一種制備朊蛋白基因敲除家畜的方法

專利名稱：一種制備朊蛋白基因敲除家畜的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體地，本發明涉及一種制備朊蛋白基因敲除家畜的方法。
背景技術：
阮蛋白類疾病(prion diseases)，又叫傳染性海綿狀腦病(TransmissibleSpongiform Encephalopathies，TSE)，是一類致命的中樞神經系統退行性疾病。該疾病的主要特點是神經細胞的死亡、大腦空泡化以及伴隨的星型膠質細胞增生等，這些將導致運動障礙、癡呆，最終導致患病動物的死亡。為大家比較熟悉的阮蛋白類疾病主要有發生在綿羊和山羊上的羊搔癢病(scrapie)，發生在牛身上的牛海綿狀腦病(Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE，即俗稱的“瘋牛病”)，以及發生在人身上的庫魯氏病(Kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease，CJD)、Gerstmann-Straussler-Sheinker disease(GSS)、致死性失眠綜合癥(fatal familial insomnia，FFI)、新型克雅氏病(Variant Creutzfeldt-Jakobdisease，vCJD)等(Prusiner SBPrions.Proc Natl Acad Sci USA 1998，9513363-13383)。
現在已有很多證據表明，發生在牛身上的牛海綿狀腦病可以通過一定途徑傳染給人并在人身上引起一種新型的克雅氏病(vCJD)，由于阮蛋白類疾病至今仍然沒有有效的治療手段，該疾病到目前為止已經導致了一百多人的死亡(主要在英國)，進而在全球范圍內引起了巨大的心理恐慌，導致數百萬頭牛被屠宰后掩埋或焚燒處理，造成了巨大的經濟損失。
大量的證據表明阮蛋白類疾病的病原體(英文叫prion，在哺乳動物的TSE疾病中致病型prion也可以翻譯成阮病毒)僅由PrPSc組成，PrPSc是細胞內正常表達的朊蛋白(PrPC)的異構體(conformer)，該異構體富含β-折疊并具有抵抗蛋白酶消化的能力。PrPC是一個確切功能未知的由GPI(glycosylphosphatidylinositol)錨定在細胞膜上的糖蛋白(Prusiner SBNovelproteinaceous infectious particles cause scrapie.Science 1982，216136-144；Legname G，Baskakov IV，Nguyen HO，Riesner D，Cohen FE，DeArmond SJ，Prusiner SBSynthetic mammalian prions.Science 2004，305673-676)。根據Prusiner博士提出的TSE病原體只含有蛋白質“protein-only”的學說，當作為病原體的PrPSc進入體內后會引起PrPC轉變成PrPSc，從而使PrPSc得到增殖，該學說同時預測如果動物體內不表達PrPC，將使PrPSc在體內不能增殖，從而使該動物具有抵抗TSE病原體感染的能力。該學說已經被兩個獨立的朊蛋白基因敲除(Prnp-/-)小鼠品系所完全證實，兩個(Prnp-/-)小鼠品系不僅具有抵抗TSE病原體感染的能力還都能正常發育和繁殖后代(Bueler H，Fischer M，Lang Y，Bluethmann H，Lipp HP，DeArmond SJ，Prusiner SB，Aguet M，Weissmann CNormal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrPprotein.Nature 1992，356577-582)。
羊搔癢病是一種在綿羊或山羊身上自發產生同時可以在羊群之間互相傳染的阮蛋白類疾病，也是第一種通過人工接種方法成功傳播給嚙齒類動物的阮蛋白類疾病，因而羊搔癢病常被用作TSE疾病研究的原型(Chandler R LEncephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.Lancet 1961，11378-1379)。雖然在小鼠中敲除其朊蛋白基因不會對敲除小鼠本身造成明顯的有害影響，但是并沒有證據表明在綿羊或山羊中敲除其朊蛋白基因也會有相同的表型。此外，PRNP基因單基因敲除和雙基因敲除綿羊或山羊的獲得將有利于開展PrPC確切生理功能的研究，也對阮蛋白類疾病的發病機理的研究極有價值。最后，PRNP基因雙敲除奶山羊的獲得將在生物藥業方面有直接的應用，因為根據“protein-only”學說，PRNP基因雙敲除山羊將具有抵抗TSE疾病病原體感染的能力，利用這些動物作為生物反應器生產出來的藥用蛋白將比較容易被消費者接受。
