶性蛋白。在圖6b中-從轉基因煙草13-6(表達膠原Iα1和α2鏈-由箭標指出，人P4Hα和β亞基以及人LH3)提取總可溶性蛋白，并實施熱處理(33℃、38℃或42℃20分鐘)，立即在冰上冷卻以防止三股螺旋重新裝配，并于室溫(約22℃)與胃蛋白酶一起溫育30分鐘，隨后在標準蛋白質印跡方法中用抗-膠原I抗體(來自Chemicon Inc.的#AB745)進行檢測。陽性對照是～50ng人膠原I樣品(來自Chemicon Inc.的#CC050，通過胃蛋白酶消化從人胎盤中提取)，將其加到從野生型煙草中提取的總可溶性蛋白中。
圖7舉例說明了對野生型煙草進行的RNA印跡分析。印跡用煙草P4H cDNA進行探測。
圖8是由共轉化2、3和13產生的轉基因植物的蛋白質印跡分析。從煙草共轉化體提取總可溶性蛋白，并用抗人P4Hα和β以及抗膠原I抗體進行檢測。
優選實施方案的描述本發明是關于表達并積聚膠原的植物，所述植物可用于生產顯示哺乳動物膠原特征的膠原和膠原纖維。
參考附圖和附加的描述可以更好地理解本發明的原理和操作。
在詳細解釋本發明的至少一個實施方案之前，應當理解本發明在其應用方面不局限于下文描述中闡明或由實施例示例的細節。本發明能夠是其他實施方案、或以各種方式加以實踐或執行。同樣，應當理解本文所采用的措辭和術語是用于描述的目的且不應被視為限制。
生產膠原的植物是本領域已知的。盡管此類植物可以用于生產膠原鏈以及膠原，但此類鏈是不正確地羥基化的，并因此無論是在植物中還是不在植物中，其自身的裝配導致內在不穩定的膠原。
在將本發明變為實踐的同時，本發明人設計了植物表達方法，它確保膠原鏈的正確羥基化并因此使得能夠在植物中生產膠原，所述膠原緊密地模仿人I型膠原的特征(例如，溫度穩定性)。
因此，根據本發明的一個方面，提供了基因修飾植物，它能夠表達至少一種類型的膠原α鏈，并將其積聚在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中。
如本文所使用的，短語“基因修飾植物”指任何低等(例如蘚類)或高等(維管)植物或組織或其被分離的細胞(例如細胞懸浮液)，它用外源性多核苷酸序列穩定或瞬時轉化。植物的例子包括煙草、玉米、苜蓿、稻、馬鈴薯、大豆、番茄、小麥、大麥、低芥酸菜子、棉花、胡蘿卜以及低等植物例如蘚類。
如本文所使用的，短語“膠原鏈”指膠原亞基，例如膠原纖維的α1或2鏈，優選I型纖維。如本文所使用的，短語“膠原”指被裝配的膠原三聚體，在I型膠原的情況下它包括2個α1鏈和1個α2鏈。膠原纖維是缺乏末端前肽C和N的膠原。
如本文所使用的，短語“缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室”指細胞的任何被區室化的區域，它不包括植物P4H或具有植物樣P4H活性的酶。此類亞細胞區室的例子包括液泡、質外體和細胞質，以及細胞器例如葉綠體、線粒體等。
任何類型的膠原鏈都可以由本發明的基因修飾植物表達。例子包括形成原纖維的膠原(I、II、III、V和XI型)、形成網絡的膠原(IV、VIII和X型)、與原纖維表面結合的膠原(IX、XII和XIV型)、作為跨膜蛋白存在的膠原(XIII和XVII型)、或形成11nm周期性珠狀絲的膠原(VI型)。關于進一步的描述請參見Hulmes，2002。
優選地，表達的膠原鏈是I型膠原α1和/2鏈。表達的膠原α鏈可以由來源于任何哺乳動物的任何多核苷酸序列編碼。優選地，編碼膠原α鏈的序列是人的并且由SEQ ID NO1和4闡明。
一般地，在植物中表達的α膠原鏈可以包括或不包括其末端前肽(即前肽C和前肽N)。
Ruggiero等人(2000)指出前膠原經由植物蛋白水解活性的處理不同于在人中的正常處理，并且前肽C通過植物蛋白水解活性去除，盡管切割位點不明。前肽C的切割可以在三聚體裝配之前(3種C-前肽的結合是發動三聚體裝配所必需的)發生在前膠原肽上。
經由植物蛋白水解活性的N-前肽切割發生在成熟植物中而不發生在小植物中。此類切割去除來自N端肽的2個氨基酸(17個中的2個)。
C-前肽(以及較少程度上的N-前肽)在前膠原通過動物細胞的過程中保持前膠原可溶(Bulleid等人，2000)，并且預期在植物細胞中有類似作用。在前膠原分子分泌進入細胞外基質后或在這個過程中，通過前膠原N-和C-蛋白酶去除前肽，從而觸發膠原分子自發地自身裝配為原纖維(Hulmes，2002)。通過前膠原N-和C-蛋白酶去除前肽使前膠原的溶解性降低了＞10000倍，并且是發動膠原自身裝配成纖維所必需和充分的。對這個裝配過程關鍵的是在三股螺旋結構域末端被稱為端肽的短的非三股螺旋肽，它確保原纖維結構內的膠原分子的正確記錄，并降低自身裝配的臨界濃度(Bulleid等人，2000)。現有技術描述了在膠原生產過程中利用胃蛋白酶切割前肽(Bulleid等人2000)。然而胃蛋白酶破壞端肽，并且因此，胃蛋白酶提取的膠原不能形成有序的原纖維結構(Bulleid等人2000)。
形成人P4Hβ亞基的蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)顯示在三聚體裝配之前與C-前肽結合，因此在鏈的裝配過程中還充當分子侶伴(Ruggiero等人，2000)。在不同植物中表達的人前膠原I N-蛋白酶和前膠原C-蛋白酶的使用可以產生更類似于天然的人膠原的膠原，并且可以形成有序的原纖維結構。
在其中N或C前肽或二者包括在表達的膠原鏈中的情況下，本發明的基因修飾植物還可表達分別的蛋白酶(即，C或N或二者)。編碼此類蛋白酶的多核苷酸序列由SEQ ID NO18(蛋白酶C)和20(蛋白酶N)示例。此類蛋白酶可以被這樣表達，從而使得它們在與膠原鏈相同的亞細胞區室中積聚。
表達的膠原鏈在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中的積聚可以經由幾種方法中的任何一種來實現。
例如，表達的膠原鏈可以包括用于將表達的蛋白靶向亞細胞區室例如質外體或細胞器(例如葉綠體)的信號序列。適當的信號序列的例子包括葉綠體轉運肽(包括在Swiss-Prot的登錄號P07689中，氨基酸1-57)和線粒體轉運肽(包括在Swiss-Prot的登錄號P46643中，氨基酸1-28)。下文實施例部分提供了適當的信號序列的另外例子以及關于在植物細胞的膠原鏈表達中采用此類信號序列的指導方針。
可替代地，當在植物中表達時，膠原鏈的序列可以以改變膠原細胞定位的方式進行修飾。
如上文所提及的，植物的ER包括不能使膠原鏈正確羥基化的P4H。膠原α鏈天然地包括ER靶向序列，它指導表達的膠原進入ER，在其中它被翻譯后修飾(包括不正確的羥基化)。因此，ER靶向序列的去除將導致缺乏翻譯后修飾(包括任何羥基化)的膠原鏈的細胞質積聚。
下文實施例部分的實施例1描述了缺乏ER序列的膠原序列的生產。
再可替代地，膠原鏈可以被表達并積聚在包含DNA的細胞器例如葉綠體或線粒體中。葉綠體表達的進一步描述在下文中提供。
如上文所提及的，α鏈的羥基化是穩定的I型膠原裝配所必需的。因為通過本發明基因修飾植物表達的α鏈積聚在缺乏內源性P4H活性的區室內，所以必須從植物、植物組織或細胞中分離此類鏈并在體外進行羥基化。此類羥基化可以通過Turpeenniemi-Hujanen和Myllyla(Concomitant hydroxylation of proline and lysine residues in collagenusing purified enzymes in vitro.Biochim Biophys Acta.1984 Jul 16；800(l)59-65)所述方法實現。
盡管此類體外羥基化可以產生正確羥基化的膠原鏈，但它的實現是困難且代價高的。
為了克服體外羥基化的局限，本發明的基因修飾植物優選還共表達P4H，它能使膠原α鏈正確羥基化[即只在Gly-X-Y三聯體的脯氨酸(Y)位置上羥基化]。P4H是由2個亞基α和β組成的酶。二者都是形成活性酶所必需的，而β亞基還具有侶伴功能。
通過本發明的基因修飾植物表達的P4H優選是人P4H，它由例如SEQ ID NO12和14編碼。此外，還可使用顯示增強的底物特異性的P4H突變體或P4H同源物。
適當的P4H同源物由NCBI編號NP_179363鑒定的鼠耳芥屬(Arabidopsis)氧化還原酶示例。由本發明人進行的這種蛋白質序列和人P4Hα亞基的逐對比對揭示了任何已知的植物P4H同源物的功能結構域之間的最高同源性。
因為P4H需要與表達的膠原鏈共積聚，所以其編碼序列優選相應地進行修飾(加入信號序列、可能阻止ER靶向的缺失，等等)。
在哺乳動物細胞中，膠原還通過賴氨酰羥化酶、半乳糖基轉移酶和葡糖基轉移酶進行修飾。這些酶序貫地將特定位置的賴氨酰殘基修飾為羥賴氨酰、半乳糖基羥賴氨酰和葡糖基半乳糖基羥賴氨酰殘基。單獨的人的酶，賴氨酰羥化酶3(LH3)可以催化羥賴氨酸連接的碳水化合物形成中的所有3個連續步驟。
因此，本發明的基因修飾植物還優選表達哺乳動物LH3。編碼LH3的序列例如SEQ ID NO22所闡明的那些可以用于此類用途。
上文描述的膠原鏈和修飾酶可以由穩定整合或瞬時表達的核酸構建體進行表達，所述核酸構建體包括編碼α鏈和/或修飾酶(例如P4H和LH3)、置于植物功能啟動子的轉錄控制下的多核苷酸序列。此類核酸構建體(它在本文中也被稱為表達構建體)可以被設置為在遍及完整植物、限定的植物組織或限定的植物細胞、或在植物的限定發育階段進行表達。此類構建體還可包括選擇標記(例如抗生素抗性)、增強子元件和用于細菌復制的復制起點。
應當理解包括2種可表達的插入片段(例如2個α鏈類型、或α鏈和P4H)的構建體優選包括適合于每種插入片段的單獨啟動子，或可替代地，此類構建體可以表達包括來自單個啟動子的2個插入序列的單個轉錄物嵌合體。在這種情況下，嵌合轉錄物包括在2個插入序列之間的IRES序列，從而使得下游插入片段可以從那里被翻譯。
本發明的構建體可以采用眾多植物功能表達啟動子和增強子，它們可以是組織特異性、發育特異性、組成型或誘導型的，下文提供了一些例子。
如本說明書此處和隨后的權利要求部分所使用的，短語“植物啟動子”或“啟動子”包括可以指導植物細胞(包括包含DNA的細胞器)中的基因表達的啟動子。此類啟動子可以來源于植物、細菌、病毒、真菌或動物來源。此類啟動子可以是組成型的，即能夠指導在多個植物組織中的高水平基因表達，組織特異性的，即能夠指導在一種或多種特定植物組織中的基因表達，誘導型的，即能夠在刺激下指導基因表達，或嵌合的，即由至少2個不同的啟動子部分形成。
因此，所使用的植物啟動子可以是組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子或嵌合啟動子。
組成型植物啟動子的例子包括，但不限于，CaMV35S和CaMV19S啟動子、FMV34S啟動子、甘蔗桿狀病毒(sugarcane bacilliformbadnavirus)啟動子、CsVMV啟動子、鼠耳芥ACT2/ACT8肌動蛋白啟動子、鼠耳芥遍在蛋白UBQ1啟動子、大麥葉硫素BTH6啟動子和稻肌動蛋白啟動子。
組織特異性啟動子的例子包括，但不限于，豆菜豆蛋白貯存蛋白啟動子、DLEC啟動子、PHS啟動子、玉米醇溶蛋白貯存蛋白啟動子、來自大豆的羽扇豆球蛋白γ啟動子、AT2S1基因啟動子、來自鼠耳芥的ACT11肌動蛋白啟動子、來自歐洲油菜(Brassica napus)的napA啟動子和馬鈴薯patatin基因啟動子。
誘導型啟動子是由特異性的刺激例如應激條件(包括例如光、溫度、化學制劑、干旱、高鹽度、滲透壓休克)、氧化劑條件或在致病性的情況下誘導的啟動子，并且包括，但不限于，來源于豌豆rbcS基因的光誘導型啟動子，來自苜蓿rbcS基因的啟動子，在干旱時活化的啟動子DRE、MYC和MYB；在高鹽度和滲透壓應激下活化的啟動子INT、INPS、prxEa、Ha hsp17.7G4和RD21，以及在致病性應激下活化的啟動子hsr203J和str246C。
優選地，本發明使用的啟動子是強組成型啟動子，從而使得構建體插入片段的超表達在植物轉化后實現。
應當理解，本發明所使用的任何構建體類型都可以利用每種構建體類型中相同或不同的選擇標記共轉化到相同的植物中。可替代地，第一種構建體類型可以導入第一種植物中，而第二種構建體類型可以導入第二種等基因植物中，之后由此產生的轉基因植物可以進行雜交并選擇雙重轉化體的后代。此類后代的進一步自交可以用于產生2種構建體的純合系。
存在將核酸構建體導入單子葉植物和雙子葉植物的各種方法(Potrykus，I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42205-225；Shimamoto等人，Nature(1989)338274-276)。此類方法依賴于核酸構建體或其部分穩定整合到植物基因組中，或在其中這些序列不由植物后代遺傳的情況下依賴于核酸構建體的瞬時表達。
此外，存在可以將核酸構建體直接導入包含DNA的細胞器例如葉綠體的DNA中的幾種方法。
存在實現外源序列例如包括在本發明的核酸構建體內的那些穩定地基因組整合到植物基因組中的2種基本方法(i)土壤桿菌屬(Agrobaclerium)-介導的基因轉移Klee等人(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38467-486；Klee和Rogers，CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants，第6卷，MolecularBiology of Plant Nuclear Genes，eds.Schell，J.，和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第2-25頁；Gatenby，Plant Biotechnology，eds.Kung，S.和Arntzen，C.J.，ButterworthPublishers，Boston，Mass.(1989)第93-112頁。
