卡他摩拉克菌外膜蛋白－106多肽及其基因序列和用途的制作方法

專利名稱：卡他摩拉克菌外膜蛋白－106多肽及其基因序列和用途的制作方法
本申請是申請日為1997年4月28日，申請號為97195990.0，發明名稱為“卡他摩拉克菌外膜蛋白-106多肽及其基因序列和用途”的發明專利申請的分案申請。
1.介紹本發明一般涉及卡他摩拉克菌的外膜蛋白-106(OMP106)多肽。本發明包括純化的OMP106多肽和其衍生多肽(OMP106衍生多肽)。本發明也包括特異性結合所述OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的抗體，包括胞毒抗體。本發明還包括包含OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的預防或治療組合物包括疫苗。本發明另外還提供在哺乳動物中誘導對卡他摩拉克菌的免疫應答的方法。本發明還提供編碼所述OMP106多肽和OMP106衍生多肽的分離的核苷酸序列、具有所述序列的載體和含有所述載體的宿主細胞。
2.發明背景卡他摩拉克菌也稱作卡他摩拉克菌(布蘭漢氏球菌)或卡他布蘭漢氏球菌，而以前也被稱作卡他奈瑟菌或卡他微球菌，該菌是常常發現于人類呼吸道的革蘭氏陰性細菌。最初認為卡他摩拉克菌是無害的共生生物，現在認為該菌是動物上下呼吸道感染的重要病原體。在人類，卡他摩拉克菌在患有慢性肺病的成人中引起嚴重的下呼吸道感染、在無免疫應答的病人引起全身性感染以及在嬰幼兒和兒童引起中耳炎和竇炎。參見Helminen等，1993，Infect.Immun.612003-2010；Catlin，B.W.，1990，Clin.Microbiol.Rev.3293-320；和其中引用的文獻。
2.1.外膜蛋白和保護性抗體已經研究了卡他摩拉克菌的外表面成分，以試圖了解卡他摩拉克菌感染的致病過程和開發針對這類感染的有用的治療方法和預防措施。所述外膜蛋白(OMP)作為可能的毒性因子和有潛力的疫苗抗原已特別受到極大的關注。卡他摩拉克菌有大約10-20種不同的OMP，其中的6-8種(OMP A-H)為主要種類(Murphy和Loeb，1989，MicrobialPathogen.6159-174)。OMP A-H的分子量范圍分別為97-20kD。參Bartos Murphy，1988，J.Infect.Dis.158761-765；Helminen等，1993，Infect.Immun.612003-2010；Murphy等，1993，Molecul.Microbiol.1087-97；和Sarwar等，1992，Infect.Immun.60804-809。通過自50種卡他摩拉克菌株的外膜制品的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，進行蛋白型的比較表明，OMP A-H的帶型幾乎同型(Bartos和Murphy，1988，J.Infect.Dis.158761-765)。
除了OMP A-H外，一個命名為HMV-OMP、SDS-PAGE顯示表觀質量為350-720kD的高分子量OMP，也已被鑒定為存在于許多卡他摩拉克菌菌株的另一主要表面成分。用甲酸變性時，HWM-OMP產生120-140kD的單鏈，因此，它似乎是一種寡聚蛋白質(Klingman和Murphy，1994，Infect.Immun.621150-1155)。HMW-OMP似乎是與Helminen等(1994，J.Infect.Dis 170867-872)命名為UspA的蛋白相同的蛋白，且表明存在于許多卡他摩拉克菌菌株中。
在完整的細菌或細菌衍生的外膜泡囊中，幾種以上鑒定的OMP存在引發結合所述OMP的抗體產生的表面暴露的表位。這些抗原性OMP包括OMP E和OMP G(Murphy和Bartos，1989，Infect.Immun.572938-2941)；OMP C/D(Sarwar等，1992，Infect.Immun.60804-809)；Cop B，為-80kD的OMP(Helminen等，1993，Infect.Immun.612003-2010)；和UspA(Helminen等，1994，J.Infect.Dis.170867-872)。
已經在一種動物模型中評價了Cop B和UspA表面暴露表位的抗體的治療潛力。所述模型涉及用受控數目的卡他摩拉克菌細胞直接團塊接種在BALB/C VAF/Plus小鼠的肺部，然后檢查肺部的該細菌清除率(Unhanand等，1992，J.Infect.Dis.165644-650)。卡他摩拉克菌的不同臨床分離菌顯示不同的清除率，該清除率與粒細胞募集到該感染部位的水平有關。用導向或者Cop B或者UspA的表面暴露表位的單克隆抗體進行被動免疫，提高卡他摩拉克菌的肺清除率(Helminen等，1993，Infect.Immun.612003-2010；Helminen等，1994，J.Infect.Dis.170867-872)。
2.2.細菌/宿主細胞粘著和血凝集細菌性病原體粘著到宿主細胞表面，促進定居和引發病理過程。參見E.H.Beachey，1981，J.Infect.Dis.143325-345。革蘭氏陰性細菌通常表達結合到宿主細胞表面的糖蛋白和/或糖脂的特異性寡糖的表面凝集素。這類凝集常常與菌毛(pili)或菌毛(fimbriae)相關。與宿主細胞表面發生疏水和/或電荷相互作用引起的非特異結合也可以使細菌發生粘著。
卡他摩拉克菌粘著到呼吸道細胞的機理仍然了解甚少。所述生物粘著到培養的人口咽上皮細胞(Mbaki等，1987，Tohuku J.Exp.Med.153111-121)。Rikitomi等的研究提示，菌毛在粘著到這類細胞方面可能有作用，因為菌毛變性或用抗菌毛抗體處理降低有菌毛菌株的粘著(Rikitomi等，1991，Scand.J.Infect.Dis.23559-567)。然而，介導結合的菌毛不可能是這種粘著的唯一基礎，因為在檢查的幾種菌株中最高粘著力菌株為無菌毛菌株。
在分類細菌粘附素時血凝集常常取代更為復雜的粘著檢測法。然而，Rikitomi等發現人口咽上皮細胞粘著與卡他摩拉克菌菌株的血凝集無關(文獻同前)。即3種高粘著菌株不凝集人紅細胞。因此，在人口咽上皮細胞粘著和血凝集反應中涉及不同結合機制。
相反，Kellens等的最近一項研究提示由卡他摩拉克菌引起的血凝集與宿主細胞粘著有關(Kellens等，1995，Infection 2337-41)。然而，該研究采用基于細菌結合到豬氣管切片的粘著檢測法。就卡他摩拉克菌致病菌株的粘著而言，不知道是否可以認為豬氣管組織與人呼吸管組織是同源的。
盡管所述粘著檢測法有問題，Kellens等還是檢查了卡他摩拉克菌的80個臨床分離菌的血凝集活性(Kellens等，1995，Infection 2337-41)。差不多四分之三的所檢查菌株凝集人、兔、豚鼠、狗或大鼠紅細胞，而其它菌株不發生凝集。某些血凝集性菌株的血凝集活性進一步特征鑒定并表明是鈣離子依賴性的，而且受胰蛋白酶消化或高溫處理或加入D-葡萄糖胺或D-半乳糖胺的抑制。
由Tucker等對血凝集性和非血凝集性卡他摩拉克菌株的調查已表明，所有菌株結合糖脂神經節四糖神經酰胺，但是只有血凝集性菌株結合糖脂紅細胞四糖神經酰胺(Tucker等，1994，Annual Meeting ofAmer.Soc.Microbiol.，文摘號D124)。而且表明，卡他摩拉克菌的血凝集活性受構成紅細胞四糖神經酰胺的碳水化合物部分的各種單糖的抑制。這些觀測結果引導Tucker等提出卡他摩拉克菌通過結合到易感紅細胞細胞膜(包括人紅細胞細胞膜)上的紅細胞四糖神經酰胺引起血凝集。到目前為止，現有技術未鑒定出負責或者宿主細胞粘著或者血凝集的卡他摩拉克菌的外表面分子。
不能把本申請在這一小節或任何其它小節中任一文獻的引用或標引認為是表示本發明可以采用作為先有技術的這類文獻。
3.發明概述本發明包括卡他摩位克菌的OMP106多肽和OMP106衍生多肽以及制備所述多肽的方法。本發明也包括所述OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的特異抗血清和特異抗體，包括胞毒抗體。本發明還包括含一種或多種所述多肽的免疫原組合物、預防組合物或治療組合物，包括疫苗。本發明又包括編碼所述多肽的核苷酸序列。本發明還包括含減毒或滅活非血凝集性卡他摩位克菌品種的免疫原組合物、預防組合物或治療組合物，包括疫苗。
本發明具有多種用途。例如，所述OMP106多肽和OMP106衍生多肽可以用作檢測應答卡他摩拉克菌感染所產生的抗體的配基(例如，在診斷卡他摩拉克菌感染方面)。所述OMP106多肽和OMP106衍生多肽也可以用作誘導卡他摩拉克菌特異性抗體的免疫原。這類抗體用于免疫檢測中以檢測生物樣品中的卡他摩拉克菌。本發明的胞毒抗體在抗卡他摩拉克菌感染的被動免疫中是有用的。所述OMP106多肽和OMP106衍生多肽還可以用作抗卡他摩拉克菌感染的疫苗的活性成分。
本發明基于下述驚人的發現，即血凝集性卡他摩拉克菌菌株和其品種具有分子量大約180kD至大約230kD的外膜蛋白OMP106多肽，而非血凝集性卡他摩拉克菌菌株和其培養物或者不具有OMP106多肽或者具有不引起血凝集和不可銀染色的不當修飾的OMP106多肽。本發明還基于發現，自血凝集性卡他摩拉克菌菌株分離的OMP106多肽誘導的多克隆抗血清對不同的血凝集性卡他摩拉克菌菌株具有胞毒活性，但是對非血凝集性卡他摩拉克菌菌株無胞毒活性。
3.1.定義知縮寫抗-OMP106＝抗-OMP106多肽抗體或抗血清ATCC ＝美國典型培養物保藏中心大囊泡(blebs)＝天然產生的卡他摩拉菌外膜囊泡Gb4 ＝GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4G1c1-1神經酰胺HA ＝血凝集免疫應答性的 ＝能激發細胞免疫應答或體液免疫應答kD ＝千道爾頓卡他摩拉克菌 ＝Mc；卡他摩拉克菌卡他摩拉克菌(布蘭漢氏球菌)卡他布蘭漢氏球菌卡他奈瑟菌；或卡他微球菌NHA ＝非血凝集性OG ＝正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(n-octyl β-D-glucopyranoside)或辛基葡糖苷OMP106 ＝卡他摩拉克菌的外膜蛋白-106多肽，SDS-PAGE顯示其分子量為180kD-230kD；用OG或Sarkosyl去污劑可從卡他摩拉克菌的大囊泡或完整細胞提取OMP106衍生多肽 ＝所述OMP106多肽的片段；變異體，含一個或多個氨基酸缺失、插入或置換的野生型OMP106多肽或其片段；或者嵌合蛋白，含有融合到整個或部分OMP106多肽的C-末端或N-末端或內部區段的異源多肽OMP ＝外膜蛋白OMPs＝多種外膜蛋白PBS ＝磷酸緩沖鹽溶液PAG ＝聚丙烯酰胺凝膠多肽＝任何長度的多肽，最好為含十個或更多氨基酸殘基的多肽SDS ＝十二烷基硫酸鈉SDS-PAGE＝十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳本文定義的核苷酸或核酸序列如下用一個字母符號表示堿基A(腺嘌呤)C(胞嘧啶)G(鳥嘌呤)T(胸腺嘧啶)U(尿嘧啶)