由于小鼠ES細胞的成功建立，基因打靶已經成為精確改造小鼠基因組的常規手段。盡管經過巨大的努力，具有生殖系統發育潛能的任何家畜的ES細胞到目前為止都沒有建成，這使得精確改造家畜基因組在相當長的一段時間內都困難重重。近年來，隨著動物克隆技術的快速發展，已經可以通過核移植經傳染的胎兒成纖維細胞來制備轉基因動物并且整個過程與ES細胞基因打靶非常相似(Schnieke AE，Kind AJ，Ritchie WA，Mycock K，Scott AR，Ritchie M，Wilmut I，Colman A，Campbell KHHuman factor IX transgenic sheep producedby transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts.Science 1997，2782130-2133)。終于，在2000年McCreath等人報道了一個里程碑意義的研究結果，他們通過綿羊的胎兒成纖維細胞的基因打靶成功的將含有人的α1抗胰蛋白酶基因的乳腺特異表達框架插入到綿羊的COLlAl(α1(I)procollagen)位點(McCreath KJ等，Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer fromcultured somatic cells.Nature 2000，4051066-1069.)。此后，通過類似的技術路線又有數個實驗室成功的敲除了豬和綿羊的α(1，3)galactosyltransferase基因(Dai Y，等，Targeted disruption of the alpha 1，3-galactosyltransferase gene incloned pigs.Nat Biotechnol 2002，20251-255；Lai L，等，Production of alpha-1，3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning.Science 2002，2951089-1092)。
迄今為止，現有技術中還沒有PRNP基因單等位基因或雙等位基因敲除山羊的報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種制備朊蛋白基因敲除家畜的方法。
在本發明的第一方面，提供了一種制備朊蛋白基因敲除家畜的方法包括以下步驟(a)通過基因打靶將一構建物定點引入家畜胎兒成纖維細胞，所述的構建物含有兩個作為同源重組同源臂的朊蛋白基因片段和至少一個選擇性標記基因片段；(b)篩選得到朊蛋白基因被敲除的家畜胎兒成纖維細胞；(c)將步驟(b)獲得的家畜胎兒成纖維細胞作為核供體，制備朊蛋白基因敲除的家畜。
在另一優選例中，所述的朊蛋白單等位基因敲除的家畜的制備方法包括如下步驟(1)構建一種能通過同源重組敲除朊蛋白基因的DNA打靶載體；(2)將構建好的DNA打靶載體轉染入家畜的細胞；(3)對轉染的細胞進行藥物篩選，獲得藥物抗性細胞克隆；(4)對獲得的藥物抗性細胞克隆進行鑒定，挑選出同源重組的細胞克隆；(5)將同源重組的細胞克隆細胞移植到去核的家畜卵母細胞中形成重構胚；(6)培養該重構胚發育到桑椹或囊胚期；(7)將發育到桑椹或囊胚期的重構胚移植到同步發情的受體家畜子宮內；(8)妊娠，分娩產生朊蛋白單等基因敲除的家畜。
在另一優選例中，還包括步驟(d)利用已獲得的朊蛋白單等位基因敲除的家畜進行繁殖，獲得朊蛋白雙等位基因敲除的家畜。
在另一優選例中，還包括步驟(d)利用朊蛋白基因被敲除的家畜胎兒成纖維細胞進行朊蛋白第二個等位基因的打靶，獲得朊蛋白雙等位基因敲除的家畜胎兒成纖維細胞細胞，再利用該細胞進行動物克隆，獲得朊蛋白雙等位基因敲除的家畜。
在另一優選例中，所述的標記基因為抗性基因。
在另一優選例中，所述的標記基因選自下組新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因。
在另一優選例中，所述的標記基因選自下組新霉素抗性基因(neomycin)、潮霉素抗性基因(hygromycin)、嘌呤霉素抗性基因(puromycin)。
在另一優選例中，在5’同源臂序列的上游或3’同源臂序列的下游還含有負篩選標記基因。
在另一優選例中，所述的家畜為牛、綿羊、山羊、兔、豬。
在另一個優選例中，所述的動物為山羊。
