一種鮮切花百合的高效離體繁殖方法

專利名稱：一種鮮切花百合的高效離體繁殖方法
專利說明一種鮮切花百合的高效離體繁殖方法 本發明涉及鮮切花百合鱗片、葉、短縮莖離體快速繁殖優良種苗的方法。百合(Lilium spp.)是多年生球根花卉，花朵碩大，色彩豐富，花姿優美，既能作切花、盆花，又能在園林綠地中應用。隨著百合在國內外鮮切花市場中的走俏，百合花生產和消費逐年增加，百合切花在荷蘭的排名已上升為第五位，取得球根花卉之王的稱號(陸美蓮，許新萍，生物技術在百合上的應用，仲愷農業技術學院學報，15(4)69～76，2002)。百合花不僅具有觀賞價值還具有祛咳生津、補脾益氣、清心安神的藥用價值，民間常用于做“百合稀粥”、“百合蓮子羹”，其味鮮美可口(阮少寧，楊華，梁一池，劉榮忠，香水百合組織培養的試驗研究，福建林學院學報2001，21(2)142～145)。中國是百合屬植物的自然分布中心，全世界百合屬植物約有94個種，起源于我國的有47個種、18個變種，占世界百合屬植物的一半，其中36個種、15個變種為我國特有種。我國百合不僅種類多，而且生態習性各異，分布廣泛。但目前我國的百合育種工作十分落后，現有的百合種質資源不僅沒有得到充分利用，而且破壞、流失現象十分嚴重，與百合故鄉的地位很不相稱(張云，原雅玲，劉青林，百合的品種改良與生物技術研究進展，北京林業大學學報，23(6)56-59，2001)。由于觀賞百合商品種球繁殖率低，病毒侵染退化，造成種球生產難于滿足切花生產需要。近幾年，我國百合切花生產的種球主要靠進口，價格昂貴。
自Robb離體培養百合鱗莖成功以來，生物技術在百合上的應用已取得顯著的進展(趙祥云，王樹棟，陳新露，等.百合[M].北京中國農業出版社，1999)。國內外許多科學家以百合不同品種的鱗片、葉、莖、花藥、花絲、花被、花托等器官為外植體進行了擴繁研究，眾多研究結果表明百合鱗片是最佳的擴繁外植體(Takayama and Misawa，1980；Takayama and Misawa，1983；Niimi，1986；Gerrits and De Klerk，1992；Priyadarshi and Sen，1992；Wickremesinhe et al.，1994 and Tanimoto and Matsubara，1995；Watad A.A.etal.，1998；Long et al.，2004；Zhang et al.，2004)。目前主要采用鱗莖組織培養技術進行百合脫毒和擴繁，促進了百合商品種球的生產。(謝航，白偉，劉云，劉巍，百合組織培養及快繁技術，農業與技術，18(5)33-34，1998)。
但百合組織培養中也存在以下問題(1)商業化生產中的不利因素。迄今為止，百合的生產種植仍以傳統的種球繁殖方式或以分植小鱗莖法繁殖，這樣不僅繁殖系數低，而且病害侵染嚴重，因此有人采用鱗片葉直接種植的方式進行繁殖，這樣雖然理論上能提高繁殖系數，但實際上單鱗片在土中很容易滋生病蟲害并引起腐爛而亡。傳統雜交育種方法常存在受精前后障礙，影響育種效率，利用柱頭切割技術和胚胎拯救技術可克服百合受精前后障礙，但由于其技術難度過大、育種年限長而無法大規模推廣應用。因此，需要通過組織培養進行無性系的快速繁殖。(2)污染嚴重。由于百合鱗莖裸露無皮，直接從田間采回的百合鱗莖，經消毒后污染率高達85％以上，因此大多數的百合快繁均以失敗告終。污染問題成了百合快繁中的一大障礙。(3)繁殖系數低。國內百合的組織培養快速繁殖研究雖然早已受到重視，例如早有黃敏玲、井忠平、馬惠等關于百合組織培養的報道(黃敏玲，陳楊春.庫克點百合的組織培養[J].植物生理學通訊，1988(5)49；井忠平，李惠芝，潘景麗.麝香百合葉片培養[J].植物雜志，1989(5)8；馬惠，郭扶興.百合葉片愈傷組織的誘導和植株再生[J].植物生理學通訊，1992，28(4)284.)，但這些研究都未涉及到提高百合繁殖系數的問題。此后雖有人研究該問題，但系數都很低。例如黃惠英研究東方百合的離體培養，繁殖系數為4.95；王鳳蘭等以鱗莖為外植體研究亞洲百合的快繁技術，繁殖系數僅為4.4；張君等研究麝香百合的離體培養，繁殖系數僅為2.0；阮少寧等研究香水百合的繁殖系數為6.8；杭玲等研究龍牙百合的離體快速繁殖，用鱗片連續培養8-10次時，繁殖系數才達到512-1000。(4)繁殖時間過長。Han et al.