(ii)DNA直接攝取Paszkowski等人，Cell Culture and SomaticCell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of Plant NuclearGenes eds.Schell，J.，和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第52-68頁；包括用于將DNA直接攝入原生質體中的方法，Toriyama，K.等人(1988)Bio/Technology 61072-1074。通過植物細胞短暫電休克誘導的DNA攝取Zhang等人Plant Cell Rep.(1988)7379-384.Fromm等人Nature(1986)319791-793。通過粒子轟擊，Klein等人Bio/Technology(1988)6559-563；McCabe等人Bio/Technology(1988)6923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79206-209；通過使用微量移液管系統，Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.(1987)7530-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79213-217；或通過將DNA與發芽的花粉直接溫育，DeWet等人Experimental Manipulation of Ovule Tissue，eds.Chapman，G.P.和Mantell，S.H.和Daniels，W.Longman，London，(1985)第197-209頁；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83715-719，將DNA注射到植物細胞或組織中。
土壤桿菌屬系統包括質粒載體的使用，所述質粒載體包含整合到植物基因組DNA中的限定的DNA片段。植物組織的接種方法依賴于植物物種和土壤桿菌屬送遞系統而變。廣泛使用的方法是葉盤法，它可以由任何組織外植體來進行，所述外植體提供用于發動整個植物分化的良好來源。Horsch等人Plant Molecular Biology Manual A5，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht(1988)第1-9頁。補充方法采用與真空滲透組合的土壤桿菌屬送遞系統。土壤桿菌屬系統在轉基因雙子葉植物的制備中尤其可行。
存在直接將DNA轉移到植物細胞中的各種方法。在電穿孔中，使原生質體短暫地暴露在強電場中。在顯微注射中，利用極小的微量移液管將DNA機械地直接注射到細胞中。在微粒轟擊中，DNA吸附在微粒例如硫酸鎂晶體、鎢顆粒或金顆粒上，并且微粒物理加速進入細胞或植物組織中。
轉化后進行植物繁殖。最常見的植物繁殖法是通過種子。然而通過種子繁殖的再生具有由于雜合性而在農作物中缺少一致性的缺陷，因為根據孟德爾定律決定的遺傳變異，種子通過植物產生。基本上，每個種子在遺傳上不同并且每個將伴隨其自身的特殊性狀生長。因此，優選被轉化的植物被這樣生產，從而使得再生的植物具有與親本轉基因植物相同的性狀和特征。因此，優選被轉化的植物通過微繁殖(micropropagation)進行再生，所述微繁殖提供被轉化植物的快速、一致的生殖。
可以用于瞬時表達包括在本發明的核酸構建體內的被分離核酸的瞬時表達法包括，但不限于，如上所述的顯微注射和轟擊，但在有利于瞬時表達的條件下，和病毒介導的表達，其中包括核酸構建體的被包裝或未包裝的重組病毒載體用于感染植物組織或細胞，從而使得其中確立的繁殖的重組病毒表達非病毒的核酸序列。
已顯示對于植物宿主轉化有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。利用植物病毒的植物轉化描述于美國專利號4,855,237(BGV)、EP-A67,553(TMV)、日本公開申請號63-14693(TMV)、EPA 194,809(BV)、EPA 278,667(BV)；和Gluzman，Y.等人，Communications in MolecularBiologyViral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，pp.172-189(1988)中。用于在多種宿主包括植物中表達外來DNA的假病毒顆粒描述于WO 87/06261中。
用于在植物中導入和表達非病毒性外源核酸序列的植物RNA病毒的構建由上述參考文獻以及Dawson，W.O.等人，Virology(1989)172285-292；Takamatsu等人EMBO J.(1987)6307-311；French等人Science(1986)2311294-1297；和Takamatsu等人FEBS Letters(1990)26973-76證實。
當病毒是DNA病毒時，可以對病毒自身進行構建。可替代地，病毒可以首先克隆到細菌質粒中以用于容易地構建含有外來DNA的所需病毒載體。病毒隨后可以從質粒中切除。如果病毒是DNA病毒，則可以將細菌的復制起點附著在病毒DNA上，所述病毒DNA隨后通過細菌進行復制。這種DNA的轉錄和翻譯將產生外殼蛋白，它將使病毒DNA殼體化。如果病毒是RNA病毒，則該病毒通常作為cDNA被克隆并插入質粒中。質粒隨后用于制備所有構建體。RNA病毒隨后通過轉錄質粒的病毒序列并翻譯病毒基因以產生使病毒RNA殼體化的外殼蛋白來產生。
用于在植物中導入和表達非病毒性外源核酸序列的植物RNA病毒的構建由上述參考文獻以及美國專利號5,316,931證實，所述外源核酸序列例如本發明構建體中包括的那些。
在一個實施方案中，提供了植物病毒性核酸，其中天然的外殼蛋白編碼序列已從病毒核酸中缺失，已插入非天然的植物病毒外殼蛋白的編碼序列和非天然的啟動子，優選非天然的外殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動子，其能夠在植物宿主中表達，包裝重組的植物病毒核酸，并確保通過重組的植物病毒核酸全身地感染宿主。可替代地，外殼蛋白基因可以通過在其中插入非天然的核酸序列來滅活，從而產生蛋白質。重組的植物病毒核酸可以包含一個或多個另外的非天然的亞基因組啟動子。每個非天然的亞基因組啟動子都能夠在植物宿主中轉錄或表達鄰近基因或核酸序列，并且不能互相重組以及與天然的亞基因組啟動子重組。如果包括超過一個的核酸序列，則插入的非天然(外來)核酸序列可以鄰近天然的植物病毒亞基因組啟動子、或鄰近天然的和非天然的植物病毒亞基因組啟動子。非天然的核酸序列在亞基因組啟動子控制下在宿主植物中被轉錄或表達，以生產所需產品。
在第二個實施方案中，提供的重組的植物病毒核酸與第一個實施方案中的一樣，只是除了將天然的外殼蛋白編碼序列置于鄰近一個非天然的外殼蛋白亞基因組啟動子而不是非天然的外殼蛋白編碼序列。
在第三個實施方案中，提供重組的植物病毒核酸，其中天然外殼蛋白的基因鄰近其亞基因組啟動子，且一個或多個非天然亞基因組啟動子已插入到病毒核酸中。插入的非天然的亞基因組啟動子能夠在植物宿主中轉錄或表達鄰近基因，并且不能互相重組及與天然的亞基因組啟動子重組。插入的非天然的核酸序列可以鄰近非天然的亞基因組植物病毒啟動子，從而使得所述序列在亞基因組啟動子控制下在宿主植物中被轉錄或表達，以生產所需產品。
在第四個實施方案中，提供的重組的植物病毒核酸與第三個實施方案中的一樣，只是除了天然的外殼蛋白編碼序列由非天然的外殼蛋白編碼序列替代。
病毒載體通過由重組的植物病毒核酸編碼的外殼蛋白進行殼體化，以生產重組的植物病毒。重組的植物病毒核酸或重組的植物病毒用于感染適當的宿主植物。重組的植物病毒核酸能夠在宿主中復制、在宿主中全身地擴散、并且在宿主中轉錄或表達外來基因(被分離的核酸)，以生產所需蛋白。
用于將外源核酸序列導入葉綠體基因組的技術是已知的。這種技術包括下列過程。首先，植物細胞被化學處理以便將每個細胞的葉綠體數目減少至約一個。隨后，外源核酸經由粒子轟擊導入細胞中以用于將至少一種外源核酸分子導入葉綠體中。選擇外源核酸從而使得它能夠經由同源重組整合到葉綠體基因組中，所述同源重組易于通過葉綠體固有的酶來實現。為此，外源核酸除了目的基因之外還包括至少一個核酸段，它來源于葉綠體基因組。此外，外源核酸包括選擇標記，它通過序貫選擇過程以用于確定所有或基本上所有的葉綠體基因組拷貝在此類選擇后將包括外源核酸。關于這種技術的進一步的細節在美國專利號4,945,050和5,693,507中找到，所述專利引入本文作為參考。因此多肽可以通過葉綠體的蛋白質表達系統來生產并且變得整合到葉綠體內膜中。
上述轉化方法可以用于在任何物種的植物、或植物組織或來源于那里的被分離的植物細胞中生產膠原鏈和/或修飾酶以及被裝配的膠原(含或不含前肽)。
優選的植物是能夠積聚大量本文描述的膠原鏈、膠原和/或加工酶的那些。還可根據其對應激條件的抗性和其中表達的組分或被裝配的膠原可以被提取的容易性來選擇此類植物。優選的植物的例子包括煙草、玉米、苜蓿、稻、馬鈴薯、大豆、番茄、小麥、大麥、低芥酸菜子和棉花。
膠原纖維廣泛地用于食物和化妝品工業中。因此，盡管由植物表達的膠原纖維組分(α鏈)和修飾酶在膠原的工業合成中找到功用，但由于其簡單性和成本效率，優選在植物中生產完整的膠原。
幾種方法可以用于在植物中生成I型膠原。例如可以從表達膠原α1和P4H(和任選的LH3)的植物中分離膠原α1鏈并且將其與膠原α2鏈混合，所述膠原α2鏈從表達膠原α2和P4H(和任選的LH3以及蛋白酶C和/或N)的植物中分離。因為膠原α1鏈自動地自身裝配為三股螺旋，所以在混合之前可能必須使此類同源三聚體變性，且與膠原α2鏈一起復性。
優選地，表達膠原α1和P4H(和任選的LH3以及蛋白酶C和/或N)的第一種植物可以與表達膠原α2的第二種(且優選等基因的)植物雜交，或可替代地，表達2種α鏈的第一種植物可以與表達P4H和任選的LH3以及蛋白酶C和/或N的第二種植物雜交。
應當指出盡管上述植物育種方法使用2種單獨轉化的植物，但使用3種或更多種單獨轉化的植物的方法也可采用，所述植物各自表達1種或2種組分。
本領域的普通技術人員知道各種植物育種技術并且因此本文不提供此類技術的進一步描述。
盡管植物育種方法是優選的，但應當指出表達膠原α1和2、P4H和LH3(和任選的蛋白酶C和/或N)的單個植物可以經由數個轉化事件產生，每個所述轉化事件被設計用于將再一個可表達的組分導入細胞中。在這種情況下，每個轉化事件的穩定性可以利用特異性的選擇標記進行驗證。
在任何情況下，轉化和植物育種方法都可以用于生成表達任何數目的組分的任何植物。目前優選的是表達膠原α1和2鏈、P4H、LH3和至少一種蛋白酶(例如蛋白酶C和/或N)的植物。如下文實施例部分將進一步描述的，此類植物積聚在最高達42℃的溫度下顯示出穩定性的膠原。
由育種產生的后代，或可替代地，多重轉化的植物可以通過使用核酸或蛋白質探針(例如抗體)證實外源mRNA和/或多肽的存在來選擇。后面的方法是優選的，因為它能夠定位所表達的多肽組分(通過例如，探測分級分離的植物提取物)，并因此同樣證實了用于正確加工和裝配的潛力。適當的探針的例子在下文實施例部分提供。
一旦表達膠原的后代被鑒別，此類植物就進一步在使膠原鏈以及修飾酶最大化表達的條件下進一步培育。
因為游離的脯氨酸積聚可以促進不同的富含脯氨酸的蛋白質的過度生產，所述蛋白質包括由本發明的基因修飾植物表達的膠原鏈，所以優選的培育條件是增加被培育植物中游離脯氨酸積聚的那些。
游離脯氨酸響應于廣泛的環境應激而在多種植物中積聚，所述環境應激包括剝奪、鹽化、低溫、高溫、病原體感染、重金屬毒性、無氧生活、養分缺乏、大氣污染和紫外線照射(Hare和Cress，1997)。
游離脯氨酸還可響應于經由化合物例如ABA，或應激誘導化合物例如銅鹽、百草枯(paraquate)、水楊酸等處理植物或土壤而積聚。
因此，表達膠原的后代可以在不同的應激條件(例如50mM-最高達250mM的不同的NaCl濃度)下生長。為了進一步增強膠原的生產，將檢查各種應激條件對膠原表達的作用，并關于植物生活力、生物量和膠原積聚進行最優化。
植物組織/細胞優選在成熟期進行收獲，并且利用眾所周知的現有技術的提取方法分離膠原纖維，下文描述了一種此類方法。
轉基因植物的葉子在液氮下被磨成粉末，并且于4℃在包含0.2MNaCl的0.5M乙酸中提取勻漿物60小時。通過離心去除不溶的材料。包含重組膠原的上清液在0.4M和0.7M NaCl下進行鹽分級分離。包含重組的異源三聚體膠原的0.7M NaCl沉淀物溶解于0.1M乙酸中并針對其進行透析，并儲存于-20℃(根據Ruggiero等人，2000)。
在檢查下列實施例后本發明的其他目的、優點和新型特征對于本領域的普通技術人員而言將是顯而易見的，所述實施例不預期是限制性的。另外，如上文所描繪的和下文權利要求部分所請求保護的本發明的各種實施方案和方面中的每一個在下列實施例中都能找到實驗支持。
實施例現在參考下列實施例，所述實施例與上述說明書一起以非限制性的方式舉例說明本發明。
