專利名稱：一種提高結縷草遺傳轉化效率的方法
技術領域：
本發明明涉及一種提高結縷草遺傳轉化效率的方法，屬生物技術領域。
背景技術：
結縷草屬(Zoysia Willd.)是一類多年生、低矮、C4型禾本科草本植物，主要分布于亞洲東部，在非洲等溫暖地區亦有分布。結縷草在我國分布廣泛，北起遼寧北部，南到福建、臺灣，東起吉林鴨綠江上游，西到陜西省東南部均有分布(劉建秀等，1997；董厚德等，1999)。結縷草屬植物主要具備以下優勢(1)結縷草屬植物被認為是最抗鹽的草坪植物之一，(2)抗旱性強，(3)病蟲害較少，因而在草坪草開發利用上有重要價值。在韓國和日本，目前有70-80％的草坪均采用結縷草屬植物來建植，包括家庭草坪、高爾夫球場、運動場、公園草坪等。在我國，結縷草種植面積也在日益擴大。結縷草的缺點主要是不耐寒，當氣溫持續下降到10℃以下時，地上莖葉開始變紫發黃，逐漸枯死。因此在北方寒溫帶地區結縷草的綠期只有180-200天。綠期短導致結縷草的觀賞價值和使用價值降低。培育抗寒性強的新品種(系)，成為結縷草育種的主要目標之一。
利用基因工程技術把外源基因有目的、有針對性地導入特定品種的愈傷組織或原生質體，獲得改良的轉基因植物，提高草坪草的抗逆性，成為草坪草育種領域研究的前沿。4種轉基因方法用于草坪草的遺傳轉化基因槍、原生質體DNA吸收，碳化介導的DNA發送和農桿菌介導的轉化(柴明良，2002)。目前僅一例報道基因的瞬時表達試驗采用碳化硅纖維介導的DNA發送系統。通過原生質體再生植株很困難，而且原生質體吸收DNA法常導致多拷貝基因的整合以及轉基因的重排等，限制了該方法的應用。基因槍吸收法是草坪草遺傳轉化中常用的方法，它不受寄主范圍的影響，也無需通過原生質體途徑再生，但基因槍法也有外源基因多拷貝插入等問題，獲得穩定遺傳的轉基因植株也有較多的困難。與前三種方法比較，農桿菌介導轉化的方法具有明顯優點首先是費用相對低廉，操作程序也不復雜，更主要的是通過此方法獲得的轉基因植株通常只有1-3個拷貝的完整外源DNA。雖然單子葉植株不屬于農桿菌固有的寄主范圍。但是，自從1994年日本在水稻上證實農桿菌技術可以以來，農桿菌技術在重要的單子葉植物，如水稻、玉米和大麥上的應用快速發展，在草坪草的轉基因研究中也取得了成功。
柴明良通過A.tumefaciens LBA4404介導結縷草胚性愈傷組織，獲得了具有潮霉素磷酸轉移酶(HPT)和葡萄糖苷酸酶(GUS)基因共整合的瞬時表達轉基因再生植株，是世界上首例用農桿菌介導法獲得草坪草轉基因成功的報道(柴明良，2000)。Rahman等(2002)研究了A.tumefaciens菌株、感染及共培養時間、乙酰丁香醇(AS)和潮霉素濃度等關鍵因子對A.tumefaciens介導轉化效果的影響，建立了A.tumefaciens介導的日本結縷草(Z.japonica Steud.cv YK-EM2)轉化體系。Toyama(2003)通過農桿菌成功地將bar基因導入結縷草基因組中獲得抗除草劑株系。農桿菌介導的結縷草遺傳轉化仍然有轉化率低的問題，中華結縷草的相關研究未見報道。
發明內容
針對現有技術存在的不足，本發明以結縷草屬草坪草種獲得的愈傷組織為轉基因的受體材料，通過改進了的農桿菌介導法將外源基因高效率的導入受體細胞，并經選擇培養獲得較高誘導再生頻率的轉基因再生植株，從而建立了一種中華結縷草高效遺傳轉化的方法。
本發明的方案是通過選擇生長狀態良好的愈傷組織、調整農桿菌浮懸液體培養基及共培養基成分及培養方式，將外源基因導入結縷草愈傷組織，通過選擇培養及再生誘導培養，使遺傳轉化效率明顯提高。