M(A或C)R(A或G)W(A或T/U)S(C或G)Y(C或T/U)K(G或T/U)V(A或C或G；非T/U)H(A或C或T/U；非G)D(A或G或T/U；非C)B(C或G或T/U；非A)N(A或C或G或T/U)或(未知堿基)本文所定義的肽和多肽序列用一個字母符號如下表示氨基酸殘基A(丙氨酸)R(精氨酸)N(天冬酰胺)D(天冬氨酸)C(半胱氨酸)Q(谷氨酰胺)E(谷氨酸)G(甘氨酸)H(組氨酸)I(異亮氨酸)L(亮氨酸)K(賴氨酸)M(蛋氨酸)F(苯丙氨酸)
P(脯氨酸)S(絲氨酸)T(蘇氨酸)W(色氨酸)Y(酪氨酸)V(纈氨酸)X(未知的)通過參看本發明的以下詳細說明、本發明具體實施方案的非限制性例子和附圖可以更全面地理解本發明。
4.附圖簡述


圖1變性PAGE比較卡他摩拉克菌大囊泡或整個卡他摩拉克菌細胞辛基葡糖苷(OG)提取物的外膜蛋白型。泳道上的數字指的是美國典型培養物保藏中心(ATCC)菌株標識。預染色的SDS-PAGE標準品(BioRad分類目錄號161-0305)用作分子量標記物。所述標準品由以下多肽(括號內數字為其近似分子量)組成兔肌肉磷酸化酶B(106kD)；牛血清白蛋白(80kD)；雞卵清蛋白(49.5kD)；牛碳酸酐酶(32.5kD)；大豆胰蛋白酶抑制劑(27.5kD)；雞卵清溶菌酶(18.5kD)。分子量標記物在凝膠中的位置用箭頭標注在該圖的左側，箭頭上為部分標記物的分子量(kD)。
圖2用125I標記外膜大囊泡覆蓋糖脂的薄層層析譜結果。在A-C薄層板中，第1道含糖脂標準品(標示在左側)；第2道含去唾液酸-GM1；第3道含Gb3、Gb4和福斯曼抗原；和第4道含人紅細胞的Folch提取物。板A中顯示的層析譜是用地衣二酚染色的，板B中顯示的層析譜是用雙ATCC菌株8176(非血凝集性菌株)的125I標記的大囊泡覆蓋的，而板C中顯示的層析譜是用ATCC菌株49143(血凝集性菌株)的125I標記的大囊泡覆蓋的。只有所述血凝集性菌株結合到第3和第4道的Gb4糖脂帶上。
圖3用該圖中所示蛋白酶消化所述卡他摩拉克菌細胞后，銀染外膜蛋白辛基葡糖苷提取物的蛋白型。消化后所述細胞的血凝集活性標示在該圖下方標記為HA的行中。所用分子量標記物同
圖1。
圖4通過銀染不同ATCC卡他摩拉克菌菌株的外膜蛋白的蛋白質型比較。菌株標識標示在泳道的上方。所述菌株的血凝集活性標示在該圖下方的標記為HA的行中。注意到表觀分子量大于兔肌肉磷酸化酶B(106kD)的一種蛋白普遍存在于血凝集性菌株中，但是不存在于非血凝集性菌株中。這一種多肽命名為OMP106。所用分子量標記物同
圖1。
圖5通過銀染得自卡他摩拉克菌ATCC 49143的兩個品種49143(血凝集性品種)和49143-NHA(非血凝集性品種)的外膜蛋白的蛋白質型比較。所述品種的血凝集活性標示在圖下方的標記為HA的行中。注意到在所述非血凝集性品種中無所述OMP106多肽電泳帶(用＜表示)。所用分子量標記物同
圖1。
圖6在6％變性聚丙烯酰胺凝膠中用ATCC菌株49143的OG提取物估測OMP106的分子量，所述菌株在上樣到凝膠之前于或者25℃或者100℃溫育于樣品緩沖液中。通過還原銀染色可見到凝膠中的蛋白質。注意到所述OMP106多肽電泳帶(用＜表示)僅見于100℃溫育的樣品。寬范圍的SDS-PAGE標準品(Biorad分類目錄號161-0317)用作分子量標記物。所述標準品由下列多肽(括號內為其近似分子量)組成兔骨骼肌肌球蛋白(200kD)；大腸桿菌β-半乳糖苷酶(116kD)；兔肌肉磷酸化酶B(97.4kD)；牛血清白蛋白(66.2kD)。分子量標記物在凝膠中的位置用箭頭標注在該圖右側，箭頭上方為標記物的分子量。
圖7用Mc5-72探查的卡他摩拉克菌染色體DNA的DraI和HindIII限制性內切核酸酶消化產物的Southen印跡分析。用DraI或HindIII消化卡他摩拉克菌菌株49143的DNA。用Mc5-72(SEQ IDNO4)作探針進行消化DNA的Southern分析。用2×SSC、1％SDS于50℃高度嚴格洗滌大約20至大約30分鐘。第1道含HindIII消化產物；其雜交帶大小大約為8.0kb。第2道含DraI消化產物其雜交帶大小大約為4.2KB。
圖8A和8B用OMP106的兔抗血清作探針進行的卡他摩拉克菌和相關菌種的蛋白提取物的Westen印跡分析(圖8A)，與用OMP106免疫該兔前的血清反應性比較(圖8B)。圖8A和8B各泳道中的樣品如下A道為卡他摩拉克菌；B道為羊摩拉克菌；C道為腔隙摩拉克菌；D道為奧斯陸摩拉克菌；E道為牛摩拉克菌；F道為腦膜炎奈菌；G道為淋病奈瑟菌。所用分子量標記物同
圖1。
圖9A蛋白質印跡分析，表明卡他摩拉克菌ATCC 49143的所述OMP106多肽的兔抗血清與許多HA和NHA卡他摩拉克菌菌株類似分子量的多肽發生交叉反應(箭頭指示所述OMP106多肽的位置)。所述蛋白質印跡檢查不同卡他摩拉克菌菌株的辛基葡糖苷提取物。所述菌株的ATCC登記號標示在泳道的頂部。所用轉移和蛋白質印跡方法與用于獲得圖8所示印跡的方法相同。
圖9B用與圖9A中所用的相應的免疫前血清對與圖9A中相同的提取物的蛋白質印跡。
5.本發明詳細說明5.1血凝集和非血凝集品種本發明提供卡他摩拉克菌的分離的或大致純的OMP106多肽。所述OMP106多肽包括包埋在細菌外膜中或位于外膜外表面的整個蛋白或其蛋白亞基，所述細菌為卡他摩拉克菌的血凝集(HA)菌株和許多非血凝集(NHA)菌株以及品種。OMP106直接或間接組成所述HA菌株和品種的血凝集表型。按照本發明，在諸如Soto-Hernandez等(1989，J.Clin.Microbiol 27903-908)講述的任何標準血凝集檢測中，HA卡他摩拉克菌細胞均凝集人或兔紅細胞。雖然不想被限制于任何具體的作用機理，但是目前仍然設想卡他摩拉克菌通過結合到宿主細胞表面糖脂和糖蛋白受體的紅細胞四糖(Gb4)部分，從而使紅細胞凝集，而且設想所述血凝集活性部分由具有易于銀染色特殊性質的經適當修飾的OMP106多肽介導。相反，未修飾或不當修飾的OMP106多肽既不能有效介導血凝集也不能銀染。而且，OMP106多肽是唯一在SDS-PAGE中具有大約180kD至大約230kD表觀分子量、可從HA或NHA卡他摩拉克菌大囊泡或完整細胞用OG或Sarkosyl提取的多肽。
HA卡他摩拉克菌細胞的血凝集活性被紅細胞四糖(GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4G1cβ1；Gb4)和組成Gb4的單糖抑制，所述單糖包括N-乙酰-D-半乳糖胺、D-半乳糖和葡萄糖和其衍生物，諸如甲基-α-半乳糖或甲基-β-半乳糖。HA卡他摩拉克菌細胞的血凝集活性也受相對較高濃度的許多其它糖的抑制，所述糖包括(但不限于)D-甘露糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺。
通過用各種蛋白酶消化完整的卡他摩拉克菌細胞使完整HA卡他摩拉克菌細胞的血凝集活性和OMP106多肽均減少或破壞，所述蛋白酶包括(但不限于)TLCK(Na-對甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基酮(也叫作1-氯-3-甲苯磺酰氨基-7-氨基-L-2-庚酮)處理后的胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和TPCK(N-對甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮)處理后的胰蛋白酶。然而，蛋白酶V8消化完整的HA卡他摩拉克菌細胞既不影響這類細胞的OMP106多肽血凝集活性，也不影響其生理完整性。
通過在靜止液體培養物(即，沒有振蕩的維持在35℃的液體培養物)中連續傳代，從HA卡他摩拉菌菌株或品種可以衍生獲得非血凝集(NHA)品種。例如，HA卡他摩拉克菌菌株或品種生長在Mueller Hinton肉湯中，并每5天從靜止培養物表面取出接種物，以接種后續的靜止培養物。最好的接種物是在培養物表面的任何漂浮層(floating mat)細胞。在靜止培養物中連續傳代直到產生NHA品種。本發明的NHA品種可以用于產生抗卡他摩拉克菌感染的保護性疫苗，諸如全細胞疫苗。
相反，通過在振蕩的液體培養物中，將所述菌株或品種傳代，可以保持HA卡他摩拉菌菌株或品種的血凝集表現型。在實施方案中，HA卡他摩拉克菌菌株或品種生長于35-37℃的Mueller Hinton肉湯中，并以大約200RPM振蕩，而且每24-48小時傳代一次。在固體培養基上傳代也可以維持HA卡他摩拉克菌菌株或品種的血凝集表現型。例如，HA卡他摩拉克菌菌株或品種生長于含血瓊脂或MuellerHinton瓊脂平板上。
5.2.OMP106多肽本發明的OMP106多肽是HA卡他摩拉克菌菌株或品種的唯一外膜蛋白，該外膜蛋白在SDS-PAGE中的表觀分子量大約為180kD至大約230kD，優選大約為190kD。根據本發明，卡他摩拉克菌外膜蛋白是存在于卡他摩拉克菌大囊泡、或者可以在室溫下用含正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)或者Sarkosyl去污劑的緩沖液從卡他摩拉克菌大囊泡或完整細胞提取的多肽。關于卡他摩拉克菌大囊泡的討論，參見Murphy和Loeb，1989，Microbial Pathogenesis 6159-174，該菌大囊泡是由卡他摩拉克菌外膜組成的天然產生的泡囊。NHA卡他摩拉克菌菌株或品種或者不具有OMP106多肽，或者具有結合抗OMP106抗體(參見下文的5.5.小節)形式但不與銀染色劑反應(即采用Silver Stain Plus ofBioRad[Richmond，CA]的OMP106多肽，或者采用Gottlieb和Chauko，1987，Anal.Biochem.16533所述的方法)。相反，HA卡他摩拉菌菌株或品種的OMP106多肽結合抗-OMP106抗體，且與銀染色劑發生反應。
利用其易于被蛋白酶處理降解的特性，可以在HA卡他摩拉克菌大囊泡或完整細胞中鑒定OMP106多肽，所述蛋白酶處理也消除或減弱同一HA菌株的血凝集活性(參見上面5.1.小節關于破壞或不破壞完整卡他摩拉克菌細胞血凝集活性的蛋白酶例子)。換言之，與消化前從同一菌株或品種分離的OMP106多肽比較，用破壞或減弱HA菌株或品種血凝集活性的蛋白酶消化，也會改變從經這種消化之后的菌株或品種分離的OMP106多肽在SDS-PAGE中的多度和位置。
OMP106也可以作為存在于卡他摩拉克菌大囊泡或完整細胞的OG或Sarkosyl提取物中的多肽鑒定，正如采用在Harlow和Lane(抗體實驗室操作手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，附錄I，1988)中所述的制劑，在具有SDS的12％PAG中的變性凝膠電泳測定的，該多肽的表觀分子量大于106kD。于100℃熱處理所述OG或Sarkosyl提取物5分鐘，可以使所述OMP106具有大約108kD至大約230kD的表觀分子量，所述分子量為采用在Harlow和Lane(同上)中所述的制劑，在沒有任何還原劑的6％PAG中的SDS-PAGE測定的。在具體實施方案中，在卡他摩位克菌菌株ATCC 49143的熱處理OG或sarkosyl提取物中的OMP106多肽具有大約190kD的表觀分子量。
