專利名稱：通過體胚發生途徑建立地錦再生體系的方法
技術領域：
本發明涉及地錦離體培養再生體系建立的方法。具體講涉及以地錦種子成熟胚為外植體，通過體細胞胚胎發生途徑建立其再生體系的方法。屬于植物細胞工程領域。
背景技術：
地錦為葡萄科(Vitaceae)地錦屬(Parthenocissus)，又名爬山虎，是落葉藤本植物，有強大的吸附和攀緣能力。地錦是具有良好觀賞效果的園林、城市垂直綠化、美化植物。聯合國生物圈和環境組織提出“城市綠地面積達到60m2/人時為最佳居住環境”，人類視野中綠色占25％以上時視覺感覺最舒服。但我國城市人均綠地面積不到5m2，與發達國家水平相距甚遠，綠化用地缺乏是主要問題之一，而絕大多數城市建筑墻面未加以充分利用，荒漠、石質山地的植被恢復，新建公路、鐵路創傷面及護坡的植被建設均需要特殊功能植物。地錦是解決上述問題的優選植物種類之一。
在城市綠化中地錦適應墻面輻射的高溫，對氯氣抗性強，夏季地錦爬滿墻壁對墻面有顯著的降溫增濕效果，減少墻壁熱輻射的面積，有效地消除部分熱污染源，并且地錦種植在建筑物墻根處，占用綠化土地面積小，既達到了綠化效果，又彌補了城市綠地不足。地錦增加了城市中植物光合作用的面積，提高了光合效率，從而吸收、固定了溫室氣體，從根本上減弱了“熱島效應”，同時地錦具有一定的耐蔭性，可在高架路下立柱等較蔭處作為垂直綠化材料。地錦還是一種優美的攀攝植物，枝繁葉茂，層層密布，入秋葉色變紅，有很好的景觀效果。
地錦適應性強，對土質要求不嚴，無論是種子繁殖、插條、分株都容易成活；生長迅速，一年生苗株高可達1.5-2.0m，莖長20-50m；耐瘠薄，一般無病蟲害。同屬的異葉爬山虎、綠爬山虎和美國爬山虎都有較好的綠化山體斷面的效果，其自然生境多為山坡、溝邊灌叢或疏林中以及攀援樹上、巖石上，生長地海拔最低為140m，最高可達1760m。地錦屬植物較強的適應性，使其成為綠化荒漠的先鋒植物。隨著國家對生態環境建設的日益重視，地錦屬植物大量用于荒山綠化、固土護坡，防止水土流失以及干旱地區地面覆蓋和植被恢復。地錦在土石荒山與石質荒山、黃土高原、風沙地、長江流域紅、黃壤水土流失區綠化中已經應用。地錦還適宜光滑巖面配置，種植后，不需采取任何防護和輔助措施，即可布滿巖面，達到綠化美化效果，預示了地錦在荒漠綠化中廣闊的應用前景。
然而地錦在冬季落葉，缺乏綠意，在降雨400mm以下，就難生存，限制了其綠化效果和范圍，因此通過育種手段培育綠期長、耐干旱的地錦新品種可顯著增強其綠化價值。同時地錦的優良特性并不是都存在于每一個種中，以原產中國的地錦(Parthenocissus tricuspidata)和原產美國的五葉地錦(P.quinquefolia)所含優良特性為多。地錦吸盤發達，附著力強，但生長較慢，五葉地錦生長快、抗性強，但吸盤不發達，附著力弱，這些性狀限制嚴重影響了地錦的推廣應用，培育兼具兩者優點的新品種將擺脫這一限制。但到目前為止對地錦的利用還處于自然式的隨機應用狀態，有目標的育種工作尚未開展。
建立高頻、穩定的植株再生體系是利用現代生物技術進行品種改良的前提。植株再生體系是外源基因的良好受體，同時也是體細胞融合的基礎。深入研究爬山虎體細胞胚的發生還將為爬山虎原生質體培養、優良無性系的繁殖和突變體篩選等研究奠定基礎。因此，地錦高頻、穩定再生體系的建立成為生物技術育種的關鍵。
有關地錦屬植物植株再生的研究工作僅有少量報道。馮大領等(北京林業大學學報，2004，26(4)，97-100)以地錦子葉的葉片和葉柄為試驗材料，在MS附加6-BA0.3mg/L和NAA0.1mg/L培養基上或1/2MS附加6-BA0.5mg/L和NAA0.1mg/L培養基上誘導產生體細胞胚，轉移到無植物生長調節劑的MS或B5培養基上發育成正常植株。并進行了組織學觀察，發現地錦體細胞胚的形成經歷了球形胚、心形胚、魚雷胚、于葉胚等幾個階段，與合子胚的發育途徑相似，但存在誘導率較低的問題，誘導率僅為16.7％。本發明人之一(李正紅等，林業科學研究，2005，1)對地錦盛花期后45天的幼胚在添加2，4-D和6-BA的B5培養基進行愈傷誘導，通過對誘導出的生長較快、灰白色無粘性、質地稀軟的愈傷組織繼代培養，繼代培養基為B5+6-BA+NAA+LH，得到黃綠色顆粒狀松散的胚性愈傷組織，轉移到胚狀體分化培養基B5+6-BA+NAA+LH后，分化出胚狀體并再生出地錦植株，但胚狀體分化率較低，只有33％。
雖然通過以上方法建立了地錦再生體系但再生率較低，同時外植體的取材受季節限制大，因此在實際應用中受到了極大的限制。在地錦離體培養的各種外植體中，其種子比其他外植體具有易收集、耐貯藏，取材不受季節限制等優勢，且種子中成熟胚內源激素含量高，細胞具有潛在旺盛的分裂能力，是用于離體培養的良好材料。
發明內容