一般地，本文所使用的術語和本發明中使用的實驗程序包括分子、生物化學、微生物學和重組DNA技術。此類技術在文獻中得到充分說明。參見，例如“Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook等人(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等人(eds)，“Genome AnalysisA Laboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；美國專利號4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所闡明的方法；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”，第I-III卷Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等人(eds)，“Basic and ClinicalImmunology”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫測定廣泛描述于專利和科學文獻中，參見，例如，美國專利號3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，Eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I，ed.(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCRProtocolsA Guide To Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies for ProteinPurification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有這些都如本文完全闡明的那樣引入本文作為參考。這個文件自始至終提供了其他的一般參考文獻。其中的程序被認為是本領域眾所周知的并且為了讀者的方便而提供。其中包含的所有信息都引入本文作為參考。
實施例1構建體和轉化方案
圖1a-d中舉例說明了在這項工作中使用的表達盒和載體的構建。這項工作中的所有編碼序列都對于在煙草中的表達進行最優化，并與所需側翼區(SEQ ID NO1、4、7、12、14、16、18、20、22)一起進行化學合成。
圖1a-編碼與液泡信號或質外體信號(由SEQ IDNO7編碼)融合的、或不含信號的Col1和Col2的合成基因(SEQ ID1、4)在由菊花rbcS1啟動子和5′UTR(SEQ ID NO10)以及菊花rbcS1 3′UTR和終止子(SEQ ID NO11)組成的表達盒中進行克隆。將完整的表達盒克隆到pBINPLUS植物轉化載體的多克隆位點中(van Engelen等人，1995，Transgenic Res 4288-290)。
圖1b-編碼與液泡信號或質外體信號(由SEQ ID NO7編碼)融合的、或不含信號的P4Hβ-人、P4Hα-人和P4H-植物(SEQ ID NO12、14和16)的合成基因在由載體pJD330攜帶的CaMV 35S啟動子和TMVω序列和土壤桿菌屬胭脂堿合成酶(NOS)終止子組成的表達盒中進行克隆(Galili等人，1987，Nucleic Acids Res 153257-3273)。將完整的表達盒克隆到攜帶Col1或Col2表達盒的pBINPLUS載體的多克隆位點中。
圖1c-編碼與液泡信號或質外體信號(由SEQ ID NO7編碼)融合的蛋白酶C和蛋白酶N(SEQ ID NO18、20)的合成基因在由菊花rbcS1啟動子和5′UTR(SEQ ID NO10)以及菊花rbcS13′UTR和終止子(SEQ ID NO11)組成的表達盒中進行克隆。將完整的表達盒克隆到pBINPLUS植物轉化載體的多克隆位點中。
圖1d-編碼與液泡信號或質外體信號(由SEQ ID NO7編碼)融合的、或不含信號的、具有側翼的草莓鑲脈病毒(SVBV)啟動子(NCBI編號AF331666REGION623..950版本AF331666.1GI13345788)并由土壤桿菌屬章魚堿(octopin)合酶(OCS)終止子(NCBI編號Z37515REGION1344..1538版本Z37515.1GI886843)終止的LH3的合成基因(SEQ ID NO22)在攜帶Col1和P4Hβ表達盒的pBINPLUS載體的多克隆位點中進行克隆。
在圖2中舉例說明了利用
圖1中描述的表達盒進入宿主植物的共轉化方案。每個表達盒插入片段由編碼序列的短名表示。編碼序列和相關的SEQ ID NO描述于表1中。每次共轉化由2個pBINPLUS二元載體來進行。每個長方形表示攜帶1、2或3個表達盒的單個pBINPLUS載體。啟動子和終止子在
圖1中詳細說明。
實施例2植物膠原表達下表1中列出的編碼蛋白質的合成的多核苷酸序列對于在煙草植物中的表達進行設計和最優化。
表1-表達的蛋白質的列表
信號肽(i)用于巰基蛋白酶aleurain前體(NCBI編號P05167GI113603)的大麥基因的液泡信號序列MAHARVLLLALAVLATAAVAVASSSSFADSNPIRPVTDRAASTLA(SEQ IDNO24)。
(ii)鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)內切-1，4-β-葡聚糖酶的質外體信號(Cell，NCBI編號CAA67156.1GI2440033)；SEQ ID NO.9，由SEQ ID NO.7編碼。
質粒的構建如實施例1所教導的構建植物表達載體，每種被構建的表達載體的組成經由限制酶切分析和測序進行確認。
構建包括下列表達盒的表達載體1.膠原α12.膠原α1+人P4Hβ亞基3.膠原α1+人P4Hβ亞基+人LH34.膠原α25.膠原α2+人P4Hα亞基6.膠原α2+鼠耳芥P4H7.人P4Hβ亞基+人LH38.人P4Hα亞基上述編碼序列中的每一種都與液泡轉運肽或質外體轉運肽翻譯地融合，或在其中預期細胞質積聚的情況下，缺乏任何轉運肽序列。
植物轉化和PCR篩選煙草植物(煙草(Nicotiana tabacum)，Samsun NN)根據圖2中教導的轉化方案由上述表達載體進行轉化。
所得的轉基因植物經由多重PCR利用4種引物進行篩選，所述引物被設計為能夠擴增膠原α1的324bp片段和膠原α2的537bp片段(表2)。圖3舉例說明了多重PCR篩選的結果。
表2-用于擴增膠原α1的324bp片段和膠原α2的537bp片段的多重PCR的引物列表
實施例3在轉基因煙草植物中的人膠原的檢測通過在0.5ml 50mM Tris-HCl pH＝7.5中與“完整的”蛋白酶抑制劑混合物(來自Roche Diagnostics GmbH的產品#1836145，1片劑/50ml緩沖液)一起磨碎500mg葉子，從煙草轉化體2、3和4中提取總可溶性蛋白。粗提取物與250μl包含10％β-巰基乙醇和8％SDS的4×樣品應用緩沖液混合，將樣品煮沸7分鐘并在13000rpm下離心8分鐘。將20μl上清液加載到10％聚丙烯酰胺凝膠中并在標準蛋白質印跡程序中用抗-膠原I(變性的)抗體(來自Chemicon Inc.的#AB745)進行測試(圖4)。W.T.是野生型煙草。在對于I型膠原α1或α2或二者PCR陽性的植物中可見陽性膠原條帶。來自人胎盤的500ng I型膠原(來自Chemicon Inc.的#CC050)的陽性對照條帶代表來自轉基因植物的樣品中的約0.3％總可溶性蛋白(約150μg)。
當膠原靶向液泡時，檢測到表達預期分子量的、最高達～1％總可溶性蛋白的膠原的植物(圖4)。成功地實現了全長膠原亞細胞靶向質外體(圖5)。在細胞質中表達膠原(即沒有靶向肽)的植物沒有將膠原積聚至可檢測的水平，從而顯示在植物中的膠原亞細胞靶向作用對于成功是關鍵的。
此外，與顯示對缺少N-前肽的膠原實施重要的蛋白質水解作用的Ruggiero等人2000和Merle等人2002研究相反，使用本方法，含有C-前肽和N-前肽的全長膠原蛋白質以高水平積聚在亞細胞區室中。
現在的數據還清晰地顯示各自表達不同膠原鏈類型的2種植物雜交是有利的，因為它使得能夠選擇表達最佳水平的每種鏈類型的植物和后續的植物雜交，以獲得所需生產膠原的植物。
由本發明的植物生產的膠原包括天然的前肽，并因此預期形成比通過蛋白質水解純化的人對照大的蛋白質。計算出的不含羥基化或糖基化的膠原α1和α2鏈分子量如下含有前肽的Col1-136kDa，不含前肽的Col1-95kDa、含有前肽的Col2-127kDa、不含前肽的Col2-92kDa。
如圖4中可見的，轉化體3-5和3-49中的Col1條帶看起來比其他植物中的Col1條帶大。這提示膠原鏈中通過由α和β亞基組成的人脯氨酸4-羥化酶全酶進行脯氨酸羥基化，所述α和β亞基在這些植物中共表達并靶向與人膠原鏈相同的亞細胞區室(例如液泡)。
實施例4在轉基因植物中的膠原三股螺旋裝配和熱穩定性通過轉基因植物的總粗蛋白提取物的熱變性、隨后為胰蛋白酶或胃蛋白酶消化，來測試在轉基因植物中的膠原三股螺旋的裝配和螺旋的熱穩定性(圖6a-b)。
在第一個實驗中，來自煙草2-9(只表達膠原α1，且不表達P4H)和3-5(表達膠原α1+2和P4H)的總可溶性蛋白通過下列操作提取在0.5ml 50mM Tris-HCl pH＝7.5中磨碎500mg葉子，在13000rpm下離心10分鐘，并收集上清液。對50μl上清液實施熱處理(于33℃或43℃15分鐘)，并隨后立即置于冰上。通過向每種樣品加入6μl溶于50mM Tris-HCl pH＝7.5的1mg/ml胰蛋白酶開始胰蛋白酶消化。樣品在室溫(約22℃)下溫育20分鐘。通過加入20μl包含10％β巰基乙醇和8％SDS的4×樣品應用緩沖液來終止消化，將樣品煮沸7分鐘并在13000rpm下離心7分鐘。將50μl上清液加載到10％聚丙烯酰胺凝膠上并利用標準蛋白質印跡程序經由抗-膠原I抗體(來自Chemicon Inc.的#AB745)進行測試。陽性對照是～500ng人膠原I樣品(來自Chemicon Inc.的#CC050，通過胃蛋白酶消化從人胎盤中提取)，將其加入從野生型煙草中提取的50μl總可溶性蛋白中。
如圖6a中所示，在植物#3-5中形成的膠原三股螺旋以及對照人膠原在33℃對變性有抗性。相反，由植物#2-9形成的膠原在33℃變性。這種熱穩定性方面的差異提示在轉化體#3-5中的成功的三股螺旋裝配和翻譯后的脯氨酸羥基化，所述轉化體#3-5表達膠原α1和膠原α2以及P4Hβ和α亞基。
轉化體#2-9中的2個條帶可以表示二聚體或三聚體，它們在與SDS和巰基乙醇一起煮沸7分鐘后是穩定的。類似的條帶在人膠原(上面的圖)和轉化體#3-5中可見。可能的解釋是不同三股螺旋中的2種肽之間的共價鍵(交聯)，所述共價鍵在2個賴氨酸通過賴氨酸氧化酶氧化脫氨后形成。
在第二個實驗中，來自轉基因煙草13-6(表達膠原Iα1和α2鏈-由箭標指出，人P4Hα和β亞基以及人LH3)的總可溶性蛋白通過下列操作提取在0.5ml 100mM Tris-HCl pH＝7.5和300mM NaCl中磨碎500mg葉子，在10000rpm下離心7分鐘，并收集上清液。對50μl上清液實施熱處理(于33℃、38℃或42℃20分鐘)，并隨后立即置于冰上。通過向每種樣品加入溶于10mM乙酸的4.5μl 0.1M HCl和4μl 2.5mg/ml胃蛋白酶開始胃蛋白酶消化。樣品在室溫(約22℃)下溫育30分鐘。通過加入5μl無緩沖的1M Tris來終止消化。每種樣品與22μl包含10％β巰基乙醇和8％SDS的4×樣品應用緩沖液混合，煮沸7分鐘并在13000rpm下離心7分鐘。將40μl上清液加載到10％聚丙烯酰胺凝膠上并在標準蛋白質印跡程序中用抗-膠原I抗體(來自Chemicon Inc.的#AB745)進行測試。陽性對照是加入從野生型煙草中提取的總可溶性蛋白中的～50ng人膠原I(來自Chemicon Inc.的#CC050，通過胃蛋白酶消化從人胎盤中提取)。
如圖6b中舉例說明的，在植物#13-6中形成的膠原三股螺旋在42℃對變性有抗性。前肽的切割首先在33℃可見，并且當溫度升至38℃并再升至42℃時效力逐漸增加。被切割的膠原三股螺旋結構域在凝膠上顯示出的遷移與胃蛋白酶處理的人膠原的遷移相似。在這個實驗中使用的人膠原通過胃蛋白酶的蛋白水解作用從人胎盤中提取出來，并且因此缺少前肽和某些端肽。
實施例5植物P4H表達天然的植物P4H的誘導煙草P4H cDNA被克隆并用作探針以測定將誘導內源性P4H表達的條件和處理。RNA印跡分析(圖7)清晰地顯示，P4H以相對高的水平表達于苗端并以低水平表達于葉中。P4H水平在磨損處理(在下面的圖中的“創傷”)后4小時在葉中被顯著誘導。利用其他應激條件達到類似結果(未顯示)。
轉基因煙草植物中入P4Hα和β亞基以及膠原α1和α2鏈的檢測使用抗人P4Hα亞基抗體(來自ICN Biomedicals Inc.的#63-163)、抗人P4Hβ亞基抗體(來自Chemicon Inc.的#MAB2701)和抗膠原I抗體(來自Chemicon Inc.的#AB745)實現轉基因煙草植物中人P4Hα和β亞基以及I型膠原α1和α2鏈的檢測。用這些抗體探測的蛋白質印跡結果顯示于圖8中。
在植物13-6(還轉化有人LH3)中確認P4Hα、P4Hβ和膠原Iα1和α2條帶的表達。計算出的包括液泡信號肽的P4Hα和β的分子量分別為65.5kDa和53.4kDa。計算出的含有前肽、不含羥基化或糖基化的膠原α1和α2鏈的分子量分別為136kDa和127kDa。
應當理解本發明的某些特征還可與單個實施方案組合提供，所述特征為了清晰起見在分開的實施方案的背景中進行描述。相反地，本發明的各種特征還可分開或以任何適當的亞組合提供，所述特征為了簡短起見在單個實施方案的背景中進行描述。
盡管本發明已結合其具體實施方案進行了描述，但明顯的是，多種替代方案、修飾和改變對于本領域技術人員將是顯而易見的。因此，它預期包含落在附加權利要求的精神和廣泛范圍內的所有此類替代方案、修飾和改變。本說明書中提到的所有公開出版物、專利和專利申請以及GenBank編號都整體引入本說明書作為參考，其程度相當于每個單獨的公開出版物、專利或專利申請或GenBank編號被具體地和單獨地說明引入本文作為參考。此外，本申請中的任何參考文獻的引用或鑒定不應被解釋為承認此類參考文獻可作為本發明的現有技術。
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序列表<110>CollPlant Ltd.
