專利名稱：九節茶藥材種苗的組培快繁方法
技術領域：
本發明涉及通過組織培養技術的植株再生方法，具體說是涉及九節茶藥材通過生物組培無性繁殖技術獲得株性穩定的組培快繁育苗方法。
背景技術：
九節茶(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)，別名草珊瑚、接骨蓮、竹節草、腫節風。為金粟蘭科半灌木，多年生常綠草本或亞灌木，植株高50～120厘米。花期每年6～7月，果期每年8～9月。生于山溝、溪谷林陰濕地，分布于華南、華東、中南、西南。含有藥用價值的化學成分，已有開發成功的“清熱消炎寧膠囊”就是用九節茶植物為原料制備而成的，具有清熱解毒，消炎止痛，舒筋活絡的功效。用于流行性感冒，咽喉炎，肺炎，菌痢，急性胃腸炎，闌尾炎，燒傷，瘡瘍膿腫，蜂窩織炎。隨著以九節茶為原料的新藥品種的不斷開發，對九節茶原料的需求量越來越大，無限制的采挖使野生資源遭到嚴重破壞。
九節茶的繁殖常可采用播種、扦插、壓條等。由于藥材采挖，使種子(果實)的收獲極困難，且九節茶作為半陰生植物，果實成熟率和收獲率低，且發芽率低；而采用分株、壓條的繁殖方法，繁殖系數低，枝莖扦插的成活率低；而且，靠上述的繁殖法，一般需2～3年。為加強中藥材野生變家種，實現中藥材規范化種植和產業化生產，發展綠色藥材，實現該中藥材GAP規范化管理，保證藥品生產的質量，因而研究對優質的九節茶藥材的人工栽培及優質種苗的快速繁殖非常重要，是為滿足種苗市場的需要提供一條有效的途徑。
已有對九節茶組織培養的研究主要集中于植物細胞工程及次生代謝產物的研究，僅見獲得愈傷組織，而未見有成功獲得再生苗的報道。如文獻1.涂藝聲江洪如，植物離體培養產生草珊瑚有效成分，天然產物研究與開發，1995，7(1)35-41文獻2.涂藝聲 王碧琴，不同色光，溫度，PH對草珊瑚愈傷組織的培養效應，江西科學，1994，12(2)85-89文獻3.涂藝聲 江洪如，草珊瑚細胞懸浮培養之研究，江西科學，1994，12(3)162-166涂藝聲等報道了以九節茶外植體誘導愈傷組織的適宜培養基和各種植物激素在誘導及其生長培養中的調節作用。應用薄層層析(TLC)和紫外光鑒定，證明所獲得的愈傷組織具有合成與原植物材料相同的黃酮類、異嗪皮啶類、延胡索酸等有機酸的能力。亦通過愈傷組織無性系篩選過程，得到一個增長率和代謝物產量比愈傷組織母系高4倍左右的優良愈傷組織系。
植物組織培養成苗的途徑通常有兩種經過愈傷組織后再出芽生根，該方法對九節茶種苗的培育未見成功的報道；直接誘導出芽和生根，對九節茶種苗的培育也未見有公開文獻的報道。愈傷組織途徑的增殖系數相對較大，但容易發生突變，并且誘導出芽和生根較為困難。而直接誘導出芽和生根的組培苗不易發生變易和退化，組培苗間的種性較穩定和整齊一致。同時如組織培養只到愈傷組織階段而不能出芽和生根，就不能用于對九節茶的快繁育苗。九節茶通過叢生芽途徑的離體快繁育苗尚未見報道。
發明內容
本發明的目的是采用植物組織培養技術建立九節茶種苗的快速繁殖的快繁育苗方法。是以通過叢生芽途徑的離體快繁育苗方法加速其繁殖速度獲得大量試管苗，為滿足種苗市場的需要。
為達到本發明目的所采用的技術方案，九節茶藥材的組培快繁方法是按如下步驟操作第一步是外植體處理選取九節茶的帶節莖段或頂芽作外植體，進行表面消毒；第二步是誘導叢生芽將表面消毒后的外植體，接種于初代培養基上，在18～30℃，每天光照10～16小時，光照強度為1500～2000Lux，培養35～42天，誘導叢生芽，所說的初代培養基是采用在MS中添加6-芐氨基嘌呤2.0～4.0毫克/升和蔗糖30克/升、瓊脂7.0克/升組成初代培養基；第三步是增殖培養將叢生芽切成單芽或小叢芽，轉入增殖培養基中，在18～30℃，每天光照10～16小時，光照強度為1500～2000Lux，進行增殖培養32～38天，所說的增殖培養基是采用在MS中添加6-芐氨基嘌呤1.0～4.0毫克/升、萘乙酸0～0.2毫克/升和蔗糖30克/升、瓊脂7.0克/升組成增殖培養基；第四步是生根培養切取單芽轉入生根培養基中，在18～30℃，每天光照10～16小時，光照強度為1500～2000Lux，進行生根培養20～25天，形成具有根、莖、葉和芽的完整九節茶組培苗，所說的生根培養基是采用在1/2MS或者MS中添加萘乙酸0～0.5毫克/升、蔗糖30克/升和瓊脂7.0克/升組成生根培養基；第五步是煉苗和移栽具有根、莖、葉和芽的完整九節茶組培苗，在自然光照下煉苗4～5天后，組培苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，栽入由泥炭土和河沙1∶1混合成的基質土并定植于大田中，移栽后一個月統計成活率。