在另一個優選例中，各同源臂序列的長度為1-20kb。
在本發明的第二方面，提供一種朊蛋白基因敲除的組織或細胞，所述組織或細胞來自采用所述的方法制備的朊蛋白基因敲除的家畜。
在本發明的第三方面，提供一種制備家畜成纖維細胞的方法，所述的家畜成纖維細胞的朊蛋白基因被敲除，該方法包括步驟(a)通過基因打靶將一構建物定點引入家畜胎兒成纖維細胞，所述的構建物含有兩個作為同源重組同源臂的朊蛋白基因片段和至少一個選擇性標記基因片段；
(b)篩選得到朊蛋白基因被敲除的家畜胎兒成纖維細胞。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1.山羊野生型PRNP基因、GTPrP打靶載體和中靶后的PRNP基因示意圖。在野生型PRNP基因示意圖中標明了該基因的三個外顯子，用黑色框代表。在中靶后的PRNP基因示意圖中同時標明了用于PCR鑒定的引物和Southern雜交的探針。該示意圖同時注明了用不同限制性內切酶消化后進行Southern雜交的預期DNA條帶大小。限制性內切酶位點Bg代表BglI；Xb代表XbaI；Sc代表ScaI；Ba代表BamHI；Sa代表SalI。
圖2.G418藥物抗性細胞克隆的PCR分析。在每個泳道上方標明了細胞克隆的編號，(a)，(b)，(c)使用的引物分別是P1/P4，P1/P2和P3/P5。具體的引物位置參見圖1。(d)P1/P4引物的PCR產物的Southern雜交分析，所用探針是1.9kb打靶載體的5’同源臂。
圖3.PCR陽性細胞克隆GTPrP74的Southern雜交分析。使用的探針分別是1.9kb打靶載體的5’同源臂(a)和1.1kb新霉素抗性基因片段(b)。限制性內切酶位點Bg代表BglI；Xb代表XbaI；Sc代表ScaI；Ba代表BamHI。
圖4.克隆山羊的基因組DNA分析。(a)PCR分析，使用的引物是P1/P4。(b)Southern雜交分析，基因組DNA經BglI或XbaI消化后用1.9kb打靶載體的5’同源臂作為探針進行雜交。(c)五只健康存活的PRNP單等位基因敲除(PRNP+/-)山羊(45B，50A，50B，8A，14A)。
圖5.PRNP+/-46A克隆山羊的朊蛋白表達水平的Western blot檢測。使用野生型(WT)小羊和PRNP+/-46A羊的腦勻漿進行檢測，所用的朊蛋白PrPC抗體是小鼠單克隆抗體，同時還使用了肌動蛋白(actin)的抗體作為對照以保證每個電泳道的蛋白總量相等。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，發現可將家畜的朊蛋白基因在細胞水平上敲除，然后通過體細胞克隆的方法制備朊蛋白基因敲除的家畜，獲得的家畜朊蛋白基因功能失活，不表達功能性的朊蛋白，從而可賦予家畜抵抗朊蛋白類相關疾病的能力。基于此完成了本發明。
簡而言之，本發明的技術路線是，通過基因敲除的方法，將特定的打靶構建物轉染家畜胎兒成纖維細胞，定點敲除朊蛋白特異位點序列，建立朊蛋白基因被敲除細胞系。利用核移植技術，獲得朊蛋白敲除的轉基因克隆家畜。
本發明的基因打靶的構建物從5’→3’依次含有以下元件5’同源臂序列、選擇性標記基因、和3’同源臂序列。各元件的作用如下5’同源臂序列和3’同源臂序列用于將位于其間的序列通過同源重組整合入染色體；選擇性標記基因用于篩選發生重組的轉化子。產生重組的轉化子因含有標記基因而被選出。
在優選例中，所述構建物在5’同源臂序列的上游或3’同源臂序列的下游還含有負篩選標記基因，其作用是排除非同源重組型的轉化子。發生同源重組時，位于同源臂外側的負篩選標記基因將不會整合入染色體；而發生非同源的重組時，位于同源臂外側的負篩選標記基因將會整合入染色體。通過篩選不含負篩選標記基因的轉化子，就獲得了發生預定的定點同源重組的轉化子。可用于本發明的負篩選標記基因包括(但并不限于)自殺基因，如胸苷激酶(TK)基因等。
更具體的，本發明的主要技術路線如下1.從家畜的組織中提取基因組DNA。首先從妊娠35-45天的胎兒分離細胞，同時利用該胎兒的組織進行基因組DNA的提取。
2.從該基因組DNA中克隆出朊蛋白基因(PRNP)。方法一利用提取得到的基因組DNA進行基因組文庫的建立，利用已知序列動物的朊蛋白基因設計雜交探針，得到朊蛋白基因。方法二直接利用提取得到的基因組DNA進行朊蛋白基因的PCR克隆。
3.構建一種能通過同源重組敲除朊蛋白基因的DNA打靶載體，選擇標記基因可選新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因，在本發明的一個優選例中，選擇新霉素抗性基因(neo)作為選擇標記基因。