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<223>含有與人膠原α1(I)鏈融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列編碼區和側翼區的合成序列<400>1gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag60atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg120aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aaccatggct180cacgctcgtg ttctcctcct cgctctcgct gttttggcaa cagctgctgt ggctgtggct240tctagttctt cttttgctga ttcaaaccct attagacctg ttactgatag agcagcttcc300actttggctc aattgcaaga ggagggccag gttgagggcc aagatgagga tatccctcca360attacatgcg tgcaaaatgg cttgcgttac cacgataggg atgtgtggaa acctgaacct420tgtcgtatct gtgtgtgtga taacggcaag gtgctctgcg atgatgttat ctgcgatgag480acaaaaaatt gccctggcgc tgaagttcct gagggcgagt gttgccctgt gtgccctgat540ggttccgagt ccccaactga tcaggaaact actggcgtgg agggcccaaa aggagatact600ggtccacgtg gtcctagggg tccagcaggt cctccaggta gagatggtat tccaggccag660
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<223>與人膠原α1(I)鏈融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列和側翼區的合成序列<220>
<221>CDS<222>(175)..(4644)<400>2gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aacc atg 177Met1gct cac gct cgt gtt ctc ctc ctc gct ctc gct gtt ttg gca aca gct 225Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Ala5 10 15gct gtg gct gtg gct tct agt tct tct ttt gct gat tca aac cct att 273Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile20 25 30aga cct gtt act gat aga gca gct tcc act ttg gct caa ttg caa gag 321Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Gln Glu35 40 45gag ggc cag gtt gag ggc caa gat gag gat atc cct cca att aca tgc 369Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys50 55 60 65gtg caa aat ggc ttg cgt tac cac gat agg gat gtg tgg aaa cct gaa 417Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu
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595 600 605cct aaa ggt gct gct gga gag cca gga aag gca ggt gaa aga gga gtt2049Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val610 615 620 625cct ggt cca cca gga gca gtg ggt cct gct ggc aaa gat ggt gaa gct2097Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala630 635 640gga gca cag ggc cct cca ggc cct gct ggc cca gct ggc gaa cgt gga2145Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly645 650 655gaa caa ggc cca gct ggt agt cca gga ttt caa gga ttg cct ggc cct2193Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro660 665 670gct ggc cct cca gga gaa gca gga aaa cct gga gaa caa gga gtt cct2241Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro675 680 685ggt gat ttg gga gca cct gga cct tca gga gca cgt ggt gaa aga ggc2289Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly690 695 700 705ttc cct ggc gag agg ggt gtt caa ggt cca cca ggt cca gca gga cct2337Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro710 715 720aga ggt gct aat ggc gct cct ggc aac gat gga gca aaa ggt gat gct2385Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala725 730 735ggt gct cct ggc gca cct gga agt cag ggt gct cct gga ttg caa gga2433Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly740 745 750atg cct gga gag agg ggt gct gct ggc ttg cca ggc cca aag ggc gat2481Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp755 760 765agg ggt gat gct gga cca aaa ggt gct gat gga tcc cca gga aaa gat2529Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp
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950 955 960cca gga gct gat ggc cca gct ggt gct cca gga act cca ggc cct caa3105Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln965 970 975ggt att gct gga cag aga ggc gtt gtg gga ctc cct ggt caa agg gga3153Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly980 985 990gag aga gga ttt cca ggc ttg cca gga cct agt gga gaa cct gga aaa 3201Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys995 1000 1005caa ggc cca tca ggc gct agt gga gag cgt gga cct cct ggc cct 3246Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro1010 1015 1020atg gga cct cct gga ttg gct ggc cca cct ggc gaa tca ggt cgt 3291Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Arg1025 1030 1035gaa ggc gca cca ggc gca gaa gga tca cct gga aga gat gga tcc 3336Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly Ser1040 1045 1050cct ggt gct aaa ggc gat cgt gga gaa act ggt cca gca ggc cca 3381Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro1055 1060 1065cca ggc gca cca ggt gca cct ggc gct cca gga cct gtg gga cca 3426Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Pro1070 1075 1080gct gga aaa tcc gga gat agg ggc gag aca ggc cca gca gga cca 3471Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro1085 1090 1095gct gga cct gtt ggc cct gct ggc gct cgt gga cca gca gga cct 3516Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro1100 1105 1110caa gga cca agg gga gat aag gga gaa aca ggc gaa caa ggc gat 3561Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp
1115 1120 1125agg ggc att aag ggt cat agg ggt ttt agt ggc ctc cag ggt cct3606Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro1130 1135 1140cct ggc cca cct gga tca cca gga gaa cag gga cca tct ggt gct3651Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala1145 1150 1155tcc ggc cca gct ggt cca aga gga cct cca gga tca gct ggt gca3696Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala1160 1165 1170cct gga aaa gat ggt ctt aac ggt ctc cca gga cca atc ggc cct3741Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro1175 1180 1185cca gga cct aga gga aga aca gga gat gct ggc cct gtt ggc cct3786Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro1190 1195 1200cca gga cct cct ggt cca cca ggt cca cct ggt cct cca tca gct3831Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala1205 1210 1215gga ttc gat ttt tca ttt ctt cca cag cca cca caa gag aaa gct3876Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala1220 1225 1230cac gat ggc ggc aga tat tac cgt gct gat gat gct aac gtt gtt3921His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val1235 1240 1245agg gat aga gat ttg gaa gtg gat aca act ttg aaa tcc ctc tcc3966Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser1250 1255 1260cag caa att gaa aac att aga tct cca gaa ggt tca cgt aaa aac4011Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn1265 1270 1275cca gct aga aca tgt cgt gat ttg aaa atg tgt cac tcc gat tgg4056Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp Trp
1280 1285 1290aaa agt ggt gaa tac tgg att gat cca aat cag ggc tgt aat ctc4101Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn Leu1295 1300 1305gat gct atc aaa gtt ttc tgt aac atg gaa aca ggc gaa aca tgc4146Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys1310 1315 1320gtt tat cct act caa cct tcc gtg gct cag aaa aat tgg tac atc4191Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr Ile1325 1330 1335tca aaa aat cct aaa gat aag agg cac gtt tgg ttc ggt gaa agt4236Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser1340 1345 1350atg act gat gga ttt caa ttt gag tac ggc ggt caa ggt agt gat4281Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp1355 1360 1365cca gct gat gtg gct att caa ctc aca ttt ttg cgt ctt atg tcc4326Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser1370 1375 1380aca gag gca tca caa aac atc act tac cac tgc aaa aac agt gtg4371Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val1385 1390 1395gct tat atg gat caa caa aca gga aac ctt aag aag gct ctt ctt4416Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu1400 1405 1410ttg aag ggc tca aac gag att gag att aga gca gag ggc aac tca4461Leu Lys Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser1415 1420 1425agg ttt act tat tca gtt act gtt gat ggc tgc act tca cat act4506Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr1430 1435 1440ggc gct tgg ggt aaa aca gtt atc gag tat aag act aca aaa aca4551Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr
1445 1450 1455tca aga ctc cca atc att gat gtt gct cct ctc gat gtt ggc gct4596Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala1460 1465 1470cct gat caa gag ttc ggt ttt gat gtg ggc cca gtt tgt ttc ctc4641Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu1475 1480 1485taa tgagctcgcg gccgcatc 4662<210>3<211>1489<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>與人膠原α1(I)鏈融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列和側翼區的合成序列<400>3Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Gln35 40 45Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr50 55 60Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro65 70 75 80
Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp85 90 95Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro100 105 110Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr115 120 125Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro130 135 140Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro145 150 155 160Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly165 170 175Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr180 185 190Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val Pro Gly Pro Met Gly Pro195 200 205Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln210 215 220Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly225 230 235 240Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp245 250 255
Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro260 265 270Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly275 280 285Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp290 295 300Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn305 310 315 320Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly325 330 335Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala340 345 350Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro355 360 365Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly370 375 380Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro385 390 395 400Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp405 410 415Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly420 425 430
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Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala785 790 795 800Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly805 810 815Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro820 825 830Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro835 840 845Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly850 855 860Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn865 870 875 880Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro885 890 895Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly900 905 910Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys915 920 925Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro930 935 940Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly945 950 955 960
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Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly1460 1465 1470Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys Phe1475 1480 1485Leu<210>4<211>4362<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有與人膠原α2(I)鏈融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列編碼區和側翼區的合成序列<400>4gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag60atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg120aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aaccatggct180cacgctcgtg ttctcctcct cgctctcgct gttttggcaa cagctgctgt ggctgtggct240tcaagttcta gttttgctga ttccaaccca attcgtccag ttactgatag agcagcttcc300actttggctc aattgcttca agaagaaact gtgaggaagg gccctgctgg cgataggggc360cctaggggcg aaaggggtcc accaggacct ccaggcaggg atggcgaaga tggtccaact420ggccctcctg gacctcctgg ccctccaggg ccacccggct tgggcggaaa cttcgcagct480caatacgatg gcaagggtgt tggtcttggt cctggtccta tgggcttgat gggacctaga540ggcccacctg gtgctgctgg tgctcctgga ccacagggtt ttcagggacc agctggcgag600ccaggagagc caggccaaac aggaccagct ggtgcaaggg gacctgctgg acctcctgga660