在具體實施方案中，所述OMP106多肽是從任何一種卡他摩拉克菌菌株制得的多肽，所述菌株包括(但不限于)ATCC 49143、ATCC25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628。OMP106多肽的優選來源是這些菌株的HA品種。更為優選的來源是ATCC 49143的HA品種。
在具體實施方案中，OMP106多肽在氨基末端最好含有氨基酸序列IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQ ID NO1)或與該序列大致同源的序列。所述OMP106多肽還可以在上述序列的遠側羧基端含有氨基酸序列GTVLGGKK(SEQ ID NO2)的八肽或與該序列大致同源的序列。本文所用的大致同源氨基酸序列至少90％、最好100％與所述參照氨基酸序列相同。
根據本發明的各個不同方面，本發明的多肽的特征為，它們基于在SDS-PAGE中相對于已知分子量標記物遷移的該類多肽的遷移的表觀分子量。盡管本領域已知的任何分子量標準品可以用于SDS-PAGE，但是最好的分子量標記物至少包括兔骨骼肌肌球蛋白、大腸桿菌β-半乳糖苷酶和兔肌肉磷酸化酶B。本領域技術人員會知道本發明的多肽在不同類型凝膠系統(例如，不同緩沖液；不同濃度的凝膠、交聯劑或SDS)中可能遷移距離不同。本領域技術人員也會知道因為用于SDS-PAGE的分子量標記物不同，所述多肽可以有不同的表觀分子量。所以，本發明多肽的分子量特征是指在任何SDS-PAGE系統和應用任何分子量標記物涉及同一類多肽，所述分子量標記物可能顯示該類多肽較此處公開的多肽的表觀分子量略有不同。
5.3.OMP106衍生多肽本發明的OMP106多肽可以是所述OMP106多肽的片段。所述完整的OMP106多肽可以含有其免疫原性非必需的一個或多個氨基酸殘基。可以是這種情況，例如，只有形成所述OMP106多肽特定表位的氨基酸殘基是免疫原活性必需的。采用本領域熟知的技術可以去除非必需氨基酸序列。例如，通過用諸如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或相關蛋白水解酶的有限蛋白水解消化，或通過用諸如溴化氰類的試劑化學切割，可以去除不需要的氨基酸序列，然后分級分離所消化或切割的產物。
本發明的OMP106衍生多肽也可以是修飾的OMP106多肽或其片段(即，OMP106多肽或片段含有所述野生型OMP106序列的一個或多個氨基酸置換、插入和/或缺失)。這類修飾可以增強所產生的多肽產物的免疫原性或者對此活性沒有影響。可以利用的修飾技術包括美國專利號4,526,716中公開的技術。
OMP106衍生多肽還可以是包含一種或多種異源多肽的嵌合多肽，所述異源多肽融合到完整OMP106多肽或其部分或其片段的氨基末端或羧基末端或內部。構成這種嵌合多肽的有用的異源多肽包括(但不限于)，a)促進宿主細胞中的所述OMP106衍生多肽的轉運、易位和/或加工的前和/或原序列，b)親和純化序列，和c)任何有用的免疫原序列(例如，編碼微生物病原體表面暴露蛋白的一種或多種表位的序列)。
可優選的是，本發明的OMP106衍生多肽可與該OMP106多肽發生免疫交叉反應，因此能夠在動物中引發對卡他摩拉克菌的免疫應答。更為優選的是，本發明的OMP106衍生多肽包含形成卡他摩拉克菌天然OMP106多肽的一種或多種外表面表位(即，OMP106多肽本身存在于完整的卡他摩拉克菌細胞時的表面暴露表位)的序列。通過它們特異性結合針對整個卡他摩位克菌細胞產生的抗體(例如，由甲醛或戊二醛固定的卡他摩拉克菌細胞誘發的抗體；在此處這類抗體稱為“抗全細胞”抗體)的能力，可以鑒定這類優選OMP106衍生多肽。例如，對得自所述OMP106多肽有限的或完全的蛋白酶消化的多肽或肽采用標準方法分級分離，并檢測它們結合抗全細胞抗體的能力。反應性多肽包括優選的OMP106衍生多肽。可以分離這些多肽以及采用該領域已知的方法確定其氨基酸序列。
也可以優選的是，本發明的OMP106衍生多肽包含形成介導HA卡他摩拉克菌細胞血凝集的天然OMP106多肽的一種或多種表位的序列。由它們干擾HA卡他摩拉克菌細胞血凝集的能力可以鑒定這類優選OMP106衍生多肽。例如，用標準方法分段分離得自有限或完全蛋白酶消化或化學切割OMP106多肽的多肽，并檢測其干擾卡他摩拉克菌細胞血凝集的能力。一旦鑒定和分離后，就用標準序列分析方法確定這類優選OMP106衍生多肽的氨基酸順序。采用合成化學和/或遺傳工程方法可以用所述確定序列實現這類多肽的生產。
通過用抗全細胞抗體篩選表達卡他摩拉克菌基因組DNA的隨機片段的細菌庫或編碼所述OMP106多肽的克隆核苷酸序列，也可以鑒定這些優選OMP106衍生多肽。參見例如Sambrook等，分子克隆，實驗室操作手冊，第2版，冷泉港出版社，紐約，第1卷，第12章。鑒定反應性克隆，然后分離及序列分析其插入片段，以確定這類優選OMP106衍生多肽的氨基酸順序。
5.4.OMP106多肽知OMP106衍生多肽的分離和純化本發明提供分離的OMP106多肽和OMP106衍生多肽。本文所用的術語“分離的”指該產品明顯不含與其天然相連的其它生物物質。也就是說，例如，一種分離的OMP106多肽組合物為純度約為70％-94％(重量)的OMP106多肽。最好純化本發明的OMP106和OMP106衍生多肽。本文所用的術語“純化的”指該產品大致不含與其天然相連的其它生物物質。也就是說，純化的OMP106多肽組合物為純度至少為95％(重量)的OMP106多肽，優選為純度至少為98％(重量)的OMP106多肽，和最優選為純度至少為99％(重量)的OMP106多肽。
可以從任何卡他摩拉克菌菌株或品種的蛋白提取物(包括全細胞提取物)中分離本發明的OMP106多肽。所述蛋白提取物最好是卡他摩拉克菌外膜泡囊(即大囊泡)或全細胞的辛基葡糖苷或sarkosyl提取物，所述卡他摩拉克菌包括(但不限于)菌株ATCC 49143、ATCC25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628中的任何菌株。這類提取物的優選來源是這類菌株的HA品種。這類提取物更優選來源是ATCC 49143的HA品種。所述OMP106多肽的另一來源是得自表達編碼OMP106多肽或OMP106衍生多肽的克隆序列的基因表達系統的蛋白質制劑(參見下文5.8.小節)。
可以采用本領域技術人員熟知的任何生化技術和方法，從源材料分離和純化所述OMP106多肽。在一種方法中，用標準技術獲得卡他摩拉菌外膜，之后用諸如去污劑的增溶化合物溶解外膜蛋白。優選增溶溶液是含約1.25％(w/v)辛基吡喃葡萄糖苷(OG)的增溶溶液。另一優選增溶溶液是含約1.25％Sarkosyl的增溶溶液。OMP106多肽存在于增溶溶解部分。分離且最好通過離心去除提取物中的細胞碎片和不溶性物質。濃縮提取物中的多肽，并將該多肽于100℃在含SDS的Laemmli凝膠樣品緩沖液中溫育5分鐘，然后在沒有還原劑的6％變性十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠(PAG)中電泳分級分離該多肽。參見Laemmli，1970，Nature 227680-685。然后可以直接從含所述OMP106多肽的分級分離部分或凝膠片分離如上述的鑒定為OMP106多肽的帶或分級分離部分(例如，存在于HA的OG或Sarkosyl提取物中的銀染多肽帶，所述提取物不是相應的NHA品種的提取物或者用消除血凝集活性的蛋白酶消化之后的HA品種的提取物)。在優選實施方案中，正如通過比較在變性SDS-PAGE中相對于兔骨骼肌肌球蛋白(200kD)和大腸桿菌β-半乳糖苷酶(116kD)的遷移距離或遷移率所確定的，OMP106多肽具有190kD的表觀分子量。
純化OMP106的另一方法是用抗-OMP106抗體的親和層析法(參見5.5.小節)。最好用單克隆的抗-OMP106抗體。該類抗體共價連接到通過溴化氰或琥珀酸胺酯(Affi-Gel，BioRad，Inc.)或通過本領域技術人員已知的其它方法活化的瓊脂糖凝膠上。如上所述將蛋白質提取物加到凝膠頂部。讓其接觸一定時間并在標準反應條件下讓OMP106多肽充分結合到所述抗體。固相支持體最好是用于層析柱的材料。然后使OMP106與所述抗體分離，這樣允許OMP106多肽以分離的或最好是純化的形式回收。
通過分離或純化的OMP106的化學和/或酶切割或者降解，可以產生本發明的OMP106衍生多肽。在已知OMP106多肽氨基酸順序的基礎上，而在嵌合多肽的情況下，在通過本領域熟知的方法知道這些異源多肽的氨基酸順序的基礎上，也可以化學合成OMP106衍生多肽。參見例如Creighton，1983，ProteinsStructures and Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.，NY。
也可以在表達重組核苷酸構建物的基因表達系統中產生OMP106衍生多肽，其中所述重組基因構建物含OMP106衍生多肽編碼序列。根據本領域技術人員熟各的技術可以合成、和/或克隆及表達編碼本發明多肽的核苷酸序列。參見例如Sambrook等，1989，分子克隆，實驗室操作手冊，第1-3卷，冷泉港出版社，紐約，第九章。
可以應用標準蛋白質純化技術分級分離及純化本發明的OMP106衍生多肽，根據本文所述的發現和內容可以修飾及應用本發明的OMP106衍生多肽。特別是，根據以上公開的分離及純化OMP106多肽的親和方法，可以分離和純化形成天然OMP106多肽外表面表位的這些本發明的優選OMP106多肽(例如，用抗-OMP106抗體進行親和純化)。
假如需要的話，可以采用標準蛋白質或肽純化技術進一步純化本發明的多肽，所述純化技術包括(但不限于)電泳、離心、凝膠過濾、沉淀、透析、層析(包括離子交換層析、親和層析、免疫吸附親和層析、反相高效液相層析和凝膠滲透高效液相層析)、等電聚焦、和以上方法的變化方法及聯用。
一種或多種這些技術可以連續用在設計的程序中，以便根據其物理或化學特性分離分子。這些特性包括該蛋白質的疏水性、電荷、結合能力和分子量。檢測每一技術后獲得材料的不同部結合所述OMP106受體或配體、結合抗-OMP106抗體或干擾HA卡他摩拉克菌細胞血凝集的能力(“試驗”活性)。然后將顯示此活性的那些部分提供給連續程序中的下一技術，并再檢測所述新部分。重復此過程，直到只存在一種部分具有上述“試驗”活性，并且當進行聚丙烯酰胺凝膠電泳或層析時該部分時，只產生唯一的條帶或實體。
5.5OMP106免疫原和抗-OMP106抗體本發明提供特異性結合OMP106多肽或OMP106衍生多肽的抗體。為了生產這類抗體，將OMP106多肽或OMP106衍生多肽的分離的或最好是純化的制劑用作免疫原。
在一實施方案中，用SDS-PAGE(參見前面5.2.小節)從存在于HA卡他摩拉克菌細胞或大囊泡外膜的OG或Sarkosyl提取物中的其它外膜蛋白質中分離所述OMP106多肽，將含OMP106多肽的凝膠片用作免疫原并注射到兔中，以產生含多克隆OMP106抗體的抗血清。可以用同一免疫原免疫小鼠，以生產產生單克隆抗-OMP106抗體的雜交瘤系。在具體實施方案中，將含有得自任何一種菌株的分離的或純化的OMP106的PAG片用作免疫原，所述菌株為ATCC 49143、ATCC25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628。在優選實施方案中，使用含有得自這類菌株的HA品種的分離的或純化的OMP106的PAG片。在更優選實施方案中，將得自菌株ATCC 49143的HA品種的分離或純化的OMP106的PAG片用作免疫原。