本發明的目的是建立地錦的高頻再生體系。
本發明是以地錦成熟胚為外植體進行培養，以此建立地錦再生體系的方法。
本發明通過離體培養地錦成熟胚建立了高頻的再生體系，所獲得的再生植株性狀均一、穩定，易于遺傳工程操作。
本發明的培養方法包括三個培養階段(1)成熟胚切塊培養誘導愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(3)愈傷組織誘導體細胞胚和體細胞胚發育成植株，培養基中均含有蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，培養溫度22～28℃，光暗周期16h/8h，光強2000～2500勒克斯，相對濕度60％-70％，每培養30天更換一次新鮮培養基。
本發明三個階段的基本培養基是改良B5培養基(表一)，在第(1)階段培養中所用激素為1.0mg/l-3.0mg/l6-芐基氨基腺嘌呤6-BA，100mg/L-1000mg/l水解乳蛋白LH，0.5mg/l-6.0mg/l2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，在第(2)階段的培養基中所用激素為0.5mg/l-3.0mg/l 2，4-D，0.1mg/l-3.0mg/l6-BA，在第(3)階段的培養基中所用激素為0.1mg/l-3.0mg/l6-BA、0.1mg/l-3mg/l奈乙酸NAA、100mg/l-1000mg/l LH、0.1mg/l-10.1mg/l赤霉酸AC。
優選為第(2)階段培養在含激素為1.5mg/l-2.5mg/L 2，4-D，0.5mg/l-1.5mg/l 6-BA的培養基上愈傷組織繼代三次，在第(3)階段的培養基從A.含500mg/L水解乳蛋白LH的培養基B.含激素2mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、300mg/LLH的培養基C.含激素2mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、100mg/L LH、5mg/l AC的培養基三種培養基中選擇其一。
本發明特別優選的方法包括以下步驟(1)成熟胚切塊接種于添加3.5mg/L-4.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.5mg/L-2.5mg/L6-芐基氨基腺嘌呤6-BA和500mg/l水解乳蛋白LH的培養基上；(2)誘導得到的愈傷組織第一次繼代培養于1.5-2.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-芐基氨基腺嘌呤0.5-1.56-BA的培養基上；第二次繼代培養于0.5-1.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-芐基氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L 6-BA的培養基上；第三次繼代培養于0.5-1.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-芐基氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L 6-BA的培養基上(3)繼代的愈傷組織在400-600mg/l水解乳蛋白(LH)的培養基上，誘導出體細胞胚并發育成植株。
本發明方法的優點在于1.以種子成熟胚為培養物建立了地錦的再生體系，使得其離體培養外植體的取材不再受季節限制。
2.此方法建立的再生體系，再生頻率達到53％，顯著的高于已報道的再生頻率。
3.此方法建立的再生體系，植株發育正常、穩定，是良好的育種平臺。
具體實施例方式
在下面的實施例中進一步說明了本發明，這并不限制本發明的范圍。
實施例1本試驗采用由加拿大引進的地錦種子，將地錦種子用室溫下的自來水浸泡10～15小時，然后用70％酒精表面滅菌2分鐘，無菌水沖洗2遍，接著用0.1％氯化汞HgCl2表面滅菌10分鐘，無菌水沖洗5遍，用鑷子和解剖刀剖出胚接種在含6-BA 2.3mg/l，2，4-D 3.8mg/l，600mg/l水解乳蛋白的改良B5培養基(表1)上。培養基中均含有蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L。用1mol/LNaOH或HCl調pH值為5.8～6.2，高壓蒸汽滅菌20min，培養溫度22～28℃，光暗周期16h/8h，光強2000～2500lx，相對濕度60％-70％，每培養30天更換新鮮培養基。