aaagctggtg aagatggtca cccaggcaaa ccaggacgtc ctggcgaaag aggtgttgtt720ggaccacaag gcgctagggg atttccaggt acacctggat tgccaggttt taagggcatt780cgtggtcata acggcctcga tggattgaag ggacagcctg gcgcacctgg cgttaagggt840gaacctggag caccaggtga aaacggtact cctggccaga ctggtgcaag aggactccca900ggtgaaaggg gtagagttgg tgctcctgga cctgctggag ctaggggtag tgatggtagt960gttggtcctg tgggccctgc tggtccaatc ggttccgctg gcccacctgg attcccaggc1020gctccaggac ctaaaggaga aatcggtgct gtgggtaacg caggtcctac tggtccagca1080ggtcctcgtg gagaagtggg attgccagga ctttctggtc cagtgggccc tccaggcaac1140cctggagcta acggcttgac aggagctaaa ggcgcagcag gactccctgg agtggctggc1200gcaccaggat tgcctggtcc aaggggtatc ccaggccctg ttggcgcagc tggagctact1260ggtgcacgtg gacttgttgg cgaaccaggc cctgctggat caaaaggcga gtctggaaat1320aagggagaac ctggttctgc tggacctcaa ggtcctcctg gaccttctgg agaagaagga1380aaaaggggac caaatggcga ggctggatca gcaggtccac caggaccacc tggacttcgt1440ggatcccctg gtagtagagg acttccaggc gctgatggta gagcaggcgt tatgggacca1500ccaggaagta gaggagcatc cggtccagca ggagttaggg gtcctaacgg agatgctggt1560agaccaggtg aaccaggtct tatgggccca aggggcctcc caggtagtcc aggaaatatc1620ggccctgctg gaaaagaagg ccctgttgga cttccaggta ttgatggacg tcctggccct1680attggcccag caggtgcaag aggagaacct ggcaatattg gatttccagg accaaagggt1740ccaacaggcg atcctggaaa aaatggagat aagggtcatg ctggattggc aggcgcaagg1800ggcgctcctg gtccagatgg aaacaacggc gcacagggtc cacctggccc tcagggtgtt1860caaggcggaa aaggcgaaca aggcccagct ggaccaccag gctttcaagg cttgccagga1920ccaagtggtc cagcaggtga agttggcaag ccaggcgagc gtggacttca tggcgagttt1980
ggactccctg gaccagcagg accaaggggt gaaagaggcc ctcctggaga gagtggcgct2040gctggaccaa caggcccaat cggtagtaga ggtcctagtg gacctccagg cccagatgga2100aataagggtg aaccaggagt tgtgggcgct gttggaacag ctggtccttc aggaccatca2160ggactcccag gcgagagagg cgctgctggc attcctggag gaaaaggtga aaaaggcgaa2220cctggcctcc gtggcgaaat cggaaatcct ggacgtgatg gtgctcgtgg tgcacacggc2280gctgtgggcg ctccaggccc tgctggtgct actggtgata gaggagaggc tggcgcagct2340ggcccagcag gtcctgctgg cccaaggggt agtcctggtg aaagaggcga agttggacct2400gctggcccta acggctttgc tggccctgct ggagcagcag gtcaacctgg cgctaaaggt2460gaaaggggcg gaaagggccc aaaaggtgaa aatggcgttg tgggaccaac tggtccagtg2520ggcgcagctg gacctgctgg tccaaatgga ccaccaggac cagcaggtag tagaggagat2580ggtggacctc caggaatgac aggttttcca ggtgctgctg gtagaacagg acctcctggt2640cctagtggta tttctggtcc accaggacca ccaggtcctg ctggaaaaga aggattgagg2700ggtccacgtg gtgatcaagg accagtgggc agaactggtg aagttggcgc agtgggacca2760cctggttttg ctggagaaaa gggcccttct ggagaggcag gaacagctgg tcctcctggt2820acacctggac ctcaaggact tttgggtgca cctggtattc tcggattgcc aggaagtagg2880ggcgaacgtg gacttcctgg cgtggcagga gcagttggag aacctggccc tctcggaatc2940gcaggcccac caggcgcaag aggaccacca ggagctgttg gatcaccagg cgtgaatggt3000gcacctggcg aggctggtcg tgatggaaac ccaggaaatg atggcccacc aggaagagat3060ggtcaacctg gacacaaagg cgagaggggc tacccaggaa atattggccc agttggtgct3120gctggcgcac caggcccaca cggtccagtt ggaccagcag gaaaacacgg taatcgtggc3180gaaacaggcc cttcaggccc agtgggacct gctggtgctg ttggcccaag aggaccatct3240ggacctcaag gcattagagg cgataaggga gagcctggcg aaaaaggacc tagaggcttg3300
cctggtttta aaggacacaa cggtctccaa ggacttccag gtatcgctgg tcatcatgga3360gatcagggtg ctcctggatc agtgggtcca gcaggtccta gaggcccagc aggcccttcc3420ggtccagcag gaaaggatgg acgtactggc caccctggaa ctgtgggccc tgctggaatt3480agaggtcctc aaggtcatca gggccctgct ggccctccag gtccaccagg tcctccaggc3540ccaccaggag tttcaggtgg tggttacgat tttggttacg atggtgattt ttaccgtgct3600gatcaaccta gaagtgctcc ttctctccgt cctaaagatt atgaagttga tgctactttg3660aaatcactta acaaccagat tgagactctt ctcacacctg agggatcaag aaagaatcca3720gcacgtacat gccgtgatct cagacttagt cacccagagt ggtcaagtgg ctattattgg3780attgatccta atcagggttg tacaatggag gctatcaaag tttactgtga ttttccaact3840ggagagacat gtattagggc acaacctgag aacattccag ctaaaaattg gtatcgttcc3900tctaaagata agaaacatgt ttggctcgga gagactatta acgctggttc tcagttcgag3960tataatgttg agggcgttac ttctaaagag atggcaactc agctcgcttt tatgagattg4020ctcgctaact acgcatccca aaacatcact tatcactgca aaaattccat tgcatatatg4080gatgaggaga caggaaattt gaagaaagca gttattctcc aaggtagtaa cgatgttgag4140cttgtggctg agggaaatag tagattcact tacacagttt tggtggatgg atgctcaaag4200aaaactaatg agtggggcaa gacaatcatt gagtacaaga caaataagcc ttctaggctc4260ccatttctcg atattgcacc tcttgatatc ggaggagctg atcacgagtt ttttgttgat4320atcggacctg tttgttttaa gtaatgagct cgcggccgca tc 4362<210>5<211>4362<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>與人膠原α2(I)鏈融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列和側翼區的合成序列<220>
<221>CDS<222>(175)..(4344)<400>5gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aacc atg177Met1gct cac gct cgt gtt ctc crc ctc gct ctc gct gtt ttg gca aca gct225Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Ala5 10 15gct gtg gct gtg gct tca agt tct agt ttt gct gat tcc aac cca att273Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile20 25 30cgt cca gtt act gat aga gca gct tcc act ttg gct caa ttg ctt caa321Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Leu Gln35 40 45gaa gaa act gtg agg aag ggc cct gct ggc gat agg ggc cct agg ggc369Glu Glu Thr Val Arg Lys Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg Gly50 55 60 65gaa agg ggt cca cca gga cct cca ggc agg gat ggc gaa gat ggt cca417Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly Pro70 75 80act ggc cct cct gga cct cct ggc cct cca ggg cca ccc ggc ttg ggc465Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly85 90 95gga aac ttc gca gct caa tac gat ggc aag ggt gtt ggt ctt ggt cct513Gly Asn Phe Ala Ala Gln Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly Pro100 105 110
ggt cct atg ggc ttg atg gga cct aga ggc cca cct ggt gct gct ggt561Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly115 120 125gct cct gga cca cag ggt ttt cag gga cca gct ggc gag cca gga gag609Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Glu130 135 140 145cca ggc caa aca gga cca gct ggt gca agg gga cct gct gga cct cct657Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro150 155 160gga aaa gct ggt gaa gat ggt cac cca ggc aaa cca gga cgt cct ggc705Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly165 170 175gaa aga ggt gtt gtt gga cca caa ggc gct agg gga ttt cca ggt aca753Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr180 185 190cct gga ttg cca ggt ttt aag ggc att cgt ggt cat aac ggc ctc gat801Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu Asp195 200 205gga ttg aag gga cag cct ggc gca cct ggc gtt aag ggt gaa cct gga849Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro Gly210 215 220 225gca cca ggt gaa aac ggt act cct ggc cag act ggt gca aga gga ctc897Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly Leu230 235 240cca ggt gaa agg ggt aga gtt ggt gct cct gga cct gct gga gct agg945Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg245 250 255ggt agt gat ggt agt gtt ggt cct gtg ggc cct gct ggt cca atc ggt993Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly260 265 270tcc gct ggc cca cct gga ttc cca ggc gct cca gga cct aaa gga gaa 1041Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu275 280 285
atc ggt gct gtg ggt aac gca ggt cct act ggt cca gca ggt cct cgt1089Ile Gly Ala Val Gly Asn Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Arg290 295 300 305gga gaa gtg gga ttg cca gga ctt tct ggt cca gtg ggc cct cca ggc1137Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly310 315 320aac cct gga gct aac ggc ttg aca gga gct aaa ggc gca gca gga ctc1185Asn Pro Gly Ala Asn Gly Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Leu325 330 335cct gga gtg gct ggc gca cca gga ttg cct ggt cca agg ggt atc cca1233Pro Gly Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Ile Pro340 345 350ggc cct gtt ggc gca gct gga gct act ggt gca cgt gga ctt gtt ggc1281Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Leu Val Gly355 360 365gaa cca ggc cct gct gga tca aaa ggc gag tct gga aat aag gga gaa1329Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn Lys Gly Glu370 375 380 385cct ggt tct gct gga cct caa ggt cct cct gga cct tct gga gaa gaa1377Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Glu Glu390 395 400gga aaa agg gga cca aat ggc gag gct gga tca gca ggt cca cca gga1425Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly405 410 415cca cct gga ctt cgt gga tcc cct ggt agt aga gga ctt cca ggc gct1473Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly Ala420 425 430gat ggt aga gca ggc gtt atg gga cca cca gga agt aga gga gca tcc1521Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala Ser435 440 445ggt cca gca gga gtt agg ggt cct aac gga gat gct ggt aga cca ggt1569Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro Gly450 455 460 465
gaa cca ggt ctt atg ggc cca agg ggc ctc cca ggt agt cca gga aat1617Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Asn470 475 480atc ggc cct gct gga aaa gaa ggc cct gtt gga ctt cca ggt att gat1665Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile Asp485 490 495gga cgt cct ggc cct att ggc cca gca ggt gca aga gga gaa cct ggc1713Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly500 505 510aat att gga ttt cca gga cca aag ggt cca aca ggc gat cct gga aaa1761Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly Lys515 520 525aat gga gat aag ggt cat gct gga ttg gca ggc gca agg ggc gct cct1809Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro530 535 540 545ggt cca gat gga aac aac ggc gca cag ggt cca cct ggc cct cag ggt1857Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly550 555 560gtt caa ggc gga aaa ggc gaa caa ggc cca gct gga cca cca ggc ttt1905Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe565 570 575caa ggc ttg cca gga cca agt ggt cca gca ggt gaa gtt ggc aag cca1953Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys Pro580 585 590ggc gag cgt gga ctt cat ggc gag ttt gga ctc cct gga cca gca gga2001Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly595 600 605cca agg ggt gaa aga ggc cct cct gga gag agt ggc gct gct gga cca2049Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly Pro610 615 620 625aca gge cca atc ggt agt aga ggt cct agt gga cct cca ggc cca gat2097Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Asp630 635 640
gga aat aag ggt gaa cca gga gtt gtg ggc gct gtt gga aca gct ggt2145Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala Gly645 650 655cct tca gga cca tca gga ctc cca ggc gag aga ggc gct gct ggc att2193Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile660 665 670cct gga gga aaa ggt gaa aaa ggc gaa cct ggc ctc cgt ggc gaa atc2241Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu Ile675 680 685gga aat cct gga cgt gat ggt gct cgt ggt gca cac ggc gct gtg ggc2289Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly Ala His Gly Ala Val Gly690 695 700 705gct cca ggc cct gct ggt gct act ggt gat aga gga gag gct ggc gca2337Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly Ala710 715 720gct ggc cca gca ggt cct gct ggc cca agg ggt agt cct ggt gaa aga2385Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg725 730 735ggc gaa gtt gga cct gct ggc cct aac ggc ttt gct ggc cct gct gga2433Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala Gly740 745 750gca gca ggt caa cct ggc gct aaa ggt gaa agg ggc gga aag ggc cca2481Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Gly Lys Gly Pro755 760 765aaa ggt gaa aat ggc gtt gtg gga cca act ggt cca gtg ggc gca gct2529Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Ala Ala770 775 780 785gga cct gct ggt cca aat gga cca cca gga cca gca ggt agt aga gga2577Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly790 795 800gat ggt gga cct cca gga atg aca ggt ttt cca ggt gct gct ggt aga2625Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg805 810 815