MS為Murashige和Skoog培養基的縮寫，以下同。MS培養基是植物組織培養中常用的培養基，為植物組織生長提供必需的大量元素、微量元素及維生素、氨基酸等營養成分。(具體參考文獻李浚明.2002.北京植物組織培養教程.中國農業大學出版社.)6-芐氨基嘌呤，縮寫為6-BA，培養基中的濃度單位是毫克/升(mg/L)，以下同。
萘乙酸，縮寫為NAA，培養基中的濃度單位是毫克/升(mg/L)，以下同。
外植體表面消毒方法很多，常用的消毒劑有70～75％酒精、次氯酸鈉溶液、二氯化汞溶液等，本發明優選的方法是取九節茶的帶節莖段或頂芽作外植體，先用75％酒精浸泡30秒，無菌水沖洗，再用0.1％二氯化汞添加添加0.5～1.0毫升/升的吐溫80溶液，消毒15～20分鐘，無菌水沖洗的方法。
本發明成功地利用植物組織細胞的全能性和植物組織培養進行植物種苗的規模化生產，建立九節茶的組織培養和快速繁殖方法，優點是具有出苗快，穩定性高，苗壯，種苗品質好、抗性強、生長良好等優點。實施該專利只需有簡單的植物組織培養設備即可進行，實用性強，可解決九節茶藥材種植的種苗供應，為實現九節茶藥材種植的GAP規范化管理提供了保障，也為以九節茶藥材為原料的藥品生產提供了質量保證。
下面通過實施例進一步闡述本發明的技術方案
具體實施例方式
實施例11.取材取九節茶(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)的帶節莖段為外植體。
2.外植體的消毒選取生長健壯的植株枝條，在自來水下沖洗干凈后剪去葉片，用75％酒精棉球擦拭外表。剪取2cm左右的帶節莖段，在超凈工作臺上，用75％酒精浸泡30秒，無菌水沖洗，再用0.1％二氯化汞溶液(每升加0.5ml吐溫80)浸泡20分鐘，無菌水沖洗即可。
3.將消毒好的外植體插入已配好的初代培養基MS加6-BA 2.0毫克/升和蔗糖30克/升和瓊脂7.0克/升。每天光照12小時，光照強度為2000Lux，溫度為25℃，培養35天，誘導出叢生芽，每個外植體可誘導出芽4～6個。
4.增殖培養將誘導出的叢芽分割成單個芽或者小叢芽，接種到增殖培養基MS加6-BA4.0加NAA0.2，附加蔗糖30克/升，瓊脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小時，光照強度為2000Lux，進行增殖培養35天，1個繼代增殖周期由1個芽可增殖形成4～5個芽，叢生芽致密，粗壯。
5.生根培養切取高2cm左右的單芽，轉入生根培養基用1/2M附加蔗糖30克/升，瓊脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小時，光照強度為2000Lux條件下培養。13～14天時開始長根，根剛長出時較白，過一個星期左右根逐漸變成深綠色。23天時統計，生根率可達100％，每棵苗可長根2～4條，根較細，植株生長良好。
6.試管苗煉苗和移栽將具有根、莖、葉和芽的完整九節茶組培苗，在自然光照下煉苗4天后，用鑷子從培養瓶中取出組培苗，洗掉根部培養基，栽入由泥炭土和河沙1∶1混合成的基質土并定植于大田中，移栽初期注意澆水。移栽后一個月統計成活率，成活率可達95％。
實施例21.取材取九節茶的頂芽為外植體。
2.外植體的消毒剪取2cm左右生長健壯的植株頂芽，在自來水下沖洗干凈后剪去葉片，用70％酒精棉球擦拭外表。在超凈工作臺上，用75％酒精浸泡30秒，無菌水沖洗，再用0.1％二氯化汞溶液(每升加1ml吐溫80)消毒20分鐘，無菌水沖洗，消毒成功率與實施例1無明顯差異。