在其它實施方案中，OMP106多肽的肽片段用作免疫原。優選使用純化的OMP106多肽的肽片段。可以通過蛋白酶消化、化學切割分離或純化的OMP106多肽或者通過化學合成生產所述肽，然后可以分離或純化所述肽。這類分離或純化的肽可以直接用作免疫原。在具體實施方案中，有用的肽片段包括(但不限于)含有序列IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQ ID NO1)的那些肽或長度為6個或更多氨基酸的其任何部分。在另一實施方案中，所述肽片段含有序列GTVLGGKK(SEQ ID NO2)。
有用的免疫原也可以包括綴合到載體分子、最好是載體蛋白的這類肽或肽片段。載體蛋白可以是通常用于免疫學的任何載體蛋白，包括(但不限于)牛血清白蛋白(BSA)、雞白蛋白、鑰孔血藍蛋白(KLH)等等。關于半抗原蛋白綴合物的討論，參見例如Hartlow等，抗體實驗室操作手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1988，或者標準免疫學教科書，諸如Roitt.I.等，免疫學，C.V.Mosby Co.，St.Louis，MO(1985)或Klein，J.免疫學，Blackwell Scientific Publications，Inc.，Cambridge，MA，(1990)。
在又一實施方案中，為了產生特異性結合所述天然OMP106多肽的一種或多種外表面表位的抗體，完整HA卡他摩拉克菌細胞或由其制備的大囊泡用作免疫原。在免疫之前可以用諸如甲醛或戊二醛之類的試劑固定所述細胞或大囊泡。參見Harlow和Lane，抗體實驗室操作手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1988，第15章。最好這類抗-全細胞抗體是單克隆抗體。通過用純化的OMP106多肽作為篩選配位，可以鑒定產生所需要的單克隆抗體的雜交瘤系。任何一種卡他摩拉克菌菌株的細胞或大囊泡用作誘導這些抗體的免疫原，所述菌株包括(但不限于)ATCC 49143、ATCC 25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628。可優選的是，這些菌株的HA品種的細胞或大囊泡用作免疫原。更優選的是，菌株ATCC 49143的HA品種的細胞或大囊泡用作誘導這些抗體的免疫原。
由全細胞或大囊泡免疫產生的多克隆抗體含有結合其它卡他摩拉克菌外膜蛋白的抗體(“非-抗-OMP106抗體”)，因此，當已知或懷疑所述樣品含有與這些其它外膜蛋白交叉反應的其它卡他摩拉克菌外膜蛋白或物質時，其使用更為麻煩。在這類情況下，必須通過同一樣品或帶同時與特異性結合OMP106多肽(例如，抗OMP106)和/或OMP106衍生多肽的抗體結合，或通過用抗OMP106抗體、OMP106多肽或OMP106衍生多肽作競爭物的競爭試驗(即，將抗-OMP106抗體、OMP106多肽或OMP106衍生多肽加入到反應混合物中，使樣品與抗-全細胞抗體結合減少或消除)，證實給定樣品或帶與抗-全細胞抗體的任何結合。另一方面，這類含有“非-抗-OMP106”抗體的多克隆抗血清可以采用標準途徑和方法去除這類抗體。例如，通過用NHA卡他摩拉克菌品種或已知不含所述OMP106多肽的卡他摩拉克菌菌株(例如ATCC 8176，更優選ATCC 49143的NHA品種)的細胞進行沉淀；或者通過吸附到含有這類細胞或這類細胞的外膜蛋白的柱子，可以去除這類非-抗-OMP106抗體。
在再一類實施方案中，引發本發明的抗體的有用免疫原包括二種或多種任何上述單個免疫原的混合物。
按照本領域技術人員熟知的方法，用本文所述免疫原免疫哺乳動物，最好是人、兔、大鼠、小鼠、綿羊、山羊、牛或馬，目的是獲得含多克隆抗體的抗血清或分泌單克隆抗體的雜交瘤系。
可以用標準技術制備單克隆抗體，已知其內容包含在本文中。這類技術例如公開在美國專利號4,271,145和美國專利號4,196,265中。簡單地說，用免疫原免疫動物。通過將已免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤。融合產物在產生結合所述免疫原的抗體的雜交瘤克隆方面進行篩選。分離陽性雜交瘤克隆，并從那些克隆回收所述單克隆抗體。
用于生產多克隆和單克隆抗體的免疫方法是本領域眾所周知的。免疫原注射可以采用許多途徑中任何一種途徑，包括皮下、靜脈內、腹膜內、皮內、肌內、粘膜或這些途徑的聯用。采用本領域眾所周知的方法和材料，可以注射可溶形式、凝聚形式、吸附到物理載體或與佐劑混合的免疫原。采用本領域技術人員熟知的柱層析法可以純化所述抗血清和抗體。
根據本發明，HA或NHA卡他摩拉克菌菌株的OMP106多肽是免疫交叉反應性的。因此，針對一種卡他摩拉克菌菌株或品種的OMP106多肽產生的抗體特異性結合其它卡他摩拉克菌菌株及培養物的OMP106多肽和OMP106衍生多肽。例如，由菌株ATCC 49143的OMP106多肽誘導的多克隆抗-OMP106抗體不僅特異性地結合同源的OMP106多肽(即，菌株ATCC 49143的OMP106多肽)，而且結合其它卡他摩拉克菌菌株的OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽，所述其它卡他摩拉克菌菌株包括(但不限于)ATCC 43628、ATCC 43627、ATCC 43618、ATCC 43617、ATCC 25240和ATCC 25238。
本發明的抗體(包括但不限于抗-OMP106抗體)可以用來促進OMP106和OMP106-衍生多肽的分離及純化。所述抗體也可以用作探針，以鑒定表達庫中具有編碼OMP106多肽或其片段的插入片段的克隆的。這類抗體也可以用于特異性檢測和/或定量生物樣品中的卡他摩拉克菌的免疫檢測法(例如，ELISA、RIA、免疫印跡)中。本發明的抗-OMP106抗體特異性結合OMP106多肽，而不結合得自相關細菌病原體的蛋白質，相關細菌病原體諸如羊摩克拉克菌、腔隙摩拉克菌、奧斯陸摩拉克菌、牛摩拉克菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。因此抗-OMP106抗體可以用來診斷卡他摩拉克菌感染。
本發明的抗體，尤其是那些胞毒抗體，也可以用來進行被動免疫，以防止或減輕動物(包括人類)的卡他摩拉克菌感染。(本文使用的胞毒抗體是促進免疫調理和/或補體殺傷已被該抗體結合的細菌的抗體)。可以給予宿主有效濃度的由本發明的免疫原產生的多克隆或單克隆抗體以獲得這類效應。給予所述抗體的確切濃度隨每一具體抗體制劑而變化，但是可以采用本領域普通技術人員熟知的標準技術確定給與的準確抗體濃度。可以采用各種技術，包括(但不限于)5.6.小節中所述的傳遞疫苗的這些技術，完成所述抗體的給與。
采用在實驗動物中的標準藥學方法可以確定本發明抗體的預防和治療效能。從動物研究獲得的數據可以用來計算用于人類的劑量范圍。
5.6.疫苗本發明也提供對抗動物卡他摩拉克菌感染的治療和預防疫苗，所述動物包括哺乳動物，更具體為嚙齒動物、靈長類動物以及人類。這些疫苗的最好應用于人類。可以采用本領域技術人員已知的技術制備該類疫苗，而且這類疫苗包括例如免疫原形式的抗原、藥學上可接受的載體、可能的適合佐劑、以及在疫苗中常規發現的可能的其它物質。從本文的內容來看，采用本領域已知的方法確定用于疫苗的免疫原的免疫學有效量。
本發明的疫苗包括免疫學有效量的任何在5.5小節中公開的藥學上可接受載體中的免疫原。
根據另一實施方案，本發明的疫苗包括免疫學有效量的本發明的滅活或減毒的HA卡他摩拉克菌品種或NHA卡他摩拉克菌品種。采用本領域已知的任何方法，包括(但不限于)化學處理(例如，福爾馬林)、熱處理及輻射，獲得滅活或減毒HA卡他摩拉克菌品種或NHA卡他摩拉克菌品種。
本文使用的術語“免疫學有效量”是指足以誘導免疫應答的量，該免疫應答可以防止卡他摩拉克菌感染或減輕任何先前存在或后來的卡他摩拉克菌感染的嚴重程度。其確切濃度將取決于給予的具體免疫原，但是通過采用本領域技術人員熟知的檢測免疫應答發展的標準技術，可以確定免疫原的準確濃度。
有用的多肽免疫原包括所述分離的OMP106多肽及OMP106-衍生多肽。優選免疫原包括所述純化的OMP106多肽和OMP106衍生多肽或肽。混合的免疫原和載體可以是水溶液、乳液或懸液。一般來說，多肽免疫原每一劑量的量為0.1-500微克。這類載體是本領域技術人員已知的，而且包括穩定劑、稀釋劑和緩沖劑。合適的穩定劑包括碳水化合物，諸如山梨醇、乳糖、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖和葡萄糖及蛋白質，諸如白蛋白或酪蛋白。合適的稀釋劑包括鹽水、Hanks平衡鹽溶液、和Ringers液。合適的緩沖劑包括堿金屬磷酸鹽、堿金屬碳酸鹽或堿土金屬碳酸鹽。所述疫苗也可以含有一種或多種佐劑以提高或增強免疫應答。合適的佐劑包括(但不限于)肽類；氫氧化鋁；磷酸鋁；氧化鋁；由例如Marcol 52類的礦物油、或者植物油與一種或多種乳化劑、或者諸如溶血卵磷脂、聚陽離子、聚陰離子類的表面活性物質組成的組合物；以及潛在有用的人類佐劑，例如卡介菌和小棒桿菌。所述疫苗也可以含有其它免疫原。這種聯合疫苗的優點是通過單次給與就可以獲得對幾種病原體的免疫性。其它免疫原的例子是用于已知的DPT疫苗中的那些免疫原。
采用本領域技術人員已知的技術制備本發明的疫苗，已知其內容已包含在本文中。一般來說，將免疫原與載體混合形成溶液、懸液或乳液。前面討論的一種或多種添加劑可以在載體中加入或者可以隨后加入。可以例如通過凍干干燥所述疫苗制劑，達到貯藏目的。假如如此，隨后可以通過加入適宜的液體載體將它們再復制成液體疫苗。
將所述疫苗給予人類或其它哺乳動物，包括嚙齒動物和靈長類動物。它們可以以一劑或多劑給與。可以由已知的給藥途徑給與疫苗。許多方法可以用來輸入此處描述的疫苗制劑。這些方法包括(但不限于經口、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下及鼻內途徑。優選途徑是肌內或皮下注射。
本發明也提供在哺乳動物誘導針對卡他摩拉克菌的免疫應答的方法，以便保護該哺乳動物抗感染和/或減輕由卡他摩拉克菌引起的疾病。所述方法包括給與宿主免疫有效量的本發明的免疫原，而且優選給與宿主本發明的疫苗。
5.7.編碼OMP106多肽和OMP106-衍生多肽的核酸本發明也提供編碼OMP106多肽和OMP106-衍生多肽的核酸、DNA和RNA。一方面，采用本領域已知的方法可以合成本發明的核酸。具體地說，采用本領域技術人員熟知的技術，例如通過Edman降解技術(參見例如Creighton，1983，蛋白質結構與分子原理，W.H.Freeman & Co.，N.Y.，第34-49頁)，可以確定OMP106或OMP-衍生多肽的部分或全部氨基酸順序。所獲得的氨基酸序列用作合成編碼OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的DNA的指導物，并采用常規化學方法或聚合酶鏈式反應(PCR)擴增重疊的寡核苷酸。