aca gga cct cct ggt cct agt ggt att tct ggt cca cca gga cca cca2673Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro820 825 830ggt cct gct gga aaa gaa gga ttg agg ggt cca cgt ggt gat caa gga2721Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln Gly835 840 845cca gtg ggc aga act ggt gaa gtt ggc gca gtg gga cca cct ggt ttt2769Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly Phe850 855 860 865gct gga gaa aag ggc cct tct gga gag gca gga aca gct ggt cct cct2817Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala Gly Pro Pro870 875 880ggt aca cct gga cct caa gga ctt ttg ggt gca cct ggt att ctc gga2865Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly885 890 895ttg cca gga agt agg ggc gaa cgt gga ctt cct ggc gtg gca gga gca2913Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala900 905 910gtt gga gaa cct ggc cct ctc gga atc gca ggc cca cca ggc gca aga2961Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg915 920 925gga cca cca gga gct gtt gga tca cca ggc gtg aat ggt gca cct ggc3009Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro Gly Val Asn Gly Ala Pro Gly930 935 940 945gag gct ggt cgt gat gga aac cca gga aat gat ggc cca cca gga aga3057Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn Asp Gly Pro Pro Gly Arg950 955 960gat ggt caa cct gga cac aaa ggc gag agg ggc tac cca gga aat att3105Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gly Asn Ile965 970 975ggc cca gtt ggt gct gct ggc gca cca ggc cca cac ggt cca gtt gga3153Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro His Gly Pro Val Gly980 985 990
cca gca gga aaa cac ggt aat cgt ggc gaa aca ggc cct tca ggc cca 3201Pro Ala Gly Lys His Gly Asn Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly Pro995 1000 1005gtg gga cct gct ggt gct gtt ggc cca aga gga cca tct gga cct3246Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro1010 1015 1020caa ggc att aga ggc gat aag gga gag cct ggc gaa aaa gga cct3291Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Glu Lys Gly Pro1025 1030 1035aga ggc ttg cct ggt ttt aaa gga cac aac ggt ctc caa gga ctt3336Arg Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly Leu1040 1045 1050cca ggt atc gct ggt cat cat gga gat cag ggt gct cct gga tca3381Pro Gly Ile Ala Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly Ser1055 1060 1065gtg ggt cca gca ggt cct aga ggc cca gca ggc cct tcc ggt cca3426Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro1070 1075 1080gca gga aag gat gga cgt act ggc cac cct gga act gtg ggc cct3471Ala Gly Lys Asp Gly Arg Thr Gly His Pro Gly Thr Val Gly Pro1085 1090 1095gct gga att aga ggt cct caa ggt cat cag ggc cct gct ggc cct3516Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln Gly His Gln Gly Pro Ala Gly Pro1100 1105 1110cca ggt cca cca ggt cct cca ggc cca cca gga gtt tca ggt ggt3561Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly Gly1115 1120 1125ggt tac gat ttt ggt tac gat ggt gat ttt tac cgt gct gat caa3606Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp Gln1130 1135 1140cct aga agt gct cct tct ctc cgt cct aaa gat tat gaa gtt gat3651Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val Asp1145 1150 1155
gct act ttg aaa tca ctt aac aac cag att gag act ctt ctc aca3696Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu Thr1160 1165 1170cct gag gga tca aga aag aat cca gca cgt aca tgc cgt gat ctc3741Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu1175 1180 1185aga ctt agt cac cca gag tgg tca agt ggc tat tat tgg att gat3786Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ile Asp1190 1195 1200cct aat cag ggt tgt aca atg gag gct atc aaa gtt tac tgt gat3831Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Glu Ala Ile Lys Val Tyr Cys Asp1205 1210 1215ttt cca act gga gag aca tgt att agg gca caa cct gag aac att3876Phe Pro Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu Asn Ile1220 1225 1230cca gct aaa aat tgg tat cgt tcc tct aaa gat aag aaa cat gtt3921Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His Val1235 1240 1245tgg ctc gga gag act att aac gct ggt tct cag ttc gag tat aat3966Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr Asn1250 1255 1260gtt gag ggc gtt act tct aaa gag atg gca act cag ctc gct ttt4011Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala Phe1265 1270 1275atg aga ttg ctc gct aac tac gca tcc caa aac atc act tat cac4056Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His1280 1285 1290tgc aaa aat tcc att gca tat atg gat gag gag aca gga aat ttg4101Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Glu Glu Thr Gly Asn Leu1295 1300 1305aag aaa gca gtt att ctc caa ggt agt aac gat gtt gag ctt gtg4146Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Leu Val1310 1315 1320
gct gag gga aat agt aga ttc act tac aca gtt ttg gtg gat gga4191Ala Glu Gly Ash Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp Gly1325 1330 1335tgc tca aag aaa act aat gag tgg ggc aag aca atc att gag tac4236Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu Tyr1340 1345 1350aag aca aat aag cct tct agg ctc cca ttt ctc gat att gca cct4281Lys Thr Asn Lys Pro Set Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala Pro1355 1360 1365ctt gat atc gga gga gct gat cac gag ttt ttt gtt gat atc gga4326Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp His Glu Phe Phe Val Asp Ile Gly1370 1375 1380cct gtt tgt ttt aag taa tgagctcgcg gccgcatc 4362Pro Val Cys Phe Lys1385<210>6<211>1389<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有與人膠原α2(I)鏈融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列編碼區和側翼區的合成序列<400>6Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Set Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Set Thr Leu Ala Gln Leu Leu35 40 45
Gln Glu Glu Thr Val Arg Lys Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg50 55 60Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu85 90 95Gly Gly Asn Phe Ala Ala Gln Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly100 105 110Pro Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala115 120 125Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly130 135 140Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro145 150 155 160Pro Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro165 170 175Gly Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly180 185 190Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu195 200 205Asp Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro210 215 220
Gly Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly225 230 235 240Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala245 250 255Arg Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile260 265 270Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly275 280 285Glu Ile Gly Ala Val Gly Asn Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro290 295 300Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro305 310 315 320Gly Asn Pro Gly Ala Asn Gly Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly325 330 335Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Ile340 345 350Pro Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Leu Val355 360 365Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn Lys Gly370 375 380Glu Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Glu385 390 395 400
Glu Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly Pro Pro405 410 415Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly420 425 430Ala Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala435 440 445Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro450 455 460Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly465 470 475 480Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile485 490 495Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro500 505 510Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly515 520 525Lys Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala530 535 540Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln545 550 555 560Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly565 570 575
Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys580 585 590Pro Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala595 600 605Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly610 615 620Pro Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro625 630 635 640Asp Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala645 650 655Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly660 665 670Ile Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu675 680 685Ile Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly Ala His Gly Ala Val690 695 700Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly705 710 715 720Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu725 730 735Arg Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala740 745 750
Gly Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Gly Lys Gly755 760 765Pro Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Ala770 775 780Ala Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg785 790 795 800Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly805 810 815Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro Gly Pro820 825 830Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln835 840 845Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly850 855 860Phe Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala Gly Pro865 870 875 880Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu885 890 895Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly900 905 910Ala Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala915 920 925
Arg Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro Gly Val Asn Gly Ala Pro930 935 940Gly Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn Asp Gly Pro Pro Gly945 950 955 960Arg Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gly Asn965 970 975Ile Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro His Gly Pro Val980 985 990Gly Pro Ala Gly Lys His Gly Asn Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly995 1000 1005Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly1010 1015 1020Pro Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Glu Lys Gly1025 1030 1035Pro Arg Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly1040 1045 1050Leu Pro Gly Ile Ala Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly1055 1060 1065Ser Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly1070 1075 1080Pro Ala Gly Lys Asp Gly Arg Thr Gly His Pro Gly Thr Val Gly1085 1090 1095
Pro Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln Gly His Gln Gly Pro Ala Gly1100 1105 1110Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly1115 1120 1125Gly Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp1130 1135 1140Gln Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val1145 1150 1155Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu1160 1165 1170Thr Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp1175 1180 1185Leu Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ile1190 1195 1200Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Glu Ala Ile Lys Val Tyr Cys1205 1210 1215Asp Phe Pro Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu Asn1220 1225 1230Ile Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His1235 1240 1245Val Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr1250 1255 1260
Asn Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala1265 1270 1275Phe Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr1280 1285 1290His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Glu Glu Thr Gly Asn1295 1300 1305Leu Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Leu1310 1315 1320Val Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp1325 1330 1335Gly Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu1340 1345 1350Tyr Lys Thr Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala1355 1360 1365Pro Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp His Glu Phe Phe Val Asp Ile1370 1375 1380Gly Pro Val Cys Phe Lys1385<210>7<211>127<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有擬南芥內切-1，4-β-葡聚糖酶的質外體信號編碼區和側翼區的合成序列
<400>7gccatggcta ggaagtcttt gattttccca gtgattcttc ttgctgtgct tcttttctct60ccacctattt actctgctgg acacgattat agggatgctc ttaggaagtc atctatggct120caattgc 127<210>8<211>127<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擬南芥內切-1，4-β-葡聚糖酶的質外體信號和側翼區的合成序列<220>
<221>CDS<222>(10)..(120)<400>8gccatggct agg aag tct ttg att ttc cca gtg att ctt ctt gct gtg ctt51Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val Leu1 5 10ctt ttc tct cca cct att tac tct gct gga cac gat tat agg gat gct 99Leu Phe Ser Pro Pro Ile Tyr Ser Ala Gly His Asp Tyr Arg Asp Ala15 20 25 30ctt agg aag tca tct atg gct caattgc 127Leu Arg Lys Ser Ser Met Ala35<210>9<211>37<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>擬南芥內切-1，4-β-葡聚糖酶的質外體信號和側翼區的合成序列<400>9
Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val Leu Leu Phe1 5 10 15Ser Pro Pro Ile Tyr Ser Ala Gly His Asp Tyr Arg Asp Ala Leu Arg20 25 30Lys Ser Ser Met Ala35<210>10<211>1037<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>菊花rbcS1啟動子和5’UTR<400>10aaatggcgcg ccaagcttag acaaacaccc cttgttatac aaagaatttc gctttacaaa60atcaaattcg agaaaataat atatgcacta aataagatca ttcggatcca atctaaccaa120ttacgatacg ctttgggtac acttgatttt tgtttcagta gttacatata tcttgtttta180tatgctatct ttaaggatct tcactcaaag actatttgtt gatgttcttg atggggctcg240gaagatttga tatgatacac tctaatcttt aggagatacc agccaggatt atattcagta300agacaatcaa attttacgtg ttcaaactcg ttatcttttc atttaatgga tgagccagaa360tctctataga atgattgcaa tcgagaatat gttcggccga tatccctttg ttggcttcaa420tattctacat atcacacaag aatcgaccgt attgtaccct ctttccataa aggaacacac480agtatgcaga tgcttttttc ccacatgcag taacataggt attcaaaaat ggctaaaaga540agttggataa caaattgaca actatttcca tttctgttat ataaatttca caacacacaa600aagcccgtaa tcaagagtct gcccatgtac gaaataactt ctattatttg gtattgggcc660
taagcccagc tcagagtacg tgggggtacc acatatagga aggtaacaaa atactgcaag720atagccccat aacgtaccag cctctcctta ccacgaagag ataagatata agacccaccc780tgccacgtgt cacatcgtca tggtggttaa tgataaggga ttacatcctt ctatgtttgt840ggacatgatg catgtaatgt catgagccac atgatccaat ggccacagga acgtaagaat900gtagatagat ttgattttgt ccgttagata gcaaacaaca ttataaaagg tgtgtatcaa960tacgaactaa ttcactcatt ggattcatag aagtccattc ctcctaagta tctaaacata1020tgcaattgtc gactaaa 1037<210>11<211>975<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>菊花rbcS1 3’UTR和終止子<400>11aaaaggatcc gcggccgcat aagttttact atttaccaag acttttgaat attaaccttc60ttgtaacgag tcggttaaat ttgattgttt agggttttgt attatttttt tttggtcttt120taattcatca ctttaattcc ctaattgtct gttcatttcg ttgtttgttt ccggatcgat180aatgaaatgt aagagatatc atatataaat aataaattgt cgtttcatat ttgcaatctt240tttttacaaa cctttaatta attgtatgta tgacattttc ttcttgttat attaggggga300aataatgtta aataaaagta caaaataaac tacagtacat cgtactgaat aaattaccta360gccaaaaagt acacctttcc atatacttcc tacatgaagg cattttcaac attttcaaat420aaggaatgct acaaccgcat aataacatcc acaaattttt ttataaaata acatgtcaga480cagtgattga aagattttat tatagtttcg ttatcttctt ttctcattaa gcgaatcact540acctaacacg tcattttgtg aaatattttt tgaatgtttt tatatagttg tagcattcct600
cttttcaaat tagggtttgt ttgagatagc atttcagccg gttcatacaa cttaaaagca660tactctaatg ctggaaaaaa gactaaaaaa tcttgtaagt tagcgcagaa tattgaccca720aattatatac acacatgacc ccatatagag actaattaca cttttaacca ctaataatta780ttactgtatt ataacatcta ctaattaaac ttgtgagttt ttgctagaat tattatcata840tatactaaaa ggcaggaacg caaacattgc cccggtactg tagcaactac ggtagacgca900ttaattgtct atagtggacg cattaattaa ccaaaaccgc ctctttcccc ttcttcttga960agcttgagct ctttt 975<210>12<211>1633<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有與人脯氨酰4-羥化酶β亞基融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列編碼區和側翼區的合成序列<400>12ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact60gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg120actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tggatgctcc agaagaggag180gatcacgttc ttgtgcttag gaagtctaac ttcgctgaag ctcttgctgc tcacaagtac240cttcttgtgg agttttatgc tccttggtgc ggacattgca aagctcttgc tccagagtat300gctaaggctg ctggaaagtt gaaggctgag ggatctgaaa ttaggcttgc taaagtggat360gctactgagg agtctgatct tgctcaacag tacggagtta ggggataccc aactattaag420ttcttcagga acggagatac tgcttctcca aaggagtata ctgctggaag ggaggctgat480gatattgtga actggcttaa gaagagaact ggaccagctg ctactactct tccagatgga540gctgctgctg aatctcttgt ggagtcatct gaggtggcag tgattggatt cttcaaggat600
gtggagtctg attctgctaa gcagttcctt caagctgctg aggctattga tgatattcca660ttcggaatta cttctaactc tgatgtgttc tctaagtacc agcttgataa ggatggagtg720gtgcttttca agaaattcga tgagggaagg aacaatttcg agggagaggt gacaaaggag780aaccttcttg atttcattaa gcacaaccag cttccacttg tgattgagtt cactgagcag840actgctccaa agattttcgg aggagagatt aagactcaca ttcttctttt ccttccaaag900tctgtgtctg attacgatgg aaagttgtct aacttcaaga ctgctgctga gtctttcaag960ggaaagattc ttttcatttt cattgattct gatcacactg ataaccagag gattcttgag1020ttcttcggac ttaagaagga agagtgccca gctgttaggc ttattactct tgaggaggag1080atgactaagt acaagccaga gtctgaagaa cttactgctg agaggattac tgagttctgc1140cacagattcc ttgagggaaa gattaagcca caccttatgt ctcaagagct tccagaggat1200tgggataagc agccagttaa ggtgttggtg ggtaaaaact tcgaggatgt ggctttcgat1260gagaagaaga acgtgttcgt ggagttctac gcaccttggt gtggtcactg taagcagctt1320gctccaattt gggataagtt gggagagact tacaaggatc acgagaacat tgtgattgct1380aagatggatt ctactgctaa cgaggtggag gctgttaagg ttcactcttt cccaactttg1440aagttcttcc cagcttctgc tgataggact gtgattgatt acaacggaga aaggactctt1500gatggattca agaagttcct tgagtctgga ggacaagatg gagctggaga tgatgatgat1560cttgaggatt tggaagaagc tgaggagcca gatatggagg aggatgatga tcagaaggct1620gtgtgatgag ctc 1633<210>13<211>537<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有與人脯氨酰4-羥化酶β亞基融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列和側翼區的合成序列<400>13Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val35 40 45Asp Met Asp Ala Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys50 55 60Ser Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu65 70 75 80Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr85 90 95Ala Lys Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu100 105 110Ala Lys Val Asp Ala Thr Glu Glu Set Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly115 120 125Val Arg Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala130 135 140Set Pro Lys Glu Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn145 150 155 160
Trp Leu Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly165 170 175Ala Ala Ala Glu Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly180 185 190Phe Phe Lys Asp Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala195 200 205Ala Glu Ala Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp210 215 220Val Phe Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys225 230 235 240Lys Phe Asp Glu Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu245 250 255Asn Leu Leu Asp Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu260 265 270Phe Thr Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr275 280 285His Ile Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys290 295 300Leu Ser Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu305 310 315 320Phe Ile Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu325 330 335
Phe Phe Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr340 345 350Leu Glu Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr355 360 365Ala Glu Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile370 375 380Lys Pro His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln385 390 395 400Pro Val Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp405 410 415Glu Lys Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His420 425 430Cys Lys Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys435 440 445Asp His Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu450 455 460Val Glu Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro465 470 475 480Ala Ser Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu485 490 495Asp Gly Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly500 505 510
Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met515 520 525Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val530 535<210>14<211>1723<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有與人脯氨酰4-羥化酶α-1亞基融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列編碼區和側翼區的合成序列<400>14ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact60gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg120actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tgcacccagg attcttcact180tctattggac agatgactga tcttattcac actgagaagg atcttgtgac ttctcttaag240gattacatta aggctgagga ggataagttg gagcagatta agaagtgggc tgagaagttg300gataggctta cttctactgc tacaaaagat ccagagggat tcgttggtca tccagtgaac360gctttcaagt tgatgaagag gcttaacact gagtggagtg agcttgagaa ccttgtgctt420aaggatatgt ctgatggatt catttctaac cttactattc agaggcagta cttcccaaat480gatgaggatc aagtgggagc tgctaaggct cttcttaggc ttcaggatac ttacaacctt540gatactgata caatttctaa gggaaacctt ccaggagtta agcacaagtc tttccttact600gctgaggatt gcttcgagct tggaaaggtt gcatacactg aggctgatta ctaccacact660gagctttgga tggaacaagc tcttaggcaa cttgatgagg gagagatttc tactattgat720aaggtgtcag tgcttgatta cctttcttac gctgtgtacc agcagggtga tcttgataag780
gctcttttgc ttactaagaa gttgcttgag cttgatccag aacatcagag ggctaacgga840aaccttaagt acttcgagta cattatggct aaggaaaagg atgtgaacaa gtctgcttct900gatgatcagt ctgatcaaaa gactactcca aagaagaagg gagtggctgt tgattatctt960cctgagaggc agaagtatga gatgttgtgt aggggagagg gtattaagat gactccaagg1020aggcagaaga agttgttctg caggtatcac gatggaaaca ggaacccaaa gttcattctt1080gctccagcta agcaagaaga tgagtgggat aagccaagga ttattaggtt ccacgatatt1140atttctgatg ctgagattga gattgtgaag gatcttgcta agccaagact taggagggct1200actatttcta accctattac tggtgatctt gagactgtgc actacaggat ttctaagtct1260gcttggcttt ctggatacga gaacccagtg gtgtctagga ttaacatgag gattcaggat1320cttactggac ttgatgtgtc tactgctgag gagcttcaag ttgctaacta cggagttgga1380ggacaatatg agccacactt cgatttcgct aggaaggatg agccagatgc ttttaaggag1440cttggaactg gaaacaggat tgctacttgg cttttctaca tgtctgatgt ttctgctgga1500ggagctactg ttttcccaga agtgggagct tctgtttggc caaagaaggg aactgctgtg1560ttctggtaca accttttcgc ttctggagag ggagattact ctactaggca tgctgcttgc1620ccagttcttg ttggaaacaa gtgggtgtca aacaagtggc ttcatgagag gggacaagag1680tttagaaggc catgcactct ttctgagctt gagtgatgag ctc 1723<210>15<211>567<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有與人脯氨酰4-羥化酶α-1亞基融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列和側翼區的合成序列<400>15
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val35 40 45Asp Met His Pro Gly Phe Phe Thr Ser Ile Gly Gln Met Thr Asp Leu50 55 60Ile His Thr Glu Lys Asp Leu Val Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Ile Lys65 70 75 80Ala Glu Glu Asp Lys Leu Glu Gln Ile Lys Lys Trp Ala Glu Lys Leu85 90 95Asp Arg Leu Thr Ser Thr Ala Thr Lys Asp Pro Glu Gly Phe Val Gly100 105 110His Pro Val Asn Ala Phe Lys Leu Met Lys Arg Leu Asn Thr Glu Trp115 120 125Ser Glu Leu Glu Asn Leu Val Leu Lys Asp Met Ser Asp Gly Phe Ile130 135 140Ser Asn Leu Thr Ile Gln Arg Gln Tyr Phe Pro Asn Asp Glu Asp Gln145 150 155 160Val Gly Ala Ala Lys Ala Leu Leu Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Asn Leu165 170 175
Asp Thr Asp Thr Ile Ser Lys Gly Asn Leu Pro Gly Val Lys His Lys180 185 190Ser Phe Leu Thr Ala Glu Asp Cys Phe Glu Leu Gly Lys Val Ala Tyr195 200 205Thr Glu Ala Asp Tyr Tyr His Thr Glu Leu Trp Met Glu Gln Ala Leu210 215 220Arg Gln Leu Asp Glu Gly Glu Ile Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Val225 230 235 240Leu Asp Tyr Leu Ser Tyr Ala Val Tyr Gln Gln Gly Asp Leu Asp Lys245 250 255Ala Leu Leu Leu Thr Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Pro Glu His Gln260 265 270Arg Ala Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Phe Glu Tyr Ile Met Ala Lys Glu275 280 285Lys Asp Val Asn Lys Ser Ala Ser Asp Asp Gln Ser Asp Gln Lys Thr290 295 300Thr Pro Lys Lys Lys Gly Val Ala Val Asp Tyr Leu Pro Glu Arg Gln305 310 315 320Lys Tyr Glu Met Leu Cys Arg Gly Glu Gly Ile Lys Met Thr Pro Arg325 330 335Arg Gln Lys Lys Leu Phe Cys Arg Tyr His Asp Gly Asn Arg Asn Pro340 345 350
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<223>含有與植物脯氨酰4-羥化酶植物融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列和側翼區的合成序列<400>17Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val35 4 0 45Asp Met Leu Gly Ile Leu Ser Leu Pro Asn Ala Asn Arg Asn Ser Ser50 55 60Lys Thr Asn Asp Leu Thr Asn Ile Val Arg Lys Ser Glu Thr Ser Ser65 70 75 80Gly Asp Glu Glu Gly Asn Gly Glu Arg Trp Val Glu Val Ile Ser Trp