3.將消毒好的外植體插入已配好的初代培養基MS加6-BA 4.0毫克/升加蔗糖30克/升加瓊脂7.0克/升。每天光照12小時，光照強度為2000Lux，溫度為25℃，培養35天，誘導出叢生芽，每個外植體可誘導出芽2～3個。
4.增殖培養將誘導出的叢芽分割成單個芽或者小叢芽，接種到增殖培養基MS加6-BA4.0加NAA0.2，附加蔗糖30克/升，瓊脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小時，光照強度為2000Lux，進行增殖培養35天，1個繼代增殖周期由1個芽可增殖形成4～5個芽，叢生芽致密，粗壯。
5.生根培養切取高2cm左右的單芽，轉入生根培養基1/2MS中加蔗糖30克/升，瓊脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小時，光照強度為2000Lux，進行生根培養23天，生根率可達100％，每棵苗可長根2～4條。
6.試管苗煉苗和移栽將具有根、莖、葉和芽的完整九節茶組培苗，在自然光照下煉苗5天后，用鑷子從培養瓶中取出組培苗，洗掉根部培養基，栽入由泥炭土和河沙1∶1混合成的基質土并定植于大田中，移栽后一個月統計成活率，成活率可達95％。
實施例3.
同實施例1操作，不同的是外植體表面消毒中的0.1％二氯化汞溶液(每升加0.7ml吐溫80)處理15分鐘，外植體消毒成功率略低于實施例1中的20分鐘處理。叢生芽的誘導、增殖和生根培養所用的培養基和培養條件同實施例1，叢生芽的誘導與增殖率、生根數和植株生長狀況均與實施例1無明顯差異。
實施例4.
同實施例3操作，不同的是外植體表面消毒中的0.1％二氯化汞溶液(每升加0.7ml吐溫80)處理25分鐘，外植體消毒成功率高于實施例1中的20分鐘處理，但是外植體死亡率略高。叢生芽的誘導、增殖和生根培養所用的培養基和培養條件同實施例1，叢生芽的誘導與增殖率、生根數和植株生長狀況均與實施例1無明顯差異。
實施例5
1取材和外植體表面消毒方法同實施例12叢生芽誘導培養基不同于實施例1之處是叢生芽誘導的初代培養基中的6-BA濃度為4.0毫克/升，每個外植體可誘導出芽4～6個，與實施例1中使用6-BA濃度為2.0毫克/升時無顯著差異。
3其他操作步驟同實施例1。
實施例6同實施例5，不同之處在于叢生芽誘導的初代培養基中的6-BA濃度為3.0毫克/升，每個外植體可誘導出芽4～6個，與實施例1中使用6-BA濃度為2.0毫克/升時無顯著差異。
從實施例1、5、6可以看出，初代培養基中的6-BA濃度在2.0～4.0毫克/升時，都可誘導九節茶叢生芽的生長，且對九節茶叢生芽的誘導差異不明顯。
實施例71取材、外植體表面消毒方法和叢生芽誘導，操作同實施例1。
2增殖培養不同于實施例1之處是將誘導出的叢芽分割成單個芽或者小叢芽，接種到增殖培養基MS+6-BA1.0+NAA0.2，附加蔗糖30克/升，瓊脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小時，光照強度為2000Lux，進行增殖培養35天，增殖率為2～3倍，叢生芽較高、粗壯。
3其他操作步驟同實施例1。
實施例8同實施例7，不同之處是增殖培養基MS中所加6-BA2.0毫克/升，NAA0.2毫克/升，僅6-BA濃度不同于實施例7，所得增殖率2～3倍，叢生芽較高、粗壯，與實施例7無明顯差異。
實施例91取材、外植體表面消毒方法和叢生芽誘導，操作同實施例1。
2增殖培養不同于實施例1之處是將誘導出的叢芽分割成單個芽或者小叢芽，接種到增殖培養基MS+6-BA4.0，不添加NAA，附加蔗糖30克/升，瓊脂7.0克/升。在25℃，每天光照12小時，光照強度為2000Lux，進行增殖培養35天，增殖率4倍左右，但叢生芽較瘦弱，主芽均高于實施例1中添加了0.2毫克/升NAA時的高度。
3其他操作步驟同實施例1。
實施例10操作與實施例1一致。但是生根培養所用培養基是MS，14天時開始長根，略遲于實施例1中使用1/2MS時，其他方面無明顯差異。相同條件下，移栽成活率可達85％。