認為東方雜交百合和麝香百合從鱗莖到新植株開花需18個月以上(Han BH，Yae BW，Yu H J and Peak KY.Improvement of in vitro micropropagation of Lilium oriental hybrid‘Casablanca’by theformation of shoots with abnormally swollen basal plates.Scientia Horticulture，30 January2005，Volume 103，Issue 3，351-359；Han BH，Yu HJ，Yae BW and Peak KY.In vitromicropropagation of Lilium longiflorum‘Georgia’by shoot formation as influenced by additionof liquid medium.Scientia Horticulture，2004，Volume 103，Issue 1，39-49)。這期間主要是成熟苗在移栽前的低溫處理時間過長，并且由于低溫處理，很容易導致采后葉片枯黃變褐、花蕾敗育、少花且開花期縮短等一系列不良現象。為了解決這一問題，國外的Ranwala A.P和Miller W.B采用在低溫處理的培養基中加GA4+7和BA的措施，(Ranwala A.P and Miller W.B，2005.Effects of cold storage onpostharvest leaf and flower quality of potted Oriental-Asiatia-and LA-hybrid Lily cultivars.Scientia Horticulture.)雖然能緩解以上癥狀，但對整個生長期的縮短沒有多大的影響。國內阮少寧等采用在香水百合小鱗莖復壯培養基中添加一定量的BA和GA，可打破休眠，使開花期提前，但沒有具體生長期的統計資料。(5)組培苗的移栽成活率低。組培苗移栽是營養由異養型向自養型的轉變，因此對外界環境條件非常敏感。國內眾多的科研工作者以沙砂、蛭石、泥炭、園土、椰糠等材料為基質進行不同的配比來對組培苗進行馴化栽培，但成活率還是不夠理想。
綜上所述，百合快繁盡管在國內外做了許多工作，但都不系統，而且還存在許多技術難題亟待解決。因此系統地研究鮮切花百合組培快繁既可保持優良品種(花色、花形美麗，花香濃郁，株型別致，抗逆性強，瓶插壽命長)的遺傳穩定性，為其種質的保存提供了一條有效途徑，也方便了國際間種質交流；同時以麝香百合和東方百合的鱗片為初始外植體，尋找其最適宜的培養基配方，探索提高繁殖系數的方法，為麝香百合和東方百合組培苗進入工廠化生產提供依據，這對鮮切花百合的商業化生產具有重要的推動作用，具有重要的經濟和社會效益。為了解決現有技術中存在的實際且迫切需要解決的問題，本發明的目的是提供一種兩步外植體法直接快速擴繁優質鮮切花百合的組織培養方法。
本發明技術方案一種鮮切花百合的高效離體繁殖方法，包括兩步外植體法，外植體的預處理、消毒、培養、組培苗的馴化及移栽等步驟兩步外植體法以優質的鱗莖為初始外植體，以從優質鱗莖上長出的芽為次級外植體。
外植體的預處理取優質的百合鱗莖于4℃暗藏40-60天使其脫春化；消毒流線型自來水沖洗12小時，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動處理15分鐘。
培養培養階段包括初始外植體誘導出芽、次級外植體增殖及壯苗培養、催根培養、試管苗馴化及移栽等步驟。
初始外植體誘芽培養將初始外植體即鱗片葉切割成1cm見方的小塊，每片視其大小切割成3-5小塊，接種于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養16小時，強度為1500lx，連續培養時間30-50天，產生從生芽；次級外植體增殖及壯苗培養從初始外植體上誘導的從生芽為次級外植體，將其葉、小鱗莖和短縮莖分別切割成2mm(寬)×10mm(長)、4-5mm(寬)×7-8mm(長)和8-10mm(直徑)×2mm(高)的小段，每個芽可以切割成15-18小片。然后接種于MS+BM.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養16小時，強度為1500lx，連續培養40天產生從生芽。
催根培養經壯苗培養后，繁殖芽接種于1/2MS+IBA0.25mg/L+GA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-24℃，每日光照培養12小時，強度為1500lx。連續培養30天則誘導出較高質量的根系，成為生根苗。