7～10天開始出現愈傷，15天后愈傷快速生長。在附加6-BA 2.0mg/l，2，4-D 4.0mg/l和500mg/l水解乳蛋白培養基愈傷誘導率可達100％。
誘導出的胚性愈傷組織(除去雪花狀愈傷組織)，第一次繼代培養基所用激素為2，4-D 2.2mg/l，6-BA1.1mg/l，第二次繼代為2，4-D 1.1mg/l，6-BA0.55mg/l，第三次繼代為2，4-D 1.1mg/l，6-BA0.55mg/l。經過三次繼代愈傷組織為兩類，10％為生長較慢的淡黃色膠狀粘性愈傷組織，90％為生長較快的黃綠色無粘性、顆粒狀松散的愈傷組織，鏡檢為球形、細胞質較濃的胚性愈傷組織。
將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉到不加生長調節劑，附加550mg/L水解乳蛋白的B5培養基上，1月以后，觀測到體細胞胚的發生，發生率達53％。顯微觀察確定，胚狀體均從愈傷組織表面的圓形細胞產生，即外起源，愈傷底部的長形細胞無胚狀體發生。胚狀體發育經過球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚等不同時期逐漸發育成熟，與合子胚發育相類似。
在附加550mg/L水解乳蛋白的B5培養基上，愈傷組織經繼代后能不斷生長，且不斷產生胚狀體，繼代6次后仍保持胚狀體發生能力，從最初分化的10塊愈傷組織共產生約3250個胚狀體，平均每塊325個。
成熟胚狀體在相同培養基中萌發為具根、莖、葉結構的完整小苗。對39瓶胚狀體萌發情況進行調查，798個胚狀體中有422個發育為具真葉的完整小苗，成苗率63％。其余37％則為畸形胚，如不形成子葉，或單片肥大子葉，或玻璃化等。
小苗長8～10cm時，在溫度25℃、濕度75％左右的玻璃溫室中揭蓋煉苗3d后移栽，于同樣條件溫室中培養，第1周置于陰涼處，而后置于向陽處，1個月后調查成活率90％。
實施例2培養程序均按實施例1進行，所不同之處在于第一階段在附加6-BA1.7mg/l，2，4-D 4.3mg/l和700mg/l，第二階段第一次繼代2，4-D1.8mg/l，6-BA為0.9mg/l，第二次繼代為2，4-D0.9mg/l，6-BA為0.45mg/l，第三次繼代為2，4-D0.9mg/l，6-BA為0.45mg/l，第三階段將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉到不加生長調節劑，附加600mg/l水解乳蛋白的B5培養基上進行。
實施例3培養程序均按實施例1進行，所不同之處在于第一階段在附加6-BA2.5mg/l，2，4-D 3.5mg/l和800mg/l，第二階段第一次繼代2，4-D2.5mg/l，6-BA為1.25mg/l，第二次繼代為2，4-D1.25mg/l，6-BA為0.65mg/l，第三次繼代為2，4-D1.25mg/l，6-BA為0.65mg/l，第三階段將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉到不加生長調節劑，附加460mg/l水解乳蛋白的B5培養基上進行。
實施例4培養程序均按實施例1進行，所不同之處在于第一階段在附加6-BA1.8mg/l，2，4-D 3.7mg/l和500mg/l，第二階段第一次繼代2，4-D1.6mg/l，6-BA為0.8mg/l，第二次繼代為2，4-D0.8mg/l，6-BA為0.4mg/l，第三次繼代為2，4-D0.8mg/l，6-BA為0.4mg/l，第三階段將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉到不加生長調節劑，附加580mg/l水解乳蛋白的B5培養基上進行。
實施例5培養程序均按實施例1進行，所不同之處在于第一階段在附加6-BA1.9mg/l，2，4-D 4.2mg/l和400mg/l，第二階段第一次繼代2，4-D1.8mg/l，6-BA為0.9mg/l，第二次繼代為2，4-D0.9mg/l，6-BA為0.45mg/l，第三次繼代為2，4-D0.9mg/l，6-BA為0.45mg/l，第三階段將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉到不加生長調節劑，附加580mg/l水解乳蛋白的B5培養基上進行。
實施例6培養程序均按實施例1進行，所不同之處在于第一階段在附加6-BA2.2mg/l，2，4-D 4.5mg/l和480mg/l，第二階段第一次繼代2，4-D2.1mg/l，6-BA為1.0mg/l，第二次繼代為2，4-D1.0mg/l，6-BA為0.5mg/l，第三次繼代為2，4-D1.0mg/l，6-BA為0.5mg/l，第三階段將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉到不加生長調節劑，附加420mg/l水解乳蛋白的B5培養基上進行。