另一方面，所述氨基酸序列可以用作合成寡核苷酸混合物的指導物，所述寡核苷酸混合物可以再用來篩選卡他摩拉克菌基因組文庫中的OMP106多肽編碼序列。可以從任何卡他摩拉克菌菌株細胞分離DNA制得這類文庫。對于基因組文庫以及PCR擴增而言，優選用作所述OMP106多肽編碼序列的DNA從任何卡他摩拉克菌菌株細胞制得，所述卡他摩拉克菌菌株包括(但不限于)ATCC 49143、ATCC25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC 43628。
在基因組文庫的制備中產生DNA片段，其中某些片段編碼部分或整個卡他摩拉克菌OMP106多肽。采用不同限制酶在特定位點切割該DNA。或者，在錳存在下可以用DNA酶使該DNA斷裂成片段，或者可以物理剪切該DNA，例如超聲處理。然后，可以采用標準技術根據片段大小分離所述DNA片段，所述標準技術包括(但不限于)瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳、柱層析以及蔗糖梯度離心。之后將所述DNA片段插入到合適的載體，載體包括(但不限于)質粒、粘粒、λ或T4噬菌體及酵母人工染色體(YAC)。(參見例如Sambrook等，1989，分子克隆，實驗室操作手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Glover，D.M.(編輯)，1985，DNA克隆實用方法，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.，第I、II卷)。通過核酸與標記探針雜交可以篩選基因組文庫(Benton和Davis，1977，Science 196180；Grunstein和Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 723961)。
采用本領域熟知的最佳方法，用相應于OMP106多肽的任何肽氨基酸順序的標記變性寡核苷酸，可以篩選所述基因組文庫，在特定實施方案中，所述篩選探針是一簡并寡核苷酸，它相應于具有序列IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQID NO1)或其部分的肽。在另一實施方案中，所述篩選探針可以是相應于具有序列GTVLGGKK(SEQ ID NO2)的肽的簡并寡核苷酸。在又一實施方案中，將均相應于OMP106肽GTVLGGKK(SEQ ID NO2)的寡核苷酸GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR(SEQ ID NO3)和GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR(SEQ ID NO7)用作探針。在再一實施方案中，序列GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA(SEQ ID NO4)或其任何片段、或者該序列或片段的任何互補序列可以用作探針。所用的任何探針最好為15個核苷酸或更長。
在具有編碼所述OMP106多肽或其片段的插入DNA的文庫中的克隆，將與一種或多種簡并寡核苷酸探針雜交。采用本領域已知的方法進行這類寡核苷酸探針與基因組文庫的雜交。例如，與兩種上述寡核苷酸探針的雜交可以在2×SSC、1.0％SDS中于50℃進行，并采用同樣條件沖洗。在一特定實施方案中，編碼完整或部分所述OMP106多肽的ATCC 49143DNA序列是長度約8,000bp的HindIII限制片段或長度約4,200bp的DRAI限制片段。
又一方面，通過篩選卡他摩拉克菌表達文庫，也可以獲得編碼部分或完整的OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的核苷酸序列的克隆。例如，分離卡他摩拉菌DNA，制備隨機片段并將其連接到表達載體(例如，噬菌體、質粒、噬菌粒或粘粒)中，使得插入該載體中的序列能夠由然后導入該載體的宿主細胞表達。然后可以應用各種篩選檢測，在表達OMP106多肽或OMP106-衍生多肽方面進行選擇。在一實施方案中，采用本領域已知的方法，可以用本發明的不同抗OMP106抗體(參見5.5.小節)來鑒定所需要的克隆。參見例如Harlow和Lane，1988，抗體實驗室操作手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，附錄IV。使得自所述文庫的克隆或噬菌斑與所述抗體接觸，以鑒定那些結合的克隆。
在一實施方案中，根據Olsvick等，29th ICAAC，Houston，Tex.1989(通過引用結合到本文中)，可以采用DYNA珠檢測含有編碼OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的DNA的克隆或噬菌斑。將抗-OMP106抗體交聯到對甲苯磺酰化的DYNA珠M280上，然后用這些含有抗體的珠來吸附表達OMP106多肽或OMP106衍生多肽的克隆或噬菌斑。將表達OMP106多肽或OMP106衍生多肽的克隆或噬菌體鑒定為結合所述珠的這些克隆中的任何一種。
另一方面，所述抗-OMP106抗體可以非特異地固定到合適的支持體，例如二氧化硅或CeliteTM樹脂。然后可以如在前一段中所述，將這種材料用來吸附表達OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的細菌克隆。
再一方面，PCR擴增可以用來從卡他摩拉克菌基因組DNA中生產編碼部分或完整OMP106多肽的大致純的DNA。相應于已知OMP106多肽順序的簡并或非簡并的寡核苷酸引可以用作引物。在一特定實施方案中，編碼肽IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQ ID NO1)或其任一部分簡并性或非簡并寡核苷酸可以用作5’引物。例如，5’引物可以是核苷酸序列GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA(SEQ ID NO4)或其任何部分。例如，為編碼GTVLGGKK(SEQ ID NO2)的序列的反向互補序列的、簡并或非簡并核苷酸序列可以用作3’引物。例如，具有簡并核苷酸順序YTTYTTNCCNCCNAGNACNGTNCC(SEQ ID NO6)或YTTYTTNCC NCCYAANACNGTNCC(SEQ ID NO8)的簡并或非簡并寡核苷酸可以用作3’引物，該引物與前面討論的不同的5’引物連接。
可以例如采用Perkin-Elmer Cetus熱循環儀和Taq聚合酶(GeneAmpTM)進行PCR。人們可以選擇合成幾種不同的簡并引物用于所述PCR反應。改變用于引發PCR反應的雜交條件的嚴格度也是可能的，以允許簡并引物與卡他摩拉克菌DNA中的相應序列之間的核苷酸順序相似性更高或更低。在成功擴增編碼OMP106的序列的一個區段之后，可以分子克隆及序列分析該區段，并將其用作探針以分離全部基因組克隆。如下所述，這可以依次允許確定所述基因的全部核苷酸順序、分析其表達及產生其蛋白產物以進行功能分析。
一旦從一種卡他摩拉克菌菌株或品種中分離出OMP106多肽編碼序列，則可以采用同一方法從其它卡他摩拉克菌菌株及品種中分離OMP106多肽編碼序列。本領域技術人員會知道，采用本領域已知的一般技術，可以用本發明的編碼OMP106多肽(或其片段)的DNA或RNA序列來獲得在中度至高度嚴格的條件下與其雜交的其它DNA或RNA序列。在高度嚴格條件下與得自一種卡他摩拉克菌株或品種的OMP106序列的雜交反應，可以鑒定得自其它菌株和品種的相應序列。高度嚴格的條件隨探針長度及堿基組成而變化。確定這類條件的方法是本領域熟知的。參見Sambrook等，1989，分子克隆，實驗室操作手冊，冷泉港出版社，紐約，第11章。用在此處的用于大于300個堿基長度的探針的高度嚴格的雜交條件，包括最后在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃洗滌至少1小時(Ausubel等編輯，1989，Current Protocolsin Molecular Biology，第1卷，Greene Publishing Associates，Inc.andJohn Wiley & Sons，Inc.，紐約，第2.10.3頁)。在具體實施方案中，在雜交反應中采用具有SEQ ID NO4的序列或其相互序列的探針的高度嚴格沖洗，在2×SSC、1％SDS中于50℃洗滌約20至約30分鐘。
本領域技術人員采用本領域熟知的方法能夠鑒定OMP106多肽編碼序列的全部克隆。通過序列分析所克隆的插入片段并比較可讀框(ORFs)編碼多肽的推測大小與OMP106多肽的大小，和/或通過比較所推測的氨基酸序列與純化OMP106多肽已知的氨基酸順序，可以確定在所分離的克隆中含有的OMP106多肽編碼序列的程度。分離出OMP106多肽編碼序列的部分克隆時，就可以采用該部分克隆酸插入片段作為雜交探針分離完整克隆。另一方面，通過將各部分克隆的插入片段剪接在一起，可以由重疊部分克隆再構建完整的OMP106多肽編碼序列。
完整克隆可以是這樣的任何克隆，其可讀框的推測氨基酸序列與OMP106多肽的氨基酸序列相同或者，如果不知道后者的完整氨基酸順序時，其可讀框的推測氨基酸序列與OMP106多肽的肽片段氨基酸序列相同，并且所述推測的氨基酸序列的分子量與OMP106多肽的分子量相當。而且，可以由其插入片段的能力鑒定完整克隆，所述能力是指當其插入片段置于表達載體時，產生結合對OMP106多肽氨基端特異性的抗體和對OMP106多肽羧基端特異性的抗體的多肽。
編碼OMP106-衍生多肽的核酸序列可以通過本領域熟知方法產生。一方面，根據本文公開的內容，通過重組DNA方法可以從OMP106多肽編碼序列衍生編碼OMP106-衍生多肽的序列。例如，可以改變OMP106多肽編碼序列產生氨基酸置換，所述氨基酸置換不會影響所述OMP106多肽的免疫原性或者提高其免疫原性。可以使用各種不同方法，包括(但不限于)寡核苷酸指導的位點特異性誘變。可以使用這些及其它本領域已知技術以產生單個或多個突變，例如置換、插入、缺失及轉座，如在Botstein和Shortle，1985，Science 2991193-1210中所述。
此外，OMP106多肽編碼序列的DNA可以通過限制酶或外切核酸酶消化截短。通過連接或PCR擴增可以將異源編碼序列連接到OMP106多肽編碼序列。而且，在已知或推測的OMP106多肽的氨基酸順序及需要對該序列進行的任何改變的基礎上，可以化學合成或用PCR擴增編碼整個或部分OMP-衍生多肽的DNA。
含有OMP106多肽或OMP106-衍生多肽編碼序列的經鑒定及分離的DNA，可以插入到合適的正在克隆的載體。可以使用本領域已知的許多載體-宿主系統。可能的載體包括(但不限于)質粒或經修飾的病毒，但是所述載體系統必須與所用的宿主細胞相容。這類載體包括(但不限于)諸如λ衍生物之類的噬菌體或諸如pBR322或pUC質粒衍生物之類的質粒。例如，通過將DNA片段連接到具有互補粘性末端的克隆化載體中，可以完成將所述插入片段片段插入到克隆載體中。然而，如果在克隆載體中沒有用于使該DNA成片段的互補限制位點，可以酶修飾該DNA分子的末端。或者，通過連接核苷酸序列(接頭)到該DNA末端可以產生任何需要的位點；這些連接接頭可以包括編碼限制性內切核酸酶識別序列的特定化學合成的寡核苷酸。在備選方法中，該被切割的DNA可以通過同聚物加尾進行修飾。通過轉化、轉染、感染、電穿孔等可以將重組分子導入宿主細胞，因此產生許多拷貝的該基因序列。