4.將構建好的朊蛋白基因DNA打靶載體轉染該家畜的細胞。在轉染之前將朊蛋白基因DNA打靶載體進行酶切，得到線性化的DNA打靶載體。轉染方法優選電轉染。
5.對轉染的細胞進行藥物(G418)篩選，獲得藥物抗性細胞克隆。
6.對獲得的藥物抗性細胞克隆進行鑒定，挑選出同源重組的細胞克隆。首先利用PCR方法對所有的藥物抗性細胞克隆進行初步篩選，篩選出可能的中靶細胞克隆。而后對這些PCR鑒定為陽性的細胞克隆進行Southern雜交，以確證真正的中靶細胞克隆，即是朊蛋白基因敲除的細胞。
7.將獲得的朊蛋白基因敲除的細胞移植到去核的家畜卵母細胞中，形成重構胚。體外或體內培養該重構胚，使其發育到桑椹/囊胚期。將發育到囊胚期或桑椹期的重構胚移植到同步發情的受體家畜的子宮內。移植后的受體在1-2月齡時用B超進行妊娠檢查，出現孕囊的判定為懷孕。妊娠到期后，采用自然分娩或剖腹產羔。對獲得的克隆家畜進行朊蛋白基因敲除的分子生物學鑒定。
8.用朊蛋白單等位基因敲除的家畜(PRNP+/-)的有性繁殖，獲得朊蛋白雙等位基因敲除的家畜(PRNP-/-)，或者利用朊蛋白單等位基因敲除家畜的細胞進行朊蛋白第二個等位基因的打靶，獲得朊蛋白雙等位基因敲除的細胞，再利用該細胞進行動物克隆獲得雙等位基因敲除的家畜(PRNP-/-)。
本發明的主要優點在于(1)采用本發明的方法可獲得一種朊蛋白基因敲除的家畜，所述家畜具有抵抗朊蛋白類相關疾病(羊搔癢病、牛海綿狀腦病(俗稱瘋牛病)等)的能力。所述家畜的獲得具有重大的科學研究價值和應用價值。
(2)可以利用所述家畜作為研究對象開展朊蛋白類疾病相關的基礎研究，進一步了解內源性朊蛋白(PrPC)在體內的正常生理功能，為防止和治療朊蛋白類疾病提供科學依據。具有朊蛋白雙等位基因敲除家畜的細胞和具有朊蛋白單等位敲除家畜的細胞也可用于朊蛋白類疾病在細胞生物學水平的基礎研究。
(3)具體應用方面，朊蛋白雙等位基因敲除的家畜因為具有抵抗朊蛋白類疾病，如瘋牛病感染，可以用于防止此類疾病在更大范圍的蔓延，同時緩解民眾對該類疾病的恐懼心理。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1山羊朊蛋白基因的克隆和山羊朊蛋白基因打靶載體的構建1、原代山羊胎兒成纖維細胞的培養及其性別鑒定獲得出生35天的山羊胎兒的皮膚或耳組織，然后用含0.25％胰酶，1mM EDTA的消化液在37℃水浴中消化約15分鐘。
將消化后的單個細胞懸液離心，去上清后，將細胞團塊重懸在含有2mM的谷氨酰胺(GIBCO)，1mM的丙酮酸鈉(SIGMA)，1×的非必須氨基酸(SIGMA)，2ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，SIGMA)，10％胎牛血清(HyClone)，100units/ml的青霉素，100μg/ml的鏈霉素(SIGMA)的Glasgow基本培養基(GMEM，SIGMA)中，最后將細胞懸液分到培養瓶中在二氧化碳培養箱中培養數天，在細胞密度達到80％左右時將其凍存。
山羊胎兒成纖維細胞系的性別是通過PCR擴增SRY基因來鑒定的，PCR所用引物序列如下SRY16f5’-CAATCGTATGCTTCTGCTATGTTC-3’(SEQ ID NO1)；和SRY654r5’-CAATGTTACCCTATCGTGGCC-3’(SEQ ID NO2)。
結果，獲得了來自35日齡的奶山羊胎兒成纖維細胞，經鑒定為雌性，編號為GFF88。
2、打靶載體的構建PrPC是一個由動物體內常染色體單基因(PRNP基因)編碼的蛋白，該基因包含三個外顯子，而整個PrPC的編碼區都在第三個外顯子內。雖然整個山羊的PRNP基因全序列還沒有報道，但是綿羊的PRNP基因已經被成功的克隆并進行了詳細的分析。綿羊的PRNP基因包含三個外顯子，總長度達21kb，其中770bp的整個編碼區都位于第三個外顯子內(Lee IY，Westaway D，Smit AF，Wang K，Seto J，Chen L，Acharya C，Ankener M，Baskin D，Cooper C，Yao H，Prusiner SB，Hood LEComplete genomic sequence and analysis of the prion protein generegion from three mammalian species.Genome Res 1998，81022-1037)。本發明人構建了啟動子缺陷型打靶載體GTPrP(圖1)對山羊PRNP基因進行打靶。