表一改良B5培養基(Gamborg等，1968)成分
表二MS基本培養基(Murashige & Skoog，1962)成分
權利要求
1.一種建立地錦高頻再生體系的方法，其特征在于以地錦成熟胚為外植體，進行培養。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于所述方法包括三個培養階段(1)成熟胚切塊培養誘導愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(3)愈傷組織誘導體細胞胚和胚狀體發育成植株，上述三階段的培養基中均以蔗糖30g/L為碳源，瓊脂6.5g/L，培養溫度22～28℃，光暗周期16h/8h，光強2000～2500lx，相對濕度60％-70％，每培養30天更換一次新鮮培養基。
3.根據權利要求2的方法，其特征在于本發明三個階段的基本培養基是改良B5培養基，在第(1)階段培養中所用激素為1.0mg/l-3.0mg/l 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA，100mg/L-1000mg/l水解乳蛋白LH，0.5mg/l-6.0mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 2，4-D，在第(2)階段的培養基中所用激素為0.5mg/l-3.0mg/l 2，4-D，0.1mg/l-3.0mg/l 6-B，在第(3)階段的培養基中所用激素為0.1mg/l-3.0mg/l 6-BA、0.1mg/l-3mg/l奈乙酸NAA、100mg/l-1000mg/l LH、0.1mg/l-10.1mg/l赤霉酸AC。
4.根據權利要求2的方法，其特征在于第(2)階段培養在含激素為1.5mg/l-2.5mg/L 2，4-D，0.5mg/l-1.5mg/l 6-BA的培養基上愈傷組織繼代三次，在第(3)階段的培養基從A.含500mg/L水解乳蛋白LH的培養基B.含激素2mg/L6-BA、0.1mg/L NAA、300mg/L LH的培養基C.含激素2mg/L 6-BA、0.5mg/LNAA、100mg/L LH、5mg/l AC的培養基三種培養基中選擇其一。
5.根據權利要求2的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)成熟胚切塊接種于添加3.5mg/L-4.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.5mg/L-2.5mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA和500mg/l水解乳蛋白LH的培養基上；(2)誘導得到的愈傷組織第一次繼代培養于1.5-2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-芐基氨基腺嘌呤0.5-1.5 6-BA的培養基上；第二次繼代培養于0.5-1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-芐基氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L 6-BA的培養基上；第三次繼代培養于0.5-1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-芐基氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L 6-BA的培養基上(3)繼代的愈傷組織在400-600mg/l水解乳蛋白LH的培養基上，誘導出體細胞胚并發育成植株。
全文摘要
本發明涉及以地錦成熟胚為材料建立其再生體系的方法，包括三個培養階段(1)成熟胚切塊培養誘導愈傷組織；(2)愈傷組織繼代培養；(3)愈傷組織中體細胞胚的發生和體細胞胚發育成植株。在繼代培養中采用分步降低2，4－二氯苯氧乙酸濃度的方法，使體細胞胚的發生率高達53％，可作為地錦遺傳轉化體系。
文檔編號A01H4/00GK1737125SQ20051008987
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月10日 優先權日2005年8月10日
發明者孫振元, 李正紅, 江澤慧, 巨關升, 韓蕾, 劉會超, 楊學軍 申請人:中國林業科學研究院林業研究所