在備選方法中，含有OMP106多肽或OMP106-衍生多肽編碼序列的所需DNA可以在以“鳥槍”法插入到合適的克隆載體后鑒定及分離。例如，在插入到克隆載體前可以通過大小分級分離富集所需要的序列。
在具體實施方案中，用含有OMP106多肽或OMP106-衍生多肽編碼序列的重組DNA分子轉化宿主，能夠產生許多拷貝的該編碼序列。因此，通過讓轉化體生長、從所述轉化體分離所述重組DNA分子以及必要時，從分離的重組DNA中再取回插入編碼序列，可以大量獲得所述編碼序列。
5.8.OMP106多肽和OMP106-衍生多肽的重組產物通過基因工程技術可以生產本發明的OMP106多肽和OMP106-衍生多肽。在這種情況下，由編碼所述多肽的DNA轉化的合適宿主細胞生長它們。編碼本發明的OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的核苷酸序列可以插入到合適的表達載體，即含有插入多肽編碼序列轉錄及翻譯必需元件的載體。編碼OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的核苷酸序列以它們在適當條件(例如，在合適取向和正確閱讀框中以及具有合適表達序列，包括RNA聚合酶結合序列和核糖體結合序列)下可以表達的方式插入到所述載體中。
各種各樣的宿主-載體系統可以用來表達所述多肽編碼序列。這些包括(但不限于)用病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳動物細胞系統；用病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；微生物，例如含有酵母載體的酵母或用噬菌體DNA、質粒DNA或粘質DNA轉化的細菌。所述宿主細胞優選細菌，而最優選的細菌為大腸桿菌、枯草桿菌或沙門氏菌。
不同載體的表達元件的強度和特異性不同。根據所用的宿主-載體系統，可以使用許多合適轉錄和翻譯元件中的任意一種。在一具體實施方案中，表達含OMP106多肽或OMP106-衍生多肽序列的嵌合蛋白及宿主細胞的前和/或原序列。在另一具體實施方案中，表達含OMP106多肽或OMP106-衍生多肽序列的嵌合蛋白和親和純肽。在其它具體實施方案中，表達含OMP106多肽或OMP106-衍生多肽序列的嵌合蛋白和有用的免疫原肽或多肽。在最佳實施方案中，表達的OMP106-衍生多肽含有形成天然OMP106多肽的或外表表位或受體結合域的序列。
將DNA片段插入載體的本領域已知的任何方法均可以用來構建含有嵌合基因的表達載體，所述嵌合基因由合適的轉錄/翻譯控制信號及所述多肽編碼序列組成。這些方法可以包括體外重組DNA和合成技術以及體內重組體(遺傳重組)。編碼OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的核酸序列的表達，可以受第二個核酸序列的調節，使得該插入序列在用所述重組DNA分子轉化的宿主中表達。例如，所述插入序列的表達可以受本領域已知的任何啟動子/增強子元件的控制。可以用來控制插入序列表達的啟動子包括(但不限于)在動物細胞表達的SV40早期啟動子區(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)、含于Rous肉瘤病毒的3’長末端重復序列中的啟動子(Yamamoto等，1980，Cell 22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，Proc.Natt.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster等，1982，Nature 29639-42)；在細菌細胞表達的的β-內酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)、tac(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)、λPL或trc(也參見在Scientific American中的“得自重組細菌的有用蛋白質”，1980，24274-94)；表達植入細胞的胭脂堿合成酶啟動子區或花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(Gardner等，1981，Nucl.Acids Res.92871)以及光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動子(Herrera-Estrella等，1984，Nature 310115-120)；得自酵母或其它真菌的啟動子元件，例如Ga14啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子。
由三種一般方法(a)核酸雜交，(b)存在或缺乏“標記物”基因功能，以及(c)插入序列的表達，可以鑒定含有OMP106多肽或OMP106-衍生多肽編碼序列的表達載體。在第一種方法中，采用含有與插入OMP106多肽或OMP106-衍生多肽編碼序列同源的序列作探針，通過核酸雜交可以檢測插入在表達載體中的外源基因的存在。在第二種方法中，基于外源基因插入載體產生的某些“標記物”基因功能(例如，胸苷激酶活性、抗生素抗性、轉化表型、在桿狀病毒中的內含體形成等)的存在或缺乏，可以鑒定及選擇所述重組載體/宿主系統。例如，假如所述OMP106多肽或OMP106-衍生多肽編碼序列插入在載體的標記物基因序列中，那么由缺乏所述標記物基因功能可以鑒定含有所述插入片段的重組體。在第三種方法中，通過檢測由所述重組體表達的外源基因產物可以鑒定重組表達載體。這類檢測可以基于例如，在體外檢測系統中的OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的物理特性或功能特性，例如結合到OMP106配體或受體，或者與本發明的抗-OMP106抗體結合，或者宿主細胞使血凝集的功能或者細胞提取物干擾由卡他摩拉克菌引起的血凝集的能力。
一旦特定的重組DNA分子鑒定及分離，可以用本領域已知的幾種方法繁殖它。在合適的宿主系統及生長條件建立后，能夠繁殖且大量制備重組表達載體。如以上所解釋的，能夠應用的表達載體包括(但不限于)下面的載體或其衍生物諸如牛痘病毒或腺病毒的人或動物病毒；諸如桿狀病毒的昆蟲病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如λ)及質粒和粘粒DNA載體，僅舉幾個例子。
此外，可以選擇調節插入序列的表達或以所需要的具體方式修飾及加工所述基因產物的宿主細胞株。可以在某些誘導物存在的情況下提高得自某些啟動子的表達；因此，可以控制所述基因工程的OMP106多肽或OMP106-衍生多肽的表達。而且，不同宿主細胞具有蛋白質翻譯及翻譯后的加工和修飾的特征性及特異性機制。可以選擇合適的細胞系或宿主系統以保證表達的外源蛋白的所需修飾及加工。
5.9.試劑本發明的多肽、肽、抗體及核酸作為卡他摩拉克菌感染的臨床或醫療疹斷試劑和作為科學研究卡他摩拉克菌的致病性、毒力、感染性以及宿主防御機制的試劑是有用的。例如，本發明的DNA和RNA可以用作探針，以通過雜交或PCR擴增鑒定生物樣品中卡他摩拉克菌的存在。所述DNA和RNA也可以用來鑒定可以編碼與所述卡他摩拉克菌OMP106相關多肽的其它細菌。
本發明的多肽和肽可以用來制備多克隆和單克隆抗體，所述抗體可以用來經親和層析進一步純化含有本發明多肽的組合物。所述多肽和肽也能夠用于標準免疫檢測中，以在樣品中存在的抗卡他拉克菌的抗體方面進行篩選。
應該理解的是，根據包含在本文中的內容，本發明的內容在具體問題或環境上的應用將在本領域普通技術人員的能力范圍內。本發明的產物的例子及其制劑的加工和用途呈現在下面的實施例中。
6.實施例菌株ATCC 49143或其它菌株的OMP106多肽和及其編碼基因的分離和特征鑒定6.1.材料與方法6.1.1.血凝集檢測如Sato-Hernandez等(J.Clin.Microbiol.27903-908)所述檢測由卡他摩拉克菌引起的血凝集，只是在玻片凝集檢測中使用5％而不是3％(v/v)的紅細胞。最初是采用20μg的細菌細胞(濕重)進行血凝集檢測。由于在35℃下生長在血瓊脂板上的卡他摩拉克菌ATCC菌株49143引起強血凝集反應，就選擇它作為參考菌株。以1∶2稀釋度連續稀釋ATCC菌株49143結果使血凝反應降低。結果記為+++至+是基于連續1∶2稀釋后觀察到的由ATCC菌株引起的血凝集反應，這樣用獲得+++反應所需要的細胞數的1/4產生+反應。
6.1.2.血凝集反應的抑制以1∶2連續稀釋卡他摩拉克菌ATCC 49143細胞懸液，并且將當使用7μl Dulbecco氏磷酸緩沖鹽溶液和7μl 5％(v/v)人O+紅細胞時產生+血凝反應的稀釋細胞懸液，用來檢測單糖及糖衍生物對血凝反應的抑制。為了確定單糖或糖衍生物能否抑制由卡他摩拉克菌引起的血凝集反應，7μl 500mM某一給定糖與7μ卡他摩拉克菌混合并溫育5分鐘，以允許該糖與細胞相互作用。然后加入7μl 5％(v/v)人O+紅細胞，并在1分鐘之后記錄血凝集。檢測每一種糖和糖衍生物抑制血凝集的能力。之后，以1∶2連續稀釋每一種糖和糖衍生物貯液，并且采用上述方法檢測這些稀釋液抑制血凝集的能力。以這種方式確定抑制血凝集所需要的最小碳水化合物濃度。
6.1.3.配體與受體的結合按照Magnani等(1982，J.Biol.Chem.25714365-14369)所述方法，采用宿主細胞糖脂的薄層層析(TLC)分級分離部分和層析譜的標記細胞上層，檢測卡他摩拉克菌與動物細胞糖脂受體的結合。簡單地說，在氯仿、甲醇、水(5∶4∶1)中的高效薄層層析板(HPTLC)上分析得自Matreya Inc.(Pleasant Gap，PA)的糖脂。所述層析板或者于100℃用地衣二酚染色，或者用如前所述(Murphy和Loeb，1989，MicrobialPathogen.6159-174)的制備的125I-標記的2×106cpm/ml的卡他摩拉克菌覆蓋2小時。然后沖洗所述層析板5次，干燥后對X-光片曝光。
6.1.4OMP的OG提取物各種卡他摩拉克菌菌株在35℃、200rpm下各自培養在4升燒瓶中的1升Mueller Hinton肉湯中。通過用0.67ml 1.25％正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(即辛基葡糖苷；OG)的磷酸緩沖鹽溶液在室溫下處理50mg細胞(濕重)30分鐘，分離外膜蛋白(OMP)制劑。細胞在微型離心機中離心5分鐘后進行沉淀，而上清液用作辛基葡糖苷提取物。比較從許多卡他摩拉克菌菌株到通過差速離心分離的這些大囊泡(即外膜囊泡)的這些提取物的蛋白質型，它們高度富含卡他摩拉克菌外膜蛋白(OMPs)(Murphy和Loeb，1989，Microbial Pathogen.6159-174)，表明辛基葡糖苷提取物主要含有卡他摩拉克菌外膜蛋白(