具體構建過程如下1.9kb的左側同源臂和4.5kb的右側同源臂是通過PCR方法從GFF88胎兒成纖維細胞的基因組DNA中擴增出來的，其引物是根據綿羊的PRNP基因的序列(GenBank號是U67922)設計的。1.9kb左側同源臂的擴增引物為PrPLF5’-GAATCCGCGGTGTCGACTCTCTAGTCCATGATCGTTCCTC-3’(SEQ ID NO3)，其5’末尾帶有SacII和SalI酶切位點；和PrPLR5’-TGTTCAATGGCCGATCCCATGATGACTTCTCTGCAAAATAAAG-3’(SEQID NO4)，其末端與neo的起始編碼區序列互補。1.1kb的neo-pA片段的擴增引物為neoF5’-CTTTATTTTGCAGAGAAGTCATCATGGGATCGGCCATTGAACA-3’(SEQ ID NO5)，其5’末端序列與左側同源臂的末端序列互補；和neoR5’-GAATGCGGCCGCAGTACTCCCCAGCTGGTTCTTTCCG-3’(SEQ ID NO6)，其5’末端含有NotI位點和ScaI位點。這兩個片段通過PCR連接得到一個3.0kb的DNA片段。該片段經SacII和NotI酶切后連接于pBluescript IISK(STRATAGENE)載體。右側同源臂的擴增引物為PrPRF5’-ATAAGCGGCCGCGGATCCAGACTATGAGGACCGTTACTATCGTG-3’(SEQ ID NO7)，其5’末尾帶有NotI和BamHI酶切位點；和PrPRR5’-CCGCTCGAGGTCGACGTATCATTCACTTCGGCTCTGTAAA-3’(SEQ IDNO8)，其5’末尾帶XhoI和SalI酶切位點，該PCR產物經Not I和Xho I酶切后與上述帶有左側同源臂和neo-pA片段的pBluescript II SK載體(Stratagene公司)連接，完成整個載體的構建。
在構建的GTPrP打靶載體中，1.1kb的neo-pA片段被置于PRNP基因的起始密碼子之后。如果轉入的GTPrP打靶載體與內源的PRNP基因之間發生同源重組，將會有大約430bp的PRNP基因編碼區被刪除，同時該區域會被1.1kb的neo-pA片段所代替。
實施例2利用GTPrP打靶載體敲除山羊PRNP基因載體GTPrP在經SalI線性化后，通過電轉染將其轉入傳代到第三代的GFF88胎兒成纖維細胞系。將大約500百萬個胎兒成纖維細胞與10μg線性化的GTPRP載體混合，轉移到0.4cm的電轉杯(Bio-Rad)，通過電轉儀Gene pulserII(Bio-Rad)對其施以220v，950μF的脈沖，而后將細胞分到數個含GMEM培養液的培養皿。48小時后加入G418到終濃度為250μg/ml。
大約10天左右，可見有細胞克隆形成。將其中生長良好的細胞克隆挑出，轉移到96孔板孔。在快長滿時，分離出部分細胞用于PCR鑒定，剩余細胞繼續傳代直到獲得足夠的細胞分別用于凍存和抽提基因組DNA用作Southern雜交鑒定。
本發明人首先使用3組不同的引物對產生的細胞克隆進行PCR分析以便篩選出中靶的細胞克隆(targeted colonies)，每組引物中分別有一個引物在同源臂的外側。各引物的具體位置見圖1。具體的PCR過程如下將分離出來的細胞加入裂解緩沖液(40mM Tris-HCl，pH8.0，0.9％Triton X-100，0.9％NonidetP-40，0.4mg/ml proteinase K)，裂解后在65度水浴中消化30分鐘，最后在95度水浴中處理10分鐘，使蛋白酶(proteinase)K失活。利用TAKARA LA體系(購自TAKARA公司)進行PCR，在20μl的反應體系中加入2μl上述細胞裂解液作為模板。
PCR引物序列如下P1，5’-CACAGCCAGGCATTCAGAAAC-3’(SEQ ID NO9)；P2，5’-CCACCATGATATTCGGCAAG-3’(SEQ ID NO10)；P3，5’-CGCCTTCTTGACGAGTTCTTC-3’(SEQ ID NO11)；P4，5’-CACGATAGTAACGGTCCTCATAGTC-3’(SEQ ID NO12)；P5，5’-GTATGATGCAGGGAAACCAAAG-3’(SEQ ID NO13)。
PCR循環參數如下94℃，30秒；62℃，30秒；72℃，3.5分鐘(對P1/P2和P1/P4引物)或者5分鐘(對P3/P5引物)，共30個循環。如果是利用從組織或者血液中提取的DNA作為作為模板進行PCR鑒定，則只需加入1μl純化的DNA作為模板即可，其它參數相同。