試管苗馴化及移栽生根苗經2-3天的自然光煉苗后，移栽于滅菌的基質(砂∶園土∶椰糠＝1∶1∶1)中，20-22℃，每日光照培養12小時，強度為1500lx，20天后，移栽入大田。
結果分析1、外植體消毒的成功率經過預處理的外植體，用流線型自來水沖洗12小時，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動處理15分鐘，其成功率達50％以上，這說明這種消毒處理對百合鱗莖表面泥砂、細菌及其真菌孢子去除均有一定的作用，采用這一消毒技術獲得的良好效果是已見報道的技術方法所不能達到的。
2、高繁殖系數采用兩步外植體法是提高繁殖系數的最好方法。一個中等大小(重50mg)的百合鱗莖有10-15片鱗片葉，每片鱗片可以切成3-5個1cm見方的小塊，每小塊可以誘導30個不定芽，以此芽為次級外植體，每個芽可以分割成15-18個小片，平均每小片又能誘發4個生長健壯的不定芽，考慮到消毒處理時50％的成功率，因此一個中等大小的鱗莖通過兩步外植體法1代就可以擴增出27,000個獨立完整的帶小鱗莖的新植株，這一結果是國內外已見報導的技術方法所不能達到的(表1、2)。
3、高繁殖速度以經過預處理的百合鱗莖為初始外植體，在50天甚至更早就可以誘導出次級外植體，次級外植體在同樣的培養基上40天就可以誘導出叢生芽。將芽切下置于生根培養基中只需30天即可誘導生根，生根苗不需經過低溫處理直接移栽于滅菌的基質中，20天后移入大田正規生長，4個月后即可開花，因此從鱗莖到新植株開花只需8個月左右，這么快的繁殖速度是國內外都未見報導的。
4、高移栽成活率正常化生長的小苗在移入大田前進行20天左右的馴化培養是必需的。根據本實驗室對不同培養基質的配比試驗，又考慮到大規模生產的成本，發現在砂∶園土∶椰糠＝1∶1∶1的基質中生長的小苗成活率高達99％，這也是國內外現有技術所不能達到的。
本研究已對麝香百合和東方雜交百合的鱗莖預處理、消毒、初始外植體的誘芽培養、次級外植體的誘芽培養，催根及馴化移栽等環節作了系統的研究，找到了一條適合鮮切花百合快繁的可行途徑，若投入一定的人力、物力，以此技術體系為依托進行鮮切花種苗的商業化生產是可行的，此項技術的突破大大改進了國內在鮮切花百合快繁技術上的不足；通過本技術體系目前已獲得了麝香百合、東方雜交百合兩個無性系，并已移栽至大田進行示范種植，示范面積為1畝。下面結合實施方式對本發明進行詳細說明1、材料來源以從云南引進的優質東方雜交百合鱗莖和中國熱帶農業科學院園藝所提供的麝香百合鱗莖作為初始外植體。
2、方法(1)材料預處理及消毒處理①取優質的百合鱗莖于4℃暗藏40天使其脫春化；②外植體經預處理后用流線型自來水沖洗12小時，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動處理15分鐘。
(2)初始外植體誘芽培養將初始外植體即鱗片葉切割成1cm見方的小塊，每片視其大小切割成4小塊，接種于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH＝5.8，24℃，每日光照培養16小時，強度為1500lx，連續培養時間50天，產生從生芽；(3)次級外植體增殖及壯苗培養從初始外植體上誘導的從生芽為次級外植體，將其葉、小鱗莖和短縮莖分別切割成2mm(寬)×10mm(長)、4mm(寬)×7mm(長)和8mm(直徑)×2mm(高)的小段，每個芽可以切割成15小片。然后接種于MS+BM.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，24℃，每日光照培養16小時，強度為1500lx，連續培養40天產生從生芽。
(4)催根培養經壯苗培養后，繁殖芽接種于1/2MS+IBA0.25mg/L+GA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22℃，每日光照培養12小時，強度為1500lx。連續培養30天則誘導出較高質量的根系，成為生根苗。
(5)試管苗馴化及移栽生根苗經2天的自然光煉苗后，移栽于滅菌的基質(砂∶園土∶椰糠＝1∶1∶1)中，20℃，每日光照培養12小時，強度為1500lx，20天后，移栽入大田正規生長，4個月后開花。
表1.培養50天后不同的BA濃度對百合鱗片誘芽的影響