實施例11操作與實施例1一致。不同僅在于生根培養所用培養基是在原來1/2MS的基礎上添加0.5毫克/升NAA，17～18天時開始長根，明顯遲于實施例1中使用1/2MS時，但長根數較多，每棵苗長根7～9條，所長的根粗壯、肥厚，植株較矮小，相同條件下，移栽成活率僅為20％。
實施例12操作與實施例1一致。不同僅在于生根培養所用培養基是在原來1/2MS的基礎上添加0.1毫克/升NAA，13天時開始長根，每棵苗長根9～11條，所長的根略粗于實施例1中的根，植株較矮小，相同條件下，移栽成活率為75％左右。
實施例13操作與實施例2基本相同。不同僅在于所采用的培養條件是每天光照10小時，光照強度為1500Lux，培養溫度25℃，所得結果與實施例2無明顯差異。
實施例14操作與實施例2基本一致。不同僅在于所采用的培養條件是每天光照16小時，光照強度為2000Lux，培養溫度25℃，所得結果與實施例2無顯著差異。
實施例15操作與實施例2基本相同。不同之處僅在于所采用的培養溫度是18℃。叢生芽誘導和增殖時，出芽速度略慢于實施例2中采用25℃培養時的狀況，芽的增殖倍率和芽高無明顯不同。生根培養時，開始生根的時間延遲，需15天左右開始長根，其他方面與實施例1無明顯差異。
實施例16操作與實施例2基本一致。不同的地方僅在于所采用的培養溫度是25℃。植株各方面的表現與實施例2不存在顯著性差異。
權利要求
1.一種九節茶藥材種苗的組培快繁方法，其特征在于按如下步驟操作第一步是外植體處理選取九節茶的帶節莖段或頂芽作外植體，進行表面消毒；第二步是誘導叢生芽將消毒后的外植體接種于初代培養基上，在18～30℃，每天光照10～16小時，光照強度為1500～2000Lux，培養35～42天，誘導叢生芽，所說的初代培養基是采用在MS中添加6-芐氨基嘌呤2.0～4.0毫克/升和蔗糖30克/升、瓊脂7.0克/升組成初代培養基；第三步是增殖培養將叢生芽切成單芽或者小叢芽，轉入增殖培養基中，在18～30℃，每天光照10～16小時，光照強度為1500～2000Lux，進行增殖培養32～38天，所說的增殖培養基是采用在MS中添加6-芐氨基嘌呤1.0～4.0毫克/升、萘乙酸0～0.2毫克/升和蔗糖30克/升、瓊脂7.0克/升組成增殖培養基；第四步是生根培養切取單芽轉入生根培養基中，在18～30℃，每天光照10～16小時，光照強度為1500～2000Lux，進行生根培養20～25天，形成具有根、莖、葉和芽的完整九節茶組培苗，所說的生根培養基是采用在1/2MS或MS中添加萘乙酸0～0.5毫克/升、蔗糖30克/升和瓊脂7.0克/升組成生根培養基；第五步是煉苗和移栽具有根、莖、葉和芽的完整九節茶組培苗，在自然光照下煉苗4～5天后，組培苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，栽入由泥炭土和河沙1∶1混合成的基質土并定植于大田中。
2.根據權利要求1所述的組培快繁方法，其特征在于第一步驟所說的外植體表面消毒方法是取九節茶的帶節莖段或頂芽，先用75％酒精浸泡30秒，無菌水沖洗，再用0.1％二氯化汞添加0.5～1.0毫升/升的吐溫80溶液，消毒15～25分鐘，無菌水沖洗。
全文摘要
九節茶藥材種苗的組培快繁方法，涉及九節茶藥材通過生物組培無性繁殖技術獲得株性穩定的組培快繁育苗方法。它是通過選取九節茶的帶節莖段或頂芽作外植體，進行表面消毒處理；誘導叢生芽的初代培養；增殖培養；生根培養；煉苗和移栽五個步驟完成。本發明具有出苗快，穩定性高，苗壯，種苗品質好、抗性強、生長良好，實用性強等優點。解決了九節茶藥材種植的種苗供應，為實現九節茶藥材種植的GAP規范化管理提供了保障，也為以九節茶藥材為原料的藥品生產提供了質量保證。
文檔編號A01H4/00GK1762208SQ20051010087
公開日2006年4月26日 申請日期2005年11月4日 優先權日2005年11月4日
發明者張明永, 朱淑穎, 陸頌規, 李美茹, 彭紅英, 潘小平 申請人:廣州敬修堂(藥業)股份有限公司, 中國科學院華南植物園