進一步利用Southern雜交方法對來分離自培養的細胞或者山羊組織的基因組DNA進行鑒定。樣品首先在如下的裂解液(10mM Tris-HCl，pH8.0，50mMEDTA，10mM NaCl，0.5％SDS，0.4mg/ml proteinase K)中裂解過夜，然后進行基因組DNA的常規抽提。使用如下三組不同的內切酶(BglI，XbaI或者ScaI/BamHI，)對得到的基因組DNA進行酶切，而后將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，再轉移到尼龍膜上。使用兩種DNA片段作為雜交的探針(具體位置見圖1)一個1.9kb的相當于打靶載體的左側同源臂的片段(命名為5’arm)和1.1kb的neo片段。
實驗結果如下本發明人將GTPrP通過電轉染轉入雌性GFF88山羊胎兒成纖維細胞系，GTPrP的兩個同源臂就是擴增自該細胞系。經過8-10天的藥物篩選，挑出了163個細胞克隆。這些藥物抗性細胞克隆通過三個獨立的PCR分析來檢測其中的中靶細胞。在使用一個位于左側同源臂外側的P1引物和一個位于右側同源臂內P4引物分析的112個細胞克隆中有10個中靶的細胞克隆。這是根據這些細胞克隆的PGR產物中存在兩個預期大小的片段來決定的，一個2.8kb片段，來自正常PRNP等位基因的和一個3.5kb片段，來自中靶PRNP等位基因。如果轉入的GTPrP打靶載體與內源的PRNP基因之間發生同源重組，將會有大約0.4kb的PRNP基因編碼區被刪除，同時該區域會被1.1kb的neo-pA片段所代替，當用P1/P4引物分析時就會出現一個新的3.5kb片段(圖1)。
圖2a是數個具有代表性的細胞克隆的P1/P4引物分析結果。然而，根據電泳時兩個條帶的濃度，可以判斷10個P1/P4引物分析為陽性的細胞克隆中有8個是混合克隆。
為了進一步肯定打靶的成功，本發明人還使用了另外兩組PCR對這些細胞克隆做了進一步驗證。10個P1/P4引物分析為陽性的細胞克隆中，8個因為是混合克隆，沒有對其作進一步的驗證，剩余的兩個細胞克隆(GTPrP74和GTPrP78)都被另外兩組PCR證明是陽性克隆(圖2b和2c)。此外，P1/P4引物擴增的產物還被轉移到尼龍膜上并與1.9kb的相當于左側同源臂的5’arm探針雜交，結果也證明了由P1/P4引物擴增產生的新的3.5kb條帶不是非特異條帶而確實是由中靶的PRNP等位基因產生的。
由于使用PCR分析可能會有假陽性出現，所以很有必要使用Southern雜交的方法對這些PCR分析為陽性的細胞克隆做進一步的確認。GTPrP78這個細胞克隆在擴增的過程中由于未能產生足夠的細胞數用于抽提基因組DNA作為雜交使用，所以只對GTPrP74這個細胞克隆做了Southern雜交分析。
本發明人使用了三組不同的內切酶和兩個不同的探針對野生型GFF88細胞和GTPrP74細胞克隆的基因組DNA進行了詳細的分析(圖3a和3b)。如果PRNP基因的等被成功打靶，位于被neo-pA片段所替換的0.4kb編碼區內的兩個BglI位點將消失，這使得當這些中靶細胞的基因組DNA用BglI酶切后與1.9kb的5’arm探針雜交時，除了會有一條6.1kb來自正常PRNP等位基因的BglI酶切片段外，還會出現一條新的來自中靶PRNP等位基因的大小為12.0kb的BglI酶切片段(圖1和圖3a)。
類似地，當使用XbaI或ScaI/BamHI兩組酶分別酶切后與5’arm探針雜交時，除了內源的6.7kb的XbaI酶切片段或者4.4kb的ScaI/BamHI酶切片段外，還會各自出現一條新的7.4kb XbaI酶切片段或者5.5kb的ScaI/BamHI酶切片段(圖3a)。當使用1.1kb的neo探針進行雜交時，只有新產生的與預期大小相符的片段可以被雜交出來(圖3b)。這與PRNP基因的成功打靶相符，并且證明只有單一拷貝的打靶載體整合入到山羊的基因組中。
實施例3通過山羊PRNP+/-細胞的核移植制備PRNP+/-山羊在本發明人的研究中，核移植用的供質卵母細胞、臨時寄母、受體均來自薩能奶山羊。
山羊的同步發情雌性山羊通過注射0.1mg的前列腺素(prostaglandin-Cl，PG，上海計劃生育科學研究所)，24小時后注射25μg促黃體生成素釋放激素(luteinizing hormone-releasing hormone，LHRH)進行同步發情。
母山羊的超數排卵肌肉注射促卵泡激素(follicle stimulation hormone，FSH)，每天注射兩次，連續注射3天，每只山羊注射FSH的總劑量為240IU，在第三天注射一次PG，24小時后注射一次LHRH。
卵母細胞的回收LRH注射24-30小時內采用手術回收，用F10(GIBCO)培養液沖洗輸卵管后收集卵母細胞，用0.2％的透明質酸酶去除附著的顆粒細胞，而后用M16培養液培養于37.5℃、5％CO2的培養箱中。