表2不同的次級外植體類型在MS加1.0mg/L BA和0.1mg/L NAA培養基上培養40天后不同的出芽效果
權利要求
1.一種鮮切花百合的高效離體繁殖方法，即兩步外植體法，包括外植體的預處理、消毒、培養等步驟，其特征在于外植體的預處理取優質的百合鱗莖于4℃暗藏使其脫春化；消毒用流線型自來水沖洗過夜，先后用70％酒精、0.15％升汞消毒；培養培養階段包括初始外植體誘導出芽、次級外植體增殖及壯苗培養、催根培養、試管苗馴化及移栽等步驟。
2.根據權利要求1所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于在預處理時4℃暗藏天數為40-60天。
3.根據權利要求2所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于，初始外植體經預處理后用流線型自來水沖洗12小時，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動處理15分鐘。
4.根據權利要求3所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于將初始外植體即鱗片葉切割成1cm見方的小塊，每片視其大小切割成3-5小塊。接種步驟為接種于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養16小時，強度為1500lx。
5.根據權利要求4所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于以從初始外植體上誘導的芽為次級外植體，將其葉、小鱗莖和短縮莖分別切割成2mm(寬)×10mm(長)、4-5mm(寬)×7-8mm(長)和8-10mm(直徑)×2mm(高)的小段，每個長4cm的芽可以切割成15-18小片。然后接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養16小時，強度為2000lx。
6.根據權利要求5所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于所述的壯苗培養步驟為次級外植體經繼代培養后，接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養16小時，強度為2000lx。
7.根據權利要求6所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于所述的催根培養步驟為繁殖芽經壯苗培養后，接種于1/2MS+IBA0.25mg/L+GA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-24℃，每日光照培養12小時，強度為1500lx。
8.根據權利要求7所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于所述的試管苗馴化及移栽步驟為生根苗經2-3天的自然光煉苗后，移栽于滅菌的基質(砂∶園土∶椰糠＝1∶1∶1)中，20-22℃，每日光照培養12小時，強度為1500lx，20天后，移栽入大田。
全文摘要
本發明涉及鮮切花百合的高效離體繁殖方法——兩步外植體法，將優質的東方雜交百合和麝香百合，于4℃暗藏使其脫春化，選擇中等大小(50克)的鱗莖為初始外植體，通過直接分化的途徑擴繁出芽。以該芽叢為次級外植體，進行增殖及壯苗培養、催根培養、試管苗馴化及移栽等步驟。不僅解決了以鱗莖直接作為種球存在的繁殖系數低且易發生種球退化問題，而且解決了以鱗莖為唯一外植體進行組織培養存在的污染率高、增殖率低、繁殖速度慢和移栽成活率低的關鍵問題，為鮮切花百合的生產提供培育優質種苗的技術途徑，同時亦為鮮切花百合的大規模生產開發起到積極的推動作用，這具有十分重要的社會和經濟效益。
文檔編號A01H3/02GK1771797SQ200510101440
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月15日 優先權日2005年11月15日
發明者劉菊華, 徐碧玉, 金志強, 譚光蘭 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所, 中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室