本發明中，農桿菌介導的遺傳轉化程序基本上同石田(Ishida，1996)等報道，不同之處在于，在常用的浮懸農桿菌轉染液或共培養培養基中添加了1～5mg/L精氨酸(Arg)，將愈傷組織放在浮懸農桿菌轉染液中浸染10～20min，然后接種到在共培養基表面鋪的一層無菌濾紙上，保持愈傷組織周圍無積水。在濾紙上接種農桿浸染了的愈傷組織，保持愈傷組織周圍相對干燥，使愈傷組織保持較好的生長活性，以提高轉化效率。轉化體在含有適宜抗生素的培養基上抑菌，在含有合適濃度選擇劑的培養基上篩選，誘導出較高再生頻率的轉化植株。
本發明中，高頻再生體系的建立是遺傳轉化體系建立的重要技術前提，培養方法完全參考孫振元等(已申請專利200510087733.4)的方法。即在誘導愈傷組織培養基通過添加一定配比的2，4-D和6-BA以及高濃度碳源以有效提高愈傷組織的誘導率，在繼代培養到再生培養過程，通過不斷改變植物生長調節劑濃度配比及核黃素等含量，以提高植株再生率。
愈傷組織的篩選標準為淡黃色、顆粒狀、直徑約2mm的愈傷組織。新誘導產生的愈傷組織，必須經過3-5次繼代培養，才能篩選到上述優質的給與傷組織。
本發明中選用的植物材料為中華結縷草，包括中華結縷草、溝葉結縷草、大葉結縷草等。
提高中華結縷草遺傳轉化效率的方法包括如下步驟(1)挑取一個農桿菌單菌落轉移到3mL液體LB培養基(含有100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中，200rmp，28℃條件下培養12-16小時，1mL菌液轉移到含有50mL的LB培養液的250mL三角瓶內擴繁4-5h至OD600為0.3-0.4。(2)用50ml離心管收集菌液，以4000rmp離心10min，沉淀等用等體積的農桿菌重懸培養液(另加100μg/L的乙酰丁香酮)重懸殊菌體，作轉化備用液。(3)取15mL的備用液與60塊胚性愈傷混合，在60kPa負壓條件下靜置10分鐘。愈傷取出后用無菌濾紙吸干菌液，接種到共培養基(另加100μg/L的乙酰丁香酮)的濾紙上。(4)在25℃下黑暗中共培養3-5d后，用無菌清洗愈傷組織至清洗液澄清，無菌濾紙吸干多余的液體，轉到新的繼代培養基(含250mg/L頭孢霉素)上恢復培養7-10d，然后轉選擇培養上培養。(5)選擇培養基是在繼代、分化培養基中分別加入1、2、5mg/L草丁膦(Sigma公司生產)和250mg/L頭孢霉素。(6)在選擇繼代培養基上培養15-20d后，轉到選擇分化培養基上誘導植株再生。
在前人轉化方法的基礎上，結合本發明方法，結縷草愈傷組織共培養3-5天后GUS瞬時活性可達400～550個藍斑/克組織。
本發明的特點在于，在建立了完善的中華結縷草再生體系的基礎上，通過改進前人的轉化方法，使農桿菌介導的中華結縷草遺傳轉化效率明顯提高。并適應用于不同基因型結縷草。
說明附圖
圖1轉化受體材料，圖2共培養后愈傷組織的GUS瞬時活性，圖3抗性愈傷組織分化圖4再生抗性植株。
具體實施例方式在下面的實施例中進一步說明了本發明，這并不限制本發明的范圍。
實施例1采用的原始受體材料為中華結縷草(zoysia sinica Hance)。誘導愈傷組織的材料為中華結縷草成熟種子。
質粒p3301IC，含有衰老特異性啟動子SAG12調控的異戊烯基轉移酶(IPT)基因ipt，以及玉米泛素啟動子UBI調控冷誘導基因轉綠因子CBF1基因cbf1，CaMV35s啟動子調控的GUS基因(uidA)，篩選基因為bar(