供核細胞即PrP基因敲除的山羊體細胞，在生長到80％密度時用含0.5％的胎牛血清饑餓培養5天，而后用0.25％的胰酶消化至單個細胞用于核移植(NT)。卵母細胞去核之前用含2.8mg/ml HEPES和7.5μg/ml細胞松弛素B(cytochalasin B，CB)的M16培養液洗滌3次，再置于此溶液中處理10-20分鐘，而后進行去核與移核操作。將單個供核細胞注射到去核的卵母細胞的透明帶下，使其緊貼于胞質膜，采用電刺激的方法進行融合，融合基質為含0.3mM甘露醇、0.05mM氯化鈣、0.1mM硫酸鎂、0.5％BSA的溶液，融合條件為DC600-610v/cm，脈沖持續時間80μs，連續刺激3次。融合后的胚胎于M16中培養5小時后，在含5μM離子霉素(ionomycin)、7.5μg/ml CB的M16液中處理5min，再在含2mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7.5μg/ml CB的M16液中處理5小時后移到M16培養液中培養。
將激活后的重夠卵經短暫培養后，用1％的瓊脂糖進行兩次包埋，將包埋塊移植到同步發情的臨時寄母羊的輸卵管內進行體內培養，5天后剪下臨時寄母羊的輸卵管后，用F10(GIBCO)培養液沖洗輸卵管以回收NT胚胎。將回收的發育至桑椹/囊胚期NT胚胎移植到受體羊的子宮內，每只受體羊移植胚胎2-3枚。通過B超對受體羊的妊娠情況進行診斷，妊娠受體足月分娩，出生克隆羊。
實驗結果如下編號為GTPrP74中靶細胞用作供核細胞，移植到去核的MII期奶山卵母細胞中，構建核移植胚胎。共進行了兩批核移植實驗(表1)。
在第一次核移植實驗中，共有66枚發育到桑椹或囊胚期的胚胎移植到30個受體山羊子宮內，移植后35天時通過B超檢查，有10只受體羊妊娠，其中2只妊娠受體羊早期流產，沒有回收到可用于DNA分析的組織；3只妊娠受體羊沒有明顯的流產現象也沒有小羊出生，可能胎兒組織溶解后被母體吸收了。剩余的5只受體羊懷孕到了足月，分娩出6只克隆羊，其中1只為死胎，3只克隆羊在出生后不久就相繼死亡，2只克隆羊存活，目前仍生長正常。
在第二次核移植實驗中，出生了5只克隆羊，其中2只在出生后48小時內死亡，3只存活，目前健康生長。表2列出了這11只克隆山羊的主要特征。
對這些克隆山羊進行了PCR和Southern雜交鑒定。PCR分析表明，第一次核移植出生的6只克隆羊中的5只以及第二次核移植出生的所有5只克隆羊均含有一個正常的PRNP等位基因和一個中靶的PRNP等位基因(表2)。圖4a只是給出了最先出生的7只克隆羊的PCR鑒定結果。出生的11只克隆羊中仍然含有1只非中靶的小羊。
這說明經P1/P4引物PCR分析證明混合克隆的GTPrP74細胞克隆依然有非中靶細胞存在。對3只編號分別為8A、14A和45B的健康存活的小羊進行Southern雜交結果也證明這些小羊含有一個正常的PRNP等位基因和一個中靶的PRNP等位基因(圖4b)。
所有5只繼續存活的PRNP+/-克隆羊在出生后2個月(8A和14A)或者1個月(45B、50A和50B)，根據其體重及個體大小等判斷這些小羊都顯示出正常的發育情況。
表1、核移植情況

*兩次核移植分組間大概有一個月的時間間隔。
表2、克隆羊的主要特征

*有三只最終受體羊(PrP7，Prp45和PrP50)分別各自出生了兩只小羊。
實施例4PRNP+/-山羊的朊蛋白表達分析Western blot分析。對于細胞，收集后直接用裂解液(10mM Tris-HCl，pH7.4，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5％Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate)溶解。對于腦組織，利用與上面相同的裂解液制成10％(w/v)的勻漿液，1000g離心5分鐘后，上清用于Western分析。等量的蛋白樣品經12％的SDS-PAGE分離后，用半干法轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride(PVDF))膜上。先用封閉液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，10％non-fat dry milk)封閉1小時，而后用含1∶500稀釋的抗阮蛋白單克隆抗體或者1∶1000稀釋的抗actin單克隆抗體的封閉液在4度下孵育過夜。在洗滌三次后，用含1∶1000的山羊抗小鼠IgG的封閉液在室溫孵育2小時。再次洗滌后，利用Pierce公司的SuperSignal WestPico chemiluminescent substrate試劑盒進行顯色。