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805 810 815Asp Lys Ser Ile Phe Cys Arg Met Glu Val Leu Ser Arg Tyr Cys Ser820 825 830Ile Pro Gly Tyr Asn Lys Leu Ser Cys Lys Ser Cys Asn Leu Tyr Asn835 840 845Asn Leu Thr Asn Val Glu Gly Arg Ile Glu Pro Pro Pro Gly Lys His850 855 860Asn Asp Ile Asp Val Phe Met Pro Thr Leu Pro Val Pro Thr Val Ala865 870 875 880Met Glu Val Arg Pro Ser Pro Ser Thr Pro Leu Glu Val Pro Leu Asn885 890 895Ala Ser Ser Thr Asn Ala Thr Glu Asp His Pro Glu Thr Asn Ala Val900 905 910Asp Glu Pro Tyr Lys Ile His Gly Leu Glu Asp Glu Val Gln Pro Pro915 920 925Asn Leu Ile Pro Arg Arg Pro Ser Pro Tyr Glu Lys Thr Arg Asn Gln930 935 940Arg Ile Gln Glu Leu Ile Asp Glu Met Arg Lys Lys Glu Met Leu Gly945 950 955 960Lys Phe<210>22
<2ll>2888<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有與人賴氨酰羥化酶3融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列編碼區和側翼區的合成序列<400>22gcgaattcgc tagctatcac tgaaaagaca gcaagacaat ggtgtctcga tgcaccagaa60ccacatcttt gcagcagatg tgaagcagcc agagtggtcc acaagacgca ctcagaaaag120gcatcttcta ccgacacaga aaaagacaac cacagctcat catccaacat gtagactgtc180gttatgcgtc ggctgaagat aagactgacc ccaggccagc actaaagaag aaataatgca240agtggtccta gctccacttt agctttaata attatgtttc attattattc tctgcttttg300ctctctatat aaagagcttg tattttcatt tgaaggcaga ggcgaacaca cacacagaac360ctccctgctt acaaaccaga tcttaaacca tggctcacgc tagggttttg cttcttgctc420ttgctgttct tgctactgct gctgttgctg tggcttcttc aagttctttc gctgattcta480acccaattag gccagtgact gatagagctg cttctactct tgctcaattg agatctatgt540ctgatagacc aaggggaagg gatccagtta atccagagaa gttgcttgtg attactgtgg600ctactgctga gactgaagga taccttagat tccttaggag tgctgagttc ttcaactaca660ctgtgaggac tcttggactt ggagaagaat ggaggggagg agatgttgct agaactgttg720gaggaggaca gaaagtgaga tggcttaaga aagagatgga gaagtacgct gatagggagg780atatgattat tatgttcgtg gattcttacg atgtgattct tgctggatct ccaactgagc840ttttgaagaa attcgttcag tctggatcta ggcttctttt ctctgctgag tctttttgtt900ggccagaatg gggacttgct gagcaatatc cagaagtggg aactggaaag agattcctta960actctggagg attcattgga ttcgctacta ctattcacca gattgtgagg cagtggaagt1020acaaggatga cgatgatgat cagcttttct acactaggct ttaccttgat ccaggactta1080
gggagaagtt gtctcttaac cttgatcaca agtctaggat tttccagaac cttaacggtg1140ctcttgatga ggttgtgctt aagttcgata ggaacagagt gaggattagg aacgtggctt1200acgatactct tcctattgtg gtgcatggaa acggaccaac aaaactccag cttaactacc1260ttggaaacta cgttccaaac ggatggactc cagaaggagg atgtggattc tgcaatcagg1320ataggagaac tcttccagga ggacaaccac caccaagagt tttccttgct gtgttcgttg1380aacagccaac tccattcctt ccaagattcc ttcagaggct tcttcttttg gattacccac1440cagatagggt gacacttttc cttcacaaca acgaggtttt ccacgagcca cacattgctg1500attcttggcc acagcttcag gatcatttct ctgctgtgaa gttggttggt ccagaagaag1560ctctttctcc aggagaagct agggatatgg ctatggattt gtgcaggcag gatccagagt1620gcgagttcta cttctctctt gatgctgatg ctgtgcttac taaccttcag actcttagga1680ttcttattga ggagaacagg aaagtgattg ctccaatgct ttctaggcac ggaaagttgt1740ggtctaattt ctggggtgct ctttctcctg atgagtacta cgctagatca gaggactacg1800tggagcttgt tcagagaaag agagtgggag tttggaacgt tccttatatt tctcaggctt1860acgtgattag gggagatact cttaggatgg agcttccaca gagggatgtt ttctctggat1920ctgatactga tccagatatg gctttctgca agtctttcag ggataaggga attttccttc1980acctttctaa ccagcatgag ttcggaagat tgcttgctac ttcaagatac gatactgagc2040accttcatcc tgatctttgg cagattttcg ataacccagt ggattggaag gagcagtaca2100ttcacgagaa ctactctagg gctcttgaag gagaaggaat tgtggagcaa ccatgcccag2160atgtttactg gttcccactt ctttctgagc aaatgtgcga tgagcttgtt gctgagatgg2220agcattacgg acaatggagt ggaggtagac atgaggattc taggcttgct ggaggatacg2280agaacgttcc aactgtggat attcacatga agcaagtggg atacgaggat caatggcttc2340agcttcttag gacttatgtg ggaccaatga ctgagtctct tttcccagga taccacacta2400
aggctagggc tgttatgaac ttcgttgtga ggtatcgtcc agatgagcaa ccatctctta2460ggccacacca cgattcttct actttcactc ttaacgtggc tcttaaccac aagggacttg2520attatgaggg aggaggatgc cgtttcctta gatacgattg cgtgatttct tcaccaagaa2580agggatgggc tcttcttcat ccaggaaggc ttactcatta ccacgaggga cttccaacta2640cttggggaac tagatatatt atggtgtctt tcgtggatcc atgactgctt taatgagata2700tgcgagacgc ctatgatcgc atgatatttg ctttcaattc tgttgtgcac gttgtaaaaa2760acctgagcat gtgtagctca gatccttacc gccggtttcg gttcattcta atgaatatat2820cacccgttac tatcgtattt ttatgaataa tattctccgt tcaatttact gattgtccag2880aattcgcg 2888<210>23<211>764<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有與人賴氨酰羥化酶3融合的大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的維管信號序列和側翼區的合成序列<400>23Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Arg35 40 45Ser Met Ser Asp Arg Pro Arg Gly Arg Asp Pro Val Asn Pro Glu Lys
50 55 60Leu Leu Val Ile Thr Val Ala Thr Ala Glu Thr Glu Gly Tyr Leu Arg65 70 75 80Phe Leu Arg Ser Ala Glu Phe Phe Asn Tyr Thr Val Arg Thr Leu Gly85 90 95Leu Gly Glu Glu Trp Arg Gly Gly Asp Val Ala Arg Thr Val Gly Gly100 105 110Gly Gln Lys Val Arg Trp Leu Lys Lys Glu Met Glu Lys Tyr Ala Asp115 120 125Arg Glu Asp Met Ile Ile Met Phe Val Asp Ser Tyr Asp Val Ile Leu130 135 140Ala Gly Ser Pro Thr Glu Leu Leu Lys Lys Phe Val Gln Ser Gly Ser145 150 155 160Arg Leu Leu Phe Ser Ala Glu Ser Phe Cys Trp Pro Glu Trp Gly Leu165 170 175Ala Glu Gln Tyr Pro Glu Val Gly Thr Gly Lys Arg Phe Leu Asn Ser180 185 190Gly Gly Phe Ile Gly Phe Ala Thr Thr Ile His Gln Ile Val Arg Gln195 200 205Trp Lys Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Asp Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Leu210 215 220Tyr Leu Asp Pro Gly Leu Arg Glu Lys Leu Ser Leu Asn Leu Asp His
225 230 235 240Lys Ser Arg Ile Phe Gln Asn Leu Asn Gly Ala Leu Asp Glu Val Val245 250 255Leu Lys Phe Asp Arg Asn Arg Val Arg Ile Arg Asn Val Ala Tyr Asp260 265 270Thr Leu Pro Ile Val Val His Gly Asn Gly Pro Thr Lys Leu Gln Leu275 280 285Asn Tyr Leu Gly Asn Tyr Val Pro Asn Gly Trp Thr Pro Glu Gly Gly290 295 300Cys Gly Phe Cys Asn Gln Asp Arg Arg Thr Leu Pro Gly Gly Gln Pro305 310 315 320Pro Pro Arg Val Phe Leu Ala Val Phe Val Glu Gln Pro Thr Pro Phe325 330 335Leu Pro Arg Phe Leu Gln Arg Leu Leu Leu Leu Asp Tyr Pro Pro Asp340 345 350Arg Val Thr Leu Phe Leu His Asn Asn Glu Val Phe His Glu Pro His355 360 365Ile Ala Asp Ser Trp Pro Gln Leu Gln Asp His Phe Ser Ala Val Lys370 375 380Leu Val Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ser Pro Gly Glu Ala Arg Asp Met385 390 395 400Ala Met Asp Leu Cys Arg Gln Asp Pro Glu Cys Glu Phe Tyr Phe Ser
405 410 415Leu Asp Ala Asp Ala Val Leu Thr Asn Leu Gln Thr Leu Arg Ile Leu420 425 430Ile Glu Glu Asn Arg Lys Val Ile Ala Pro Met Leu Ser Arg His Gly435 440 445Lys Leu Trp Ser Asn Phe Trp Gly Ala Leu Ser Pro Asp Glu Tyr Tyr450 455 460Ala Arg Ser Glu Asp Tyr Val Glu Leu Val Gln Arg Lys Arg Val Gly465 470 475 480Val Trp Asn Val Pro Tyr Ile Ser Gln Ala Tyr Val Ile Arg Gly Asp485 490 495Thr Leu Arg Met Glu Leu Pro Gln Arg Asp Val Phe Ser Gly Ser Asp500 505 510Thr Asp Pro Asp Met Ala Phe Cys Lys Ser Phe Arg Asp Lys Gly Ile515 520 525Phe Leu His Leu Ser Asn Gln His Glu Phe Gly Arg Leu Leu Ala Thr530 535 540Ser Arg Tyr Asp Thr Glu His Leu His Pro Asp Leu Trp Gln Ile Phe545 550 555 560Asp Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Gln Tyr Ile His Glu Asn Tyr Ser565 570 575Arg Ala Leu Glu Gly Glu Gly Ile Val Glu Gln Pro Cys Pro Asp Val
580 585 590Tyr Trp Phe Pro Leu Leu Ser Glu Gln Met Cys Asp Glu Leu Val Ala595 600 605Glu Met Glu His Tyr Gly Gln Trp Ser Gly Gly Arg His Glu Asp Ser610 615 620Arg Leu Ala Gly Gly Tyr Glu Asn Val Pro Thr Val Asp Ile His Met625 630 635 640Lys Gln Val Gly Tyr Glu Asp Gln Trp Leu Gln Leu Leu Arg Thr Tyr645 650 655Val Gly Pro Met Thr Glu Ser Leu Phe Pro Gly Tyr His Thr Lys Ala660 665 670Arg Ala Val Met Asn Phe Val Val Arg Tyr Arg Pro Asp Glu Gln Pro675 680 685Ser Leu Arg Pro His His Asp Ser Ser Thr Phe Thr Leu Asn Val Ala690 695 700Leu Asn His Lys Gly Leu Asp Tyr Glu Gly Gly Gly Cys Arg Phe Leu705 710 715 720Arg Tyr Asp Cys Val Ile Ser Ser Pro Arg Lys Gly Trp Ala Leu Leu725 730 735His Pro Gly Arg Leu Thr His Tyr His Glu Gly Leu Pro Thr Thr Trp740 745 750Gly Thr Arg Tyr Ile Met Val Ser Phe Val Asp Pro
755 760<210>24<211>45<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>大麥巰基蛋白酶aleurain前體基因的液泡信號序列<400>24Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala35 40 45<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>25atcaccagga gaacagggac catc 24<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸
<400>26tccacttcca aatctctatc cctaacaac 29<210>27<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>27aggcattaga ggcgataagg gag 23<210>28<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈DNA寡核苷酸<400>28tcaatccaat aatagccact tgaccac 2權利要求
1.在植物或被分離的植物細胞中生產膠原的方法，其包括在所述植物或所述被分離的植物細胞中，以能夠使所述至少一種類型的所述膠原α鏈和所述外源性P4H積聚在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中的方式，表達至少一種類型的膠原α鏈和外源性P4H，從而在所述植物中生產膠原。
2.權利要求1的方法，其進一步包括在所述缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中表達外源性LH3。
3.權利要求1的方法，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
4.權利要求1的方法，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈缺乏ER靶向序列或保留序列。
5.權利要求1的方法，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈表達于包含DNA的植物細胞器中。
6.權利要求1的方法，其中所述外源性P4H包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
7.權利要求1的方法，其中所述外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
8.權利要求1的方法，其中所述外源性P4H表達于包含DNA的植物細胞器中。
9.權利要求1的方法，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈是α1鏈。
10.權利要求1的方法，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈是α2鏈。
11.權利要求1的方法，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈包括C-末端和/或N-末端前肽。
12.權利要求1的方法，其中所述植物選自煙草、玉米、苜蓿、稻、馬鈴薯、大豆、番茄、小麥、大麥、低芥酸菜子、胡蘿卜和棉花。
13.權利要求1的方法，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈或所述外源性P4H只表達于所述植物的部分中。
14.權利要求13的方法，其中所述植物的所述部分是葉、種子、根、塊莖或莖。
15.權利要求1的方法，其中所述外源性P4H能夠使所述至少一種類型的所述膠原α鏈的Gly-X-Y三聯體的Y位置特異性羥基化。
16.權利要求14的方法，其中所述外源性P4H是人P4H。
17.權利要求1的方法，其中對所述植物實施應激條件。
18.權利要求17的方法，其中所述應激條件選自干旱、鹽度、損傷、寒冷和噴射應激誘導化合物。
19.基因修飾植物或被分離的植物細胞，其能夠積聚具有羥基化模式的膠原α鏈，所述羥基化模式與當所述膠原α鏈表達于人細胞中時產生的模式相同。
20.基因修飾植物或被分離的植物細胞，其能夠在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中積聚膠原α鏈。
21.權利要求19或20的基因修飾植物，其進一步包括外源性P4H。
22.權利要求20的基因修飾植物，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
23.權利要求19或20的基因修飾植物，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈缺乏ER靶向序列或保留序列。
24.權利要求19或20的基因修飾植物，其中所述至少一種類型的所述膠原α鏈表達于包含DNA的植物細胞器中。
25.權利要求21的基因修飾植物，其中所述外源性P4H包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
26.權利要求21的基因修飾植物，其中所述外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
27.權利要求21的基因修飾植物，其中所述外源性P4H表達于包含DNA的植物細胞器中。
28.權利要求19或20的基因修飾植物，其中所述膠原α鏈是α1鏈。
29.權利要求19或20的基因修飾植物，其中所述膠原α鏈是α2鏈。
30.權利要求19或20的基因修飾植物，其中所述膠原α鏈包括C-末端和/或N-末端前肽。
31.植物系統，其包括能夠積聚膠原α1鏈的第一種基因修飾植物，和能夠積聚膠原α2鏈的第二種基因修飾植物。
32.權利要求31的植物系統，其中所述第一種基因修飾植物和所述第二種基因修飾植物中的至少一種進一步包括外源性P4H。
33.生產原纖維膠原的方法，其包括(a)在第一種植物中表達膠原α1鏈；(b)在第二種植物中表達膠原α2鏈，其中在所述第一種植物和所述第二種植物中的表達被這樣設置，從而使得所述膠原α1鏈和所述膠原α2鏈各自能夠在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中積聚；和(c)使所述第一種植物與所述第二種植物雜交，并選擇表達所述膠原α1鏈和所述膠原α2鏈的后代，從而生產原纖維膠原。
34.權利要求30的方法，其進一步包括在所述第一種植物和所述第二種植物的每一種中表達外源性P4H。
35.權利要求33的方法，其中所述膠原α1鏈和所述膠原α2鏈中的每一種包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
36.權利要求1的方法，其中所述膠原α1鏈和所述膠原α2鏈中的每一種缺乏ER靶向序列或保留序列。
37.權利要求1的方法，其中步驟(a)和(b)經由在包含DNA的植物細胞器中的表達來實現。
38.權利要求34的方法，其中所述外源性P4H包括用于靶向質外體或液泡的信號肽。
39.權利要求34的方法，其中所述外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
40.權利要求34的方法，其中所述外源性P4H表達于包含DNA的植物細胞器中。
41.權利要求1的方法，其中所述膠原α1鏈和所述膠原α2鏈中的每一種包括C-末端和/或N-末端前肽。
42.權利要求34的方法，其中所述外源性P4H能夠使所述至少一種類型的所述膠原α鏈的Gly-X-Y三聯體的Y位置特異性羥基化。
43.權利要求34的方法，其中所述外源性P4H是人P4H。
44.權利要求1的方法，其中對所述第一種植物與所述第二種植物實施應激條件。
45.權利要求44的方法，其中所述應激條件選自干旱、鹽度、損傷、重金屬毒性和寒冷應激。
46.生產原纖維膠原的方法，其包括(a)在第一種植物中表達膠原α1鏈和膠原α2鏈，其中在所述第一種植物中的表達被這樣設置，從而使得所述膠原α1鏈和所述膠原α2鏈各自能夠在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中積聚；(b)在第二種植物中表達能夠在所述缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中積聚的外源性P4H；和(c)使所述第一種植物與所述第二種植物雜交，并選擇表達所述膠原α1鏈、所述膠原α2鏈和所述P4H的后代，從而生產原纖維膠原。
47.核酸構建體，其包括置于在植物細胞中起作用的啟動子的轉錄控制下、編碼人P4H的多核苷酸。
48.權利要求47的核酸構建體，其中所述啟動子選自CaMV 35S啟動子、遍在蛋白啟動子、rbcS啟動子和SVBV啟動子。
49.基因修飾植物或被分離的植物細胞，其能夠表達膠原α1鏈、膠原α2鏈、P4H、LH3以及蛋白酶C和/或蛋白酶N。
50.權利要求49的基因修飾植物或被分離的植物細胞，其中所述膠原α1鏈和所述膠原α2鏈各自能夠在缺乏內源性植物P4H活性的亞細胞區室中積聚。
51.基因修飾植物或被分離的植物細胞，其能夠積聚具有溫度穩定性特征的膠原，所述特征與哺乳動物膠原的特征相同。
52.權利要求51的基因修飾植物或被分離的植物細胞，其中所述膠原是I型膠原。
53.權利要求51的基因修飾植物或被分離的植物細胞，其中所述哺乳動物膠原是人膠原。
全文摘要
提供了在植物中生產膠原的方法和生產膠原的植物。該方法通過以能夠使膠原α鏈積聚在缺乏內源性P4H活性的亞細胞區室中的方式，在植物中表達至少一種類型的膠原α鏈來實現，從而在植物中生產膠原。
文檔編號A01H5/00GK101065491SQ200580040821
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月28日 優先權日2004年9月29日
發明者O·肖塞約夫, H·斯泰恩 申請人:膠原植物有限公司