圖1)。農桿菌菌株為LBA4404和EHA105，由中國林業科學院林業研究所保存。
農桿菌感受態的制備(1)試劑的配制農桿菌LBNaCL 10g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物10g/L，pH7.0，固體培養基加瓊脂15g/L。
(2)挑取根癌農桿菌(LBA4404或EHA105)單菌落于3mL的LB液體培養基(加入25mg/L利福平)中，28℃下180rpm振蕩培養過夜；(3)取過夜培養菌液2mL，接種于含有50mL LB液體培養基的500mL三角瓶內，28℃振蕩培養至OD600為0.5-0.6；(4)5000rpm，離心5min，去上清；(5)加10mL 0.15M滅菌的NaCL緩慢的懸浮農桿菌細胞；(6)5000rpm，離心5min；(7)1mL預冷的20mM CaCl2懸浮細胞，冰浴，24h內置于4℃，或分裝成每管200L(加入15％甘油)，液氮中速凍1s，置-70℃保存備用。
質粒p3301IC轉入農桿菌取200μL感受態細胞，加入1μg質粒DNA，冰浴30min，液氮中速凍1min，37℃水浴5min，然后加入1mL LB培養基，28℃慢速振蕩培養4h；2000rpm離心1min，棄上清，加入0.1mL LB或YEB培養基重新懸浮細胞，涂布于含有100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB平板上，28℃下培養48h。
陽性克隆的鑒定和保存挑取單菌落，劃線，PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌株加入15％甘油，混勻后保存于-70℃。
轉化受體的制備用中華結縷草成熟種子為外植體誘導愈傷組織，50天后將愈傷組織繼代到新的培養基上。以后每30天繼代一次，共3次，每次都挑選淡黃色、結構密實的愈傷組織。最后一次繼代培養15天后，取愈傷組織進行轉化。
愈傷組織的轉化與抗性植株的篩選挑取一個農桿菌單菌落轉移到3mL液體LB培養基(含有100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中，200rmp，28℃條件下培養12-16小時，1mL菌液轉移到含有50mL的LB培養液的250mL三角瓶內擴繁4-5h至OD600為0.3-0.4。用50ml離心管收集菌液，以4000rmp離心10min，沉淀等用等體積的農桿菌重懸培養液(另加100μg/L的乙酰丁香酮)重懸殊菌體，作轉化備用液。取15mL的備用液與60塊胚性愈傷混合，在60kPa負壓條件下靜置10分鐘。愈傷取出后用無菌濾紙吸干菌液，接種到含2mg/L精氨酸(Arg)的共培養基(另加100μg/L的乙酰丁香酮)的濾紙上。在25℃下黑暗中共培養3-5d后，用無菌清洗愈傷組織至清洗液澄清，無菌濾紙吸干多余的液體，轉到新的繼代培養基(含250mg/L頭孢霉素)上恢復培養7-10d，然后轉到選擇培養上培養。選擇培養基是在繼代、分化培養基中分別加入1、2、5mg/L草丁膦(Sigma公司生產)(經多次預備試驗確定的篩選壓)和250mg/L頭孢霉素。在選擇繼代培養基上培養15-20d后，轉到選擇分化培養基上誘導植株再生。植物再生率達60％。
分子鑒定轉化植株的PCR與Southern雜交方法參考《分子克隆》(第三版)PCR與Southern雜交檢測如下圖。結果表明轉化率達7.75％。