實驗結果如下
為了證明使用1.1kb的neo-pA片段替換0.4kb的PRNP基因的編碼區后可以使該中靶的等位基因在表達水平上失活，對1只編號為46A的PRNP+/-小羊的腦組織樣品進行了PrPC蛋白表達水平的檢測。PRNP+/-46A小羊是在第二批核移植中由編號為PrP46的受體羊在懷孕只有131天的時候分娩的，該小羊在出生后的第二天就自然死亡(見表2)。
分離自野生型山羊和PRNP+/-46A山羊大腦相同部位的腦組織首先被制成勻漿液，而后使用一個抗阮蛋白單克隆抗體進行檢測。
結果顯示，在兩個樣品中都可以檢測到大小大約為28-36kDa的PrPC條帶，然而與野生型山羊相比，PRNP+/-46A山羊腦內的PrPC表達水平明顯下降(圖5)，這說明了中靶的PRNP等位基因確實已被功能性失活。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海杰隆生物工程股份有限公司<120>一種制備朊蛋白基因敲除家畜的方法<130>059341<160>13<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>引物<400>1caatcgtatg cttctgctat gttc 24<210>2<211>21<212>DNA<213>引物<400>2caatgttacc ctatcgtggc c21<210>3<211>40<212>DNA<213>引物<400>3gaatccgcgg tgtcgactct ctagtccatg atcgttcctc40<210>4<211>43<212>DNA<213>引物<400>4tgttcaatgg ccgatcccat gatgacttct ctgcaaaata aag43<210>5<211>43<212>DNA
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1.一種制備朊蛋白基因敲除家畜的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)通過基因打靶將一構建物定點引入家畜胎兒成纖維細胞，所述的構建物含有兩個作為同源重組同源臂的朊蛋白基因片段和至少一個選擇性標記基因片段；(b)篩選得到朊蛋白基因被敲除的家畜胎兒成纖維細胞；(c)將步驟(b)獲得的家畜胎兒成纖維細胞作為核供體，制備朊蛋白基因敲除的家畜。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(d)利用已獲得的朊蛋白單等位基因敲除的家畜進行繁殖，獲得朊蛋白雙等位基因敲除的家畜。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(d)利用朊蛋白基因被敲除的家畜胎兒成纖維細胞進行朊蛋白第二個等位基因的打靶，獲得朊蛋白雙等位基因敲除的家畜胎兒成纖維細胞細胞，再利用該細胞進行動物克隆，獲得朊蛋白雙等位基因敲除的家畜。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的標記基因為抗性基因。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家畜為牛、綿羊、山羊、兔、豬。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，各同源臂序列的長度為1-20kb。
7.一種朊蛋白基因敲除的組織或細胞，其特征在于，所述組織或細胞來自采用權利要求1-3任一所述的方法制備的朊蛋白基因敲除的家畜。
8.一種制備家畜成纖維細胞的方法，所述的家畜成纖維細胞的朊蛋白基因被敲除，其特征在于，該方法包括步驟(a)通過基因打靶將一構建物定點引入家畜胎兒成纖維細胞，所述的構建物含有兩個作為同源重組同源臂的朊蛋白基因片段和至少一個選擇性標記基因片段；(b)篩選得到朊蛋白基因被敲除的家畜胎兒成纖維細胞。
全文摘要
本發明公開了一種制備朊蛋白基因敲除家畜的方法，即是將家畜的朊蛋白基因在細胞水平上先敲除后，再通過體細胞克隆的方法制備朊蛋白基因敲除的家畜，該家畜的朊蛋白基因的功能失活，不表達功能性的朊蛋白，從而使該家畜具有抵抗朊蛋白類相關疾病，如羊搔癢病、牛海綿狀腦病(俗稱瘋牛病)等。
文檔編號A01K67/027GK1970749SQ20051011077
公開日2007年5月30日 申請日期2005年11月25日 優先權日2005年11月25日
發明者成國祥, 陳建泉, 俞國華, 劉思國 申請人:上海杰隆生物工程股份有限公司