圖1)。這表明，與由大囊泡制備的外膜蛋白比較，辛基葡糖苷提取提供了一種外膜蛋白更高產率的更快速的方法。
6.1.5OMP106的蛋白酶解消化在1ml Dulbecco氏磷酸緩沖鹽溶液中的得自ATCC菌株49143的50mg細胞于室溫下用蛋白酶消化1個小時，所述蛋白酶如下TLCK處理的胰凝乳蛋白酶(5mg)、蛋白酶K(5mg)、TPCK處理的胰蛋白酶(5mg)或蛋白酶V8(100單位)。所有蛋白酶均從Sigma Chemicals(St.Louis，MO)獲得。在所述蛋白酶處理后，立即將細胞在PBS中洗滌一次并再懸浮在1ml PBS中，檢測血凝集活性。此外，用辛基葡糖苷抽提蛋白酶處理的細菌細胞，這樣能夠溶解外膜蛋白以鑒定可能已被所述蛋白酶消化的特異性蛋白。
6.1.6.非血凝集品種一般來說，血凝集性卡他摩拉克菌培養物在含Mueller Hinton肉湯的搖瓶中在35-37℃、200rpm的條件下生長24-48小時。直接得自血瓊脂平板或Mueller Hinton培養基的瓊脂板的細胞也表現出所述血凝集表型。為了選擇非血凝集性(NHA)品種，在35℃生長于MuellerHinton肉湯中生長的靜止培養物中每5天連續傳代ATCC菌株49143。對于每次傳代，只從所述肉湯培養物的表面獲取接種物。到第2次傳代時，已生長細胞漂浮層，而這層細胞用作后續培養的接種物。以這種方式連續培養，通常在三次傳代后產生ATCC 49143的NHA品種。
6.1.7.分離OMP106多肽只在所述提取物已在100℃溫育5分鐘后，才能在變性的凝膠中檢測到(例如，用銀染色或抗-OMP106抗體)得自卡他摩拉克菌ATCC49143的外膜提取物中的OMP106多肽。為了確定在100℃溫育后出現的OMP106帶是否為煮沸過程中低分子量的蛋白凝集的結果，或者是否煮沸使通常凝集的蛋白進入凝膠，因此，在天然聚丙烯酰胺凝膠上分析ATCC 49143的未經煮沸的辛基葡糖苷外膜提取物。切取并煮沸包括緊靠樣品孔下方的凝膠的特定區域的凝膠。然后，將產生的樣品在變性的聚丙烯酰胺凝膠上分離，并用銀染色劑(Silver Stain Plus，分類目錄號161-0449，BioRad Laboratories，Richmond，CA)染色。對于N-末端的序列分析，將ATCC 49143的辛基葡糖苷外膜提取物與含有SDS的PAGE樣品緩沖液混合，并在沸水浴中溫育5分鐘。然后，將所述蛋白在含有SDS的12％PAG上分離，且用電印跡法轉移到PVDF膜上。隨后，切取含有所述OMP106帶的膜部分用于氨基末端序列分析。用來分離所述OMP106多肽的PAGE方法之中沒有一種在樣品緩沖液或凝膠緩沖液中使用還原劑。
6.1.8抗OMP106抗血清通過如前所述(Lammeli，1970，Nature 227680-685)在變性十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中分離得自ATCC 49143的HA品種的OMP106多肽，且從凝膠中切取含OMP106的帶，制備抗OMP106的抗血清。將切取的凝膠帶離析并注射到兔中，以產生抗OMP106的抗體。如在前面的6.1.2小節中所述的，該抗血清用來抑制血凝集，但是用該抗血清代替所述碳水化合物。如在第7小節中所述的，也檢查該抗血清的抗卡他摩拉克菌的補體介導的胞毒活性。
6.1.9用抗-OMP106抗血清的蛋白質印跡法卡他摩拉克菌ATCC 49143、ATCC 43628、ATCC 43627、ATCC 43618、ATCC 43617、ATCC 25240、ATCC 25238及ATCC8176；羊摩拉克菌ATCC 33078、腔隙摩拉克菌ATCC 17967；牛摩拉克菌ATCC 10900；奧斯陸摩拉克菌ATCC 10973；淋病奈瑟菌(臨床分離菌)；以及腦膜炎奈瑟菌ATCC 13077在巧克力瓊脂平板上于35℃、5％CO2中生長48小時。用聚苯乙烯接種環從瓊脂表面刮擦菌落取出細胞。然后，在150μl PAGE樣品緩沖液(360mM Tris緩沖液[pH8.8]，其中含4％十二烷基硫酸鈉及20％甘油)中懸浮30μg細胞，并在100℃溫育該懸浮液5分鐘，從而使細胞溶解。如Laemmli所述，在12％聚丙烯酰胺凝膠上分離溶解的細胞，而且如前所述(Thebaine等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354)在100伏特電泳轉移1.5小時使所分離的蛋白轉移到PVDF膜上，只是將0.05％十二烷基硫酸鈉加到轉移緩沖液中，以促進蛋白質從凝膠移動轉移。之后，用25ml含0.5％酪蛋白鈉、0.5％牛血清白蛋白和1％山羊血清的Dulbecco氏磷酸緩沖鹽溶液預處理所述PVDF膜。用這種預處理緩沖液進行所有隨后的溫育。
PVDF膜與25ml的免疫前兔血清或用OMP106多肽免疫的兔的血清(如上所述)的1∶500稀釋液在室溫下溫育1小時。然后用洗滌緩沖液(20mM Tris緩沖液[pH 7.5]，其中含150mM氯化鈉及0.05％吐溫-20)洗滌PVDF膜兩次。PVDF膜與25ml過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove Penn.分類目錄號111-035-003)的1∶5000稀釋液在室溫下溫育30分鐘。隨后用洗滌緩沖液洗滌PVDF膜4次，用Sigma化學公司(St.Louis，Mo.分類目錄號D-4418)供應的3，3’-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽及過氧化脲顯色，每次顯色4分鐘。
6.1.10.細胞表面的抗-OMP106免疫熒光染色卡他摩拉克菌ATCC 49143在Mueller Hinton肉湯中于35℃的振動水浴中生長過夜。離心使細胞沉淀，之后將細胞再懸浮在等體積的不含鈣或鎂的Dulbecco氏改良磷酸緩沖鹽溶液(PBS/MC)中。將20μl該細胞懸液分別涂到5張潔凈分顯微鏡載玻片上。在沉降10秒鐘后，用微量加液器吸去多余的流體，并讓載玻片空氣干燥1小進。然后將該載體置于開放框架之上熱固定，直到玻璃溫至可以觸摸為止。開始，用40μl抗-OMP106抗血清或得自同一動物的免疫前血清在PBS/MC或PBS/MC中稀釋的1∶40稀釋液，處理所述載玻片10分鐘，然后用PBS/MC洗滌5次。用40μl的5μg/ml PBS/MC的抗兔IgG的異硫氰酸熒光素標記的山羊抗體(Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc，Gaithersburg，MD分類目錄號02-15-06)處理所述載玻片。所述載玻片在黑暗中溫育10分鐘并在PBS/MS中洗滌5次。每一載玻片在蓋玻下用PBS/MS覆蓋后保藏，用配有489nm濾光片的熒光顯微鏡觀察。對每一樣品肉眼檢查5個視野以評價染色程度。
6.2.結果6.2.1.血凝集活性卡他摩拉克菌對于紅細胞的血凝集活性是種特異性的，且用人紅細胞觀察到最強的活性。兔紅細胞也被卡他摩拉克菌凝集，但程度顯著低于人紅細胞。小鼠、馬或羊紅細胞不被凝集(參見表1)。
6.2.2.OMP106多肽和配體卡他摩拉克菌血凝集活性是由于結合到紅細胞(Gb4)。得自血凝集性菌株的大囊泡結合到具有Gb4的糖脂上，而非血凝集性菌株不結合相同糖脂上(參見圖2)。卡他摩拉克菌血凝集活性受Gb4的單糖組分或這類單糖衍生物的抑制，而最有效的抑制劑是N-乙酰半乳糖胺和半乳糖(尤其是所述半乳糖的α異頭物)(參見表2)。
N-乙酰半乳糖胺和α-半乳糖二者均是所述Gb4四糖的組成部分。血凝集與結合Gb4之間的關系以及血凝集受構成Gb4受體的單糖抑制的觀察，提示卡他摩拉克菌細胞結合到四糖Gb4。這種四糖存在于人紅細胞及組織上，且能夠介導卡他摩拉克菌附著到真核細胞膜上。
6.2.3.OMP106多肽的鑒定蛋白酶解消化卡他摩拉克菌細胞，繼之分析所消化細胞引起的血凝集，證實用胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K蛋白酶處理破壞血凝集活性，而用胰蛋白酶處理部分破壞務凝集反應活性，表明血凝集活性是蛋白質介導的。分析蛋白酶消化的卡他摩拉克菌細胞的OMP蛋白質型表明，在每一樣品中多種蛋白質已降解，因此，蛋白質型不能提供哪種蛋白質直接引起或間接作用于血凝集活性的線索(參見圖3)。
因為蛋白酶處理表明多肽直接或間接負責血凝集活性，所以我們用SDS-PAGE來比較血凝集性菌株的OMP型與非血凝集性菌株的OMP型(圖4)。分析這些蛋白質型間的不同表明，所述血凝集性菌株具有兩種獨特的多肽，一種的表觀分子量為27kD(命名為OMP27)，而另一種是唯一的表觀分子量大于106kD的蛋白質(命名為OMP106)。值得注意的是，在蛋白酶處理過的血凝集活性降低或無血凝集活性的細胞的OMP制劑中缺乏所述OMP106多肽帶，而在蛋白酶K處理過的無血凝集活性的細胞的OMP制劑中存在所述OMP27帶。此外，所述OMP106多肽帶不被蛋白酶V8消化降解，蛋白酶V8消化不影響所處理細胞的血凝集活性。
6.2.4.NHA品種的OMP型于35℃在靜止培養中連續培養ATCC 49143的NHA品種，到該培養物的第三代時產生NHA品種(命名為49143-NHA)。這種所述血凝集活性的喪失是可重復的。分析所述HA和NHA品種的OG外膜提取物的OMP型，表明所述49143-NHA提取物缺失所述OMP106多肽帶(圖5)。這提示OMP106多肽是卡他摩拉克菌的血凝素(即，OMP106多肽結合Gb4受體或者是結合Gb4受體的同聚蛋白的亞基)或者構成卡他摩拉克菌血凝素的部分(即，OMP106多肽是結合Gb4受體的異聚蛋白的亞基)。
6.2.5.OMP106與血凝集針對ATCC 49143 OMP106多肽產生的多克隆抗血清中和由ATCC 49143產生的血凝集以及由異種ATCC 43627產生的血凝集。這進一步支持這樣的結論卡他摩拉克菌的血凝集活性包括OMP106多肽，并且在種種菌株中OMP106是抗原保守的。也參見圖9A，該圖表明在多克隆抗血清中的抗體結合異種卡他摩拉克菌株的OMP106多肽。
6.2.6.OMP106的外表面定位兔抗-OMP106抗血清用于間接免疫熒光染色，以確定OMP106多肽是否暴露在卡他摩拉克菌細胞的外表面。用抗-OMP106抗血清處理卡他摩拉克菌細胞較用免疫前血清或PBS/MC處理細胞染色更強、更均一。這表明在完整的卡他摩拉克菌細胞中，OMP106多肽是可與抗-OMP106抗體反應的。該結果表明OMP106多肽暴露在卡他摩拉菌的外表面。此發現與OMP106在血凝集中具有作用是一致的，而且表明OMP106多肽作為疫苗是有用的。
6.2.7.OMP106多肽的特性OMP106在其天然狀態作為大蛋白質復合物存在，或者當用辛基葡糖苷提取時產生凝集。該結論得到以下發現的支持，即用辛基葡糖苷提取卡他摩拉克菌細胞會增溶OMP106多肽，但是，所提取的OMP106多肽不進入變性的PAG中，除非該提取物首先在100℃溫育(圖6)。而且，所述OMP106多肽帶似乎不是由加熱時聚合或聚集的低分子量多肽形成的，因為在非熱變性的樣品中在樣品孔中捕獲到OMP106，且只有當該樣品首先在100℃溫育后才進入分離膠中。這一生化持性對鑒定各種凝膠中的OMP106多肽非常有用。