拷貝數的確定采用NcoI、EcoR1酶切中華結縷草總DNA，再做Southern雜交。結果表明為轉入的基因是單拷貝。
實施例2培養及轉化程序同實施例1，不同之處在于，采用的原始受體材料為中華結縷草幼穗。
轉化受體的制備是用中華結縷草幼穗為外植體誘導愈傷組織，40天后將愈傷組織轉到新的繼代培養基上。每30天繼代一次，共4次，每次都挑選淡黃色、結構密實的愈傷組織。最后一次繼代培養12天后，取愈傷組織進行轉化，添加2.5mg/L精氨酸(Arg)。植物再生率達62％。
轉化植株的PCR與Southern雜交結果表明轉化率達6.75％，為單拷貝。
實施例3培養及轉化程序同實施例1，不同之處在于，采用的原始受體材料為大葉結縷草成熟種子。
轉化受體的制備是用大葉結縷草成熟種子為外植體誘導愈傷組織，40天后將愈傷組織轉到新的繼代培養基上。每30天繼代一次，共3次，每次都挑選淡黃色、結構密實的愈傷組織。最后一次繼代培養15天后，取愈傷組織進行轉化，共培養基中添加3mg/L精氨酸(Arg)。植物再生率達63.55％。
轉化植株的PCR與Southern雜交結果表明轉化率達6.35％，為單拷貝。
實施例4培養及轉化程序同實施例1，不同之處在于，采用的原始受體材料為溝葉結縷草成熟種子。
轉化受體的制備是用溝葉結縷草成熟種子為外植體誘導愈傷組織，45天后將愈傷組織轉到新的繼代培養基上。每30天繼代一次，共3次，每次都挑選淡黃色、結構密實的愈傷組織。最后一次繼代培養15天后，取愈傷組織進行轉化，添加4mg/L精氨酸(Arg)。植物再生率達67.5％。
轉化植株的PCR與Southern雜交結果表明轉化率達7.25％，為單拷貝。
權利要求
1.一種提高結縷草遺傳轉化效率的方法，其特征在于(1)篩選愈傷組織作為轉化受體材料，(2)農桿菌重懸液體培養及共培養，(3)農桿菌液與培養物的共培養及培養基。
2.根據權利要求1所述的方法，其進一步特征在于作為遺傳轉化受體的愈傷組織的篩選標準為淡黃色、顆粒狀。
3.根據權利要求1所述的方法，其進一步特征在于改進了常規的農桿菌浮懸液體培養基及共培養培養基配方，在常用的農桿菌重懸液體培養或共培養培養基中添加了1～5mg/L精氨酸(Arg)。
4.根據權利要求3所述的方法，其進一步特征在于常規農桿菌重懸培養液及共培養培養基配方為MS基本成分(不含氯化鈣)+10g/L葡萄糖，pH 5.2。
5.根據權利要求1所述的方法，其進一步特征在于共培養的方法為，在共培養基表面鋪一層無菌濾紙，保持愈傷組織周圍無積水。
6.根據權利要求1所述的方法，其進一步特征在于采用該方法，結縷草愈傷組織共培養3-5天后GUS瞬時活性可達400~550個藍斑/克組織。
7.根據權利要求1所述的方法，其進一步特征在于轉化后的愈傷組織具有較強的再生能力，轉化率在6％以上。
全文摘要
本發明公開一種提高結縷草遺傳轉化效率的方法，主要步驟包括以結縷草屬草坪草成熟種子或幼穗為原始受體材料，誘導并篩選出淡黃色、顆粒狀愈傷組織為轉基因直接受體材料，采用改進了的農桿菌轉化法，結縷草愈傷組織共培養3－5天后GUS瞬時活性可達400～550個藍斑/克組織。轉化后的愈傷組織保持較高的再生能力，分子檢測結果表明，轉化率達6％以上。
文檔編號A01H4/00GK1736173SQ20051009049
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月17日 優先權日2005年8月17日
發明者孫振元, 韋善君, 錢永強, 韓蕾 申請人:中國林業科學研究院林業研究所