采用卡他摩拉克菌的辛基葡糖苷提取物，然后在100℃溫育該提取物和十二烷基硫酸鈉，以及在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離所述蛋白質，我們已估測得自卡他摩拉克菌各種MP株尤其是菌株ATCC 25238、ATCC 25240、ATCC 43617、ATCC 43618、ATCC 43627和ATCC43628的OMP106多肽的表觀分子量范圍為約180kD至230kD(圖9A)，而菌株ATCC 49143的OMP106多肽似乎具有約190kD的表觀分子量(圖6)。
從凝膠片提取菌株ATCC 49143的OMP106多肽并對其N端進行序列分析。序列分析表明得自ATCC 49143外膜的OMP106多肽的N端是IGISEADGGKGGANARGDKSLAIGDIAQALGSQSIAIGDNKIV(SEQ ID NO1)。此外，已分離由Lys-C消化產生的OMP106的內部肽(Femandez等，1994，Anal Biochem 218112-117)，且已確定其序列順序是GTVLGGKK(SEQ ID NO2)。
我們制備3種寡核苷酸探針。2種探針與內部肽GTVLGGKK相對應，一種探針具有如下序列GGNACNGTNCTNGGNGGNAARAAR(SEQ ID NO3)，另一種具有如下序列GGNACNGTNTTRGGNGGNAARAAR(SEQ ID NO7)。另一探針Mc 5-72編碼OMP106(SEQ ID NO1)的氨基端序列的內部片段(SEQ ID NO5)，該探針具有如下序列順序GAAGCGGACGGGGGGAAAGGCGGAGCCAATGCGCGCGGTGATAAATCCATTGCTATTGGTGACATTGCGCAA(SEQ ID NO4)。在Southern印跡法分析中，Mc 5-72探針與卡他摩拉克菌DNA的HindIII或PraI完全消化物雜交，在每種情況下都產生單一的條帶(圖7)。在HindIII消化物中的雜交帶大小約為8.0kb；在DraI消化物中的雜交帶約為4.2kb大小(圖7)。
6.2.8.OMP106多肽的保守性若干卡他摩拉克菌菌株和相關種的細菌的外膜蛋白提取物的蛋白質印跡法分析表明，所述抗-OMP106抗體結合到許多卡他摩拉克菌菌株(包括HA和NHA兩類菌株或品種)中的約180kD到約230kD的多肽(圖9A)。所述抗-OMP106抗體不結合相關細菌的蛋白提取物中的任何多肽(圖8A)。這些結果表明如下1)抗-OMP106抗體可以用來特異性地鑒定和區別卡他摩拉克菌和相關種的細菌。2)OMP106多肽可以用來產生診斷性用于鑒定卡他摩拉克菌的抗體。3)針對一種菌株的OMP106多肽(例如，ATCC 49143的OMP106)的抗體可以用來鑒定和分離其它卡他摩拉克菌菌株的對應OMP106多肽。有趣的是，所述蛋白質印跡法結果表明，許多NHA卡他摩拉克菌菌株在其外膜的OG提取物中具有OMP106多肽。在PAGE后，得自NHA卡他摩拉克菌菌株的OG外膜提取物的OMPs的銀染在180kD-230kD范圍內不出現帶，這一發現和所述事實表明，OMP106多肽由大多數卡他摩拉克菌菌株或品種表達，但是，為了在血凝集中是有活性的(即，結合到哺乳動物細胞表面的受體)或是可銀染色的，所述OMP106多肽必須以某種方式適當第地修飾。顯然，只有HA菌株和品種能夠適當修飾OMP106多肽，因此，它能夠介導細菌結合到哺乳動物細胞表面上的血凝素受體上。
7.實施例OMP106疫苗的效能抗-OMP106抗血清的胞毒活性檢查抗-OMP106抗體的補體介導的胞毒活性，以確定OMP106多肽的疫苗潛能。如在前面的6.1.8.小節中所述，制備抗ATCC 49143的HA品種的OMP106多肽的抗血清。采用Zollinger等所述的“血清殺菌試驗”(對腦膜炎奈瑟菌的免疫應答，載于臨床實驗室免疫學操作指南，第3版，第347-349頁中)檢查在介導補體殺傷卡他摩拉克菌中的所述免疫前血清和抗OMP106抗血清的活性，只是用HA和NHA卡他摩拉克菌菌株或品種的細胞替代腦膜炎奈瑟菌細胞。
所述結果表明，抗-OMP106抗血清介導補體殺傷異種卡他摩拉克菌ATCC 43627的HA品種，而不殺傷卡他摩拉克菌ATCC 43627的NHA品種或NHA卡他摩拉克菌ATCC 8176。表3概括了針對ATCC43627的HA品種的免疫前血清和抗-OMP106抗血清的補體介導的胞毒活性。
如表3所示，所述抗-OMP106抗血清的胞毒活性較所述免疫前血清高8倍。這一發現表明，OMP106多肽作為抗HA卡他摩拉克菌菌株及品種的疫苗是有用的。
盡管參考其具體實施方案詳細描述了本發明，應該理解，功能上相同的各種變化在本發明的范圍內。實際上，除了本文所表明和描述的這些實施方案之外，根據前面的描述和附圖對于本領域技術人員來說本發明的各種修改是顯而易見的。這類修改預定在所附的權利要求書范圍內。
本文引用了各種出版物，其說明書通過引用整個結合到本文中。
序列表(1)一般資料(i)申請人TUCKER，KENNETHPLOSILA，LAURA(ii)發明名稱卡他摩拉克菌外膜蛋白-106多肽及其基因序列和用途(iii)序列數8(iv)通信地址(A)收信人PENNIE & EDMONDS(B)街道1155Avenue ofthe Americas(C)城市紐約(D)州紐約州(E)國家美國(F)郵政編碼10036-2711(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本1.30(vi)當前申請數據(A)申請號US(B)提交日期(C)分類(viii)代理律師/代理人資料(A)姓名Baldwin，Geraldine F.
(B)注冊號31,232(C)參考/檔案號7969-045(ix)電訊資料(A)電話(212)790-9090(B)傳真(212)869-8864
(C)電報66141PENNIE(2)SEQ ID NO1的信息(i)順序特征(A)長度43個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學未知(ii)分子類型肽(xi)順序描述SEQ ID NO1Ile Gly Ile Ser Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg1 5 10 15Gly Asp Lys Ser Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln Ala Leu Gly Ser20 25 30Gln Ser Ile Ala Ile Gly Asp Asn Lys Ile Val35 40(2)SEQ ID NO2的信息(i)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學未知(ii)分子類型肽(v)片段類型內部的(xi)順序描述SEQ ID NO2Gly Thr Val Leu Gly Gly Lys Lys1 5(2)SEQ ID NO3的信息(i)順序特征(A)長度24個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓撲學未知(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“探針”(xi)順序描述SEQ ID NO3GGNACNGTNC TNGGNGGNAA RAAR 24(2)SEQ ID NO4的信息(i)順序特征(A)長度72個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學未知(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1…72(xi)順序描述SEQ ID NO4GAA GCG GAC GGG GGG AAA GGC GGA GCC AAT GCG CGC GGT GAT AAA TCC 48Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ala Asn Ala Arg Gly Asp Lys Ser1 5 10 15ATT GCT ATT GGT GAC ATT GCG CAA 72Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln20(2)SEQ ID NO5的信息(i)順序特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質
(xi)順序描述SEQ ID NO5Glu Ala Asp Gly Gly Lys Gly Gly ALa Asn Ala Arg Gly Asp Lys ser1 5 10 15Ile Ala Ile Gly Asp Ile Ala Gln20(2)SEQ ID NO6的信息(i)順序特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓撲學未知(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“探針”(xi)順序描述SEQ ID NO6YTTYTTNCCN CCNAGNACNG TNCC 24(2)SEQ ID NO7的信息(i)順序特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓撲學未知(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“探針”(xi)順序描述SEQ ID NO7GGNACNGTNT TRGGNGGNAA RAAR 24(2)SEQ ID NO8的信息(i)順序特征
(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓撲學未知(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“探針”(v)片段類型N-末端(xi)順序描述SEQ ID NO8YTTYTTNCCN CCYAANACNG TNCC 2權利要求
1.由HA卡他摩拉克菌菌株或培養物產生卡他摩拉克菌的非血凝集反應的培養物的方法，它包括在靜止液體培養物中連續傳代HA卡他摩拉克菌菌株或培養物。
全文摘要
本發明公開卡他摩拉克菌外膜蛋白－106(OMP106)多肽及其衍生多肽(OMP106衍生多肽)、編碼所述多肽的核苷酸序列和特異性結合所述OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的抗體。也公開免疫原性、預防性或治療性組合物，包括包含OMP106多肽和/或OMP106衍生多肽的疫苗。本發明還公開在動物中誘發對卡他摩拉克菌和卡他摩拉克菌OMP106多肽及OMP106衍生多肽的免疫反應的方法。
文檔編號A01N63/00GK1800359SQ200510092450
公開日2006年7月12日 申請日期1997年4月28日 優先權日1996年5月3日
發明者K·圖克爾, L·普羅斯拉 申請人:安特斯生物公司